전체 마운트 분석을 이용한 생쥐 후각 신경계 모델 내 In Vivo 조직 복잡성 보존을 통한 신경 재생 연구

요약

본 프로토콜은 생쥐 후각 신경계의 해부학적 복잡성을 보존하기 위한 전체 워크플로를 설명합니다. 여기에는 해부, 조직 준비 및 이미징을 포함한 전체 워크플로를 상세히 기술하였습니다. 이 프로토콜은 자연적 회복 상태를 포함하여, 정상 또는 비정상적인 조건에서의 후각계를 연구하는 데 사용될 수 있습니다.

초록

3차원(3D) 이미징 시대에 표준 면역조직화학법은 병리학 및 복잡한 인체 해부학 연구에 있어 매우 한계가 있는 것으로 인식되어 왔습니다. 좁은 단면만을 분석함으로써 더 큰 구조와 조직 구조의 필수적인 측면들이 중요한 맥락적 세부 사항을 잃을 수 있으며, 이는 불완전하거나 오해의 소지가 있는 해석으로 이어질 수 있습니다. 2차원(2D) 절편은 조직 구조에 대한 기본적인 이해를 돕긴 했으나, 생물학적 조직의 진정한 3차원적 실체를 포착하기에는 불충분합니다.

현재 여러 해부학적 영역에 걸친 점점 더 많은 연구에서 평면 표본(flat mount), 전장 표본(whole-mount) 또는 정면 표본(en face) 제작법과 같이 온전한 해부학적 단위를 분리하는 기술을 고해상도 형광 현미경법과 결합하여 채택하고 있습니다. 이러한 접근 방식은 구조적 조직에 대해 더욱 포괄적인 시각화와 해석을 가능하게 합니다. 이는 특히 후각 신경계에서 매우 중요한데, 후각 신경계의 놀라운 재생 능력의 기초가 되는 복잡한 세포 메커니즘을 정의하기 위해서는 전체 두께의 맥락이 필요하기 때문입니다. 얇은 절편으로는 명확히 정의되지 않은 핵심 병태생리학적 특징을 놓칠 위험이 있습니다.

이러한 한계점과 후각 재생을 유도하는 세포 간 상호작용에 관한 지식 공백을 고려할 때, 전체 두께의 조직 복잡성을 보존할 수 있는 정교한 whole-mount 기술을 개발하는 것이 필수적이었습니다. 최적화된 항체 침투 프로토콜과 함께 후각 점막 전체를 전층 샘플로 분리하였습니다. 고해상도 이미징(EVIDENT SpinSR)과 3D 재구성을 통해 in vivo에서의 세포 간 상호작용을 정확하게 시각화할 수 있었습니다.

서론

후각 신경계(ONS)는 평생 동안 신경세포 교체 능력을 유지한다는 점에서 신경 재생 메커니즘을 연구하기 위한 독특하고 잘 확립된 모델입니다¹. 하지만 후각 시스템 내 세포들의 행동에 대한 이해가 부족하여, 이러한 신경 수복 능력을 임상적으로 적용하는 가능성은 여전히 제한적입니다^2,3,4. 일차 후각 신경세포, 후각초세포(OECs) 및 신경주위 섬유아세포를 포함한 ONS의 세포 반응과 해부학적 구조는 설치류 ONS에 적용된 심각한 물리적 손상 모델과 초박절(<2 µm) 조직 절편법을 이용한 여러 동물 연구에서 설명되었습니다^1,2. 이러한 연구들의 동물들은 대개 손상 후 10일에 안락사되었으며, 이는 신경 손상 동안 발생하는 광범위하고 복잡한 조직 리모델링 과정 중 단 한 번의 특정 시점만을 보여주는 좁은 관찰 창을 제공할 뿐이었습니다². 해당 연구들은 축삭 사멸 후 OECs와 섬유아세포가 손상 부위를 따라 연속적인 통로 형태로 유지된다고 보고하였습니다.

위에서 설명한 여러 제한 사항으로 인해, 활용된 접근 방식은 정보 제공 측면에서는 유용하였으나 ONS의 표면적인 수준에서 저해상도의 개념적 개요만을 제공하였으며, 결과적으로 온전한 ONS 내의 실제 세포 조직에 대한 종합적인 평가를 가로막았습니다³. 그 결과, 중요한 공간적 관계가 간과되었을 가능성이 있습니다.

3차원 조직 구조의 보존은 정확한 해부학적 및 세포 분석을 위해 필수적이며, 여러 장기와 병리 상태 전반에 걸쳐 성공적으로 적용되어 왔습니다^{4,5,6,7,8,9,10,11,12}. 후각 점막 내의 신경 조직 구성을 매핑하기 위해 전장 표본(whole-mount) 접근법이 사용되어 왔으나^13,14, 보존된 고유층(lamina propria)을 포함하여 전체 두께의 ONS 구조와 세포 간의 상호작용을 시각화한 연구는 아직 이루어지지 않았습니다.

본 연구에서는 전장 조직 처리, 면역 염색, 고해상도 이미징 및 3차원 재구성을 이용한 마우스 모델 워크플로우를 구축하여 후각 신경계(ONS) 구조의 세밀한 분석을 가능하게 합니다. 본 프로토콜은 기존에 발표된 방법들의 공백을 메우기 위해 개발되었으며, 고유판(lamina propria)을 포함한 전층 후각 점막을 보존 및 유지함으로써 세포 간 상호작용 연구를 가능하게 합니다. 특히, 이렇게 정교해진 조직 수집 및 처리 방법론은 다양한 후각 시스템 모델에 적용 및 결합될 수 있습니다.

프로토콜

동물 및 형질전환 세포를 포함하는 모든 실험은 호주 연방 유전자 기술 규제 기관(OGTR)의 가이드라인에 따라 그리피스 대학교 생물안전위원회(NLRD/003/2020_var3) 및 그리피스 대학교 동물윤리위원회(MHIQ/04/23/AEC)의 승인을 받아 수행되었습니다.

참고: 본 연구에는 양성 및 음성 모두를 포함하여 총 15마리의 성체 실험용 마우스(8–9주령)가 사용되었습니다. 구체적으로, 모든 OEC가 S100β 프로모터의 제어 하에 밝은 적색 단백질인 DsRed를 발현하는 S100β-DsRed 형질전환 마우스를 사용하였습니다. S100β는 더 넓은 칼슘 결합 단백질 가족의 일부이며, OEC와 같이 중추신경계의 글리아 세포에서 일반적으로 발현됩니다. 이 모델은 내인성 형광 신호를 사용하여 표적 세포 집단을 쉽게 국소화할 수 있어 본 실험의 목적에 최적화되었습니다. S100β-DsRed 형질전환 마우스는 이전에 제작되었으며, 이러한 형질전환 마우스를 사용하는 것이 고정 조직 분석을 위한 면역조직화학법에 비해 OEC 검출 능력을 향상시키는 것으로 나타났습니다^15,16,17,18.

1. 머리 수집 및 조직 고정

1. 실험 시점에 맞춰 CO₂ 흡입법으로 동물을 안락사시킵니다.
2. 각막 및 발제 반사가 없는 것으로 사망을 확인한 후, 경추 탈구를 실시하거나 승인된 표준작업지침서(SOP)에 따라 처리합니다.
3. 가위를 사용하여 머리 전체와 턱을 제거합니다.
4. 두개골에서 피부를 제거하고 코끝의 연골을 제거하여 비강을 노출시키고 고정제가 효율적으로 침투할 수 있도록 합니다.
   참고: 동물의 코 연골 최전방 부분을 절개하는 이 단계는 비강 내 조직의 적절한 고정을 위해 매우 중요한 것으로 관찰되었습니다.
5. 머리를 PBS 1×로 빠르게 헹구어 과도한 혈액을 제거합니다.
6. 4 °C의 롤러 위에서 4% 파라포름알데히드에 12–18시간 동안(최소 6시간 이상, 대상 조직이 고정되기에 충분한 시간) 침전시켜 조직을 고정합니다.
   주의: 파라포름알데히드는 포름알데히드 증기를 방출하는 유해 화학 물질입니다. 흡입, 피부 접촉 및 섭취 시 독성이 있으며, 눈, 피부 및 호흡기 자극을 유발하고 발암 가능성이 있는 물질입니다. 장갑, 실험복 및 보안경을 포함한 적절한 개인보호구(PPE)를 착용하고 흄 후드 내에서만 취급하십시오. 프로토콜 과정에서 발생한 유해 화학 물질 및 생물학적 폐기물은 기관 및 지역 규정에 따라 안전하게 폐기해야 합니다.
   ​참고: 최적화 과정에서 6시간이면 대상 조직을 고정하기에 충분함을 확인했으나, 12시간 이상 고정할 경우 과고정으로 인해 점막 구조가 손상될 가능성이 높았습니다.
7. 머리를 고정제에서 꺼내어 실온(20–25 °C)의 롤러 위에서 PBS 1×로 3시간 동안 세척합니다.
8. 머리를 신선한 PBS에 담아 4 °C에 보관하고 48시간 이내에 전체 마운트 점막 조직을 수집합니다.

2. 전장 조직 수집

1. 현미경 하에서 조직 분리를 수행하십시오.
2. 메스를 사용하여 정중시상선을 따라 머리를 반으로 절단하십시오.
3. 비강 내부를 노출시킵니다 (그림 1). 해부학적 부위를 확인하고 전체 해부학적 단면을 이루는 점막 조직을 수집합니다 (그림 1B).
4. 골절단기를 사용하여 점막강의 일부를 덮고 있는 비중격골을 조심스럽게 절단하여 제거합니다.
   참고: 다음을 확인하십시오. 그림 2A이 단계는 등쪽 벽을 통해 축삭 다발이 지나가는 뼈 아래의 오목한 공동(concave cavity)을 노출시키는 데 매우 중요합니다.그림 1B).
5. 해당 부위가 노출되면, 곡선 핀셋을 사용하여 오목한 등쪽 벽에서 조직을 조심스럽게 분리하여 걷어냅니다. 하부의 뼈로부터 조직을 들어 올리고, 남은 후각점막을 부드럽게 벗겨내어 손상되지 않은 전장 표본(whole-mount preparation)을 수집합니다.
   참고: 조직이 찢어지는 것을 방지하기 위해 이 단계에서는 각별한 주의가 필요했습니다.
6. 양측 콧구멍에서 관심 조직을 수집하십시오. 점막은 비중격, 좌우 배측 벽, 그리고 비강의 사골판을 덮고 있습니다.그림 1A, B)비중격, 배측벽 및 체판을 포함하여 양쪽 콧구멍에서 조직을 채취하여 일차 후각 구조가 포함된 해부학적 영역을 분리합니다.그림 2C).
7. 수집한 조직을 1× PBS로 세척하고 골편을 포함하여 불필요한 조직을 제거한다. 향후 면역조직화학 분석을 위해 조직을 1× PBS에 담아 4 °C에서 보관한다.
   참고: 조직을 장기간 보관해야 하는 경우, 1× PBS와 0.001%(W/V) Sodium Azide 용액에 넣어 4 °C에서 보관하는 것이 권장됩니다.

3. 최적화된 염색 프로토콜

참고: 일반적으로 사용되는 염색 프로토콜은 보통 얇거나 중간 두께의 절편(예: 최대 50 µm)에 최적화되어 있습니다. 따라서 훨씬 더 두꺼운 조직에 맞게 프로토콜을 조정해야 했습니다.
​중요한 단계는 전체 염색 과정 동안 조직을 Eppendorf 튜브 내에 띄워 두고, 시약이 침투하는 동안 튜브를 롤러 위에 올려두는 것이었습니다. 따라서 조직을 이미지 슬라이드 위에 놓은 상태로 염색 단계를 수행하지 않았습니다. 조직을 먼저 띄운 상태에서 염색한 후, 이후에 이미지 슬라이드에 마운팅하였습니다. 이러한 세부 사항을 통해 조직이 접히지 않도록 하였으며, 시약과 항체가 전체 영역에 침투할 수 있도록 하였습니다.

1. 보관 중인 조직을 꺼내 블로킹 용액(사용 용액은 염색법에 따라 다름)이 들어있는 Eppendorf 튜브에 넣습니다.
   ​참고: 블로킹 용액: PBS 내 3% BSA, 0.3% Triton X-100. 또 다른 중요한 조정 사항은 조직이 각 시약 및 항체 칵테일에 노출되는 시간이었습니다.
2. 조직을 블로킹 용액에 넣고 상온의 롤러 위에서 3시간 동안 유지합니다.
   참고: 표준 박절 조직 면역염색법과 비교하여 노출 시간을 늘릴 경우, 선택된 항체 및 염색 시약(Table 1)의 농도를 높일 필요가 없음을 확인하였습니다. 이는 고가의 항체 시약 사용량을 최소화하는 효과도 있었습니다. 배양은 롤러 위에서 구를 수 있도록 뚜껑 고정 장치를 제거한 1.5 mL Eppendorf 튜브에서 진행합니다. 시약의 부피는 500 µL였습니다.
3. 1차 항체와 함께 4°C의 롤러 위에서 72시간 동안 배양합니다.
4. 상온의 롤러 위에서 PBS 1×를 사용하여 조직을 2회 세척합니다(회당 1.5시간).
5. 2차 항체(알루미늄 호일로 감쌈) 및 핵 염색 시약과 함께 조직을 상온의 롤러 위에서 최소 4시간 동안 먼저 배양한 후, 4°C의 롤러 위로 옮겨 하룻밤(12–18시간) 동안 배양합니다.
6. 상온의 롤러 위에서 PBS 1×를 사용하여 조직을 2회 세척합니다(회당 1.5시간).

4. 슬라이드 준비

1. 에펜도르프 튜브에서 조직을 조심스럽게 꺼냅니다.
2. 현미경 하에서 조직을 슬라이드 위에 올리고 조직에 접힌 부분이 없는지 확인합니다.
   참고: 형광 표지 없이도 현미경으로 조직의 방향을 식별할 수 있습니다. 점막 조직의 고유층(lamina propria) 쪽이 슬라이드에 닿게 하여, 상피(epithelium)는 유리 슬라이드 쪽을 향하고 고유층은 커버슬립 쪽을 향하도록 배치해야 합니다. 고유층은 염색 없이도 보이는 굵은 신경 다발의 존재로 식별할 수 있습니다. 고유층이 커버슬립 쪽을 향하고 상피 쪽이 슬라이드 유리에 닿도록 방향을 잡으면 염색 및 이미징 과정이 수월해집니다.
3. 형광 마운팅 용액을 사용하여 커버슬립을 덮고 슬라이드를 밀봉합니다.
4. 슬라이드는 실온의 어두운 곳에서 하룻밤(12–18 h) 동안 건조시킨 후 4 °C에서 보관할 수 있습니다.

5. 이미지 획득 및 후처리

1. 저배율 면역형광 이미지 획득
   1. 선형 알파 블렌딩(linear alpha-blending)을 사용하여 이미지 획득 중 자동 스티칭을 수행한다.
      ​참고: 조직 부피를 완전히 포함하도록 시료의 두께에 따라 z-스택 프레임 수를 조정해야 한다.
   2. 15%의 중첩 구간을 두고 인접한 시야를 캡처한다. meandering 획득 패턴을 사용하여 타일 이미지를 획득한다.
   3. 조직 두께에 따라 광학 절편의 총 수를 조정한다.
   4. 이미지 캘리브레이션을 X축과 Y축 모두 215.594 nm/pixel로 설정한다. z-스텝 크기를 0.8 µm로 하여 z-스택으로 이미지를 획득한다.
   5. 마운팅된 전장 조직(whole-mount tissue)을 공초점 현미경 스테이지 위에 놓는다. 30x 대물렌즈(NA 1.04)를 사용하여 개요 이미지를 획득한다.
2. 고배율 면역형광 이미지 획득
   1. 60× 대물렌즈(NA 1.5)를 사용하여 상세 이미지를 획득한다. 이미지 캘리브레이션을 X축과 Y축 모두 107.923 nm/pixel로 설정한다. z-스텝 크기를 0.41 µm로 하여 z-스택 이미지를 획득한다.
   2. 조직 두께에 따라 광학 절편의 총 수를 조정한다. 그리고 단일 시야에서 이미지를 캡처한다.
      ​참고: 60× 획득의 경우 각 데이터 세트가 단일 시야로 구성되므로 이미지 스티칭이 필요하지 않다.
3. 조직학적 참조 이미지 획득
   1. 명시야 조명 하에 슬라이드 스캐닝 현미경을 사용하여 HE 염색된 생쥐 머리 정중단면(mid-sagittal) 섹션을 촬영한다.
   2. 40× 대물렌즈(NA 0.95)와 0.63x 카메라 배율을 사용하여 이미지를 획득하며, 이를 통해 25.2×의 유효 배율을 얻는다.
   3. X축과 Y축 모두 픽셀 캘리브레이션이 136.905 nm/pixel인지 확인한다. 그리고 이미지를 단일 초점 평면으로 획득한다.
   4. meander 획득 패턴과 선형 알파 블렌딩을 사용하여 타일 이미지를 자동으로 스티칭한다.
4. 개요 면역형광 참조 이미지 획득
   1. 10x 대물렌즈를 사용하여 상보적인 개요 면역형광 이미지를 획득한다.
   2. 이미지 획득 중 타일 중첩을 0%로 설정하여 시료를 단일 z-슬라이스로 캡처한다.
   3. 이미지 캘리브레이션을 X축과 Y축 모두 647.249 nm/pixel로 설정한다. 그리고 관심 있는 전체 해부학적 영역을 포함하는 개요 이미지를 생성한다.
5. 이미지 처리 및 최종 피규어 생성
   1. 획득한 이미지 데이터 세트를 이미지 분석 소프트웨어로 내보낸다. z-스택 데이터 세트로부터 최대 강도 투영(MIP) 이미지를 생성한다.
   2. 후속 분석 및 피규어 제작을 위한 관심 영역(ROI)을 선택한다.
   3. 개요 면역형광 이미지와 이에 대응하는 HE 이미지를 결합하여 해부학적 참조 피규어를 생성한다. 그런 다음, 피규어 제작 전 형광 및 조직학적 데이터 세트 간의 정렬과 해부학적 대응 관계를 검증한다.
      참고: 모든 이미지 스티칭은 미리 설정된 현미경 설정을 통해 이미지 획득 중에 자동으로 수행되어야 하며, 추가적인 후처리가 필요하지 않아야 한다. 본 실험의 경우, Imaris 소프트웨어를 사용하여 3D 렌더링을 생성하였다. 각 획득 채널의 임계 강도(threshold intensity)를 기반으로 하는 표면 렌더링(surface rendering) 플러그인을 사용하여 3D 재구성물을 제작하였다. 최종적으로, 최종 이미지는 Adobe Illustrator에서 편집되었다.

결과

본 연구에서 제시하는 전장 표본(whole-mount) 접근법을 통해 후각 점막 전체를 분리하고 보존할 수 있었습니다. 본 연구의 목적은 거시적(전체 해부학적 관점) 및 미시적(세포 수준) 규모 모두에서 세포 및 해부학적 변화를 이해하는 것이었습니다.

전장 표본(whole-mount) 접근법을 통해 상피 및 고유층 구획을 모두 수집하고, 우리가 관심 대상으로 하는 세포인 축삭 다발, 후각초세포(OECs) 및 섬유아세포 사이의 공간적 관계를 보존할 수 있습니다. 이러한 접근법을 통해 점막 조직의 전체 두께와 넓은 표면적을 포착하는 대규모의 연속적인 데이터 세트를 확보할 수 있었으며(그림 3), 복잡한 세포 구조와 상호작용의 세부 사항(그림 3), 그리고 이러한 요소들이 정상 상태(n = 3) (그림 3A, B)와 손상된 상태(n = 12) (그림 3C, D) 사이에서 어떻게 변화하는지 파악할 수 있었습니다.

최적화된 조직 처리 및 염색 절차를 고해상도 공초점 현미경과 결합함으로써, 우리는 조직의 전체 깊이에 걸쳐 세포 수준의 매우 정밀한 세부 사항이 포함된 더 넓은 점막 영역의 이미지를 얻을 수 있었습니다. 인접한 여러 영역에 걸친 Z-stack 획득을 통해 해상도나 신호 무결성을 손상시키지 않고 확장된 해부학적 도메인을 재구성할 수 있었습니다(그림 4A–F). 이러한 고해상도 세포 세부 정보를 바탕으로, 우리는 획득한 전체 조직 두께의 Z-stack(그림 4G)을 사용하여 렌더링 이미지(그림 4H)를 구현함으로써 조직의 미세 구조를 더욱 깊이 이해할 수 있었습니다.

형광 표지 없이도 마운팅 및 이미징 전 조직의 방향을 일관되게 신뢰할 수 있는 수준으로 결정할 수 있었습니다. 고유판(lamina propria) 측은 상피층과 명확히 구분되는 두꺼운 신경 다발의 존재를 통해 명시야 현미경 하에서 쉽게 식별 가능했습니다. 고유판을 커버슬립에 인접하게 배치하고 상피 표면이 유리 슬라이드에 닿도록 샘플 방향을 표준화함으로써, 샘플 간 이미징 일관성을 높이고 후속 3차원 재구성을 용이하게 했습니다. 항체 침투 정도는 조직 두께 전체에서 관찰되는 관련 신호를 분석하여 결정할 수 있습니다. 이는 일반적으로 신호가 완전히 없거나, 조직 깊숙이 들어갈수록 신호가 점진적으로 감소하는 양상을 통해 확인됩니다.

Imaris를 이용한 3차원 렌더링을 통해 손상되지 않은 점막 내의 복잡한 세포 네트워크와 축삭 조직을 명확하게 시각화할 수 있었습니다. 채널별 강도 임계값 설정을 통해 적용된 표면 기반 렌더링은 미세한 구조적 세부 사항을 유지하면서 조직 구조의 정확한 3D 표현을 생성하였습니다.

염색 및 시각화의 경우, 조직 전체 두께에 걸쳐 신호의 비정상적인 손실이나 저하 없이 표적 염색 신호가 명확하게 시각화되는 것이 기대 결과입니다. 현미경 관찰 시 알려진 염색 표적을 시각화할 수 없다면 이는 실패한 결과로 간주해야 합니다.

그림 1. 점막 전층 표본 조직이 오버레이된 해부학적 부위의 표현. (A–C). 마우스 왼쪽 콧구멍 내부의 시상면 뷰(Hematoxylin and Eosin, HE 염색)(A)와 동일 부위에서 얻은 점막 전층 염색 이미지(해부학적 방향 확인용)가 오버레이된 모습(B)으로, 녹색의 축삭 다발과 청색의 세포핵을 통해 방향과 위치를 나타낸다. 이 기법은 전체 해부학적 구조의 보존을 가능하게 하여, 일차 후각신경(ON) 및 부후각신경(vomeronasal nerves, VNN) 축삭 다발을 명확히 구분할 수 있게 하며, 비중격에서 사판(B, C)을 거쳐 후각구(OB)로 이어지는 경로를 추적할 수 있게 한다. 여기에 표시된 조직은 핵(청색)을 위해 Hoechst로, 축삭 다발(녹색)을 위해 β-III-Tubulin으로 염색되었다. n = 15개의 독립적인 표본에서 얻은 대표 이미지이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2. 후각계의 거시적 및 도식적 뷰. (A) 본 절단기를 사용하여 빨간색 점선을 따라 비중격골(노란색 영역)을 제거합니다. (B) 하단의 오목한 비강(갈색)이 노출되면, 이 영역에서 호흡 및 후각 점막으로 확장되는 모든 점막 조직을 수집할 수 있습니다. (C) 후각 상피에서 후각구까지 이어지는 이러한 구조들의 연속성을 보여주는 도식적 표현입니다. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.

그림 3. 전체 마운트 수집 및 염색 프로토콜을 통해 얻은 해부학적 영역의 확장 뷰. (A–D). 정상 및 손상된 점막의 대표 이미지를 보여준다. 위에서 아래로, 정상 조직(n = 3)의 온전한 점막과 손상된 점막(n = 12)을 나타낸다. 정상 조직(A)에서 길쭉한 양극성 형태를 가진 OEC(A, 왼쪽)가 축삭 다발을 감싸고 있으며(A, 중간), 섬유아세포가 이러한 터널 구조의 외층을 형성한다(A, 오른쪽, 흰색 화살표). 선택된 세 개의 ROI가 이러한 세부 사항을 반영한다(B). 손상된 점막에서 OEC는 양극성 및 원형 형태를 모두 나타낸다(C, D, 왼쪽, 흰색 화살표). 축삭 다발은 덜 균일하고 덜 견고하게 보인다(C, D, 중간, 흰색 화살표). 섬유아세포는 전체 영역에 걸쳐 광범위하게 분포된 것으로 보인다(C, D, 오른쪽, 흰색 화살표). 스케일 바 = 100 µm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.

그림 4. 점막 전체 마운트의 3차원 형광 이미지. (A–H). SpinSR 현미경을 사용하여 여러 연속된 영역의 이미지 스택으로부터 세포의 저배율 이미지(A–F)와 고배율 이미지(G)를 얻었다. 후각초세포(OECs)는 빨간색, 섬유아세포는 마젠타색, 축삭은 녹색, 핵은 파란색으로 표시되었다. 화살표는 서로 다른 OEC 형태(A)와 축삭 다발 주변의 섬유아세포 외층(B 및 C)을 나타낸다. D–F의 화살표는 섬유아세포의 건강한 구조적 유사성을 강조한다. 이 이미지들은 세포 구성 요소의 공간적 조직을 보여주며, 이후 Imaris 소프트웨어를 사용하여 렌더링하였다(H). 스케일 바 = 50 µm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

시약	표적	희석 배수	배양 조건	근거
1차 항체
β-III-Tubulin (Rabbit)	축삭	1:300	롤러 위에서 4 °C로 72 h 동안	전 층에 걸친 충분한 침투를 위함
PDGFR-β (Rat)	섬유아세포	1:100
2차 항체
Alexa 488	Rabbit 1차 항체	1:250	알루미늄 호일로 감싼 후, 롤러 위에서 실온으로 최소 4 h 동안, 이어서 4 °C에서 하룻밤 동안 배양	알루미늄 호일은 광퇴색을 방지하며, 배양 시간, 온도 및 롤러에 의한 교반은 양호한 침투를 가능하게 함
Alexa 647	Rat 1차 항체	1:500
핵
Hoechst	세포핵	1:2500

표 1: 본 프로토콜에 최적화된 희석 배율의 항체 목록. 이 표에는 염색 시약과 해당 표적, 희석 배율 및 배양 조건의 근거가 나열되어 있습니다.

토론

지난 수십 년 동안 과학 분야에서 많은 혁신적인 접근 방식이 개발됨에 따라 3차원 시대가 서서히 시작되었습니다. 예를 들어, 고해상도 형광 현미경과 결합된 복잡한 전장 표본(whole‑mount) 이미징 방법의 개발로 가능해진 3차원 재구성 접근 방식은 여러 전층 조직의 조직 구조를 더 잘 이해하는 데 기여했습니다. 이러한 3차원 렌더링 접근 방식은 혈관, 샘, 일반적인 종양과 같은 여러 인체 구조를 정의하는 데 사용되어 왔습니다^4,5,6,7,8,9. 또한, 예를 들어 마우스 뇌 전체에서 병적 구조와 정상 구조 사이의 차이에 대한 정보가 수집되었습니다^10,11,12. 이러한 접근 방식은 다양한 생물학적 시스템을 더 잘 이해하기 위한 결정적인 단계로 확인되었으며, 세포 회로와 그 구조적 및 기능적 공간 조직, 그리고 이것들이 인체 병리에 잠재적으로 기여하는 바에 대한 더 깊은 이해를 가능하게 합니다.

3차원 조직 재구성 및 이미징의 다양한 조합에서 발생하는 단점은 대부분의 접근 방식에 조직 투명화 단계가 포함된다는 점입니다. 이 방법은 많은 조직에 유용하지만, 모든 조직 유형에 적합한 것은 아닙니다^8,9,19. 실제로 투명화 과정에는 여러 번의 세척 단계가 포함되어 있어, 표적 에피토프를 잠재적으로 손상시키고 내인성 신호에 영향을 줄 수 있습니다²⁰.

위에서 설명한 접근법들은 다양한 시스템 내의 많은 중요한 세포 구조를 정의하는 데 사용되어 왔습니다. 하지만 후각 시스템과 그 관심 구조들은 쉽게 분리해낼 수 있는 골격 성분이 거의 없으므로, 최근 몇 년 동안 투명화 단계가 포함되지 않은 whole-mount 접근법들이 시도되었습니다^13,14.

이 연구들은 후각 계통 내 신경 구조의 조직 구성을 더욱 정밀하게 정의하는 것의 중요성을 인식하였습니다. 이에 따라, 주요 목적은 다양한 마커의 발현을 기반으로 후각 감각 신경세포 분포의 명확한 지형학적 지도를 제공하는 것과¹⁴ 이들의 특이한 섬모에 대한 새로운 통찰을 제시하는 것이었습니다¹³.

여기서 개발하고 제시한 전층 표본(whole‑mount) 기술은 점막 조직 전체를 수집하고 보존할 수 있게 하여, 본 연구의 핵심 초점인 OEC, 섬유아세포 및 축삭 다발 간의 관계를 중심으로 이 환경의 해부학적 및 생리학적 구조에 대한 중요한 통찰을 얻을 수 있는 가능성을 열어줍니다. 이 정밀한 분리 및 염색 기술을 고해상도 공초점 이미징과 결합함으로써 표적 영역 전체의 구조와 그 안에 상주하는 세포들을 반영하는 대형 이미지를 수집할 수 있었습니다. 구체적으로, 본 정밀 기술은 두 가지 뚜렷한 장점을 제공하는데, 고유판(lamina propria) 구조를 포함하여 점막 전체를 채취하고 처리할 수 있다는 점¹³과, 다른 평면 표본(flat-mount) 프로토콜¹⁴에 비해 더 완만하게 조직을 준비하는 방법이 거시적 해부 구조뿐만 아니라 세포 간 상호작용(후각초세포, 축삭 및 섬유아세포 등)을 보존하는 데 도움이 된다는 점입니다. 이것이 또한 본 프로토콜에서 박절 염색(thin section staining)과의 검증 과정을 포함하지 않은 이유이기도 합니다.

앞서 언급했듯이, 전체 마운트(whole-mount) 기법은 대개 긴 조직 처리 기간과 특정한 고가의 시약 사용을 필요로 합니다. 본 방법은 처리 시간과 주요 세포 구조의 손상 위험을 모두 최소화하기 위해 조직 처리 과정을 최소화하는 데 중점을 두어 개발되었습니다. 따라서 최적화된 이 방법은 박절편 면역조직화학 염색에 흔히 사용되는 시약들을 이용해 수행할 수 있는 신속한 프로세스를 나타내며, 처리 시간이 오래 걸리거나 점막 조직과 같은 뼈가 없는 구조에 적합하지 않은 접근 방식에 대한 유효한 대안을 제공합니다.

이미지 획득 및 후처리는 두꺼운 조직 샘플에서 고해상도 z-stack을 획득할 수 있고, 관심 있는 점막층을 투과하여 이미징할 수 있는 충분한 레이저 침투 능력을 갖춘 모든 컨포컬 현미경 플랫폼을 사용하여 수행할 수 있습니다(이미지 획득 및 처리 설정에 대한 자세한 내용은 방법 섹션을 참조하십시오).

적절한 수정을 거치면, 본 프로토콜을 다른 일반적인 설치류 모델로 변환하여 적용할 수 있을 것으로 생각됩니다. 조직 특이적인 수정을 통해, 호흡기 및 위장관(GIT)의 점막 및 점막하 조직 연구, 신경계 내의 조직 구성 및 다계통 상호작용 조사, 염증 과정 및 점막 관련 림프 조직(MALTs) 분석, 그리고 장-뇌 축과 같은 다양한 다계통 축의 탐구 등 여러 가지 다른 상황에 이 방법을 적용할 수 있습니다.

본 프로토콜의 주요 강점은 조직의 무결성을 유지하면서 고품질의 3차원 이미징을 가능하게 하는 방법론적 개선에 있으며, 이와 동시에 이전에 해당 분야에서 시도되었던 다른 전장 표본(whole-mount) 방법론들과 비교하여 상대적으로 빠른 접근 방식을 보장한다는 점에 있습니다.

이 접근 방식의 성공적인 구현은 관심 조직에 대한 깊은 해부학적 이해에 크게 의존했습니다. 실제로 본 사례에서는 두개골 내부가 노출된 후 채취 과정의 침습성을 최소화하기 위해 축삭 다발(axon bundles)의 예상 위치를 아는 것이 필수적이었습니다. 이러한 해부학적 지식은 관심 영역과 조직을 신속하게 국소화하고 점막의 전반적인 구조를 보존하는 데 매우 중요했으며, 이는 성공적인 조직 처리가 단순한 후처리 단계보다는 정보에 기반한 채취 전략과 본질적으로 연결되어 있음을 강조합니다.

방법 섹션의 여러 참고 사항에서 언급했듯이, 본 방법의 개발 및 최적화를 위해서는 여러 기술적 조정이 매우 중요했습니다. 전체 염색 과정 동안 조직이 Eppendorf tube 내에서 자유롭게 떠 있게 유지하고, 시약 및 항체 배양 중에 지속적으로 회전시킨 것은 기존의 정적인 whole‑mount 및 박절 프로토콜과 차별화되는 핵심 단계였습니다. 이러한 개선을 통해 조직의 접힘을 방지하는 동시에 샘플 전체에 걸쳐 시약이 균일하게 침투하도록 하여, 불필요한 투명화 단계 없이도 염색의 일관성을 향상시킬 수 있었습니다. 또한, 각 시약 및 항체 칵테일의 배양 시간을 세밀하게 최적화하는 것이 필수적임이 입증되었습니다. 이 마지막 단계는 선택한 항체의 종류에 따라 추가적인 조정이 필요할 수 있습니다.

종합적으로, 이러한 특정 요인들은 전반적인 처리 시간을 단축하고 시료 취급상의 무리를 줄임으로써 재현성을 향상시켰습니다.

또 다른 중요한 방법론적 단계는 형광 표지 없이도 마운팅 및 이미징 전에 조직의 방향을 안정적으로 결정하는 능력이었습니다. 점막 조직의 lamina propria 측은 주변 상피 조직과 명확히 구별되는 두꺼운 신경 다발의 존재를 통해 명시야 현미경 하에서 쉽게 식별할 수 있었습니다. lamina propria가 커버슬립 쪽을 향하고 상피층이 유리 슬라이드 위에 놓이도록 샘플 방향을 표준화하는 것이 이미지 획득 품질을 향상시키는 것으로 나타났습니다. 이러한 간단하지만 효과적인 개선을 통해 샘플 간 이미징 일관성이 향상되었으며, 결과적으로 획득한 3차원 재구성의 품질을 높일 수 있었습니다.

하지만 고려해야 할 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 본 프로토콜은 많은 일반적인 마우스 계통이나 다른 설치류 종에 대해 테스트되지 않았습니다. 마찬가지로, 최적화는 위에서 설명한 특정 실험 조건과 나열된 항체 패널만으로 수행되었습니다. 본 프로토콜이 대부분의 마우스 및 랫 계통, 여러 다양한 항체, 그리고 점막을 전층으로 채취할 수 있는 모든 실험 모델에서 작동해야 하지만, 추가적인 세심한 최적화가 필요할 수 있습니다. 또 다른 주목할 만한 제한 사항은, 각 절편을 개별 항체 패널로 염색할 수 있어 얇게 절편화된 조직에서는 여러 다른 항체 패널을 테스트할 수 있는 것과 달리, 단일 전장 표본(whole-mount) 절편으로는 하나의 항체 패널만 염색할 수 있다는 점입니다.

전반적으로, 이러한 방법론적 혁신은 조직 처리, 염색 조건 및 시료 방향의 비교적 간단한 조정을 통해 전체 마운트 이미징(whole‑mount imaging) 결과를 상당히 개선할 수 있음을 보여줍니다. 광범위한 조직 처리 및 투명화 단계를 피함으로써, 이 접근법은 정밀하고 대규모인 3차원 데이터 획득을 가능하게 하면서도 취약한 무골 조직 연구를 위한 실용적이고 유연한 대안을 제공합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
소 혈청 알부민 (BSA)	Sigma-Aldrich	A3294-50G	면역조직화학염색
Adobe Illustrator		version 28.5
Anti-beta III Tubulin 항체 - 신경세포 마커	Abcam	ab18207
Anti-PDGFR beta 항체 [APB5]	Abcam	ab91066
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride	Sigma Aldrich	14533
커버슬립 24X50MM NO. 1.5 100PCS	Bio-strategy	EPBRCS245015GP	면역조직화학염색
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) 고교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluo 488	Thermo Fisher	A-21206
Dumont #15A 골 절단기 - 에폭시 코팅	Daniels Health Laboratory Products P/L	11215-02	조직 박리
Dumont #7 핀셋 - Biologie/Dumostar	Daniels Health Laboratory Products P/L	11297-10	조직 박리
Goat anti-Rat IgG (H+L) 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor™ 647	Thermo Fisher	A-21247
Imaris 소프트웨어	Imaris	version 9.5.0	이미징
Mayo 박리 가위	ProSciTech	420SS	조직 박리
파라포름알데히드	Sigma-Aldrich	P6148-500G	조직 처리
인산염 완충 식염수, 멸균 PBS 정제 (PBS)	Thermo Fisher Scientific	18912014	조직 처리
ProLong Glass 항퇴색 마운팅 용액	Thermo Fisher Scientific	P36980	면역조직화학염색
메스 날 #23	Scalpel Blades Swann Morton	COS240B	조직 박리
메스 핸들 #4	ProSciTech	T134	조직 박리
아지드화 나트륨	Sigma-Aldrich	S2002-25G	조직 처리
수크로스	Chem-Supply	57-50-1	조직 처리
TOMO Adhesion 현미경 슬라이드	ProSciTech	GEMS63705-09	면역조직화학염색
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100mL	면역조직화학염색