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방법 논문

약물 전달 연구를 위한 BBB-교모세포종 미세유체 칩 내 초음파 제어 혈뇌장벽(BBB) 개방

184 조회수

⸱

DOI:

10.3791/72041

⸱

2026년 8월 18일

 ,  , 
1Ningbo No.2 Hospital, 2Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Neurological Diseases, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences, 3Lab of Nanopharmacology Research for Neurodegeneration, Department of Research and Development of Science and Technology, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences, 4Lab of Dementia and Neurorehabilitation Research, Department of Research and Development of Science and Technology, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 미세유체 혈뇌장벽-교모세포종(BBB-GBM) 칩 모델의 구축 방법을 설명합니다. 이 모델은 BBB의 무결성이 검증되었으며, 저강도 초음파로 유도된 일시적이고 대부분 가역적인 BBB 개방 현상을 조사할 수 있어, 초음파 매개 나노미셀의 BBB 통과 수송 및 종양 표적 효율에 대한 정량적 평가가 가능합니다.

초록

혈뇌장벽(BBB)은 대부분의 치료 분자가 뇌로 진입하는 것을 제한함으로써 교모세포종(GBM) 치료의 주요 장애물이 됩니다. BBB의 구조와 기능에 있어 종 간의 차이는 동물 모델의 임상 적용을 어렵게 하며, 이는 GBM 치료 시 약물 투과성을 평가하기 위한 인간 관련 인 비트로(in vitro) BBB 플랫폼의 필요성을 강조합니다. 본 프로토콜에서는 미세유체 BBB-GBM 칩 모델을 구축하는 방법을 설명합니다. 이 모델은 Matrigel이 포함된 미세유체 플랫폼 내에 인간 뇌 미세혈관 내피세포(HCMECs), 일차 성상교세포(ACs) 및 U87-MG 세포로 구성된 삼중 배양 시스템을 구축합니다. BBB의 무결성은 zonula occludens-1 (ZO-1) 면역염색과 FITC-dextran 투과성 분석을 통해 검증됩니다. 이후 저강도 초음파(US) (1 MHz, 1 W/cm2, 30 s)를 사용하여 일시적이며 대체로 가역적인 BBB 개방을 유도함으로써, 종양 표적 나노미셀(SFN@RB@SPMs)이 장벽을 효율적으로 통과하여 GBM 세포에 축적되도록 합니다. 이 프로토콜의 핵심 특징은 단일 초음파 반응형 칩 내에서 실시간 BBB 투과성 및 약물 전달 측정을 통합한 것으로, 이는 GBM에서 초음파 증강 약물 전달 메커니즘을 분석할 수 있는 강력한 플랫폼을 제공합니다.

서론

교모세포종(GBM)의 치료는 혈뇌장벽(BBB)으로 인해 크게 제한되며, 이는 거의 모든 치료제의 뇌 진입을 심각하게 방해합니다1,2. BBB는 밀착연접 단백질(예: occludin, ZO-1)로 결합된 비창상 내피세포로 형성되며, 혈관주위세포와 성상교세포 종말발의 추가적인 지지를 받습니다3. 동물 모델이 BBB 기능에 대한 귀중한 통찰을 제공해 왔으나, 생리와 대사의 종 특이적 차이로 인해 인간의 약물 반응을 정확하게 예측하는 데 한계가 있습니다4,5. 따라서 GBM 치료에서 약물 투과도를 평가하기 위해서는 생리학적으로 유의미한 인간 BBB 모델이 필수적입니다.

Transwell 배양 시스템과 같은 전통적인 in vitro BBB 모델은 세포 간 상호작용, 동적인 유체 변화, 흐름으로 인한 전단 응력을 포함한 BBB의 복잡성을 재현하지 못합니다6. 반면, 미세유체 BBB 모델은 이러한 in vivo 유사 특성을 밀접하게 모방하는 우수한 플랫폼으로 등장했습니다7. 이러한 BBB-on-a-chip 시스템은 뇌종양 전이 연구8, 알츠하이머병과 같은 신경퇴행성 질환에서의 BBB 기능 장애 조사9, 그리고 BBB를 통한 약물 수송 평가10,11에 널리 사용되어 왔습니다. 하지만 기존의 대부분의 BBB-chip 모델은 주로 약물 투과성 테스트에 사용되며, BBB 투과성을 조절하는 외부 물리적 자극을 통합하는 능력이 부족합니다. 현재 집속 초음파(FUS)는 상당한 회복력을 가지면서 일시적으로 BBB를 개방하여 뇌로의 치료제 전달을 향상시킬 수 있는 유망한 전략으로 부상했습니다12,13. 이전의 기전 연구들은 초음파로 유도된 기계적 자극이 세포 간 접합을 재구성하고 내피 투과성을 높임으로써 장벽 기능을 일시적으로 조절할 수 있음을 입증했습니다. 예를 들어, Silvani 등은 초음파 유도 기계적 힘이 in vitro vessel-on-a-chip에서 가역적인 내피 세포 간 틈 형성을 유발함을 보여주었습니다14. 이러한 결과와 일치하게, Beekers 등은 초음파 매개 기계적 생물학적 효과가 내피 세포 간 접촉의 일시적 개방을 유도하여 내피 투과성을 증가시킨다는 것을 입증했습니다15. 최근 Qiao 등은 내피 장벽 투과성이 초음파 노출 파라미터, 특히 펄스 길이에 의해 결정적으로 조절된다고 보고하며, 안전하고 조절 가능한 BBB 변조를 달성하기 위해 음향 파라미터 최적화가 중요함을 강조했습니다16. 이러한 진전에도 불구하고, 초음파 매개 BBB 개방과 그것이 나노 의약품 전달에 미치는 영향에 대한 정량적 분석을 동시에 가능하게 하는 in vitro 플랫폼은 여전히 제한적입니다.

위와 같은 공백을 메우기 위해, 미세유체 BBB-GBM 칩을 구축하는 프로토콜을 제시합니다. 이 미세유체 장치는 Matrigel에 매립된 HCMEC, 일차 AC 및 U87-MG GBM 세포의 삼중 배양을 지원합니다. 재구성된 BBB는 세포 간 접합부를 따라 연속적인 ZO-1 국소화와 혈관 인터페이스를 통한 40 kDa FITC-dextran의 제한된 확산으로 입증된, 온전한 장벽의 구조적 및 기능적 특성을 모두 나타냈습니다. 중요한 점은, 이 칩을 제어된 초음파 자극과 결합하여 일시적인 BBB 개방을 유도함으로써 나노미셀의 후속 수송 및 종양 표적 효율을 높일 수 있다는 것입니다. 이 시스템을 사용하여 나노미셀 SFN@RB@SPM의 수송 및 종양 표적 효율을 정량적으로 평가할 수 있습니다. 전반적으로, 이 플랫폼은 초음파 파라미터, 가역적 특성을 가진 BBB 조절, 그리고 GBM 치료에서 향상된 나노미셀 전달 사이의 관계를 연구하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

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프로토콜

모든 동물 실험 절차는 실험 동물 복지의 윤리적 심사를 위한 가이드라인(GB/T35892-2018)을 준수하였으며, UCAS 닝보 생명건강산업연구소의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다(승인 번호 GK-2023-XM-073). 사용된 시약과 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. BBB-GBM 오가노이드-온-어-칩 장치의 제작 및 준비

  1. 칩 설계 및 포토마스크 레이아웃
    1. Auto CAD 소프트웨어를 사용하여 칩을 설계한다.
      참고: 칩은 혈관 채널, 뇌 채널, 종양 채널을 포함하여 3개의 병렬 미세유체 채널로 구성된다. 혈관 채널과 종양 채널의 너비는 모두 100 µm이며, 뇌 채널의 너비는 130 µm이다. 세 채널의 높이는 150 µm이며, 인접한 채널들은 구획 간 분자 확산과 세포 간 통신이 가능하도록 너비 20 µm의 사다리꼴 마이크로필러 어레이로 구분된다. 상세한 포토마스크 설계 레이아웃은 Supplementary Figure 1 및 Supplementary Figure 2에 제시되어 있다. 본 연구에 사용된 SU-8 포토레지스트는 3050이다.
  2. SU-8 포토레지스트와 표준 포토리소그래피 공정을 이용하여 실리콘 마스터 몰드를 제작한다.
    1. 공시료 실리콘 웨이퍼를 스핀 코터의 진공 척 위에 놓고 진공을 활성화하여 웨이퍼를 단단히 고정한다.
    2. SU-8 포토레지스트 10 mL를 웨이퍼 중앙에 천천히 분주한다.
    3. 균일한 포토레지스트 층을 얻기 위해 2단계 스핀 코팅 공정을 수행한다: 먼저 50 rpm에서 10 s 동안, 그다음 250 rpm에서 90 s 동안 수행한다.
    4. 코팅된 웨이퍼를 핫플레이트로 옮겨 95 °C에서 30 min 동안 소프트 베이크를 수행하여 용매를 증발시킨다.
    5. 웨이퍼를 실온까지 식힌 후, 두께 측정기를 사용하여 SU-8 층의 두께를 측정한다.
      참고: 최적의 BBB 형성을 위해 10–150 µm의 채널 높이가 권장된다. 1회 스핀 코팅(단계 1.2.3)은 일반적으로 40–50 µm의 박막 두께를 형성하므로, 원하는 전체 두께에 도달하려면 2~3회의 스핀 코팅 공정이 필요하다.
  3. 포토리소그래피 패턴 형성
    1. 마스크 얼라이너의 자외선(UV) 광강도를 14–15 mW/cm2로 설정한다.
    2. 크롬 포토마스크를 SU-8이 코팅된 실리콘 웨이퍼와 정렬하고 10 s 동안 UV 노광을 수행한다.
    3. 실리콘 웨이퍼를 즉시 핫플레이트로 옮겨 다음 조건으로 노광 후 베이킹(PEB)을 수행한다: 65 °C에서 10 s, 이어서 95 °C에서 30 s.
    4. 실리콘 웨이퍼가 실온으로 식은 후, 현상액(propylene glycol monomethyl ether acetate, PGMEA)에 담그고 4–6 min 동안 현상시킨다.
    5. 이소프로판올로 웨이퍼를 헹궈 현상을 중단시킨 후, 탈이온수로 세척한다.
    6. 질소 가스를 사용하여 웨이퍼를 건조하고, 광학 현미경으로 패턴화된 미세채널 구조를 검사한다.
      참고: 현상되지 않은 포토레지스트 잔여물이 남아 있는 경우, 미세구조가 명확하게 정의될 때까지 현상 단계를 반복한다.
    7. 완성된 실리콘 마스터를 오븐에서 200 °C로 1 h 동안 베이크하여 SU-8 포토레지스트와 실리콘 웨이퍼 표면 사이의 접착력을 높인다.
  4. PDMS 칩 제작
    1. 베이스 프리폴리머와 경화제를 10:1 중량비(w/w)로 30 min 동안 충분히 혼합하여 균질한 폴리디메틸실록산(PDMS) 프리폴리머를 준비한다.
    2. 제작된 실리콘 마스터 몰드 위에 PDMS 혼합물을 붓고, 미세구조가 완전히 덮이도록 한다.
    3. 기포를 제거하기 위해 마스터 몰드를 진공 데시케이터에 넣어 탈기시킨다.
    4. 마스터 몰드를 오븐으로 옮겨 65 °C에서 1.5–2 h 동안 경화시킨다.
    5. 경화 후, 공예용 칼을 사용하여 칩 경계를 따라 PDMS 층을 조심스럽게 자르고 실리콘 마스터 몰드에서 천천히 떼어낸다.
    6. PDMS 칩을 70%–75% 에탄올에 30 min 동안 담가 1차 멸균을 수행한 다음, 탈이온수로 헹구고 자연 건조시킨다.
    7. 2 mm 바이옵시 펀치를 사용하여 입구 및 출구 포트를 뚫는다.
  5. 플라스마 본딩 및 장치 조립
    1. PDMS 칩과 깨끗한 유리 슬라이드를 플라스마 세척기 챔버에 넣으며, PDMS의 미세채널 면이 위를 향하게 한다.
    2. 압력이 30 Pa 미만으로 떨어질 때까지 챔버를 진공 상태로 만든 후, 산소 가스를 주입한다.
    3. 챔버 압력을 40 Pa 미만으로 유지하면서 산소 흐름을 90 s 동안 유지한다.
    4. 무선 주파수(RF) 출력을 5%로 설정하고 90 s 동안 플라스마 처리를 수행하여 PDMS와 유리 표면을 활성화한다.
    5. 활성화된 PDMS 칩을 즉시 유리 슬라이드에 접촉시키고 가볍게 눌러 비가역적 본딩을 형성한다.
    6. 조립된 장치를 오븐에서 65 °C로 24 h 동안 유지하여 본딩을 안정화하고 소수성을 회복시킨다.
    7. 세포 파종 전, 본딩된 장치를 자외선 조사로 30 min 동안 멸균한다.
      참고: 사용 전까지 멸균된 칩을 생물안전작업대(BSC) 내의 밀폐된 페트리 접시에 보관하여 무균 상태를 유지한다.

2. 세포 파종 및 BBB-GBM 모델 구축

  1. 다음 시약을 준비합니다:
    1. ACs 배양액(뇌 채널용): 20% fetal bovine serum (FBS) 및 1% penicillin/streptomycin (P/S)이 포함된 DMEM/F12 기본 배지.
    2. HCMECs 배양액(혈관 채널용): 1% P/S가 첨가된 내피세포 배지 (Endothelial cell medium, ECM).
    3. GBM 세포 배양액(글리오마 채널용): 10% FBS 및 1% P/S가 포함된 MEM 기본 배지.
    4. 세포 해리 시약: 부착 세포를 떼어내기 위해 0.25% trypsin-EDTA 용액을 사용합니다.
      참고: trypsin에 장시간 노출되면 세포 생존율이 감소할 수 있습니다. 현미경으로 세포 해리를 모니터링하고 완전 배지로 trypsin을 즉시 중화시키십시오.
    5. 모든 세포(ACs, HCMECs, U87-MG)는 마이크로 유체 장치에 파종하기 전까지 10 mm 배양 접시에서 유지합니다.
  2. 1차 ACs 분리
    1. 신생 쥐(생후 1~3일)의 대뇌 피질에서 1차 ACs를 분리합니다. 얼음 위에서 뇌막과 혈관을 조심스럽게 제거한 후, 멸균된 수술 가위로 피질 조직을 잘게 다지고 효소 소화를 진행합니다.
    2. 해리된 세포 현탁액을 ice-cold PBS로 세척하고, trypsin으로 처리하여 단일 세포 해리를 유도한 후, 원심분리(40 x g, 5분, 상온)를 통해 펠릿을 수집합니다.
    3. 세포를 재현탁하여 ACs 배양액이 담긴 T25 배양 플라스크에 파종합니다.
    4. 면역형광 염색을 통해 GFAP로 ACs를 확인합니다. 해당 이미지는 부록 그림 3에 제공되어 있습니다.
  3. 세포 파종
    ​참고: 1일 차 - 뇌 채널에 ACs 파종.
    1. ACs가 포함된 배양 접시에 0.25% trypsin-EDTA 1 mL를 넣습니다. 가볍게 흔들어 골고루 덮이도록 합니다.
    2. 세포가 배양 접시에서 떨어질 때까지 37 °C에서 1~2분 동안 배양합니다.
    3. trypsin을 중화시키기 위해 ACs 배양액 3 mL(단계 2.1.1 참조)를 추가합니다. 파이펫으로 가볍게 섞어 단일 세포 현탁액을 얻습니다.
    4. 세포 현탁액을 원심분리 튜브에 담고 4 °C에서 30 × g으로 3분 동안 원심분리합니다.
    5. 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 200 µL의 AC 배지에 재현탁합니다.
    6. 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 농도를 측정하고 밀도를 2.5 × 106 cells/mL로 조정합니다.
    7. ACs 세포 현탁액과 Matrigel을 3:5 (v/v) 비율(AC 세포: Matrigel)로 혼합합니다.
    8. 마이크로 파이펫을 사용하여 Matrigel-ACs 혼합액 10 µL를 뇌 채널에 분주합니다.
      참고: Matrigel의 조기 중합을 방지하기 위해 칩을 얼음 위에 둔 상태에서 로딩 절차를 수행하십시오.
    9. Matrigel 중합 및 세포 안정을 위해 칩을 5% CO2 배양기 내 37 °C에서 30분 동안 배양합니다.
      참고: 1일 차 - 혈관 채널에 HCMECs 파종.
    10. 0.25% trypsin-EDTA 1 mL를 처리하고 세포가 떨어질 때까지 37 °C에서 약 30초 동안 배양합니다.
    11. 효소 소화를 중단시키기 위해 HCMECs 배지 3 mL(단계 2.1.2 참조)를 추가합니다.
    12. 파이펫으로 가볍게 섞어 균일한 단일 세포 현탁액을 생성합니다.
    13. 현탁액을 수집하여 4 °C에서 30 × g으로 3분 동안 원심분리합니다.
    14. 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 20 µL의 HCMECs 배지에 재현탁합니다.
    15. 세포 수를 측정하고 농도를 2 × 106 cells/mL로 조정합니다.
    16. HCMECs 현탁액 10 µL를 칩의 혈관 채널에 조심스럽게 주입합니다.
    17. 채널 벽을 따라 내피세포의 부착을 촉진하기 위해 세포 배양기 내에서 칩을 옆으로 눕혀 30분 동안 둡니다.
    18. 혈관 채널 내 내피세포 밀도를 높이기 위해 HCMECs 현탁액 10 µL를 추가로 파종합니다.
    19. HCMECs 접착을 위해 칩을 30~60분 동안 추가로 배양합니다.
    20. 칩 입구에 혼합 배양액 100 µL를 추가합니다.
      참고: 혼합 배지는 AC 배지와 HCMECs 배지를 1:1 비율(v/v)로 섞은 것입니다.
      3일 차 - 글리오마 채널에 U87-MG 세포 파종.
    21. 배양 접시에 0.25% trypsin-EDTA 1 mL를 추가하고 37 °C에서 1~2분 동안 배양합니다.
    22. 소화를 종료하기 위해 U87-MG 배지 3 mL(단계 2.1.3 참조)를 추가합니다.
    23. 파이펫으로 가볍게 섞어 균질한 단일 세포 현탁액을 얻습니다.
    24. 세포 현탁액을 원심분리 튜브로 옮겨 300 × g으로 3분 동안 원심분리합니다.
    25. 상층액을 버리고 세포 펠릿을 20 µL의 U87-MG 배지에 재현탁합니다.
    26. 세포 농도를 측정하고 밀도를 2 × 106 cells/mL로 조정합니다.
    27. U87-MG 세포 현탁액 10 µL를 칩의 글리오마 채널에 주입합니다.
    28. 세포 부착을 위해 칩을 5% CO2가 포함된 37 °C 환경에서 30~60분 동안 배양합니다.
    29. 칩 입구에 U87-MG 배양액 10 µL를 추가합니다.
    30. 내피세포 밀착 연접(tight junction) 형성을 위해 마이크로 유체 장치를 5% CO2 가 포함된 37 °C 환경에서 48시간 동안 추가로 유지합니다.

3. BBB 무결성 평가

  1. 투과성 분석
    1. 최종 농도가 [농도 값]이 되도록 혼합 배양 배지(ACs 배지: HCMEC 배지 = 1:1, v/v)에서 분자량 40 kDa의 fluorescein isothiocyanate-dextran (FITC-dextran)을 준비하십시오. 10 µg/mL.
    2. 소개 10 µL FITC-Dextran 용액을 혈관 채널 내로 주입합니다.
    3. 내피 장벽을 가로지르는 덱스트란 확산을 모니터링하기 위해, 도립 형광 현미경의 스테이지 위에 미세유체 칩을 배치하고 20분 간격으로 혈관 채널과 인접한 뇌 채널 모두의 형광 이미지를 획득하십시오.
    4. 투과 계수(P앱, cm/s)는 다음 공식을 사용하여 계산합니다:
      P앱 (cm/s)= Fs, Fc, Δt가 포함된 공정 효율 식; 과학 연구를 위한 수학 공식.
      어디에 P앱 겉보기 투과 계수(cm/s), FS 혈액 채널의 초기 시간에서의 형광 강도, FC 확산 간격 끝에서의 뇌 채널 형광 강도이며, Δt는 확산 시간(s), VT는 뇌 채널 내 FITC-dextran의 확산 부피(cm³)입니다.3), 그리고 A는 내피 표면적(cm²)입니다.2).
      참고: 투과성 계수가 낮을수록 BBB 무결성이 더 높고 내피 장벽 형성이 더 견고함을 나타냅니다.
    5. 데이터 분석 및 파라미터 정의를 수행합니다.
      참고: 혈관 및 뇌 채널 모두에서 측정된 형광 강도 값은 칩 내 세포가 없는 영역에서 얻은 측정값을 사용하여 배경값을 뺐습니다. ROI는 형광 확산 길이를 기준으로 혈관-뇌 인터페이스의 양측에 정의되었습니다. 내피세포 표면적(A)은 혈관 채널과 뇌 채널 사이의 인터페이스 면적으로부터 계산되었습니다(두 마이크로필러 사이의 간격을 기준으로 함). 200 µm × 150 µm = 30,000 µm2 = 3 × 10-6 cm2FITC-dextran 확산 부피(VT)는 뇌 채널에서의 확산 침투 거리와 A를 곱하여 도출하였다. 형광 이미지는 60분 동안 20분(120초) 간격으로 획득하였으며, 투과 계수는 20분 간격의 데이터를 사용하여 계산하였다. 투과도 값은 각 실험군당 3개의 독립적인 칩으로부터 계산되었다. 모든 단위 변환은 투과도를 cm/s로 표기하기 전에 수행되었다.
  2. ZO-1의 면역형광 분석
    1. 잔류 배양액을 제거하기 위해 미세유체 채널을 인산완충생리식염수(PBS)로 3회 세척하십시오.
    2. 채널에 4% 파라포름알데히드(PFA)를 주입하고 실온에서 10분 동안 배양하여 세포를 고정합니다.
    3. 실온에서 0.1% Triton X-10이 함유된 PBS로 15분 동안 세포를 투과화합니다.
    4. PBS에 희석된 2% 소 혈청 알부민(BSA)으로 채널을 실온에서 45분 동안 배양하여 비특이적 항체 결합을 차단하십시오.
    5. anti-ZO-1 1차 항체(1:20 희석)를 채널에 주입하고 다음 온도에서 배양하십시오. 4 °C 하룻밤 동안
    6. 결합되지 않은 1차 항체를 제거하기 위해 PBS로 채널을 충분히 세척하십시오.
    7. 칩을 Alexa Fluor 55가 접합된 항토끼 2차 항체(1:10 희석)와 함께 실온의 암소에서 45분 동안 배양한다.
    8. 핵을 다음으로 대조 염색합니다. 1 µg/mL 상온의 암실에서 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)로 1분 동안 처리합니다.
      참고: DAPI는 빛에 민감하므로 염색 과정 동안 빛으로부터 보호해야 합니다.
    9. PBS로 채널을 3회 세척하십시오.
    10. 도립 형광 현미경과 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 미세유체 장치를 촬영함으로써 내피세포 접합부를 따라 ZO-1의 국소화를 시각화하십시오.

4. GBM 세포로의 혈뇌장벽(BBB) 통과를 위한 초음파 강화 나노마이셀 전달

  1. 초음파 자극
    1. 배양 접시에서 칩을 조심스럽게 꺼내 생물안전작업대(biosafety cabinet) 내부에 놓으십시오.
    2. 1 MHz 트랜스듀서(유효 방사 면적: 5 cm²)가 장착된 치료용 초음파 시스템을 사용하여 초음파 자극을 가합니다.2).
    3. 초음파 프로브와 미세유체 칩 표면 사이에 3mm 두께의 의료용 음향 결합 패드를 부착하여 효율적인 음향 전달을 보장하십시오.
    4. 초음파 프로브를 미세유체 장치의 혈관 채널 영역 바로 위에 배치하십시오.
      참고: 트랜스듀서와 칩 사이에 기포가 생기면 음향 에너지 전달이 현저히 감소하므로 이를 방지해야 합니다.
    5. 초음파 파라미터를 다음과 같이 설정하십시오: 듀티 사이클: 60%; 주파수: 1 MHz; 강도: 1 W/cm²2; 노출 시간: 30초; 펄스 반복률(PRF): 10Hz. 상세한 초음파 파라미터는 다음에서 제공됩니다. 부수 표 1.
    6. 미처리 대조군의 경우, 초음파 트랜스듀서를 동일한 위치에 배치하되 가짜 대조군(sham control)으로 작용하도록 비활성 상태로 유지하여, 음향 노출 없이 처리 과정만 동일하게 수행하십시오.
    7. 초음파 조사 후, 커플링 패드를 제거하고 즉시 칩을 멸균 배양 접시로 옮기십시오.
    8. 칩의 유입구 포트에 신선한 배양액을 추가하십시오.
    9. 장치를 다음 조건에서 배양하십시오. 37 °C 5% CO 포함2 추후 분석 시까지.
  2. 초음파 유도 혈뇌장벽(BBB) 조절 평가
    1. 밀착 연접(tight junction) 무결성의 변화를 평가하기 위해 초음파 처리 직후(0시간)와 처리 후 24시간에 ZO-1 면역형광 염색을 수행하십시오.
    2. 단계 3.2에서 설명한 면역형광 염색 절차를 따르십시오.
    3. z축을 따른 ZO-1 염색 분포를 비교하여 초음파 자극이 혈뇌장벽(BBB) 밀착결합의 무결성에 미치는 영향을 평가하십시오.
  3. SFN@RB@SPM 나노미셀의 제조 및 특성 분석
    1. 이전에 확립된 프로토콜에 따라 SFN@RB@SPM 나노미셀을 준비하십시오.17간략히 설명하면, 양친성 펩타이드(SPM으로 명명, 6 mg/mL), RB(0.6 mg/mL) 및 SFN(6 mM)의 스톡 용액을 1:1:1의 부피비로 혼합하였습니다.
    2. 혼합물을 초음파 세척기에 넣고 28 kHz에서 초음파 처리하십시오. 25 °C 30분 동안.
    3. 遊離 RB 및 SFN을 제거하기 위해 혼합물을 48시간 동안 투석한다(분자량 컷오프: 100 Da).
    4. 동적 광산란(DLS)법을 이용하여 나노마이셀의 크기와 제타 전위를 측정하십시오. 특성 분석 데이터는 다음에서 제공됩니다. 부속 그림 4.
  4. 초음파 자극 나노미셀 전달 및 글리오마 세포 축적 평가
    1. 초음파 노출 직후, 나노미셀이 포함된 배양액을 미세유체 장치의 혈관 채널에 주입하십시오.
    2. BBB를 통한 나노미셀의 이동을 평가하기 위해, 미세유체 칩을 도립 형광 현미경의 스테이지 위에 놓고 60분 동안 20분 간격으로 혈관 채널과 인접한 뇌 채널 모두의 형광 이미지를 획득하십시오.
    3. 초음파 강화 나노미셀 투과도를 평가하기 위해 뇌 채널의 형광 이미지를 정량화하십시오.
    4. 글리오마 세포 내 나노미셀의 축적을 평가하기 위해, 표준 배양 조건 하에서 장치를 배양합니다 (37 °C, 5% CO₂2) 초음파 노출 후 3시간 동안 배양한 다음, 형광 현미경을 사용하여 신경교종 채널을 촬영함으로써 나노미셀의 세포 내 섭취를 평가한다.
  5. 통계 분석
    1. 모든 정량적 데이터는 평균±평균 표준 오차(SEM)로 표기하십시오.
    2. 각 실험은 3회의 독립적인 생물학적 반복 실험(실험 조건당 칩 n = 3개)으로 수행하십시오. 데이터의 신뢰성을 확보하기 위해, 각 생물학적 반복 실험당 최소 3회의 기술적 반복 측정(채널당 ROI)을 실시하였습니다.
    3. 투과 계수(P)를 계산하십시오.P앱각의 독립적인 칩에서 얻은 (cm/s) 값은 모든 통계적 비교의 기본 분석 단위로 사용되었습니다.
      참고: 두 그룹 간의 비교는 비쌍체 양측 튜던트(Student’s) t-검정을 사용하여 수행되었습니다. t-검정셋 이상의 그룹 간 비교는 일원 분산 분석(one-way ANOVA) 후 다중 비교를 위한 Tukey 사후 검정을 사용하여 분석하였습니다. 두 개의 독립 변수가 포함된 실험의 경우, 이원 분산 분석(two-way ANOVA) 후 Tukey 다중 비교 검정을 수행하였습니다. 통계 분석은 통계 및 그래프 작성 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. p-의 값 <0.05을 통계적 유의 수준으로 간주하였다.

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결과

~을 재현하기 위해 생체 내(in vivo) BBB의 구조를 모사하기 위해 HCMEC, 일차 성상세포 및 U87-MG 세포를 통합하여 삼배양 미세유체 칩(이하 “칩 모델”)을 개발하였다. 다음 그림에서 보듯 그림 1A,B장치 내에는 세 개의 평행한 채널이 배치되어 있습니다: 혈관 채널(왼쪽, 파란색), Matrigel이 충전된 뇌 채널(중앙, 분홍색), 그리고 종양 채널(오른쪽, 초록색)이며, 각 채널에는 각각 HCMEC, AC 및 U87-MG 세포를 파종합니다. 각 채널은 마이크로필라 배열로 분리되어 있으며, 이는 중앙 구획 내 Matrigel의 구속 상태를 유지하는 동시에 채널 간의 분자 및 세포 교환을 허용합니다. 장치 멸균 후, AC(2.5 × 106 (cells/mL)의 농도로 Matrigel에 3:5(v/v) 비율로 현탁된 세포를 뇌 채널에 주입하였습니다. Matrigel이 중합됨에 따라, HCMEC...

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토론

본 프로토콜은 초음파 매개 BBB 조절 및 나노미셀 전달을 평가하기 위한 미세유체 BBB-GBM 칩의 구축 방법을 설명합니다. 기존의 in vitro BBB 모델(예: Transwell)과 비교하여, 이 미세유체 플랫폼은 내피세포, 성상교세포(AC) 및 교모세포종 세포의 공간적으로 정의된 공동 배양을 가능하게 하여, 생리학적으로 유의미한 BBB를 통한 약물 수송 연구를 가능하게 합니다. 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계에서는 신뢰할 수 있는 장벽 형성을 보장하기 위해 세심한 최적화가 필요합니다. 핵심 파라미터 중 하나는 중앙 뇌 채널에 주입될 혼합물을 준비할 때 사용하는 Matrigel과 AC 세포 현탁 배지의 부피 비율입니다. 이 비율은 적절한 겔 점도를 유지하여 로딩 중에 AC-Matrigel 혼합물이 중앙 채널 내에 머물게 하는 데 매우 중요합니다. 혼합물에 AC 세포 현탁 배지의 비율이 너무 높으면, 점도가 낮아져 Matrigel이 인접한 미세채널로 누출될 수 있으며, 이로 인해 AC 세포가 인접 채널로 이...

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공개 사항

본 원고를 작성하는 과정에서 저자들은 언어 편집 및 개선 목적으로만 ChatGPT(OpenAI)를 사용하였습니다. 저자들은 AI의 도움을 받은 모든 내용을 검토 및 수정하였으며, 원고의 정확성과 무결성에 대해 모든 책임을 집니다. 데이터 생성, 분석 또는 도표 작성에는 어떠한 AI 도구도 사용되지 않았습니다.

감사의 글

본 연구는 절강성 자연과학 재단(LQ24H1600003), 절강성 의학과학 연구재단(2024KY351), 닝보 자연과학 재단(2023J365), 용장 인재 도입 프로그램(청년 혁신 인재 프로젝트, 2021A-012-G) 및 닝보 강북구 베이안 인재 프로그램(2023RC004)의 연구비를 지원받아 수행되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Alexa Fluor 555 접합 항-토끼 2차 항체Cell Signaling Technology, Inc.4413
anti-ZO-1 항체Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.40-2200
생검 펀치Zhejiang YoungChip Technology Co., Ltd.10305130004
우혈청알부민Absin Bioscience Inc.9048-46-8
세포 계수기Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.Countess TM3
세포 배양 접시 (100 mm)Corning Inc.430167
원심분리기Beckman Coulter, Inc.Avanti J-15R
크롬 마스크Suzhou Chip Scientific Instrument Co.,Ltd.ZX-GBYM
공초점 레이저 주사 현미경Carl Zeiss AGZeiss LSM900
DAPIBeyotime Biotech Inc.C1002
개발자Suzhou Chip Scientific Instrument Co., Ltd.RCD-400
DMEM/F12ScienCell Research LaboratoriesC3130-0500
세포외 기질ScienCell Research Laboratories1001
에탄올닝보 전하이 용펑 화학 공장6923193900015
소태아혈청ScienCell Research LaboratoriesC04001-500
Fiji (Fiji Is Just ImageJ)오픈 소스 프로젝트제공된 소스 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주십시오.
FITC-덱스트란 (40 kDa)Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.GC19938
슬라이드 글라스Citotest Scientific Co., Ltd.188105W
Graphpad prism 9.5GraphPad Software, Inc.제공된 소스 텍스트가 없습니다. 번역할 텍스트를 입력해 주세요.
인간 뇌 미세혈관 내피세포(HCMECs)BeNa 배양 집단BNCC337717
인큐베이터Esco Lifesciences Co., LtdCLM-170B-8-CN
도립 형광 현미경Nikon Instruments Inc.TS2-FL
이소프로판올Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.80109218
MatrigelCorning Inc.354234
최소 필수 배지(Minimum Essential Medium)프리셀라 라이프 사이언스 & Technology Co., Ltd.PM150410
질소Ningbo Baifang Gas CO., Ltd.해당 사항 없음
산소Ningbo Baifang Gas CO., Ltd.제공된 소스 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주시기 바랍니다.
파라포름알데히드 (PFA, 4%)Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1101-500mL
인산완충식염수ScienCell Research LaboratoriesC3580-0500
폴리디메틸실록산(PDMS)Corning Inc.220777
페니실린/스트렙토마이신Pricella Life Science & Technology Co., Ltd.PB180120
포토리소그래피중국과학원 광전자학 연구소URE-2000\AL
포토리소그래피 핫플레이트Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.WH-HP-02
플라즈마 애셔TIANKECHUANGDA Co., Ltd.PT-05-LF
일차 성상세포제공된 소스 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주십시오.해당 사항 없음신생 쥐(생후 1~3일) 뇌에서 분리됨
실리콘 웨이퍼Zhejiang YoungChip Technology Co., Ltd.10204040001
스핀 코터Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.WH-SC-01
SU-8Kayaku Advanced Materials Inc.1030403002
Triton X-100Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.9002-93-1
트립신ScienCell Research LaboratoriesC3530-0100
U87-MG 세포Pricella Life Science & Technology Co., Ltd.CL-0238
초음파 장치 Shenzhen Dongdixin Technology Co., Ltd.Sonic-Stimu Pro UT1041
Zen3.4(블루 에디션)Carl Zeiss AG입력된 소스 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 제공해 주십시오.

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