내기생충 말벌 Asobara japonica와 그 숙주 Drosophila melanogaster의 효율적인 사육 및 기능 분석 프로토콜

Summary

이 프로토콜의 목표는 Asobara japonica 와 Drosophila melanogaster 에서 기생벌-숙주 상호작용의 기능적 분석을 용이하게 하는 것입니다. 최적화된 사육 방법, 단일 산란 감염 분석, RNAi 매개 유전자 다운을 통해

Abstract

기생은 한 생물이 다른 생물(숙주)의 몸이나 자원을 이용하여 숙주에게 상당한 손상이나 사망을 초래하는 생물학적 상호작용입니다. 기생 동물 중에서 기생말벌은 가장 종이 풍부한 계통 중 하나로, 전체 곤충 종의 거의 20%를 차지합니다. 특히, 내기생벌은 숙주 몸에 직접 산란하여 다양한 독 인자를 사용해 숙주 발달, 면역, 생리를 조작합니다. 말벌 공격에 대응하여 숙주는 선천적 면역 기전을 통해 기생독 알을 제거하려 시도합니다. 그러나 개별 독 성분이 숙주 생물학을 조절하고 성공적인 기생을 촉진하는 분자 및 세포 메커니즘은 아직 잘 알려져 있지 않습니다. 여기서는 내기생충 말벌 Asobara japonica 와 그 숙주 Drosophila melanogaster 를 키우기 위한 표준화된 실험실 프로토콜을 설명합니다. A. japonica의 단성생식 및 유성생식 균주 모두 존재하며, 단위생식계통은 높은 기생 성공률을 보여 게놈 분석과 기생 분석을 위한 실험실 재고의 안정적인 유지를 가능하게 합니다. 독 유전자의 기능 분석에 최적화된 단일 산란 감염 분석법과 이중 가닥 RNA 기반 유전자 노크다운 방법이 적용되었습니다. 이 프로토콜들은 기생충-숙주 상호작용의 분자 메커니즘을 해부하는 실질적인 실험적 틀을 제공하며, 발생생물학, 면역학, 생리학 분야의 미래 연구를 촉진할 것입니다.

Introduction

기생은 한 생물이 다른 생물의 영양 자원을 이용하는 생활 방식으로, 분류군 전반에 걸쳐 널리 퍼져 있습니다. 알려진 생물의 최대 절반이 생애 주기에서 기생 활동을 보이는 것으로 추정됩니다¹. 기생충 중에서 기생벌은 특히 다양한 그룹으로, 전체 곤충의 약 20%를 차지합니다². 곤충, 거미, 진드기 등 다양한 절지동물 숙주를 이용하며, 생활사와 기생 전략에서 놀라운 다양성을 보인다³. 이러한 특징들은 기생 말벌을 진화적·생태적으로 가장 성공적인 곤충 그룹 중 하나로 만듭니다.

기생독과 숙주 간의 상호작용은 진화적 '군비 경쟁'의 모델 시스템으로 광범위하게 연구되어 왔습니다. 특히, 내기생충 말벌은 독, 공생 바이러스, 기형세포 등 다양한 인자를 활용합니다 ^4,5. 이 인자들은 숙주의 생리와 발달을 조작하여 숙주 내에서 성공적인 발달을 보장합니다. 이러한 진전에도 불구하고, 기생의 분자 메커니즘은 대부분의 기생독 종에서 여전히 잘 이해되지 않고 있습니다. 주요 한계 중 하나는 작은 체형으로, 독 성분의 생화학적 식별에 어려움을 겪고 있습니다. 또한, 기생독과 그 숙주를 실험실 조건에서 동기화된 발달 단계로 유지하는 것은 기술적으로 어렵습니다.

차세대 시퀀싱 및 기타 오믹스 기술의 최근 발전으로 매우 작은 기생독 종에서도 유전체 전체 분석이 가능해졌습니다. 이러한 접근법은 이전에 접근할 수 없었던 분자 메커니즘을 연구하는 새로운 길을 열어, 기생독-숙주 상호작용을 전례 없는 해상도로 연구할 수 있게 했습니다. 이와 관련해 우리 연구실은 일본에서 처음 확인된 종인 Asobara japonica Belokobylskij (막목: Braconidae)에 집중합니다 ^6,7,8. A. japonica는 암컷이 교미하지 않고 자손을 낳는 thelytokous 단위생식 균주를 포함합니다. 이 기능 덕분에 전체 유전체 시^퀀싱을 위해 유전적으로 균일한 유전체 DNA를 상당량 수집할 수 있습니다. 또한 이 종은 모델생물인 D. melanogaster를 포함한 다양한 초파리 종에 기생하며,  잘 확립된 사육 조건과 정확히 정의된 발달 단계 덕분에 재현 가능한 감염 검사와 기생벌 발달의 정확한 통제를 가능하게 합니다¹⁰.

A. japonica의 기생 기간 동안, 암컷 말벌이 독과 알을 하나 함께 파리 유충에 주입하면, 그 안에서 말벌 유충이 숙주와 함께 자랍니다. 특히 A. japonica는 숙주 D. melanogaster에서 높은 기생 성공률을 보여 이 기생벌-숙주 쌍은 강력한 실험 모델이 됩니다. 여기서는 A. japonica에서 안정적인 사육, 단일 산란 감염 분석, 그리고 이중 가닥 RNA(dsRNA) 기반 유전자 노크다운 방법에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜들은 기생충-숙주 상호작용의 분자 메커니즘을 해부하는 신뢰할 수 있는 틀을 제공합니다.

Protocol

D. melanogaster와 A. japonica의 동기화 양식 방법에 대한 도식은 그림 1에 제시되어 있습니다.

1. 실험실에서 숙주 과일파리 Drosophila melanogaster 사육

1. 모든 실험 동물은 12시간 12분의 밝고 어두운 주기로 25°C와 50-60% 상대습도를 유지하세요. 야생형 균주 Oregon-R(OR)을 A. japonica의 숙주로 사용하세요(그림 2A).
2. 성충 파리를 표준 옥수수 가루-효모-한천 배지(0.55% 한천, 표 1)가 포함된 새로운 먹이 바이알로 옮깁니다. 바이알에 이송일과 품종명인 "OR"를 적으세요.
3. 이사 후 하루 동안 이 성충 파리들을 제거하여 음식에 과도한 알이 들어가지 않도록 하세요. 새끼 유충이 먹이 표면에서 먹이를 먹고 있는지 확인하세요.
   참고: 가이드라인으로, 사료 바이알당 약 200-250개의 계란(φ30×100 mm)을 유지하세요. 알 밀도가 높으면 기생 성공률이 줄어들고 숙주와 말벌의 발달 변이를 증가시킬 수 있습니다.
4. Step 1.2 후 4일 후, 알을 낳은 지 4일 후(dAEL) 한 숟가락의 파리 유충을 새 사료 바이알로 옮깁니다. 이 유충들은 다음 세대를 위해 기생벌에 노출되지 않도록 하세요. 이 절차는 또한 바이알 내 숙주 유충 밀도를 조절하는 데도 도움을 줍니다.

2. 실험실에서 내기생벌 말벌 Asobara japonica 사육

1. 단위생식 균주 도쿄(TK)와 유성생체 균주 이리오모테지마(IR)(그림 2B)를 사용하라. 전자는 암컷으로 구성되어 있고, 후자는 암컷과 수컷으로 구성되어 있습니다. 수컷은 암컷보다 2-4일 먼저 출산합니다. 따라서 이식 전에 산란관으로 암컷의 존재를 확인하세요.
2. 스톡 바이알에서 10-20마리의 성체 말벌을 4 dAEL의 파리 유충이 담긴 바이알로 직접 옮깁니다. 바이알에 이송 날짜와 품종명인 "TK" 또는 "IR"을 적으세요. 말벌을 1.1단계와 같은 조건에서 유지하세요.
3. 성충 말벌이 파리 유충에게 산란하도록 허용하세요. 이 말벌들은 1일에서 이틀 후에 제거하여 숙주 사망으로 이어질 수 있는 초기생충을 방지하세요. 2.2단계 후 10일 이상 기생충으로부터 탈출한 폐쇄형 성충파리를 제거하세요.
4. Step 2.2 후 2주 후, 성충 말벌이 숙주 파리 번데기 껍질에서 벗어나기 시작합니다. 새로 닫힌 성충 말벌을 25% 포도당과 50 mM 비타민 C 용액이 담긴 여과지가 있는 새 먹이 바이알로 옮깁니다. 필터 페이퍼 조각은 130°C에서 2시간 동안 멸균해야 합니다. 용액을 필터 종이에 제공하면 산란 행동이 촉진되고 성충 말벌의 수명을 연장할 수 있습니다. 산란을 촉진하기 위해 비타민 C를 사용하는 우리의 접근법은 초파리 연구¹¹에서 관찰된 것에서 영감을 받았습니다.

3. 단일 산란 감염 분석

1. 감염 실험에 사용되는 파리 유충의 발달 단계를 동기화하세요.
   1. 성충 파리를 50mL 튜브에 포도즙 한천 플레이트(3% 한천)와 신선한 효모 페이스트를 발라서 24시간 동안 알을 낳게 합니다.
   2. 갓 부화한 1령 유충을 포도즙 한천 배지에 모아 2-3g의 파리 먹이(적절한 양의 물과 섞은 파리 먹이)이 든 작은 바이알(12mL)에 옮깁니다. 20-30마리의 유충을 병에 넣습니다. 파리 유충은 25°C에서 자라도록 허용합니다.
2. 적절한 시점에 약 1.5-2.0cm 직경의 얇고 고르게 펼쳐진 파리 먹이 페이스트 층을 4cm 크기의 페트리 접시(이하 감염 분석장이라고 함)를 준비합니다. 감염 분석장 외에도, 적절한 양의 파리 먹이 페이스트가 담긴 새로운 소형 바이알(12mL)을 준비하세요. 이 바이알은 감염 검사 후 숙주 유충을 사육하는 데 사용됩니다.
3. 단계별로 유충을 수집하여 탈이온수(저항률 = 15 MΩ·cm, 25 °C)가 담긴 접시로 옮깁니다. 유충을 부드럽게 저어 몸에 남은 음식물을 제거하세요.
4. 헹군 후에는 보풀 없는 종이 물티슈로 유충의 과도한 수분을 부드럽게 제거하세요. 과도한 물은 감염 분석장에서 말벌의 산란 행동에 방해가 됩니다. 그 후 유충을 경기장으로 옮기세요. 이 단계는 감염 실험 중 유충 활동을 증가시킵니다.
5. 성체 말벌을_CO2 가스로 5 L·^min-1 유량, 0.2 MPa 압력으로 마취합니다. 그 후 약 세 마리의 암컷 말벌을 부드럽게 감염 분석장에 넣습니다. 접시 뚜껑을 닫고 파리 먹이 페이스트를 먹으면 회복할 시간을 주세요.
6. 입체 현미경(확대 설정: 10×에서 15×)으로 이 말벌들의 산란 행동을 관찰하세요.
   참고: 말벌이 움직이는 파리 유충 몸체를 만지면, 산란관을 빠르게 파리 몸통에 삽입하고 독 성분을 주입합니다. 파리 유충은 몸을 뒤척이며 몸부림치지만, 즉시 마비됩니다. 그 후 말벌은 복부를 진동시키고 숙주 유충 몸에 알을 낳고, 산란관은 제거됩니다. 이러한 산란 행동을 감염이라고 부릅니다.
7. 감염 후 뚜껑을 열고 감염된 파리 유충을 3.2단계에서 준비한 파리 먹이 페이스트가 든 새 작은 바이알로 옮깁니다. 감염 시기를 표준화하기 위해 감염 실험을 15분 이내에 수행하세요.
8. 작은 바이알에 날짜, 샘플 이름, 감염 시간, 개체 수 등 실험 정보를 적으세요. 이 바이알들은 막은 후 습한 용기에 넣어 25°C에서 보관합니다.

4. dsRNA 주입에 의한 RNA 간섭(RNAi) 말벌 생성

1. 시험 관 내 전사 기반 dsRNA 합성 시스템을 사용하여 dsRNA 매개 유전자 녹다운(RNA 간결, RNAi)을 위해 400 bp 이상의 dsRNA를 합성합니다. dsRNA 샘플은 사용 전까지 -20에서 -80°C에서 보관해야 합니다. 상세 프로토콜은^{앞서 설명}한 것과 같습니다.
2. 말벌 몸체를 놓을 때 2% 한천이 들어간 5.5cm 페트리 접시를 준비하세요. 각 접시의 3분의 2를 한천으로 채워 두꺼운 한천 플레이트를 만들어 주입을 준비하세요.
3. 물에 적신 보풀 없는 종이 물티슈를 플라스틱 접시 뚜껑 위에 올려놓으세요.
4. 감염 7일째(DPI)에 기주 파리 번데기를 바이알에서 채취하여 4.3단계에서 준비한 보풀 없는 종이 닦이에 올려놓으세요. 바이알 벽에 물 한 방울을 넣으면 숙주 파리 번데기 껍질을 바이알에서 분리하는 데 도움이 됩니다.
5. 입체 현미경(줌 설정: 20×)에서 기주 파리 번데기 껍질을 제거하고 겸자로 말벌 몸체를 노출시킵니다. 7 dpi에서 대부분의 말벌은 번데기 단계에 있으며, 머리, 흉부, 복부 부위가 구별됩니다. 말벌의 몸은 움직이지 않습니다.
6. 회수한 말벌 몸체를 4.2단계에서 준비한 한천 플레이트 위에 올려놓고, 몸체 축을 같은 방향으로 정렬합니다. 등쪽이 위로 향한 말벌 몸체 20-30개를 한두 줄로 배치하세요. 말벌이 미끄러지는 것을 방지하기 위해 보풀 없는 종이 물티슈로 한천 플레이트의 과도한 수분을 제거하세요.
7. 제조사의 지침에 따라 주입 장치와 입체현미경을 설치하세요(그림 3A). 주입량과 주입 속도를 정밀하게 제어할 수 있는 유리 모세관 바늘이 장착된 마이크로주입 시스템을 사용하세요. 말벌 머리가 주입 바늘 끝을 향하도록 배치한 한천 플레이트를 놓으세요. 주입 부피는 50 nL·^wasp-1 이며, 주입 속도는 50 nL·^sec-1 입니다.
8. 바늘 풀러를 사용해 유리 모세관 바늘을 준비하세요. 유리 모세관의 형태는 히터 온도에 따라 조절할 수 있습니다.
9. 유리 모세관 바늘을 바늘 그라인더에 30-35° 각도로 올려놓으세요. 바늘을 갈아 팁 길이가 0.04 mm(접안렌즈 조준선 4개 분할, 그림 3B)에 도달할 때까지 갈아냅니다.
10. 주사 직전에 dsRNA를 녹이세요. dsRNA의 농도는 0.25-1 μg·^μL-1입니다. 시각화를 위해 dsRNA 용액은 파란색 염료(에리오글라우신 이나트륨 염, 2% 중량·부피^-1)로 염색합니다. 마이크로로더 피펫 팁을 사용해 유리 모세관에 파란색 염료가 포함된 dsRNA 용액을 채웁니다. 4 μL이면 30개의 말벌 몸을 주입하기에 충분합니다. 용액 내에 기포가 없는지 확인하세요.
    참고: dsRNA 용액을 적재한 후에는 손톱으로 바늘 옆면을 살짝 두드려 갇힌 기포를 제거하세요. 잔여 공기 방울은 용액의 흐름을 방해하여 성공적인 주입을 방해할 수 있습니다.
11. 1mL 주사기와 바늘을 사용해 유리 모세관의 빈 부분에 미네랄 오일을 채워 모세관 내에 기포가 남지 않도록 합니다.
12. dsRNA 용액과 미네랄 오일이 포함된 유리 모세관 바늘을 바늘 홀더에 부착한 후 주입 장치에 장착하세요.
13. 한천 플레이트와 유리 모세관 바늘의 위치를 인젝터에 조정하여 유리 바늘이 말벌 몸체에 대해 30-45° 각도로 위치하도록 합니다(그림 3A).
14. 유리 모세혈관 바늘을 말벌 몸의 등쪽에 삽입하고, 약간 옆쪽 쪽은 등쪽 중앙선에 가깝게 합니다. 몸 안에 dsRNA 용액을 마이크로 주입하세요. 주입된 dsRNA 용액은 파란색 염료 와 함께 보입니다(그림 3C).
15. 주사 후에는 한천 플레이트를 습한 용기(상대습도 70-80%)에 넣고 25°C 인큐베이터에서 일주일간 보관하며, 성체 말벌이 탈출할 때까지 보관합니다. 손상된 말벌 몸체는 박테리아 오염을 막기 위해 한천 배지에서 제거해야 합니다.
    멈춤 지점: 4.6단계에서는 말벌 번데기를 주입 전 몇 시간 동안 한천 플레이트에 보관할 수 있습니다. 바늘은 미리 준비할 수 있습니다(4.8 및 4.9단계); 하지만 시간이 지나면서 막힘이 생기기 쉽습니다. 신선하게 준비된 바늘은 일반적으로 더 신뢰할 수 있는 주사 성능을 제공합니다.

Results

아소바라 자포니카의 무성 및 유성 균주
A. japonica는 일본 전역에 널리 분포합니다. Thelytokous 단위생식 계통은 본도에서 우세하며, 아마미-오시마와 이리오모테지마 섬을 포함한 아열대 섬에서는 arrhonetokuous 유생식 계통이 발견됩니다 ^8,12. 유성균주에서는 수컷이 암컷보다 며칠 일찍 출현하여 성체 이동 시기가 뚜렷하게 나타납니다. A. japonica의 Thelytokous 단위생식은 모계에서 전파되는 내공생균인 Wolbachia의 감염에 의해 유도^됩니다. 항생제 치료로 Wolbachia를 제거하면 수컷 ^9,14가 생성되며, Wolbachia를 유성 균주로 이식하면 단위생식이 유도된다¹⁵. A. japonica의 무성 및 유성 균주 모두 여러 초파리 종에서 높은 기생 성공률을 보입니다. 예를 들어, 경제적으로 중요한 과일 해충인 D. suzukii에 기생할 수 있으며, 농업에서 잠재적인 생물학적 방제제로 간주됩니다¹⁶. 사용 가능한 균주 중 우리는 주로 Wolbachia에 감염된 TK 균주를 실험에 사용했습니다. TK 균주는 IR 균주에 비해 숙주 유충에 대한 기생 활동이 더 높아 분석에 적합합니다.

기생 성공은 사육 조건에 달려 있습니다
A. japonica의 기생 성공률은 일반적으로 높지만, 숙주 파리의 사육 조건에 크게 영향을 받습니다. 영양분이 부족한 환경에서는 파리 유충의 성장 기간이 길어지고, 번데기 화도¹⁷번 지연됩니다. 이러한 조건에서는 말벌이 숙주 자원을 제대로 활용하지 못하고 숙주의 발달과 동기화하지 못할 수 있습니다. 이 가능성을 조사하기 위해, 우리는 정상 효모(1×)와 효모 빈(0.1×) 조건에서 파리와 말벌을 사육했습니다. 그 후 기생 성공률과 발달 시기를 평가했습니다(그림 2C, 2D). 기생 성공률은 출현한 성체 말벌과 숙주 유충의 비율로 계산되었다.

정상 효모 조건에서 단일 산란 감염 분석에서 기생 성공률은 81.7%였습니다(그림 2C, 왼쪽; 표 2). 효모 함량이 10%로 줄어들었을 때(효모 상태가 좋지 않음), 기생 성공률은 35.0%로 감소했습니다(그림 2C, 오른쪽; 표 2). 이 감소는 감염 후 약 50%의 숙주 유충이 죽었기 때문에 설명될 수 있습니다. 이 결과는 영양분이 부족한 조건에서 숙주와 기생충 간의 자원 배분이 방해받는다는 것을 시사합니다.

특히, 효모가 적은 조건에서는 말벌의 붕괴 시기가 정상적인 효모 상태와 같지 않게 지연되었다. 파리 폐기 시기는 최대 9일까지 지연되었지만, 말벌의 성공 시기는 최대 4-5일 지연되었습니다. 이 결과는 영양소 가용성이 주로 숙주 발달에 영향을 미친다는 것을 시사합니다. 붕괴 시기는 정상적인 효모 상태에서는 파리와 말벌 모두에서 일관되지만, 효모가 적은 조건에서는 그렇지 않아 기생벌과 숙주 간의 동기화된 발달이 영양소 가용성에 달려 있음을 시사한다.

독 유전자의 기능적 분석을 위한 RNAi 기반 접근법
독샘의 전사체 및 단백질체 분석을 통해 수많은 후보 분자가 확인되었지만, 성공적인 기생에 필요한 분자가 무엇인지는 여전히 명확하지 않습니다. 이 후보 분자의 생리학적 역할을 규명하기 위해서는 유전자 노크다운 접근법을 이용한 생체 내 기능 분석이 필요합니다.

최근 우리는 A. japonica의 기생이 D. melanogaster 유충의 상상 디스크에서 세포자퇴사, 자가포식, 유사분열 정지를 유도하여 심각한 조직 열화를 초래한다는 사실을 보고했으며, 이를 상상 디스크 분해(IDD)라고 합니다¹⁰. IDD를 유발하는 분자를 규명하기 위해, 전사체, 단백질체학, 비교 유전체 분석을 통해 확인된 후보 유전자의 RNAi 스크리닝을 수행하였습니다. 그 결과, 상상 디스크 분해 인자(IDDF-1)와 IDDF-2 두 유전자가 확인되었습니다. IDDF-1과 IDDF-2 모두 미지의 기능 도메인 4803(DUF4803)을 포함하고 있습니다. 특히, 초기 보고서 이후 독립적인 연구에서 IDD와 관련된 여러 A. japonica 독 단백질(독 유도 분해(VID)이 확인되었으며, 이들 모두 DUF4803 도메인¹⁸을 가지고 있습니다.

이 결과를 바탕으로 우리는 RNAi 프로토콜을 더욱 최적화하여 재현성과 효율성을 향상시켰습니다. 특히 Nanoject III의 사용은 주입량과 속도를 정밀하게 제어할 수 있게 하여 더 일관된 넉다운 결과를 가져왔습니다.

최적화된 RNAi 프로토콜의 효율성을 평가하기 위해 IDDF-1의 녹다운을 수행하였습니다. 밀폐된 성체 말벌에서는 IDDF-1 발현 수준이 대조군에 비해 유의하게 감소했습니다(그림 3D). 기능 검증을 위해 우리는 이 RNAi 말벌과 날개 주머니 영역¹⁹에서 세포자사멸사 보고자 GC3Ai를 발현하는 기주 파리 유충을 이용한 단일 산란 감염 분석 실험을 수행하였습니다. 대조군(GFP RNAi) 말벌 감염 후 날개 주머니에서 GC3Ai 신호가 검출되었습니다. 반면, IDDF-1 RNAi 말벌 감염 후 GC3Ai 신호는 유의하게 감소했습니다(그림 3E, 3F). 이 결과들은 이전 연구 결과와 일치하며, IDDF-1 기능이 RNAi에 의해 효과적으로 억제된다는 것을 확인시켜 줍니다.

그림 1. D. melanogaster와 A. japonica의 사육 절차에 대한 도식적 개요. 
D. melanogaster 의 발달 단계에 따라 단계별 절차가 제시되어 있습니다.이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2. 아소바라 자포니카 에 의한 기생. (A) D. melanogaster 와 기생충 A. japonica 간의 발생 관계 도식. 암컷 말벌은 파리 유충에게 독과 알을 한 개 주입합니다. 부화 후 말벌 유충은 숙주 유충과 병행하여 발달하며, 이후 번데기가 됩니다. 번데기가 된 후, 말벌은 파리 몸통을 먹고 결국 파리 번데기 껍질에서 벗어납니다. (B) A. japonica 의 무성 균주(왼쪽)와 성성 균주(오른쪽)의 성충 말벌. 스케일 바, 1 mm. (C) 정상(1×) 및 효모 빈혈(0.1×) 조건에서 파리 또는 말벌의 출현률. 산란 후 4일째에 숙주 파리 유충을 대상으로 단일 산란 감염 검사(dAEL)를 수행하였다. n = 267마리(파리 1×), 120마리(파리 0.1×), 85마리(말벌 1×), 80마리(말벌 0.1×)입니다. (D) (C)에 나타난 두 가지 영양 조건 하에서 파리와 말벌의 폐쇄 시기. 성충과 번데기 비율이 표시되어 있습니다. n = 각각 250, 107, 61, 41. 검은 화살표는 말벌 감염 시기를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3. Nanoject III를 이용한 최적화된 RNAi 절차. (A) 입체현미경 하에서 미세주입 장치 설치. 유리 모세관 바늘은 한천판에 대해 30-45° 각도로 위치했습니다. (B) 유리 모세관 바늘의 끝을 바늘 연삭기를 사용해 갈았다. (C) 유리 모세관 바늘을 이용해 청색 염색 용액을 말벌 몸체에 미세하게 주입했습니다. 이미지에서 말벌의 앞쪽은 A로 표시되어 있습니다. P, 뒤측. 스케일 바, 1 mm. (D) GFP RNAi 및 IDDF-1 RNAi 말벌에서 IDDF-1의 발현 수준은 델타-델타 C_t 방법으로 정량하였다. 발현 수치는 RpL32-Aj로 정규화되었습니다. 데이터는 개별 데이터 포인트로 SD± 평균을 나타냅니다 (n = 5). P < 0.005 (학생 t-검정). (E와 F) GC3Ai 신호는 대조군(GFP RNAi)  또는 IDDF-1 RNAi 말벌과의 감염 후 6시간 후(hpi) 감염 후 감염되지 않은 유충과 숙주 유충의 날개 디스크에서 나타난다. 날개 원반은 핵의 DAPI 염색을 기반으로 흰색 점선으로 윤곽선이 그려져 있습니다(1:10000, 62247; 써모 피셔 사이언티픽). GC3Ai의 양성 면적과 날개 주머니 면적의 비율이 정량화되었다. P < 0.005 (일원 ANOVA 후 Tukey의 다중 비교 검정). n = 그룹당 11개의 생물학적 복제. 스케일 바, 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하세요.

구성 요소	양
물	1 L
아가르	5.5g
효모	40g
옥수수 가루	90g
포도당	100g
프로피온산	3 mL
70% EtOH에 10% 부틸 p-하이드록시벤조에이트	3.5 mL

표 1: 표준 옥수수 가루-효모-한천 배지(플라이 사료)의 구성 요소.

먹이 종류	상태	# 전체 개인들의	# 폐쇄되거나 사망한 개인들				파리 또는 말벌의 출현률 (%)
			비행기	말벌	번데기 치명적	유충 치명적
1×	감염되지 않은	267	248	0	2	17	92.88389513
	A. japonica 감염	120	0	98	9	13	81.66666667
0.1×	감염되지 않은	85	38	0	23	24	44.70588235
	A. japonica 감염	80	0	28	13	39	35

표 2: 정상(1배) 및 효모 빈(0.1배) 조건에서의 개체 수 및 출현률.

프라이머 명칭	연속 (5'>3')	목적
AjRpL32_qPCR_Fwd	CCCGTCACATGCTCTCTACT(CCCGTCACATGCTCTCTACT)	qRT-PCR
AjRpL32_qPCR_Rev	가트트가트카트카	qRT-PCR
qPCR_gene007424_Fwd	TGGGCAATGATTGTGTGTGAGT	qRT-PCR
qPCR_gene007424_Rev	GCGTCCCTGTATCGAAGGTA	qRT-PCR
Aj_gene007424_ex1_Fwd	ATGAGCATCAAGCAAGCAGTGCTAG	CDS 복제
Aj_gene007424_ex10_Rev	TCAGCACCTTCTACCCGGCAAATT	CDS 클로닝, dsRNA 템플릿
Aj_gene007424_RNAi_Fwd	가카카트태그	dsRNA 템플릿
T7_Aj_gene007424_ex10_Rev	GGATCCTAATACGACTCACTATATAGGT 카카크타크카카트	dsRNA 템플릿
T7_Aj_gene007424_ RNAi_Fwd	GGATCCTAATACGACTCACTATATAGGGAG 가가트가아카그트태그	dsRNA 템플릿
※ 이 프라이머와 dsRNA 템플릿은 Kamiyama 등에 보고되어 있습니다. 2022.
※ gene007424 는 IDDF-1의 약자입니다.

표 3: 본 연구에서 사용된 프라이머 및 dsRNA 템플릿 서열.

Discussion

본 연구에서는 분자 수준에서 기생독-숙주 상호작용을 조사할 수 있는 다목적 실험 플랫폼을 구축했습니다. 사육 조건 최적화, 단일 산란 감염 분석법, RNAi 프로토콜을 통해 기생충 유래 인자의 기능적 연구를 위한 견고한 시스템을 제공합니다. 이 플랫폼은 기생 말벌이 숙주 발달을 조작하는 메커니즘을 밝히는 향후 연구를 촉진하며, 생물학적 해충 방제 전략 개발에도 기여할 수 있습니다.

A. japonica의 Wolbachia에 감염된 TK 균주는 기생 분석을 위한 매우 재현성 높은 실험 시스템을 제공합니다. 많은 기생충-숙주 연구에서 실험 결과는 종종 변동적이며, 숙주 생존과 기생충 성공률은 환경적·생리학적 조건에 민감하게 좌우됩니다. 반면, TK 균주는 일관되게 높은 기생 성공률을 보여, 감염 결과가 대체로 균일한 '기생충 우성' 상태를 효과적으로 만듭니다. 더불어, 단위생식(partthenogenes) 균주로서 균일한 유전적 배경 덕분에 개체 간 실험적 변이를 줄인다. 이러한 재현성은 기생 과정을 신뢰성 있게 추적할 수 있게 하며, 숙주 반응과 기생충 유래 인자에 대한 정량적 분석을 용이하게 합니다.

또한, thelytokous 번식은 고품질 게놈 조립에 매우 중요한 매우 균일한 유전체 DNA 생성을 가능하게 하여 유전체 분석을 크게 용이하게^합니다. 이러한 단위생식계통이 모든 기생벌 종에서 존재하지는 않지만, 우리의 결과는 Wolbachia에 의해 유도된 thelytoky가 유전체 자원을 개선하는 전략으로서 잠재력을 강조합니다. 따라서 다른 기생독 종에 울바치아 감염 계통을 구축하는 것은 유전체 자원을 확장하고 기생벌 간 비교 분자 연구를 가속화하는 강력한 접근법이 될 수 있습니다.

기생 결과는 숙주의 영양 조건에 크게 영향을 받으며, 이는 사육 조건이 기생벌의 성공을 결정짓는 중요한 요인임을 시사합니다. 성공적인 기생은 숙주와 말벌의 발달과 정밀한 시간적 조율에 달려 있기 때문에, 통제되지 않은 영양 조건은 이 과정을 방해하고 재현성을 저해할 가능성이 큽니다. 따라서 기생충-숙주 상호작용을 연구할 신뢰할 수 있는 실험 시스템을 구축하기 위해서는 숙주 사육 조건의 신중한 표준화가 필수적입니다. 또한, 파리 재고 바이알은 말벌 재고 바이알과 별도로 보관해야 하며, 말벌의 존재는 파리 산란 행동을 감소시킵니다^20,21.

기생벌-숙주 상호작용의 정량적 평가를 가능하게 하기 위해, 각 숙주에 단 하나의 난자를 분주하는 단일 산란 감염 분석법을 고안했습니다. 이 분석은 여러 번의 산란 사건을 포함하는 기존의 대량 감염 검사와 대조적입니다. 제한된 시간(~15분) 내에 효율적인 산란을 촉진하기 위해, 새로 봉쇄된 말벌 성충은 포도당과 비타민 C 용액으로 사전 조건화하여 산란 효율과 전반적인 재현성을 향상시켰습니다.

더 나아가, 기생벌의 유전자 기능 분석을 위한 RNAi 프로토콜을 최적화했습니다. 마이크로인젝션 시스템을 사용하여 주입량을 정밀하게 조절하고 넉다운 효율의 일관성을 개선했습니다. IDDF-1을 이용한 기능 검증 결과, 이 방법이 유전자 발현을 효과적으로 억제하고 재현 가능한 표현형 결과를 산출한다는 것이 확인되었습니다. 전사체 및 단백질체 연구가 계속해서 많은 후보 독 인자를 식별하고 있는 만큼, 기능적 스크리닝 플랫폼의 가용성은 이들의 생물학적 역할을 규명하는 데 필수적입니다.

이 RNAi 프로토콜의 한계는 말벌 발달 초기 단계에서 기능하는 유전자를 분석하는 데 적합하지 않다는 점인데, 숙주 몸체 내에 존재하는 말벌 알에 dsRNA를 주입하는 것이 기술적으로 어렵기 때문입니다. 이를 극복하기 위해 체 외 사육 시스템을 구축하는 것이 유용한 접근법이 될 수 있습니다^. 또는 직접 부모(DIPA)-CRISPR를 이용한 유전자 노크아웃 접근법은 성체 암컷에게 시약을 주입하여 유전체 편집 자손을 생성하는 보완적 전략을 제공할 수^{있습니다.} 실제로 이 방법은 번데기 외부 기생충인 Nasonia vitripennis에서 성체 암컷이나 후기 번데기 단계^개체에 시약을 주입하여 유전자 결손 개체를 성공적으로 생성한 바 있습니다. RNAi 기반 유전자 녹다운 방법과 함께, 이러한 접근법은 기생 과정에 관여하는 유전자 기능에 대한 보다 포괄적인 분석을 촉진할 것입니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL tube	Greiner Bio-One	210261	감염 분석
1 mL 주사기	TERUMO	SS-01T	dsRNA 주입
아가르	Daisin, Ltd.	P-700	사육
Asnol Petri 접시 φ40×13.5mm	As One Corporation	1-8549-01	감염 분석
Asnol Petri 접시 φ55×17mm	As One Corporation	1-8549-02	dsRNA 주입
블루 염료(에리오글라우신 디소듐 염)	Sigma-Aldrich Co. Llc.	861146-25G	dsRNA 주입
부틸 p-하이드록시벤조에이트	Nacalai Tesque, Inc.	06327-15	사육
CO2 압력 조절기	YAMATOSANGYO	YR-507F-2	감염 분석
공간 레이저 스캐닝 현미경	Zeiss	LSM700	이미지 분석
옥수수 가루	Sunny Maize Co., Ltd.	No.4M	사육
DAPI	Thermo Fisher Scientific Inc.	PI62247	핵 염색, 1:10000
이온화된 물	Millipore Inc.	ZLXEV030WW	감염 분석
이중 단계 유리 마이크로파이펫 풀러	Narishige	PC-10	dsRNA 주입
Fiji	NA	https://fiji.sc	이미지 분석
필터 종이	Advantec	ITEM 526	사육
파리 먹이 용기	Chiyoda Science Co., Ltd.	KFB-3M	사육
파리 먹이 용기 플러그	Chiyoda Science Co., Ltd.	AS-275	사육
포초	Dumont Biologie	11252-20	해부
-20 °C 냉동고	Nihon Freezer	GS-3120HC	샘플 저장
-80 °C 냉동고	Nihon Freezer	CLN-52UD2	샘플 저장
유리 슬라이드	Matsunami Glass Ind., Ltd	S7213	감염 분석
글루코스	Showa Sangyo Co., Ltd.	사용할 수 없음	사육
KOD Plus Neo	Toyobo	KOD-401	dsRNA 합성
인큐베이터	Panasonic	MIR-254-PJ	사육
리게이션 하이 Ver.2	Toyobo	LGK-201	dsRNA 합성
마이크로파이펫 그라인더	Narishige	EG-401	dsRNA 주입
미네랄 오일	Nacalai Tesque, Inc.	23306-84	dsRNA 주입
Nanoject III	Drummond Scientific Company	3-000-207	dsRNA 주입
Nanoject 유리 모세관	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	dsRNA 주입
pBluescript KS (+) 플라스미드	사용할 수 없음	사용할 수 없음	dsRNA 합성
pBluescript SK (-) 플라스미드	사용할 수 없음	사용할 수 없음	dsRNA 합성
PrimeScript 역전사효소	Takara	2680A	dsRNA 합성
프로피온산	Nacalai Tesque, Inc.	29018-55	사육
PROWIPE	Daio Paper Corporation	2-2624-02	감염 분석, dsRNA 주입.
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover	Toyobo	FSQ-301	qRT-PCR
RNAiso Plus 시약	Takara	9108	qRT-PCR
소형 비알(12mL 시험관)	Sarstedt	REF 58.487	감염 분석
소형 비알 플러그	Chiyoda Science Co., ltd.	QD-S4	감염 분석
주걱	As One Corporation	6-522-02	사육
사각 페트리 접시	Eiken Chemical Co., Ltd.	64-2192-55, AW2000	dsRNA 주입
스테레오 현미경	Leica Microsystems	lvesta3 (C-Mount)	감염 분석
스테레오 현미경	Nikon Solutions Co., Ltd.	SMZ1000	dsRNA 주입
T7 RiboMAX Express RNAi 시스템	Promega	P1700	dsRNA 합성
Thermal Cycler Dice Real Time System	Takara	TP815	qRT-PCR
Thermal Cycler GeneAtlas	Astel	G02	dsRNA 합성, qRT-PCR
THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix	Toyobo	QPS-201	qRT-PCR
TissueLyser II	Qiagen	사용할 수 없음	qRT-PCR
비타민 C, L-아스코르브산	Nacalai Tesque, Inc.	03420-65	사육
Welch's 포도 100 주스	Asahi Soft drinks Co., Ltd.	32390	감염 분석
효모	Asahi Group Foods, Ltd.	HB-P02