인간 및 쥐 장내 오가노이드에서 클론 역학과 운명 전이를 모니터링하기 위한 생세포 영상 및 단세포 추적

요약

우리는 두 가지 리포터 전략에 적용된 공초점 영상 및 추적 파이프라인을 설명합니다: 개별 세포 행동을 해석하는 모자이크 오가노이드와 인간 및 쥐 장내 오가노이드에서 세포 유형 전이를 모니터링하는 FATE 리포터 오가노이드입니다.

초록

장 상피는 줄기세포 분열, 세포 분화, 이동을 통해 빠른 자기 갱신을 겪습니다. 개별 세포가 특정 운명에 어떻게 결정하고 이 조직 내에서 클론 역학이 어떻게 나타나는지 이해하려면 세포 행동을 실시간으로 단일 세포 해상도로 포착하는 방법이 필요합니다. 장 오가노이드는 상피 자기조직화와 세포 유형 다양성의 핵심 특징을 재현하여, 통제된 환경에서 이러한 과정을 연구하는 강력한 시스템이다. 여기서는 인간 및 쥐 장내 오가노이드에서 장기 공초점 라이브 세포 영상(최대 72시간)과 단세포 추적을 위한 프로토콜을 제시하며, 두 가지 상호 보완적인 리포터 전략을 기반으로 합니다. 첫째, 우리는 차등 표지된 세포 집단을 결합하여 모자이크 오가노이드를 생성하여, 조밀한 상피 내 개별 세포에게만 귀종할 수 없는 세포 국소화 및 세포골격 리포터의 단일 세포 해상도를 가능하게 합니다. 둘째, 세포 유형별 운명 리포터(잔 세포는 MUC2, 판네스 세포는 DEFA5)를 사용해 분비 세포 유형 전이를 실시간으로 모니터링합니다. 프로토콜은 오르가노이드 배양, 모자이크 오가노이드 형성, 광독성 최소화 전략을 통한 샘플 준비, 며칠에 걸친 영상 수집, 그리고 시간에 따른 세포 궤적과 계통을 재구성하는 OrganoidTracker를 이용한 반자동 단일 세포 추적을 포함합니다. 장 오가노이드에서 입증되었지만, 이 프레임워크는 위, 췌장, 대장 모델 등 다른 상피 오가노이드 시스템에 쉽게 적용되어 상피 생물학, 항상성, 질병 연구에 활용 범위를 넓혔습니다.

서론

장 상피는 신체에서 가장 빠르게 자기갱신하는 조직 중 하나로, 대부분의 세포는 3일에서 5일 이내에 교체됩니다. 이 지속적인 교체는 장 지하 기저부에 위치한 류신 풍부 반복 포함 G-단백질 결합 수용체 5(Lgr5) 양성 줄기세포에 의해 유지되며, 이들은 융모 끝¹ 쪽으로 이동하면서 장내 특수 세포 유형으로 분화하는 전이 증폭 전구세포를 생성합니다. 주요 분화 계통에는 흡수성 장혈구, 점액 분비 잔 세포, 호르몬 생성 장내분비 세포, 항균성 판네스 세포²가 포함됩니다. 개별 세포가 특정 운명에 어떻게 헌신하는지, 집단 세포 행동이 개별 세포 역학에서 어떻게 비롯되는지, 조직 수준의 조정이 어떻게 달성되는지는 장생물학에서 근본적인 질문으로 남아 있다. 이 질문들에 답하려면 세포 행동을 단일 세포 해상도로, 실시간에, 그리고 분화와 이동과 관련된 시간 척도에 걸쳐 포착하는 실험적 접근법이 필요합니다^.

장 오가노이드는 단일 줄기세포나 조직 조각에서 성장한 3차원(3D) 자기조직화 구조로, 상피 구조, 자기조직화, 세포 유형 다양성의 핵심 측면을 재현합니다 ^4,5,6. 오가노이드는 개발 이래 장생물학, 질병 모델링, 약물 반응 연구에 필수적인 도구가 되었습니다. 쥐와 인간 장 오가노이드 모두 배양에서 장기 유지할 수 있으며, 클러스터드 규칙 간격 짧은 회문 반복(CRISPR) 기반 접근법을 이용해 유전적으로 변형되고, 서로 다른 유전자형 또는 리포터 배경의 해리 단일 세포를 혼합하여 모자이크 구조로 결합한 후 기저막 추출물에 재임베딩할 수 있습니다 ^7,8,9. 모자이크 오가노이드는 서로 다른 유전적 또는 형광 배경을 가진 세포를 단일 구조 내에 결합하여 집단이 동일한 지적 신호와 기계적 맥락을 경험하도록 하며, 내장된 내부 대조군과 비교할 수 있습니다. 이러한 유전적 접근성 덕분에 특정 세포군 6,10,11,12의 정확한 표지가 필요한 생체 영상 연구에 특히 적합합니다. 세포 유형별 운명 표지자처럼 간헐적으로 표지를 부착하는 리포터는 단일 세포 추적 방법으로 개별 추적 및 분석이 가능한 분리된 형광 세포를 생성합니다. 그러나 세포 접합부나 피질 마이오신-II와 같은 세포 국소 및 세포골격 단백질이 상피에 균일하게 표지될 때 지속적인 도전 과제가 발생합니다. 이들의 신호는 개별 세포에 할당할 수 없는데, 이는 공초점 현미경 해상도에서 이웃 세포들이 경계를 공유하기 때문입니다. 모자이크 오가노이드는 이 한계를 극복합니다: 형광 리포터를 발현하는 세포가 표지되지 않은 이웃 세포들에 둘러싸여 있을 때, 그 세포막과 세포골격 신호가 명확히 그 단일 세포에 귀속될 수 있어, 이동, 분열 또는 돌출 과정에서 세포골격을 어떻게 재구성하는지 밝혀냅니다 ^9,13. 라벨링 비율을 조정하면 이 뷰가 뒤바뀌어, 라벨이 붙지 않은 셀 주변의 이웃 반응을 포착할 수 있게 됩니다. H2B-mCherry 또는 H2B-iRFP와 같은 히스톤 H2B 핵 리포터는 모자이크 패턴을 식별하고 분석할 수 있는 유익한 세포 별자리를 찾는 데 도구입니다. 단일 세포 해상도를 넘어, 모자이크 오가노이드는 유전자형 간 직접적인 적합도 비교를 가능하게 합니다. 두 집단이 같은 지위를 공유하기 때문에 세포 수명이나 돌출 속도의 차이가^{경쟁 적합도를} 내부적으로 제어하여 측정할 수 있게 합니다. 9^{, 14, 15}.

그러나 오가노이드의 생세포 영상은 특정한 기술적 도전 과제를 제시합니다. 이들의 3D 기하학은 광학 절단을 위해 공초점 또는 광판 현미경^{16, 17, 18, 19}를 요구합니다. 분화와 이동과 같은 느린 과정을 포착하려면 24시간 이상의 영상 촬영 시간이 필요하며, 레이저 출력, 노출 시간, 영상 간격을 세심하게 최적화하여 광독성을 제한합니다^16,18. 임베딩 매트릭스와 배양 배지는 현미경 광학과 호환되면서 오가노이드 건강을 지원해야 합니다. 더불어, 밀도가 높은 3D 타임랩스 데이터셋에서 정량적인 단일 셀 정보를 추출하려면 수백 개의 시점에서 셀을 탐지하고 연결하는 전용 계산 도구가 필요합니다. 공초점 현미경과 광시트 현미경 외에도, 다광자 현미경과 형광 평생 영상 현미경(FLIM)은 광독성 감소와 라벨 없는 대사 판독^20,21과 같은 추가 기능을 제공하지만, 공초점 현미경은 형광 표지된 오가노이드의 다색 라이브 이미징을 위한 가장 널리 접근 가능하고 다재다능한 플랫폼으로 남아 있습니다.

오가노이드 내 세포 추적을 위한 여러 접근법이 개발되었으며, 수동 주석부터 반자동화 및 완전자동화된 딥러닝 기반 파이프라인에 이르기까지 다양합니다^. OrganoidTracker는 신경망을 이용해 3D 공초점 스택 내 핵을 탐지하고, 시점 간 탐지를 연결하여 세포 궤적과 계보도를 재구성하는 반자동 소프트웨어 도구입니다 ^3,23. 이 방법은 장 내 오가노이드 내에서 수백 개의 세포를 수일간 추적하는 데 검증되었으며, 세포 분열, 이동, 분화 및 돌출 사건을 정량화하는 유연한 틀을 제공합니다. 다중 채널 영상 지원을 통해 스펙트럼적으로 구분되는 핵 리포터를 가진 모자이크 오가노이드와 세포 유형별 운명 표지를 발현하는 오가노이드와 직접 호환됩니다.

이 프로토콜에서는 인간과 쥐 장내 오가노이드에서 공초점 라이브 세포 영상과 단일 세포 추적을 통합한 모듈형 워크플로우를 설명하며, 두 가지 상호 보완적인 리포터 전략을 사용합니다. 첫 번째 전략은 서로 다른 H2B 핵 리포터를 가진 두 세포 집단(H2B-mCherry와 H2B-iRFP)을 정해진 비율로 혼합하여 생성된 모자이크 쥐 오가노이드를 사용합니다(그림 1A). 한 집단은 Myosin-II-mNeonGreen과 같이 관심 있는 공동 발현 보고체를 가지고 있는데, 이 기관의 막 국소화 신호는 두 번째 핵 표지만 가진 이웃 세포에 둘러싸여 있을 때 개별 세포에 명확히 귀속될 수 있습니다. 이를 통해 단일 세포가 조직 내에서 이동, 분열 또는 돌출 과정에서 세포골격을 어떻게 재구성하는지 직접 관찰할 수 있습니다. 두 번째 전략은 인간 장 오가노이드 내 세포 유형 특이적 운명 보고체를 사용하며, Mucin 2(MUC2)는 고블릿 세포를 표지하고, Defensin Alpha 5(DEFA5)는 Paneth 세포를 표지하여 분비 세포 유형 전이를 실시간으로 모니터링할 수 있게 합니다(그림 1B). 이 두 시스템은 함께 리포터 전략을 바꾸는 것만으로도 공유 영상 및 추적 파이프라인이 다양한 생물학적 질문에 어떻게 적응할 수 있는지를 보여줍니다(그림 1C,D). 다음 섹션들은 오르가노이드 배양부터 모자이크 생성, 이미지 획득, 정량적 단일 세포 분석에 이르기까지 이 워크플로우를 구현하는 데 필요한 모든 단계를 제공합니다.

프로토콜

동물을 대상으로 한 모든 실험은 네덜란드 정부 동물실험 중앙위원회(CCD)와 KNAW/후브레히트 연구소 동물복지기구(IvD)가 승인한 기관 지침을 준수하여 수행되었습니다. 인간 장 오기노이드는 위트레흐트 대학교 의료센터(UMCU)에서 환자 동의 하에 확보한 조직에서 생성되었습니다. 이 연구는 네덜란드 위트레흐트에 위치한 UMCU 윤리위원회의 승인을 받았으며, 헬싱키 선언과 네덜란드 법률에 따라 수행되었습니다.

1. 오르가노이드 배양 및 유지

1. 생쥐 장 오르가노이드용 표피 성장 인자, 노긴, R-스폰딘(ENR) 성장 배지를 준비합니다(표 1).
2. 인간 장 오가노이드를 위해 확장 배지(표 2), 패턴 배지(표 3), 성숙 배지(표 4)를 준비합니다.
3. 사용 전에 성장인자 감소 기저막 추출물(BME) 바이알을 하룻밤 얼음 위에 해동하세요.
4. BME는 조기 젤화를 막기 위해 항상 얼음 보관하세요.
5. 기계적 해리에 의한 1:4에서 1:8 분할 비율로 7일마다 통과하는 ENR 배지에서 쥐 장내 오가노이드를 배양^합니다.
6. 인장 오가노이드를 BME에 내장된 확장 배지에서 배양하며, 7–10^일마다 통과시킵니다.
   참고: 단세포 해리 후 쥐 오르가노이드의 확장 또는 회복을 위해, ENR 배양지에서 Wnt-조성된 배지(10 mM 니코틴아마이드 및 10 μM Y-27632 이하이드로클로라이드 보조)를 보충하여 첫 2–3일간 오가노이드 성장과 생존 촉진을 시행합니다.
7. 인간 장 내 오가노이드의 분화를 유도하기 위해, 14일간 패턴 배지에서 순차적으로 오가노이드를 배양한 뒤, 7–10일간 성숙 배양지를 진행합니다^.
   참고: 오가노이드 형성 및 배양에 관한 자세한 프로토콜은 사토 등4, 인간 장 오가노이드에 대해서는 사토 등^{5, He} 등⁶ 을 참조하십시오.

2. 형질전환 장 오가노이드 생성

1. 전기천공 시점에 활발히 증식하는 배양을 보장하기 위한 오가노이드 통과: 쥐 오가노이드는 전기천공 3일, 인간 오가노이드는 5일에서 7일 전입니다. 각 전기천공 반응마다 24웰 플레이트의 4–8웰(약 200–400 μL BME에 오가노이드가 포함된 유가노이드, 약 500–1,000개의 오가노이드)에서 오가노이드를 사용한다. 재조합 트립신 유사 해리 시약을 사용해 37°C에서 5–10분간 오가노이드를 단일 세포로 해리시킵니다.
2. 트랜스포존 기반 발현 구조체(p2T-H2B-mCherry-IRES-BlastR 또는 p2T-H2B-iRFP-IRES-PuroR; 각각 5 μg)와 전이체효소 벡터(p2T-CAG-mT2TP; 5 μg)를 전기천공 시스템을 사용하여 해리 세포에 공동 전기포공하여 핵 리포터 오가노이드 라인을 생성^합니다.
   참고: 2.2단계에서 지정한 플라스미드 DNA 양(각 구조체당 5 μg)은 전기천공 반응당 약 500–1,000개의 오가노이드에 최적화되어 있습니다. 전기천공 시에는 전기공공이 측정한 임피던스가 25–55 Ω 내에 있는지 확인하세요. 25 Ω 이하의 임피피드는 과도한 셀 밀도 또는 완충 전도도 문제를 나타냅니다; 임피던스가 55 Ω 이상이면 세포 수가 부족하거나 세포 생존성이 낮다는 신호입니다. 임피던스가 이 범위를 벗어나면 셀 농도를 조정하거나 전기천공 버퍼를 교체하세요.
3. 전기포공 후, Wnt 조건 배양지에 10 μM Y-27632 이하이드로클로라이드를 보충하여 3일간 세포 회복과 오가노이드 재형성을 지원한다.
4. 전기천공 후 일주일 후 충분한 회복을 위해 과발현 구조물(H2B-iRFP 라인의 푸로마이신(2 μg/mL) 또는 H2B-mCherry 라인의 경우 블라스티딘(10 μg/mL))을 투여하여 선택 압력 전 충분한 회복을 위해 항생제 선택을 시작한다.
5. 2주간 연속 선발을 유지하세요.
6. 적절한 필터 세트를 사용하여 후형형광 현미경 아래에서 형광 오가노이드 클론을 선별하세요.
7. 선택된 클론을 재조합 트립신 유사 해리 시약으로 단일 세포로 해리시키고, Wnt 조절 배지에서 2주간 증식한 후 ENR 배지로 전환합니다.
8. 형광 신호의 균일한 핵 위치 확인과 통로 전반에 걸친 안정적인 발현을 확인하여 리포터 라인을 검증합니다.
9. 리포터 도입이 오르가노이드 성장 속도, 형태, 분화 능력에 영향을 미치지 않는지 표지되지 않은 부모 계통과 비교하여 검증합니다.
10. 막 국소 또는 세포골격 단백질의 판독을 가능하게 하려면, 관심 있는 형광 보고체(예: mNeonGreen 표지된 마이오신-II)를 H2B 핵 리포터와 동일한 오가노이드 라인에 공동 발현시킵니다.
    참고: 확립된 H2B 리포터 오가노이드 라인은 확장 및 냉동 보존이 가능합니다. 이 라인들은 후속 모자이크 실험의 다목적 기준선 역할을 하며, 동일한 H2B 표지 배경에 추가 리포터나 유전적 돌연변이를 도입하여 4절에서 설명한 모자이크 워크플로우와 호환되는 라인 라이브러리를 생성할 수 있습니다.

3. 인간 장 내 오가노이드 내인성 운명 보고자 생성

1. Artegiani 등7에서 설명한 CRISPR 매개 상동 독립 표적 통합(CRISPR-HOT)을 사용하여 인간 장 오가노이드에서 MUC2 형광 녹인 리포터를 생성^합니다.
2. He 등에서 설명한 대로 상동 지향 수리(HDR)를 통해 인간 장 오가노이드에서 DEFA5 형광 노크인 리포터를 생성^한다.
   참고: CRISPR-HOT(3.1단계)과 HDR(3.2단계)은 내인성 녹인 리포터를 생성합니다.
3. MUC2와 DEFA5에 대해 각각 형광 신호와 항체 염색의 공동 위치성을 확인하여 두 리포터 발현을 검증합니다.
4. 리포터 도입이 오르가노이드 성장, 형태 또는 분화 능력을 변화시키지 않는지 확인하라.
   참고: CRISPR-HOT 접근법은 운명 표지 이상의 범위에 적용되며, 인간 및 쥐 오가노이드 모두에서 Myosin-II, E-cadherin, ZO-1과 같은 막 국소화 및 세포골격 단백질에 대한 내인성 형광 보고자를 생성하는 데 사용될 수 있습니다.

4. 모자이크 오가노이드의 생성

1. 모자이크 오가노이드 생성 3일 전, 두 오가노이드 계통을 Wnt 조건 배지에 전달하여 줄기세포 확장을 촉진하고 해리 중 세포 생존력을 극대화합니다.
2. 모자이크 생성 당일, 48웰 플레이트의 각 웰에 5% BME 20 μL 두께를 DMEM에 코팅하여 세포 부착을 위한 얇은 접착층을 제공합니다. 37°C에서 1시간 배양하세요.
3. BME는 얼음처럼 차가운 베이스 매체를 추가하여 용해시키고, 각 라인에서 300 × g에서 4°C에서 5분간 원심분리하여 각각의 오가노이드를 따로 채취합니다. 오가노이드를 37°C의 효소 세포 분리 용액에서 5–7분간 배양하여 단일 세포로 분리시킵니다. 기계적 해리를 돕기 위해 P1000 피펫을 사용해 서스펜션을 반복적으로 피펫 세척하세요. 밝은 필드 현미경으로 해리를 관찰하고, 주로 단일 세포나 2–10개의 세포로 이루어진 작은 오가노이드 조각이 보일 때 과도한 얼음 냉각 베이스 배지를 첨가하여 반응을 멈추세요.
4. 300 × g에서 4 °C에서 5분간 원심분리하여 펠릿 세포를 만듭니다. 선택적으로: 각 세포 현탁액을 40 μm 세포 체로 여과하여 잔여 덩어리, 세포 잔해, BME 겔 조각을 제거합니다.
   참고: 이는 깨끗한 세포 현탁을 보장하고, 모자이크 균일성을 개선하며, 미리 형성된 세포 군집에서 발생하는 대규모 클론 패치의 위험을 줄여줍니다. 세포 집단 간 경계를 넓히기 위해서는 필터링이 권장되지 않습니다.
5. 트리판 블루 배제를 사용하여 세포 생존성을 평가하고 생존 가능한 세포를 세는 것. 두 세포 집단을 원하는 비율(예: 1:1, 1:3, 또는 1:9)으로 결합하여 총 300,000개의 세포를 500 μL Wnt 조절 배지에 10 μM Y-27632 이하이드로클로라이드를 보충합니다. 부드럽게 피펫으로 잘 섞으세요.
   참고: 혼합 비율은 분석 유형을 결정합니다: 낮은 리포터 대 표지 비율(예: 1:9)은 표지되지 않은 이웃 세포 사이에서 개별 표지된 세포를 분리하여 막 및 세포골격 신호를 단일 세포에 명확히 귀속시킬 수 있게 합니다. 리포터 셀의 높은 비율(예: 9:1)은 이 관점을 뒤집어, 표지되지 않은 셀 주변의 이웃 반응을 포착할 수 있게 합니다.
6. 셀 현탁액을 코팅된 48웰 플레이트에 시딩합니다. 플레이트를 200 × g에서 실온에서 5분간 원심분리한 후 37°C에서 배양합니다.
7. 24시간 후에는 P200 피펫 팁으로 긁어 세포층을 기계적으로 분리하고, 얼음 식은 베이스 배지나 셀 스크레이퍼로 철저히 세척합니다. 분리된 골재는 300 × g에서 4 °C에서 3분간 원심분리하여 추가 기계적 전단 없이 수집합니다. BME에서 응집체를 재현탁하고 이미징 호환 샘플 운반체로 플레이트를 만듭니다. ENR 매체에서의 배양.
   참고: BME 없이 2D 집단 단계는 두 세포 집단의 소금과 후추 분포를 가진 잘 혼합된 모자이크 오가노이드를 생성하는 데 매우 중요합니다.
8. 인간 모자이크 오가노이드의 경우, Wnt 조건 배지와 ENR을 인간 확장 배지로 교체하세요(표 2); 다른 모든 단계는 변함이 없습니다.

5. 공초점 생세포 영상을 위한 샘플 준비

1. 유리 하단 영상 챔버(예: 고성능 #1.5 붕규산 커버슬립이 장착된 24웰 유리 바닥판)를 사용하여 고수치 개구경(NA) 공초점 대물물과의 광학 호환성을 보장합니다.
2. 오가노이드-BME 현탁액을 유리 바닥 중앙 근처에 얇은 돔(≤ 30 μL) 형태로 도금합니다. 37 °C로 옮기기 전에, 플레이트를 4 °C에서 5–10분간 배양하여 오가노이드가 중력에 의해 유리 바닥 쪽으로 가라앉도록 하여 BME 겔레이션을 진행합니다.
   참고: 이로 인해 오가노이드와 커버슬립 사이의 작업 거리가 줄어들어 역현미경으로 이미지 품질을 극대화합니다.
3. 37°C로 옮기고 BME가 20–30분간 굳어지도록 합니다. 그 다음 24웰당 500 μL 예열된 성장 배지를 추가합니다. 도금 후 최소 24시간 동안 오르가노이드가 회복하고 형태를 확립할 시간을 두고, 라이브 이미징을 시작하세요.
4. 장기 영상 촬영 중 증발을 최소화하기 위해 가습된 스테이지 탑 인큐베이션 챔버를 사용하세요. 시료를 영상 촬영 1–2시간 전에 현미경 스테이지에 올려 열평형을 유지하고 획득 시 Z-드리프트를 최소화하세요.
5. 영상 촬영 내내 스테이지 상단 인큐베이터가 37 °C와 5% CO₂를 유지하도록 하세요.
6. 유리 바닥 근처(덮개슬립에서 ≤50 μm 떨어진 곳)에 건강한 형태를 가진 선택적인 오가노이드: 쥐 오가노이드는 명확한 지하물 출아 구조나 인간 오가노이드의 낭포성 출아 구조. 신호 품질과 추적 정확도가 영상 깊이에 크게 저하되므로 BME 깊숙이 위치한 오가노이드는 피해야 합니다.
   참고: BME와 배양 배지 모두에 페놀 적색이 존재해도 이 프로토콜에 사용된 형광 리포터(H2B-mCherry, H2B-iRFP, MUC2-mNeonGreen, DEFA5-dsRed)는 신뢰할 수 있는 핵 검출과 단일 세포 추적을 위한 충분한 신호 대 잡음비를 제공하므로 상당한 자가형광 또는 영상 인공물을 유발하지 않습니다. 그러나 약한 리포터나 추가 형광 채널을 사용하는 실험의 경우, 페놀 적색 없는 BME와 배양 배지로 전환하는 것이 도움이 될 수 있습니다.

6. 공초점 이미지 획득

1. 스테이지 상단 인큐베이터(37 °C, 5% CO₂), 모터 구동 Z-드라이브, 사용 중인 형광체에 적합한 레이저 라인이 장착된 레이저 주사 공초점 현미경을 사용하세요.
2. 실험 요구사항에 따라 목표를 선택하세요. 40×/1.10 NA 수중 대물렌즈를 0.62 mm 작업 거리로 사용하여 BME를 더 깊이 촬영하세요. 다중 오가노이드 또는 넓은 시야 획득을 위해 작동 거리 0.62mm의 20×/0.75 NA 대물렌즈를 사용하세요.
   참고: 더 높은 NA는 빛 수집, 해상도, 광학 단면화를 개선하기 때문에, 40×/1.10 수중 침수 대물렌즈는 BME 내부의 미세한 디테일을 해상도로 맞추는 반면, 더 높은 배율은 필드를 한두 개의 오가노이드로 제한합니다. 20×/0.75 대물렌즈는 빛을 덜 수집하고 단면도 덜 촘촘하지만, 넓은 시야로 한 번에 많은 오가노이드를 포착할 수 있어 집단 규모나 다위 촬영에 더 적합한 선택입니다.
3. 샘플과 침지 매체가 현미경 스테이지에서 최소 1–2시간 동안 열적으로 평형을 이루도록 한 후 채취를 시작하세요(단계 5.8).
4. 처음 몇 시간 동안 모든 위치에서 초점을 확인하고, 드리프트가 쌓이기 전에 수동으로 보정하세요.
   참고: 초점 상실과 이미지 드리프트는 장기 공초점 획득 시 흔히 발생하는 문제이므로 적극적으로 관리해야 합니다. 물 침수 대물렌즈의 경우, 물 대신 물과 일치하는 굴절률(n = 1.333)을 사용하는 침수 오일을 사용하여 증발을 없애면서도 물에 담그는 광학적 특성을 유지합니다.
5. 각 형광체별로 여기 및 방출 설정을 설정하세요. 교차 블리드를 최소화하기 위해 형광 채널을 동시에 획득하지 않고 순차적으로 획득하여 한 번에 하나의 레이저 라인만 활성화되도록 합니다. 채널 분리를 유지하면서 각 시간대의 총 획득 시간을 줄이기 위해 양방향 순차 스캐닝을 사용하세요.
   참고: 잔류 교차 블리드를 정량화하고 필요시 스펙트럼 혼합 보정을 적용하기 위해 단일 색상 리포터만 발현하는 단일 색상 대조 오가노이드를 포함하세요.
6. 2색 마우스 모자이크 오가노이드의 경우, H2B-mCherry에는 561 nm, H2B-iRFP670에는 638 nm 여기를 사용하고, 적절한 방출 필터를 사용하여 스펙트럼 누출을 최소화합니다. 인간 장 오가노이드의 경우, MUC2-mNeonGreen은 488nm, DEFA5-dsRed는 561nm의 여기를 사용합니다.
   참고: Hoechst 33342와 같은 생 핵 염료나 극적색 형광 DNA 염료는 유전적 핵 표지자를 대체할 수 있는데, 검출 파이프라인은 특정 형광체가 아닌 핵 신호에 의해 작동하기 때문입니다. 특히 ~400 nm 여기를 가진 Hoechst는 반복적인 조명 시 광독성 및 증식 방지 효과를 낼 수 있으므로, 농도를 낮추고 광독성이 낮은 광독성 원적색 염료를 선호하여 장시간 라이브 이미징을 할 수 있습니다.
7. Z-스택을 2μm 간격으로 25–35개의 광학 섹션으로 설정하세요. 쥐 장내 오가노이드는 5–10분, 인간 오가노이드는 15–30분으로 시간 간격을 설정합니다.
   참고: OrganoidTracker를 이용한 신뢰할 수 있는 핵 탐지를 위해 다음 설정을 시작점으로 권장합니다: 40배 수중 대물렌즈, 스캔 속도 600Hz, 줌 팩터 0.75×, XY 픽셀 크기는 0.38 μm입니다. 이러한 설정은 개별 핵을 분해할 수 있는 충분한 공간 샘플링을 제공하면서도 z-스택당 획득 시간을 다단계 장기 영상 촬영에 적합한 한도 내에서 유지합니다.
8. 레이저 출력은 최대한 낮게 유지하되, 핵이 명확히 분해될 때까지 증가시키세요. 다단계 타임랩스 촬영을 시작하세요. 모든 위치에서 각 시간대별 총 획득 시간이 설정된 시간 간격의 90%를 초과하지 않도록 하여 무대 이동과 자동 초점 조정을 수용하세요. 생물학적 질문에 따라 12–72시간의 이미지.
   참고: 긴 오르가노이드트래커 실행을 시작하기 전에 단일 z-스택을 확보하여 식별 테스트를 하십시오. 놓치거나 잘못된 탐지가 거의 없는 신뢰할 수 있는 식별은 설정이 적절함을 확인시켜 줍니다. 그렇지 않으면 레이저 출력, 검출기 이득, 또는 Z-스텝을 조정한 후 진행하세요. MUC2 양성 고블릿 세포나 DEFA5 양성 판네스 세포의 출현과 같은 분화 사건을 포착하는 데는 일반적으로 48–72시간이 소요됩니다. 세포 압출과 같은 단기 역학은 12–24시간 이내에 포착할 수 있습니다. 광독성은 장기 영상 촬영의 주요 제한 요인입니다. 징후로는 세포 분열 지연, 세포자멸사, 핵응축, 오가노이드 붕괴 등이 있습니다(그림 2). 내부 참조로 영상화되지 않은 제어 오가노이드를 포함하는 것이 권장됩니다. 관찰되면 레이저 출력을 줄이거나 시간 간격을 늘려야 합니다.

7. OrganoidTracker와 같은 반자동 오르가노이드 세포 추적 소프트웨어 도구를 이용한 단일 세포 추적 및 계통 재구성

1. https://github.com/jvzonlab/OrganoidTracker 의 지침에 따라 OrganoidTracker를 설치하세요.
   참고: 이 소프트웨어는 numpy, scipy, matplotlib, tensorflow가 포함된 Python 3.8 이상이 필요합니다.
2. 타임랩스 데이터셋을 OrganoidTracker에 불러와. 허용되는 파일 형식으로는 TIFF 스택, ND2, LIF가 있습니다. 신경망 기반 핵 탐지기를 핵 채널(H2B-mCherry 또는 쥐 오가노이드의 경우 H2B-iRFP)에서 실행합니다.
   참고: 소프트웨어에 제공된 사전 학습 모델은 H2B 표지된 장 오가노이드 핵에 최적화되어 있어 MUC2-mNeonGreen 또는 DEFA5-ds적혈 양성 세포를 직접 식별할 수 없습니다.
3. 자동 검출을 검토하고 수동으로 수정하며, 위양성(잔해, 자가형광 물질, 중복 집계된 유사분열 수치에서의 검출), 위음성(밀집된 영역이나 오가노이드 주변부의 누락된 핵), 그리고 두 세포가 가까이 지나갈 때 발생하는 잘못된 세포 식별 할당에 초점을 맞춥니다.
4. 연결 알고리즘을 실행하여 시점 간 탐지를 연결하고 셀 궤적을 재구성합니다. 링크를 수동으로 검토하며, 특히 세포 분열 사건(한 트랙이 두 개의 딸 트랙으로 분열됨)과 세포 방출 이벤트(세포가 상피를 떠날 때 트랙 종료)에 주의를 기울이세요.
   참고: 모자이크 오가노이드의 경우, 1차 핵 채널에서 검출 및 추적을 수행한 후, 각 추적된 세포를 두 핵 채널 간 형광 강도 비율에 따라 집단 A 또는 B에 속하도록 분류하세요.
5. 소프트웨어의 "수동 추적" 옵션을 사용해 인간 운명 리포터 오가노이드를 추적하세요. 수동 추적 중 삽입된 세포 중심 위치 주변의 정의된 ROI 내 평균 신호 강도를 측정하여 리포터 형광을 정량화합니다. 기자의 강도가 정해진 임계점을 넘는 시점이 운명에 대한 약속을 나타냅니다. MUC2-mNeonGreen 신호의 시작은 고블릿 셀 약속을 정의하며, DEFA5-dsRed 신호의 시작은 Paneth 세포 약속을 정의합니다.
6. 소프트웨어의 점진적 저장 기능을 사용해 정기적으로 추적 프로젝트를 저장하며, 이를 통해 수정 과정을 일시정지했다가 재개할 수 있습니다. 추적 데이터(셀 위치, 계보 트리, 셀 분류 포함)를 Python 또는 R에서 하위 분석을 위해 내보내.

8. 세포 운명 전이 및 단일 세포 행동의 정량화

1. 세포 유형 전이를 정량화하기 위해, 추적 내 리포터 채널 강도에 따라 각 DEFA5-dsRed 음성 세포가 처음으로 DEFA5-dsRed 양성(Paneth 세포 할당)으로 전환되는 시점을 식별합니다. 각 추적 세포에 대해 MUC2-mNeonGreen 채널과 DEFA5-dsRed 채널의 형광 강도를 시간에 따라 추출하여 두 리포터 간의 시간적 관계를 모니터링합니다. 개별 세포별로 이중 채널 강도 추적 경로를 그래프로 작성하여 리포터 역학 간 상관을 식별합니다.
   참고: 개별 추적 세포에서 두 채널을 동시에 모니터링하는 것은 고블릿 세포 참여(지속 중인 MUC2-mNeonGreen 활성화)와 판네스 세포 참여(일시적 MUC2-mNeonGreen 활성화 후 DEFA5-dsRed 발현)를 구분하는 데 필수적입니다. 단일 채널 분석만으로는 이러한 역동성을 포착하기에 부족하며, 초기 판네스 세포 전구체를 고블릿 세포로 잘못 분류할 수 있습니다.
2. 모자이크 오가노이드에서는 추적된 각 세포별로 세포별 행동 지표를 추출하는데, 여기에는 세포 수명(마지막 분열부터 압출 또는 영상 종료까지), 분열 속도, 이동 속도 등이 포함됩니다. 관심 있는 보고자가 함께 발현된 경우, 분할, 이동, 압출과 같은 특정 사건에서의 동적 변화를 시간에 따른 형광 강도를 정량화합니다. 이 측정값을 표지된 세포의 지역 이웃 맥락과 연관시키기 위해 라벨이 붙은 셀의 즉각적인 비라벨 이웃 세포의 행동을 비교합니다.
   참고: 두 유전자형이 동일한 오가노이드에 혼합되어 있을 때, 두 집단 간 이 지표들 중 하나라도 체계적으로 차이가 있다면 한 유전자형이 다른 유전자형보다 경쟁 적합도에 유리함을 나타낼 수 있습니다.
3. 적절한 검정을 사용하여 통계 분석을 수행하세요. 운명 헌신 시기나 수명, 이동 속도, 분열률 같은 세포별 지표를 비교하려면 Mann-Whitney U 검정을 사용하세요. 시간에 따른 리포터 강도 역학을 비교할 때는 동일한 셀 내에서 반복되는 측정값을 고려하기 위해 선형 혼합 효과 모델을 사용하세요.
   참고: 모든 정량화는 수작업으로 수정된 추적 데이터에 대해 수행되어야 합니다. 수정되지 않았거나 부분적으로 수정된 데이터셋은 운명 약속 시기, 공간 할당, 행동 지표 계산에 체계적인 오류를 초래합니다. 수작업으로 수정할 충분한 시간을 예산에 두고 수량화로 진행하세요(7절 참조).

결과

4절에서 설명한 프로토콜에 따라, H2B-mCherry 및 H2B-iRFP 표지된 모자이크 오가노이드 세포 집단이 씨앗 후 48시간 이내에 형성됩니다. 성공적인 모자이크 형성은 분리 정도에 따라 소금과 후추 분포 또는 두 개체군 사이에 명확한 경계가 있는 것이 특징입니다. 소금과 후추 분포란 두 집단이 무작위로 단일 세포 단위로 혼합되는 것을 의미하며, 각 집단의 세포들이 단일 세포 수준에 흩어져 있고 큰 클론 도메인은 없습니다. 반면, 정의된 경계는 동일한 오가노이드 내 각 세포 집단의 일관된 패치를 만듭니다. 세포 분산의 정도는 해리 단계의 지속 시간과 피펫팅의 활력에 의해 조절된다: 철저한 단일 세포 해리는 소금과 후추 같은 모자이크를 만들고, 부드러운 단편화는 작은 클론 군집을 보존한다(그림 3A).

모자이크 표지는 균일 표지된 조직에서는 해결할 수 없는 과정을 단일 세포로 분석할 수 있게 합니다. 관심 있는 리포터(예: 형광 마이오신-II 리포터)를 공동 발현하는 개별 세포가 표지되지 않은 이웃 세포들에 둘러싸여 있을 때, 이동, 분열 또는 돌출 중 세포골격 역학은 명확히 해당 세포에 귀속될 수 있습니다(그림 3B). 핵 H2B 리포터는 모자이크 내에서 유익한 세포 별자리를 식별하는 데 도움을 주며, 수명, 분열 속도, 리포터 강도 역학과 같은 세포별 측정값도 추적 데이터에서 추출할 수 있습니다(그림 3C). 두 유전자형이 혼합될 경우, 이러한 세포당 지표를 집단 간 비교하여 경쟁 적합도 차이를 평가할 수 있습니다.

MUC2-mNeonGreen 및 DEFA5-dsRed 운명 리포터를 가진 인간 장 오가노이드에서는 분비 세포 운명 확률이 며칠에 걸쳐 점진적으로 증가하는 것으로 나타난다. 성숙 배지에서 배양된 오르가노이드는 7일째에 유리 바닥 플레이트로 옮겨져 공초점 생세포 현미경으로 영상화되었습니다(그림 4A). 타임랩스 영상은 두 가지 뚜렷한 리포터 역학을 보여줍니다: 고블릿 세포는 영상 기간 내내 높은 MUC2-mNeonGreen 발현을 활성화하고 유지하는 반면, Paneth 세포는 초기 MUC2-mNeonGreen 활성화 후 점진적으로 신호 감소와 이어지는 DEFA5-dsRed 활성화⁶ (그림 4A)를 보입니다. 단일 세포 정량화는 개별 세포 수준에서 이 연속적 전이가 확인되어 (그림 4B), 판에스 세포의 결정이 표지되지 않은 전구세포로부터 직접 나오는 것이 아니라 일시적인 MUC2 발현 중간 상태를 통해 진행된다는 것을 시사합니다. 여러 추적 세포 간의 평균 강도 곡선은 이 패턴이 집단 수준에서 일관성을 보이며, Paneth 세포 전구체는 MUC2-mNeonGreen과 DEFA5-dsRed 신호 사이에 특징적인 역관계(역 관계)를 보인다는 것을 확인시켜 줍니다(그림 4C). 이 데이터를 종합해 보면, 이중 리포터 시스템이 단일 세포 해상도에서 서로 다른 분비 운명 경로를 해명한다는 것을 보여줍니다.

그림 1: 인간 및 쥐 장내 오가노이드에서 공초점 생세포 영상과 단세포 추적을 통합하고, 두 가지 상호 보완적인 리포터 전략을 결합한 워크플로우. (A) 모자이크 오가노이드 생성 워크플로우의 개요. H2B-mCherry(마젠타) 또는 H2B-iRFP(녹색)를 발현하는 생쥐 장 오가노이드는 단일 세포로 분리되어 정해진 비율로 혼합된 후 BME 코팅된 판에 24시간 동안 응집체를 형성한 후 다시 BME에 박힙니다. (B) 인간 장 오가노이드 분화의 개략적 개요. MUC2-mNeonGreen(잔 세포, 녹색)과 DEFA5-dsRed(파네스 세포, 마젠타) 내인성 녹인 리포터를 발현하는 인간 오가노이드는 2단계 프로토콜을 통해 분별합니다. 오르가노이드는 먼저 패턴 배지에서 14일간 배양한 뒤, 7일에서 10일간 성숙 배양지를 진행합니다. 분화 과정에서 오르가노이드는 낭포성 구형 형태에서 광범위하게 출아오르는 구조로 전환되며, 여기에는 MUC2-mNeonGreen 양성 고블릿 세포와 DEFA5-ds적색 양성 Paneth 세포 등 주요 장 세포 유형이 존재합니다. (C) 핵 리포터를 발현하는 쥐 모자이크의 3D 타임랩스 공초점 영상. (D) 반자동 오가노이드 세포 추적 소프트웨어 도구를 이용한 단일 세포 추적 및 계통 재구성. 검출된 핵은 시간 시점을 넘나들며 세포 경로와 계통수를 재구성하여 세포 분열, 이동, 돌출 사건의 정량화를 가능하게 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: 건강한 인장 오가노이드와 광독성 인장 오가노이드의 라이브 공초점 영상 비교. (A) 건강한 인체 장 오가노이드의 대표적인 밝은 시야 및 형광 이미지. 건강한 오가노이드는 주변 배지에 세포 잔해가 없고 명확한 낭포성 또는 출아 형태를 보입니다. (B) 광독성 손상을 보여주는 인간 장 오가노이드의 대표적인 밝은 시야 및 형광 이미지. 광독성의 징후로는 주변 배지에 세포 잔해가 축적되거나, 핵 응축, 세포 분열이 멈추는 현상이 있습니다. H2B-mCherry 형광 이미지는 최대 강도 투영으로 표시됩니다. 스케일 바, 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하세요.

그림 3: 쥐 장 오가노이드에서 모자이크 오가노이드 생성 및 세포 골격 역학의 단세포 해상도. (A) 해리, 정해진 비율로 혼합, 재집집을 통한 모자이크 오가노이드 생성 도식. 1:9, 1:5, 1:2 세포 비율에서 생성된 모자이크 오가노이드의 대표 공초점 이미지(H2B-mCherry, 녹색; H2B-iRFP, 마젠타)를 사용해 단일 세포 해리(상단 행) 또는 소 조각 해리(하단 행)를 사용했습니다. 단세포 해리는 소금과 후추 혼합 패턴을 만들어내고, 소규모 조각 해리는 더 큰 클론 패치를 만듭니다. 스케일 바, 50 μm. (B) 모자이크 오가노이드의 공초점 이미지로, 조밀한 집단(왼쪽) 또는 드문드문한 집단(오른쪽)은 Myosin-II-mNeonGreen(녹색)을 발현하고, 다른 집단은 H2B-iRFP(마젠타)만 발현합니다. 점선 상자는 (C)에서 확대된 영역을 나타냅니다. 스케일 바, 20 μm (C) 타임랩스 시리즈, 세포 제거 순간(t = 0분)에 맞춰 8분 간격으로 세포 돌출을 보여줍니다. 상단 행(화살촉): 표지되지 않은 세포가 Myosin-II-mNeonGreen을 발현하는 이웃으로 둘러싸여 이웃 반응을 드러내는 돌출. 하단 행(별표): 표지되지 않은 이웃 세포들로 둘러싸인 개별 Myosin-II-mNeonGreen 발현 세포의 돌출, 피질 마이오신 역학을 분출 세포에 명확히 귀속시킬 수 있게 하는 모습. 스케일 바, 10 μm. 오른쪽: 세포 제거 순간(t = 0분)에 정렬된 분출 세포의 시간에 따른 정규화된 마이오신-II-mNeonGreen 형광 강도. 마이오신-II는 압출 전 몇 분 동안 점진적으로 축적되며, 제거 시점에 최고조에 달합니다. 음영 처리된 영역은 표준편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4: MUC2-mNeonGreen 및 DEFA5-dsRed 운명 리포터를 이용한 인간 장 오가노이드의 분비 세포 운명 전환 실시간 모니터링. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.

(A) 성숙 배지에서 배양하고 7일째부터 촬영한 인간 장 오가노이드의 대표적인 타임랩스 공초점 이미지. MUC2-mNeonGreen(녹색)은 잔 세포를, DEFA5-dsRed(마젠타)는 Paneth 세포를 표시합니다. 스케일 바, 20 μm. (B) 대표적인 Paneth 세포에서 MUC2-mNeonGreen(녹색)과 DEFA5-dsRed(마젠타) 형광 강도를 시간에 따라 단세포 정량화했으며, 초기 MUC2-mNeonGreen 활성화 후 점진적인 신호 감소 및 이후 DEFA5-dsRed 발현을 보였다. 형광 강도는 임의의 단위(a.u.)로 표시됩니다. (C) 고블릿 셀(n = 7 셀)과 파네스 셀 전구체(n = 8 셀)의 평균 형광 강도 곡선으로^{, 시간에 따른} MUC2-mNeonGreen(녹색)과 DEFA5-dsRed(마젠타) 신호 역학을 시간에 따른 변화 6. Paneth 세포 전구체의 경우, 시간은 DEFA5-dsRed 신호가 처음 나타나는 시점(t = 0 h)에 맞춰집니다. 고블릿 세포는 시간이 지남에 따라 일관되게 높은 MUC2-mNeonGreen 강도를 유지하는 반면, Paneth 세포 전구체는 MUC2-mNeonGreen 신호와 DEFA5-dsRed 신호 사이에 특징적인 역관계 관계를 보입니다. 음영 처리된 영역은 표준편차를 나타냅니다.

구성 요소	가축 농도	최종 집중
어드밴스드 둘벡코의 변형 이글 미디엄/F12 (어드밴스드 DMEM/F12)		기본 매체
젠장	1M	10mM
글루타맥스	200m	2mM
N2 보충제	100배	1회
B27 보충제	50배	1회
N-아세틸시스테인	500mM	1mM
페니실린/스트렙토마이신	10000U/ml, 10000ug/ml	100U/ml, 100ug/ml
재조합 쥐 EGF		50ng/ml
재조합 생쥐 노긴		100ng/ml
재조합 인간 R-스폰딘 1		500ng/ml

표 1: 쥐 장 오가노이드의 배양 배지.

구성 요소	가축 농도	최종 집중
어드밴스드 둘벡코의 변형 이글 미디엄/F12 (어드밴스드 DMEM/F12)		기본 매체
젠장	1M	10mM
글루타맥스	200m	2mM
B27 보충제	50배	1회
페니실린/스트렙토마이신	10000U/ml, 10000ug/ml	100U/ml, 100ug/ml
프리모신	50mg/ml	100ug/ml
R-스폰딘 조건 배지 (U-단백질 발현)		2%
노긴 컨디셔닝 미디엄 (U-단백질 익스프레스)		2%
N-아세틸시스테인	500mM	1mM
니코티나마이드	1M	10mM
인간 재조합 EGF	500ug/ml	50ng/ml
A83-01	5mM	500nM
SB202190 (p38 억제제)	30분경	3uM
프로스타글란딘 E2	10mM	1uM
대리인		1000배

표 2: 인간 장 오가노이드의 확장 배지.

구성 요소	가축 농도	최종 집중
어드밴스드 둘벡코의 변형 이글 미디엄/F12 (어드밴스드 DMEM/F12)		기본 매체
젠장	1M	10mM
글루타맥스	200m	2mM
B27 보충제	50배	1회
페니실린/스트렙토마이신	10000U/ml, 10000ug/ml	100U/ml, 100ug/ml
프리모신	50mg/ml	100ug/ml
R-스폰딘 조건 배지 (U-단백질 발현)		2%
노긴 컨디셔닝 미디엄 (U-단백질 익스프레스)		2%
N-아세틸시스테인	500mM	1mM
인간 재조합 EGF	500ug/ml	50ng/ml
A83-01	5mM	500nM
대리인		1000배
CHIR99021	3mM	3uM
재조합 인간 IL-22	10 ug/ml	2ng/ml

표 3: 인간 장 오가노이드용 패턴 매개체.

구성 요소	가축 농도	최종 집중
어드밴스드 둘벡코의 변형 이글 미디엄/F12 (어드밴스드 DMEM/F12)		기본 매체
젠장	1M	10mM
글루타맥스	200m	2mM
B27 보충제	50배	1회
페니실린/스트렙토마이신	10000U/ml, 10000U/ml	100U/ml, 100U/ml
프리모신	50mg/ml	100ug/ml
R-스폰딘 조건 배지 (U-단백질 발현)		2%
노긴 컨디셔닝 미디엄 (U-단백질 익스프레스)		2%
N-아세틸시스테인	500mM	1mM
인간 재조합 EGF	500ug/ml	50ng/ml
A83-01	5mM	500nM
대리인		30000x
재조합 인간 IL-22	10 ug/ml	2ng/ml

표 4: 인간 장 오가노이드의 성숙 배지.

토론

이 프로토콜은 인간 및 쥐 장내 오가노이드에서 생세포 공초점 영상 및 단일 세포 추적을 위한 단계별 워크플로우를 제공하며, 두 가지 상호 보완적인 실험 시스템을 기반으로 합니다: 밀집된 상피 내 개별 세포 행동을 해소하는 모자이크 오가노이드와, 분비 세포 유형 전환을 실시간으로 모니터링하는 MUC2-mNeonGreen 및 DEFA5-dsRed 발현 운명 리포터 오가노이드입니다.

면역형광법이나 단세포 RNA 시퀀싱과 같은 고정 시간점 기법과 비교할 때, 라이브 이미징은 스냅샷이 아닌 전이의 역학을 포착합니다. 크레 기반 계보 추적과 비교할 때, 이는 개별 운명 결정을 식별할 수 있는 시간적 해상도를 제공합니다. 모자이크 접근법은 동일한 조직 맥락 내에서 내부 통제 비교를 추가하여 오가노이드 간 변이성 혼란을 피합니다.

프로토콜의 여러 단계는 성공을 위해 매우 중요합니다. 소금과 후추 분포가 있는 모자이크의 경우, 오가노이드의 단세포 해리는 철저하지만 부드럽게 이루어져야 합니다: 불완전한 해리는 큰 클론 패치를 만들고, 과도한 해리는 생존력을 감소시킵니다(4.3절). BME에 재임베딩하기 전 평면 위에서 24시간 집계 단계는 두 집단의 적절한 혼합에 필수적입니다; 이를 생략하면 모자이크가 제대로 통합되지 않게 됩니다(4.6–4.8절). 영상 중 광독성 관리는 보수적인 레이저 설정부터 시작해 추적 소프트웨어가 과도한 위음성을 발생시킬 경우에만 신중한 보정이 필요합니다(6.8절).

주요 한계는 오가노이드 시스템과 라이브 이미징의 고유한 제약과 관련이 있습니다. 오르가노이드는 세포 행동에 영향을 줄 수 있는 연대, 혈관, 면역 요소가 부족합니다. 공초점 현미경의 경우, 영상 깊이는 커버슬립에서 약 100 μm 이내로 제한되며, 그 이상을 넘어 빛 산란은 신호 품질과 추적 정확도를 저하시킵니다. 다광자 현미경과 광판 현미경은 추가 장비와 프로토콜 적응 비용을 대가로 이 깊이 범위를 크게 확장할 수 있습니다. 반자동 추적 방식은 수동 주석보다 훨씬 효율적이지만, 특히 밀집 조직에서는 상당한 보정 시간이 필요합니다(섹션 7.4).

두 전략 모두 쉽게 확장할 수 있습니다. 핵 마커와 함께 발현된 리포터를 변화시킴으로써, 기계적 역학을 위한 피질 마이오신-II부터 접합 E-카데린(부착 재형성), tq-Ca-FLITS와 ColBD-Twitch와 같은 칼슘 바이오센서, 세포 NAD+/NADH 산화환원 상태를 위한 SoNar와 같은 대사 바이오센서 등 단일 세포 행동의 다양한 측면을 조사할 수 있으며, 이를 통해 동일한 오가^노이드 내에서 세포 정체성, 계통, 생리적 상태를 동시에 읽을 수 있습니다^{. 25, 26, 27}. 혼합 비율을 조정하면 분석이 조정됩니다: 표지된 세포가 드문드문하면 막 신호의 단일 세포 귀인을 가능하게 하고, 표지되지 않은 세포는 이웃 반응을 드러냅니다. 운명 리포터 전략은 CRISPR-HOT 또는 HDR 기반 태깅이 가능한 모든 내인성 유전자좌로 확장될 수 있습니다. 두 접근법을 동일한 오가노이드 내에 결합하면 계통 헌신과 단일 세포 역학을 동시에 추적할 수 있을 것입니다.

더 넓게는, 영상 및 분석 파이프라인은 위, 대장, 간, 췌장 모델 등 다른 상피 조직에서 유래한 오가노이드에도 적용 가능합니다. 유도 다능성 줄기세포(iPSC) 유래 오가노이드는 H2B 기반 핵 표지와 세포 혼합에 의한 모자이크 생성이 직접 전이 가능하며, 이 파이프라인은 환자별 세포 운명 및 경쟁 역학 연구를 가능하게 할 가능성이 있어 유망한 확장입니다. 가스트룰로이드와 줄기세포 유래 배아와 같은 합성 배아 모델도 단일 세포 추적에 적합하지만, 더 복잡한 기하학과 높은 핵밀도로 인해 반자동 오르가노이드 세포 추적 소프트웨어 도구인 신경망 모델의 재훈련과 영상 매개변수의 적응이 필요할 수 있습니다. 뇌 오가노이드는 크기가 크고 광학 밀도가 높아 공초점 영상 깊이를 제한하는 추가적인 도전 과제를 안고 있습니다. 더불어, 뇌 오가노이드는 의미 있는 영상 실험을 수행하기까지 몇 주에서 몇 달의 분화가 필요하며, 장 오가노이드에 비해 실험 기간이 크게 늘어납니다. 일부 뇌 오가노이드 프로토콜은 BME 임베딩 대신 현탁 배양에 의존하는데, 이는 여기서 설명한 샘플 준비 방식과 호환되지 않고 영상 촬영 전에 매트릭스 내장형 또는 표면 부착 형식에 적응해야 합니다. 광독성이 줄고 영상 깊이가 더 넓어지는 라이트시트 현미경이 이러한 시스템에 더 적합할 수 있습니다¹³. 이러한 확장은 여기서 설명한 상피 오가노이드를 넘어 다양한 3D 모델 시스템에 걸쳐 파이프라인의 광범위한 잠재력을 부각시킵니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
A83-01	Tocris	2939
Accutase Cell Detachment Solution	Innovative Cell Technologies	AT104-500
Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12 (Advanced DMEM/F12)	Invitrogen	12634-010
B27 supplement	Thermo Fisher	17504044
Blasticidin	InvivoGen	ant-bl-05
Cell strainer (40um)	Greiner Bio-one	542140
CHIR99021	Stemgent	04-0004-base
Confocal microscope	Leica	SP8	with climate control for temperature and CO2
Cultrex Basement Membrane Extract (BME)	R&D Systems, Bio-Techne	3533-001-02
Fiji	open source		open source https://imagej.net/software/fiji/
Glass bottom plates	CellVis	P24-1.5H-N
Glutamax	Gibco	35050-061
HEPES	Gibco	15630-080
N2 supplement	Thermo Fisher	17502048
N-acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165
NEPA electroporation system	NEPAGENE	NEPA21
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
NucSpot Live			far-red live-cell nuclear dye
Noggin conditioned medium (U-Protein Express)	IPA Therapeutics	N002
OrganoidTracker	open source		open source https://organoidtracker.org/
p2T-CAG-mT2TP	homemade		protocol to generate the plasmid DOI: 10.1126/science.adr8753
p2T-H2B-iRFP-IRES-PuroR	homemade		protocol to generate the plasmid DOI: 10.1126/science.adr8753
p2T-H2B-mCherry-IRES-BlastR	homemade		protocol to generate the plasmid DOI: 10.1126/science.adr8753
Penicillin/Streptomycin	Gibco	11548876
Primocin	InvivoGen	ant-pm-05
Prostaglandin E2	Tocris	2296
puromycin	InvivoGen	ant-pr
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15
Recombinant Human IL-22	Peprotech	200-22
Recombinant human R-spondin 1	Thermo Fisher	120-38-5UG
Recombinant murine EGF	Thermo Fisher	315-09-500UG
Recombinant murine Noggin	Thermo Fisher	250-38-100UG
R-spondin conditioned medium (U-Protein Express)	IPA Therapeutics	R001
SiR-DNA			far-red live-cell DNA dye
SB202190 (p38 inhibitor)	Sigma-Aldrich	S7076
Suspension plate for organoid culture	Greiner	665102
Trypan blue	Gibco	15250061
TrypLE	Gibco	12605-010
Wnt surrogate	U-Protein Express	custom order
Wnt3A conditioned medium	homemade		The production of Wnt3A conditioned medium can be found here:  https://doi.org/10.1002/cpim.106
Y-27632 dihydrochloride	Abmole Bioscience	M1817