포유류 세포에서 형광현미경을 이용한 형광 펩티딜 억제제 표적 미토콘드리아 ClpXP 표적 시연

요약

이 프로토콜은 공초점 현미경을 적용하여 형광 펩티딜 ClpP 억제제 FAM-FAPAL-CMK(카복시플루오레세인-FAPAL-클로로메틸 케톤)의 선택적 위치 추적을 모니터링하는 정량적 영상 워크플로우를 구축하며, ClpP 억제로 인해 미토콘드리아의 형태학적 변화를 관찰합니다.

초록

미토콘드리아 ATP 의존성 프로테아제는 손상되거나 잘못 접힌 단백질의 분해를 통해 단백질 항상성을 유지하는 데 필수적입니다. 이 중 ClpXP 프로테아제 복합체는 미토콘드리아 기질 내에 위치하며 생리적 및 스트레스 조건에서 미토콘드리아 품질 관리에 기여합니다. 이 연구는 형광 펩티딜 억제제 FAM-FAPAL-CMK의 미토콘드리아 표적화와 포유류 세포 내 ClpXP 억제와 관련된 미토콘드리아 형태학적 변화를 평가하기 위한 정량적 형광 현미경 워크플로우를 입증합니다. HeLa 세포는 FAM-FAPAL-CMK 처리를 하였으며, 미토콘드리아 마커의 면역형광 염색과 정량적 영상 분석을 결합한 공초점 현미경 검사를 이용해 분석하였습니다. Costes 임계값 분석과 Manders의 중복 계수를 이용한 공동위치 분석을 통해 억제제 신호의 미토콘드리아 농축이 입증되었습니다. 그 결과, ClpP 억제는 미토콘드리아 형태를 변화시켰다. 면역블롯 분석 결과 억제제 치료 후 ClpP 단백질 풍부도에 유의한 변화가 없음을 확인하였습니다. 이 연구는 산화 스트레스와 같은 항상성 교란에 반응하여 온전한 세포 내 미토콘드리아 ClpXP 기능을 재현 가능한 영상 기반 워크플로우로 설명합니다.

서론

미토콘드리아 ATP 의존성 프로테아제는 단백질 항상성에 중심적인 역할을 하며, 잘못 접히거나 손상된 단백질 1,2,3,4,5,6을 분해합니다. 이 중 ClpXP는 미토콘드리아 매트릭스에 위치한 이종 올리고머 AAA+ 프로테아제 복합체입니다. ClpX ATPase는 단백질을 인식하고 펼친 후 이를 ClpP 단백질분해 챔버 ^7,8,9로 옮깁니다. 다른 미토콘드리아 프로테아제들과 함께 ClpXP는 정상 및 스트레스 조건, 특히 산화 스트레스 및 대사 교란 ^1,2,4 모두에서 단백질 품질 관리를 유지합니다. 미토콘드리아 단백질 항상성 파괴는 신경퇴행성 및 암과 같은 질병과 연관되어 있어, 온전한 세포 시스템에서 이러한 프로테아제 활성을 이해하는 것이 중요함을 강조합니다 ^3,6,10.

이 분야의 주요 과제는 온전한 세포에서 공간 해상도를 가진 미토콘드리아 프로테아제 활동을 직접 모니터링할 방법이 부족하다는 점입니다. 기존 접근법은 주로 정제된 단백질이나 세포 용해체를 이용한 생화학적 분석에 의존하는데, 이는 상세한 동역학적 정보를 제공하지만 세포 내 맥락을 보존하지 못합니다 11,12,13,14. 화학 생물학 전략은 플루오로생성 펩타이드 기질과 활성 부위 지향 억제제 개발을 통해 이 한계를 부분적으로 해결했습니다. 형광 펩티딜 기질은 ATP 의존성 펩티다아제 활성을 정량적으로 측정할 수 있게 하며, 펩티딜 억제제는 단백질 분해 부위와 가역적 공유 상호작용을 형성하여 선택적 억제 13,15,16,17,18,19를 달성합니다. 이전에 실험실에서 합성된 ClpXP 억제제 FAPAL-CMK가 ClpP²⁰과 공유 결합을 형성하는 것으로 밝혀졌습니다. 본 연구에서는 FAPAL-CMK의 형광 표지 유도체인 FAM-FAPAL-CMK가 ClpP의 기전 기반 억제제로 개발되어 세포 내 위치 시각화를 가능하게 했습니다.

생화학적 분석과 비교할 때, 공초점 형광 현미경은 온전한 세포 내 프로브 분포와 미토콘드리아 형태를 공간적으로 평가할 수 있게 하여 용해액만으로는 얻을 수 없는 정보를 제공합니다. 그러나 효소 분석과 달리 형광 위치 지정은 촉매 활성이나 분자 결합 이벤트를 직접 측정하지 않으며, 프로브 흡수 효율, 미토콘드리아 역학, 영상 조건의 영향을 받을 수 있습니다. 또한, 성공적인 구현은 충분한 프로브 축적과 충분히 해소된 미토콘드리아 네트워크에 달려 있어, 명확하게 구별되는 미토콘드리아 형태를 가진 부착 배양 세포에 가장 적합합니다.

본 연구의 목표는 메커니즘 기반 형광 탐침과 공초점 현미경을 통합하여 미토콘드리아 프로테아제의 위치 및 기능을 온전한 세포에서 모니터링하는 정량적 워크플로우를 확립하는 것입니다. 선택적 화학 탐침과 고해상도 공초점 영상을 결합함으로써, 이 워크플로우는 미토콘드리아 위치 지정, 프로브 분포, 그리고 미토콘드리아 항상성 교란에 대한 형태학적 반응을 평가할 수 있게 합니다. 이는 프로테아제 활성을 직접 측정하는 기존 생화학적 분석법을 보완할 수 있지만 공간 해상도는 부족합니다.

프로토콜

실험은 시중에서 구할 수 있는 HeLa 셀을 사용하여 수행되었습니다. 인간 참가자, 척추동물, 또는 인간 또는 척추동물에서 유래한 주요 생물학적 재료는 사용되지 않았습니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 세포 배양 및 처리

1. Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)에서 10% 태아 소 혈청(FBS)을 보충한 채, 5%_CO2가 포함된 가습 인큐베이터에서 배양.
2. 세포를 멸균 유리 커버슬립에 플레이트 부착하고 24시간 배양하여 세포 부착을 가능하게 합니다.
3. 억제제 FAM-FAPAL-CMK를 DMSO에 용해하여 50 μM 스톡을 준비하고 -20 °C에서 냉동하여 저장합니다.
4. 처리된 세포 샘플의 세포 배양지에 50 nM FAM-FAPAL-CMK를 첨가합니다.
5. 억제제 처리 샘플의 최종 용매 농도와 일치하도록 대조 샘플에 동일한 부피의 DMSO를 첨가하여 어떤 영향도 DMSO에 의한 것이 아님을 보장합니다.
6. 세포를 같은 배양 조건에서 추가로 18시간 배큐한 후 하류 가공에 들어가세요.
   참고: FAM-FAPAL-CMK 억제제는 실험실에서 설계 및 합성되었으며, 이 합성 방법은 이전에²⁰년간 보고된 바 있습니다.

2. 고정 및 투과화

1. 미리 데워진 D-PBS로 세포를 5분간 세척한 후 한 번 반복하세요.
2. 세포를 상온에서 15분간 고정합니다. 여기에는 2.4% (v/v) 포름알데히드, 0.05% (v/v) 글루타알데히드, 0.5% (w/v) 사포닌이 함유된 PHEM 버퍼(68 mM PIPES, 25 mM HEPES, 15 mM EGTA, 3 mM MgCl₂, pH 6.9)가 포함됩니다.
3. 신선한 붕소나트륨 용액(5 mg/mL in D-PBS)을 준비합니다.
4. 세포를 상온에서 15분간 배양하여 잔류 글루타알데히드를 중화시킵니다.
5. 염색 전에 D-PBS로 세포를 세 번씩 각각 5분씩 세척합니다.
   참고: 포름알데히드와 글루타알데히드는 독성 고정제입니다. 후드에서 고정 절차를 수행하고 적절한 개인 보호 장비(장갑, 실험복, 안경 보호구)를 착용하세요. 붕소나트륨은 반응성 환원제이므로 신중하게 다뤄야 합니다. 포름알데히드, 글루타알데히드, 사포닌을 포함한 PHEM 기반 고정 완충제가 면역염색 시 항원 접근성을 유지하면서 미토콘드리아 형태를 보존하도록 선택되었습니다. 포름알데히드와 글루타알데히드는 구조 보존을 위한 단백질 가교 역할을 하며, PHEM의 완충 조성과 pH는 미토콘드리아 초구조²¹의 안정화에 도움을 줍니다. 사포닌은 막 투과를 촉진하여 고정액 침투 속도를 향상시킵니다. 이 고정 전략은 미토콘드리아 네트워크의 왜곡을 최소화하며, 특히 미토콘드리아 형태의 정량적 분석에 적합합니다.

3. 면역형광 염색

1. 상온에서 1시간 동안 차단 세포를 3%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA)이 포함된 차단 버퍼에 사용하며, PBS(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄, pH 7.4)와 0.1%(v/v) Triton X-100을 함께 사용한다.
2. 1차 항체를 차단 완충제에 희석한 상태로 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 마우스 안티-TOMM20(1:500)과 래빗 안티-클프(1:500)를 사용하세요.
3. 세포를 PBS로 세 번씩 각각 5분씩 세척하여 결합되지 않은 1차 항체를 제거합니다.
4. 2차 항체를 차단 완충제에 희석한 상태로 상온에서 1시간 동안 배양합니다. CF405S 접합 마우스 2차 항체(1:500)와 Alexa Fluor 647 접합 토끼 2차 항체(1:500)를 사용하세요.
5. 2차 항체 배양 중과 후에 샘플을 빛으로부터 보호하세요.
6. 3.3단계를 반복합니다.
7. 마운트 커버슬립을 마운팅 매체를 이용해 유리 슬라이드에 부착합니다.
   참고: ClpP와 TOMM20은 FAM 신호와의 스펙트럼 중복을 피하기 위해 405nm와 647nm 아래에서 시각화되었습니다.

4. 이미지 획득

1. 고구경 오일 침수 대물렌즈가 장착된 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 이미지를 획득하세요.
2. 405nm 및 633nm 레이저 라인을 사용하여 형광체를 여기시킵니다. 적절한 이색성 빔 스플리터를 사용하여 여기광을 반사하고 방출된 형광을 검출기에 전달합니다.
3. 픽셀 크기를 35.3 nm(X, Y)로, Z-스텝을 0.1 μm로 설정하여 미토콘드리아 구조의 충분한 축 샘플링을 보장합니다.
4. 1900 x 1900 픽셀(X, Y) 크기의 이미지를 획득하고, 상위 미토콘드리아 신호에서 시작해 미토콘드리아 신호 아래에서 끝나는 Z-스택당 5개의 광학 구간을 수집하여 주요 미토콘드리아 신호가 수집되도록 합니다.
   참고: 대표적인 현미경 획득 설정은 보충 그림 1에 제공되어 있습니다. 헬라 세포의 경우 미토콘드리아는 일반적으로 직경 0.5-1 μm 정도의 얇은 관 구조입니다.²². 따라서 0.5 μm Z-부피는 개별 미토콘드리아 기질의 상당 부분을 포착할 수 있지만, 반드시 전체 세포를 포착하는 것은 아닙니다. 미토콘드리아 구조의 충분한 샘플링과 빠른 이미지 획득을 균형 있게 하여 세포 영상 촬영 중 움직임 관련 아티팩트를 최소화하기 위해 5섹션 Z-스택이 선택되었습니다.

5. 생세포 처리 및 영상

1. 35mm 유리바닥 접시에 HeLa 세포를 DMEM에서 10% FBS와 함께 37°C, 5%_CO2가 포함된 가습 인큐베이터에서 배양합니다.
2. 억제제(최종 농도: 50 nM) 또는 동등한 용량의 DMSO를 시드 후 24시간 후에 세포에 첨가합니다. 표준 배양 조건에서 추가로 18시간 배양합니다.
3. 억제제나 DMSO가 포함된 배양지를 제거하고, 미리 예열된 D-PBS로 세포를 한 번 5분간 세척합니다.
4. 20 nM MitoTracker DeepRed를 포함한 생세포 영상 용액을 추가하세요.
5. 위에서 설명한 현미경 설정을 사용하여 실온에서 라이브 셀 이미징을 수행합니다. 프레임당 스캔 모드에서 광학 단면당 약 4.72초(5개 Z-스택당 약 24초)의 시간을 가진 이미지를 획득합니다.
   참고: Z-스택당 5개의 광학 섹션이 미토콘드리아 구조의 충분한 샘플링과 관리 가능한 획득 시간을 균형 있게 유지하도록 설정되어 있습니다. 또한, 37°C에서의 영상 촬영에 비해 미토콘드리아 운동성을 낮추기 위해 상온에서 사용하는 생세포 영상 솔루션이 사용됩니다. 생세포 영상 중 미토콘드리아의 움직임이 공존 위치 측정의 변동성에 기여할 수 있지만, 모든 샘플에서 일관된 획득 설정이 체계적 편향을 줄이는 데 도움이 됩니다. 대표적인 소프트웨어 설정은 보충 그림 2에 나와 있습니다.

6. 미토콘드리아 형태 분석

1. 피지²³에서 이미지 파일을 열고 Z 프로젝트→ 이미지 → 스택을 선택한 후 최대 강도를 선택하여 Z-스택에서 최대 강도 투영을 생성하세요.
2. Otsu 임계값 측정 방법을 적용하려면 이미지 → Adjust → Threshold로 이동한 후 임계값 옵션에서 Otsu를 선택하세요. 임계값을 분절 미토콘드리아에 적용하세요.
3. Mitochondria Analyzer 플러그인²⁴ 를 실행하고 미토 단위별로 2D 분석 모드를 선택하세요.
4. 미토콘드리아 분석기 출력을 사용해 미토콘드리아 크기(면적)와 둘레를 측정하세요.
5. 미토콘드리아 형량 값을 미토콘드리아 분석기 출력에서 직접 얻으세요. 여기서 형량은 P²/(4πA)로 계산되며, P는 주변 거리, A는 면적을 나타냅니다.
6. 플러그인 내 네트워크 분석 기능을 사용하여 미토콘드리아 연결성을 평가하기 위해 미토콘드리아당 총 가지 길이를 측정합니다.
7. 데이터를 개별 미토콘드리아 측정값의 분포와 30개의 개별 생물학적 복제 중 30개 세포에서 도출된 평균 값으로 제시합니다.
8. 통계 분석 소프트웨어에서 웰치 t-검정 을 사용하여 통계적 유의성을 평가하세요.

7. 공존 위치 분석

1. 피지에서 이미지 파일을 열고 3D 이미지 스택에서 최대 강도의 2D 투영을 생성할 수 있습니다. 일관성을 위해 모든 샘플을 동일한 투영 및 획득 전략으로 분석하세요.
2. 이미지 → 컬러 → 분할 채널을 선택하여 형광 채널을 분할할 수 있습니다.
3. Coloc 2 플러그인을 실행하려면 Coloc 2→ → Plugins 함께 위치화(Colocalization)를 선택하세요.
4. 분석할 적절한 채널을 할당하고 플러그인 설정에서 Costes 임계값 회귀를 활성화하세요. 분석은 셀별로 실행하세요.
5. 맨더스의 중복 계수(M1과 M2)를 기록하여 각 채널에서 서로 공간적으로 일치하는 신호 비율을 평가합니다.
6. Coloc 2 설정에서 Costes 무작위화를 활성화하고, 무작위화 횟수를 50개로 설정하여 통계적 유의성을 평가합니다.

8. 세포 용해액 생성

1. HeLa 세포를 DMEM에 10% FBS로 씨앗 뿌리고, 5%_CO2가 포함된 가습 인큐베이터에서 37°C에서 배양합니다.
2. 씨앗 후 24시간 후에 세포에 50 nM 억제제 또는 그에 상응하는 DMSO를 첨가하고, 표준 배양 조건에서 추가로 18시간 배양합니다.
3. 배양지를 제거하고 미리 예열된 D-PBS로 세포를 5분간 세척한 후 트립신제로 분리합니다.
4. 트립신 추출을 신선한 세포 배지 배지로 소집하고, 300 x g 에서 실온에서 3분간 원심분리합니다. 상원액은 버리세요.
5. 세포 펠릿을 D-PBS에 다시 현탁하고 300 x g 에서 원심분리기에서 3분간 세척하여 세포를 세척하세요. 상원액은 버리세요.
6. 세포 펠릿을 사전 냉각된 용해 완충제(50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM 염화나트륨, 0.1% SDS, 0.5% 디옥시콜레이트 나트륨, 2% CHAPS, 10 mM TCEP, 1 mM PMSF, 1x 프로테아제 억제제 칵테일)에 재현탁합니다.
7. 완전히 용해되도록 얼음 위에서 20분간 인큐베이트하고, 얼음물에 2분간 초음파 분해액을 넣어 완전히 용해되도록 합니다.
8. 원심분리기는 13,000 x g, 4 °C에서 20분 용해합니다.
9. 깨끗한 상청액을 신선한 사전 냉각된 튜브로 옮겨 다음 분석을 진행합니다.
   참고: PMSF는 독성이 있으므로 적절한 개인 보호 장비를 착용한 후드에서 처리해야 합니다. SDS는 자극제이고, 초음파 검사는 열과 에어로졸을 발생시킵니다. 얼음 위에서 용해 및 초음파 검사를 수행하고 기관 안전 지침을 준수하세요.

9. 브래드포드 분석

1. 0.15 M 염화나트륨에 BSA를 사용해 표준 용액 세트를 준비합니다. 농도는 0, 0.02 mg/mL, 0.04 mg/mL, 0.06 mg/mL, 0.08 mg/mL, 0.10 mg/mL입니다.
2. 미지의 세포 용해물을 0.15 M 염화나트륨에 50배, 100배 희석합니다.
3. 피펫은 각 표준 곡선 용액과 미지의 샘플을 96웰 플레이트에 복제합니다.
4. 각 우물에 브래드포드 시약을 추가하세요. 각 웰마다 160 μL 단백질 용액과 40 μL 5x 브래드포드 시약(상업적으로 구할 수 있음)을 사용하세요. 피펫팅으로 부드럽게 섞으세요.
5. 상온에서 10분간 배양한 후 595nm에서 플레이트 리더기를 사용해 흡수를 측정합니다.
6. x축에 BSA 농도를 표시하고, 반복 측정값에서 평균 흡광도를 y축에 표시하여 표준 곡선을 생성합니다.
7. 표준 곡선을 사용하여 샘플의 단백질 농도를 측정합니다. 계산된 값에 희석 계수를 곱해서 원래 농도를 얻습니다.

10. 면역 블롯팅

1. SDS-PAGE에 12% 폴리아크릴아마이드 겔에 같은 양의 세포 용해물을 적재하고 단백질을 분리합니다.
2. PVDF 막을 에탄올에 잠시 담가서 활성화하세요. 전이 버퍼 내 막과 블로팅 페이퍼를 모두 평형으로 맞추세요.
3. 반건식 전달 시스템을 사용하여 젤에서 PVDF 막으로 단백질을 전달합니다.
4. 멤브레인을 5% 무지방 건우유를 TBS(20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.6)에 넣어 1시간 동안 실온에서 부드럽게 저어줍니다.
5. 1차 항체를 블로킹 버퍼에 희석한 상태로 실온에서 1시간 동안 부드럽게 교반하며 막을 배양하세요. 토끼용 항 ClpP 제(1:2000)와 마우스 항베타-액틴 제(ACTB, 1:10,000)를 사용하세요.
6. 막을 TBST(20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1% (v/v) Tween 20, pH 7.6)로 세 번 세척하여 한 번 세척한 후 5분간 분리된 항체를 제거하세요.
7. HRP 결합 2차 항체를 차단 완충제(1:3000)에 희석한 상태로 실온에서 1시간 동안 부드럽게 교반하여 배양합니다.
8. 세척 단계를 반복하세요.
9. 화학발광 검출 시약을 사용해 단백질 밴드를 검출합니다.

11. 덴시토메트릭 분석

1. 피지에서 서부 얼음 이미지를 열어보세요.
2. 이미지 타입을 8비트로 변경하면 이미지 → 타입 → 8 비트로 변경하세요.
3. Process에서 이미지 배경을 빼→ 배경을 빼세요. 밝은 배경을 확인하고 롤링 볼 반경을 50.0 픽셀로 설정하세요.
4. 직사각형 도구로 첫 번째 레인에서 밴드를 원을 그리고, 젤 분석→ 선택하고 첫 번째 레인→ 선택하세요.
5. 직사각형 도구를 두 번째 레인으로 옮기고, 분석 → 젤을 선택→ 다음 레인을 선택하세요. 이 과정을 모든 차선이 선택될 때까지 반복합니다.
6. 블로→ 밀도를 분석해 플롯 레인→ 분석하세요.
7. 직선 도구를 사용해 밴드 밀도 피크 하단에 선을 그고, 완드 툴로 밴드 밀도를 읽으세요.
8. 로딩 제어 블롯 이미지에서 11.1–11.8 단계부터 같은 절차를 반복합니다.
9. 밀도(ClpP)를 밀도(ACTB)로 나누어 상대 밴드 밀도를 보고합니다.

결과

ClpP 억제는 미토콘드리아 형태와 네트워크 조직을 변화시킵니다
미토콘드리아 형태학을 평가하여 ClpP 억제가 HeLa 세포 내 미토콘드리아 조직에 변화를 주는지 여부를 확인하였습니다. 대표성 형광 영상은 대조군과 FAM-FAPAL-CMK 처리 세포 간에 미토콘드리아 조직에 뚜렷한 차이를 보여주었습니다(그림 1A). 정량적 분석 결과, 미토콘드리아 면적은 대조군 세포에서 1.15 ± 4.8 μm² (n = 8013)에서 억제제 처리 후 0.47 ± 1.1 μm² (n = 8516)로 감소하였습니다. 이 감소는 억제 시 미토콘드리아 둘레가 8.1 ± 20 μm에서 4.6 ± 6.4 μm로 감소하는 것을 동반했다(그림 1B, C). 또한, 미토콘드리아 형태 인자는...

토론

펩티딜 클로로메틸 케톤 FAPAL-CMK¹⁵는 이전에 미토콘드리아 ATP 의존성 프로테아제 ClpXP의 프로테아제 소단위(ClpP)를 가역적으로 억제할 수 있는 잠재적 억제제로 밝혀졌습니다. 동역학 실험은 억제제의 효능과 작용 기전을 입증했으나, 시험관 내 접근법으로는 FAPAL-CMK가 온전한 세포에서 선택적 미토콘드리아 ClpP 억제제로서 효능을 평가하지 못했습니다. 형광 공초점 현미경 검사 결과 FAM-FAPAL-CMK는 ClpP가 위치한 미토콘드리아에 선택적으로 국소되어 있음을 확인했습니다. 미토콘드리아 위치 지정만으로는 직접적인 표적 상호작용이 입증되지 않으므로, 여기서 공동위치 측정은 공유 결합의 직접적 증거가 아니라 ClpP 국소화와 일치하는 미토콘드리아 풍부의 증거로 해석됩니다. FAM-FAPAL-CMK는 다른 미토콘드리아 ATP 의존성 프로테아제인 Lon과 반응하지 않았기 때문에, FAM-FAP...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
알렉사 플루오르 647-결합 토끼 이차 항체	Jackson Immuno Research	711-607-003
베타 액틴 마우스 항체	Proteintech	66009
우 혈청 알부민	Fisher bioreagents	BP1600
CHAPS	VWR	M127
ClpP 토끼 PolyAb	Proteintech	15698
cOmplete 프로테아제 억제제 칵테일	Roche	11697498001
D-PBS	Corning	21-031-CV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Corning	10-013-CV
Dylight405-결합 마우스 이차 항체	Jackson Immuno Research	715-475-150
ECL Select Western Blotting 검출 시약	Cytiva	RPN2235
EGTA	Calbiochem	4100
태아 우 혈청	R&D Systems	S11550
글루타르알데히드, 70% 용액	Polysciences, Inc	01201-2
GraphPad Prism	11.0.2 (100)
HEPES	Dot Scientific, Inc	DSH75030
HRP-결합 마우스 항체	Cell Signaling Technology	7076S
HRP-결합 토끼 항체	Cell Signaling Technology	7074S
ImageJ/Fiji	2.16.0/1.54p
생체 세포 이미지 솔루션	Gibco	A59688DJ
염화 마그네슘 6수화물	Fisher	BP214
Fiji용 Mitochondria-Analyzer 플러그인	https://github.com/AhsenChaudhry/Mitochondria-Analyzer
MitoTracker DeepRed	Life Technologies	M22426
마우스 anti-TOMM20	Santa Cruz Biotechnology	SC17764
파라포르말데히드, 16% 용액	Electron Microscopy Sciences	15710
PIPES	Dot Scientific, Inc	DSP40140
PMSF	RPI research products	P20270
염화 칼륨	Alfa Aesar	11595
일인산 칼륨	VWR	BDH9268
ProLong 실장 매체	Invitrogen	P36930
단백질 분석 염료	Bio-Rad	5000006
사포닌	Thermo Scientific	A18820.14
보론화 수소 나트륨	Thermo Scientific	200050250
염화 나트륨	VWR	BDH9286
나트륨 데옥시콜레이트	Sigma	D6750
나트륨 도데실 설페이트	VWR	0227
이인산 나트륨	AMERSCO	0348
소프트웨어 이름	버전 정보
트리스	Dot Scientific, Inc	DST60040
트리스(2-카르복시에틸)인산 하이드로클로라이드(TCEP)	GOLD BIOTECHNOLOGY INC	TCEP-10
트리톤 X-100	Sigma	X100
Tween 20	VWR	0777
ZEISS Zen	2.3