본 연구는 쥐와 위 상피 세포에서 클로피도그렐(clopidogrel) 투여와 관련된 위점막 손상을 조사하며, 이것이 소포체 스트레스 관련 분자 변화, 세포 사멸 및 전신 염증과 연관되어 있음을 강조합니다.
연구 논문
소포체 스트레스와 관련된 쥐의 클로피도그렐 유발 위점막 손상
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
클로피도그렐(Clopidogrel)은 동맥 혈전성 질환의 예방 및 치료를 위한 항혈소판제로 널리 사용되지만, 위점막 손상을 포함한 위장관계 부작용으로 인해 임상 적용에 제한이 있을 수 있습니다. 상피 세포의 생존은 위점막의 무결성을 유지하는 데 필수적이므로, 본 연구진은 클로피도그렐로 유도된 위상피 손상이 소포체(ER) 스트레스 및 세포사멸 관련 마커의 변화를 동반할 것이라는 가설을 세웠습니다. 이 가설을 검증하기 위해 GES-1 인간 위상피 세포에 다양한 농도의 클로피도그렐을 처리하고, Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 분석, 유세포 분석, 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 및 웨스턴 블로팅을 통해 세포 생존율, 세포사멸, 세포 주기 분포 및 분자적 변화를 평가하였습니다. 이와 병행하여, Sprague-Dawley 랫드에 클로피도그렐을 경구 투여하여 in vivo 위손상 모델을 구축하였습니다. 위점막의 병리학적 변화는 헤마톡실린-에오신(H&E) 염색으로 평가하였으며, 혈청 염증성 사이토카인 수치는 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)을 사용하여 측정하였습니다. 클로피도그렐은 GES-1 세포의 생존율을 감소시키고 세포사멸을 촉진하며 세포 주기 진행을 변화시켰습니다. 랫드에서는 클로피도그렐이 위점막의 미란, 부종 및 염증 세포 침윤을 유도하였으며, 혈청 내 interleukin (IL)-1β, IL-6 및 tumor necrosis factor-α (TNF-α) 수치의 증가가 동반되었습니다. 또한, 클로피도그렐은 위 조직과 GES-1 세포 모두에서 소포체 스트레스 마커인 C/EBP homologous protein (CHOP) 및 activating transcription factor 5 (ATF5)의 발현을 증가시켰고, Bcl-2-associated X protein (Bax) 발현은 증가시키고 B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) 발현은 감소시켜 Bax/Bcl-2 비율을 높였습니다. 이러한 결과는 본 연구에서 소포체 스트레스와 미토콘드리아 세포사멸 경로 간의 직접적인 인과 관계가 확립되지는 않았으나, 클로피도그렐로 유도된 위점막 손상이 소포체 스트레스 관련 마커의 발현 증가 및 Bax/Bcl-2 균형의 붕괴와 연관되어 있음을 시사합니다.
서론
상피세포, 면역세포 및 신호 분자로 구성된 위점막의 선천 및 적응 면역 체계는 상호 작용하여 점막의 무결성을 유지하며 유해 요인에 대한 중요한 생리적 장벽 역할을 합니다1,2. 이러한 보호 기능은 위장관 항상성에 필수적이며, 이 기능이 파괴되면 위염을 포함한 위장 질환의 발생 원인이 될 수 있습니다3. 임상적으로 약물 유발 위점막 손상은 흔한 합병증이며, 비스테로이드성 항염증제와 항혈소판제가 가장 빈번한 원인 중 하나입니다4. 위점막의 무결성은 세포 증식과 세포사멸 사이의 역동적인 균형에 달려 있습니다5. 약물을 포함한 환경적 요인에 장기간 노출되면 이러한 균형이 깨지고 세포사멸이 촉진되어 점막 손상으로 이어질 수 있습니다6,7. 소포체는 세포 내 항상성 유지에 중추적인 역할을 합니다. 세포 스트레스 조건에서 잘못 접히거나 접히지 않은 단백질이 축적되면 PERK/eIF2α/ATF4/CHOP 신호를 포함한 소포체 스트레스 반응(unfolded protein response)이 활성화되어 세포사멸을 촉진하고 B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) 가족 단백질의 발현을 변화시킬 수 있습니다8. ATF5 또한 미토콘드리아 스트레스 반응과 미토콘드리아 기능 장애 및 소포체 스트레스 사이의 상호 작용(crosstalk)에 관여합니다9. 최근의 임상적 근거에 따르면 clopidogrel을 포함한 지속적인 항혈소판 요법은 점진적인 위 및 소장 점막 손상과 관련이 있습니다10.
Clopidogrel은 널리 처방되는 항혈소판제로, 대사 활성화를 거쳐 혈소판 P2Y12 수용체에 비가역적으로 결합함으로써 아데노신 이인산(adenosine diphosphate) 매개 혈소판 응집을 억제하고 항혈전 효과를 나타냅니다11. 이러한 생체 활성화는 주로 간의 cytochrome P450 효소를 통해 일어납니다. 따라서 배양된 위 상피 세포에 clopidogrel 모화합물을 직접 노출시키는 방식으로는 clopidogrel 투여의 완전한 대사 및 약동학적 맥락을 in vivo에서 재현할 수 없습니다. 하지만 clopidogrel 치료가 재발성 위궤양 및 위장관 출혈과 관련이 있을 수 있다는 증거가 증가하고 있으며, 이는 항혈전 효능과 위장관 안전성 사이의 균형을 맞추는 것이 중요하다는 점을 시사합니다12,13,14. 이러한 부작용이 보고되었음에도 불구하고, clopidogrel 관련 위점막 손상의 기저 기전은 여전히 충분히 밝혀지지 않아 표적 예방 및 치료 전략의 개발이 제한적인 실정입니다. 본 연구에서는 Sprague–Dawley 쥐와 GES-1 세포를 이용하여 clopidogrel이 위점막에 미치는 영향을 조사하였습니다. 쥐에게는 경구 투여(gavage)로 clopidogrel을 투여하였으며, GES-1 세포를 이용해 보완적인 in vitro 실험을 수행하였습니다. clopidogrel로 유도된 위점막 손상이 소포체 스트레스(endoplasmic reticulum stress) 및 세포 사멸(apoptosis)과 관련이 있는지 조사하기 위해 조직병리학적, 분자적, 세포적 분석을 실시하였습니다. 이에 따라 본 연구는 인과적 신호 전달 경로를 확립하기보다는 clopidogrel 유도 위손상과 관련된 분자적 변화를 특성화하는 데 중점을 두었습니다. 본 연구 결과는 clopidogrel 유도 위점막 손상과 관련된 분자적 변화에 대한 추가적인 통찰을 제공하며, 이러한 부작용을 예방하고 관리하기 위한 향후 연구에 기여할 수 있을 것입니다.
프로토콜
모든 동물 실험 절차는 Dr. Can Biotechnology (Zhejiang) Co., Ltd.의 동물 실험 윤리 검사 위원회에서 검토 및 승인되었습니다. 본 연구는 실험 동물의 관리 및 사용에 관한 기관 지침에 따라 수행되었습니다. 동물 윤리 승인 번호는 DRK-20251015210입니다.
동물 및 세포주
윤리 위원회의 승인 하에 20마리의 SPF 등급 Sprague–Dawley 쥐를 사용하였다. 본 연구에는 실험 시작 당시 연령 6–8주, 체중 280–300 g인 수컷 SPF 등급 Sprague–Dawley 쥐 총 12마리가 포함되었다. 쥐는 Hangzhou Ziyuan Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (중국 항저우; 생산 허가 번호 SCXK [Zhejiang] 2024-0004)에서 구입하여 대조군과 clopidogrel 투여군에 각각 6마리씩 무작위로 배정하였다. 쥐는 약 22°C의 제어된 환경에서 12시간 명/암 주기 하에 사육되었으며, 표준 사료와 멸균된 식수를 자유롭게 섭취하도록 하였다. 모든 쥐는 실험 전 일주일 동안 적응 기간을 가졌다. Clopidogrel hydrogensulfate를 0.5% sodium carboxymethyl cellulose (CMC-Na)에 0.781 mg/mL 농도로 현탁하였다. clopidogrel 투여군의 쥐에게는 clopidogrel hydrogensulfate를 체중 kg당 10 mL (체중 100 g당 1 mL 및 7.81 mg/kg 용량에 해당)의 양으로 3일 연속 매일 1회 경구 투여하였다. 대조군의 쥐에게는 동일한 부피의 0.5% CMC-Na를 투여하였다. 투여 용량과 3일의 투여 기간은 이전에 보고된 clopidogrel 경구 투여의 단기 쥐 모델을 기반으로 선정하였다. 3일째 마지막 투여 후, 물은 ad libitum으로 제공하되 사료는 12시간 동안 제한하였다. 쥐는 산소가 포함된 3% isoflurane 유도 챔버에서 마취되었으며, nose cone을 통해 전달되는 1.5%–2.0% isoflurane로 마취 상태를 유지하였다. 각막 반사와 발Withdrawal 반사가 소실된 것을 통해 적절한 마취 깊이를 확인하였다. 깊은 마취 상태에서 최종 심장 천자를 통해 혈액을 채취하였다. 깊은 마취 상태를 유지하며 방혈 후 양측 흉강 절개술을 통해 쥐를 안락사시켰다. 자발적 호흡과 심장 활동이 최소 5분간 관찰되지 않고, 각막 및 발Withdrawal 반사가 없는 것을 통해 사망을 확인하였다. 그 후 위를 신속하게 적출하여 대만(greater curvature)을 따라 절개하고, 얼음처럼 차가운 식염수로 부드럽게 세척하였다.
인간 위점막 상피 세포주 GES-1은 iCell Bioscience Inc. (Shanghai, China; Cat. No. iCell-h062)로부터 구입하였으며, 공급업체를 통해 short tandem repeat profiling으로 인증되었다. 세포는 10% fetal bovine serum (FBS)과 1% penicillin–streptomycin이 첨가된 RPMI-1640 배지에서 37°C, 5% CO₂ 조건의 습윤 배양기에서 배양되었다. 실험에는 계대 배양 3~10회 사이의 초기 계대 세포를 사용하였다. 세포 합류도가 약 80%–90%에 도달했을 때, 1:3의 분할 비율로 계대 배양하였다. 대수 성장기의 세포를 후속 실험에 사용하였다. CCK-8 분석을 위해 세포를 96-well plate에 6 × 103 cells/well 밀도로 분주하였다. 세포 사멸 및 세포 주기 분석을 위해 세포를 6-well plate에 약 5 × 105 cells/well 밀도로 분주하고, clopidogrel 처리 전 세포가 부착되도록 하였다.
화학 물질 및 용액
동물 및 세포 실험을 위해 Clopidogrel hydrogensulfate (Cat. No. C874834; purity ≥ 99%)를 사용하였다. 100 mg의 clopidogrel 분말을 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹여 1 M stock solution을 조제하였다. 이 stock solution은 사용 전 필요한 작업 농도로 추가 희석하였다. 1 M stock solution을 DMSO로 연속 희석하여 10, 100, 200, 400, 600, 800 및 1000 mM 농도의 1000× 투여 용액을 준비하였다. 처리 직전에 각 1000× 투여 용액을 완전 배지에 1:1000 (v/v) 비율로 첨가하여 clopidogrel 최종 농도를 각각 0.01, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 및 1.0 mM로 맞추었다. vehicle 대조군은 clopidogrel이 없는 동일 부피의 DMSO를 투여받았다. 이에 따라 모든 군에서 최종 DMSO 농도는 0.1% (v/v)로 유지되었다. 배양된 GES-1 세포는 간의 cytochrome P450 매개 clopidogrel 생체 활성화를 재현하지 않는다. 따라서 clopidogrel 직접 처리를 탐색적 모화합물 노출 모델로 사용하였다. 농도 범위는 실험 조건 하에서 농도 의존적인 세포 반응을 특성화하기 위해 선택되었으며, 이를 임상적으로 달성 가능한 혈장 또는 위 조직 농도와 동일한 것으로 해석해서는 안 된다.
세포 계대배양
기초 배지에 FBS와 penicillin–streptomycin을 첨가하여 완전 배지를 준비하였다. 세포 합류도가 약 80%에 도달했을 때, 배양액을 제거하고 멸균된 phosphate-buffered saline (PBS)로 세포를 3회 세척하였다. 그 후 trypsin–ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 용액으로 약 1–2분 동안 세포를 처리하였다. 세포가 부분적으로 분리되면, 완전 배지를 첨가하여 소화를 중단시켰다. 세포 현탁액을 1,200 × g에서 3분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후, 세포 펠렛을 1–2 mL의 완전 배지에 다시 현탁하여 실험 요구 사항에 따라 새로운 배양 접시에 분주하였다.
CCK-8 세포 생존능 분석
로그 성장기(logarithmic growth phase)의 GES-1 세포를 96-well 플레이트에 6[단위/수치 누락됨]로 분주하였다. × 103 웰당 세포 수를 맞추어 분주하고, 세포 부착을 위해 하룻밤 동안 배양하였다. 세포가 부착된 후, 서로 다른 농도의 clopidogrel(0, 0.01, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 및 1.0 mM)을 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 대조군에는 동일한 최종 농도의 용매를 처리하였다. 처리 후, 각 웰에 CCK-8 용액을 첨가하고 다음 조건에서 배양하였다. 37°C 키트 지침에 따라 수행하였다. 450 nm에서의 흡광도는 마이크로플레이트 리더를 사용하여 측정하였다. 세포 생존율은 대조군의 백분율로 계산하였다. 농도-반응 결과에 근거하여, 후속 아포토시스, 세포 주기, qPCR 및 Western blot 분석을 위해 0.1 mM의 클로피도그렐로 24시간 동안 처리하는 조건을 선택하였다.
유세포 분석
GES-1 세포를 6-well plate에 분주하고, 세포가 부착된 후 0.1 mM clopidogrel로 24시간 동안 처리하였습니다. 처리 후, 부유 세포와 부착 세포를 모두 수집하였습니다. 부착 세포는 EDTA가 없는 trypsin으로 소화시킨 후, 차가운 PBS로 2회 세척하고 binding buffer에 재현탁하였습니다. 제조사의 지침에 따라 Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit를 사용하여 세포를 염색하였습니다. 암실 내 실온에서 배양한 후, RaiseCyte 2L6C flow cytometer를 사용하여 세포 사멸 세포를 검출하였습니다. 데이터는 RaiseFlower 획득 소프트웨어를 사용하여 수집하였으며, FlowJo 소프트웨어(version 10.8.1)를 사용하여 분석하였습니다. 초기 세포 사멸, 후기 세포 사멸 및 전체 세포 사멸 세포 집단은 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 정량화하였습니다.
유세포 분석을 이용한 세포 주기 분포 분석
GES-1 세포를 6-well 플레이트에 분주하고 0.1 mM clopidogrel을 24시간 동안 처리하였다. 처리 후, 세포를 수확하여 PBS로 세척하고 4°C에서 미리 냉각된 70% 에탄올로 고정하였다. 고정된 세포는 잔류 에탄올을 제거하기 위해 세척한 후, 제조사의 지침에 따라 암실에서 RNase A 및 propidium iodide 염색 용액과 함께 배양하였다. 세포 주기 분포는 유세포 분석기(flow cytometer)를 사용하여 분석하였다. 데이터는 획득 소프트웨어를 통해 수집하였으며 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 세포 주기 분포는 Watson 모델을 사용하여 피팅하였으며, G0/G1, S 및 G2/M 단계에 있는 세포의 백분율을 산출하였다.
정량적 실시간 PCR (qPCR)
RNA 추출 키트의 지침에 따라 GES-1 세포와 쥐 위 조직 샘플에서 총 RNA를 추출하였습니다. 조직 샘플의 경우, 위점막 조직을 신속하게 수집하여 저온 조건에서 균질화한 후 RNA 추출을 수행하였습니다. RNA 농도와 순도는 260 nm 및 280 nm에서의 흡광도를 측정하여 결정하였습니다. 동일한 양의 RNA를 게놈 DNA 제거 기능이 포함된 역전사 키트를 사용하여 상보적 DNA(cDNA)로 역전사하였습니다. 정량적 실시간 PCR은 SYBR Green 기반의 PCR 마스터 믹스를 사용하여 수행하였습니다. 각 반응은 2× 마스터 믹스 10 µL, cDNA 1 µL, 정방향 프라이머 0.4 µL, 역방향 프라이머 0.4 µL, RNase-free ddH₂O 8.2 µL를 포함하여 총 20 µL 부피로 진행하였습니다. 열 순환 조건은 다음과 같습니다: 95°C에서 10분간 초기 변성 후, 95°C에서 10초간 변성, 60°C에서 30초간 결합, 72°C에서 30초간 신장을 총 40회 반복하였습니다. CHOP, ATF5, Bcl-2 및 Bax의 발현 수준을 측정하였습니다. 내부 참조 유전자로 GAPDH를 사용하였습니다. 상대적 유전자 발현량은 2−ΔΔCt법을 사용하여 계산하였습니다. 프라이머 서열은 보충 표 1에 나열되어 있습니다.
웨스턴 블롯
GES-1 세포와 쥐 위 조직 샘플에서 총 단백질을 추출하였다. 세포 샘플의 경우, 처리된 GES-1 세포를 차가운 PBS로 세척하고 프로테아제 억제제가 포함된 RIPA(radioimmunoprecipitation assay) 용해 버퍼를 사용하여 용해시켰다. 조직 샘플의 경우, 위 점막 조직을 저온 조건에서 RIPA 버퍼로 균질화한 후 원심분리하여 상층액을 수집하였다. 단백질 농도는 BCA 단백질 분석법을 사용하여 결정하였다. 레인당 총 20 µg의 단백질을 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리하고 PVDF(polyvinylidene difluoride) 막으로 전이시켰다. BSA(bovine serum albumin)로 블로킹한 후, 막을 CHOP (1:1000), ATF5 (1:1000), Bcl-2 (1:1000), Bax (1:1000) 및 β-actin (1:5000)에 대한 1차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 세척 후, 막을 해당 HRP(horseradish peroxidase) 접합 2차 항체 (1:10000)와 함께 반응시켰다. 단백질 밴드는 강화 화학발광 시약을 사용하여 시각화하고 화학발광 이미징 시스템으로 캡처하였다. 밴드 강도는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 정량화하고 β-actin으로 표준화하였다.
조직병리학적 평가
클로피도그렐(clopidogrel) 투여 후 Sprague–Dawley 쥐로부터 위 조직 샘플을 수집하여 10% 중성 완충 포르말린으로 고정했습니다. 샘플을 탈수 및 투명화한 후 파라핀에 매립하고 4 µm 두께로 절편을 제작했습니다. 파라핀 절편은 헤마톡실린 및 에오신(hematoxylin and eosin)으로 염색했습니다. 점막 형태, 상피 무결성, 부종 및 염증 세포 침윤을 바탕으로 광학 현미경 하에서 조직병리학적 변화를 정성적으로 평가했습니다. 대표 이미지를 캡처하였으며, 조직학적 점수 체계는 적용하지 않았습니다.
면역조직화학염색
파라핀 임베딩된 위 조직 절편을 자일렌으로 탈파라핀화하고 단계별 에탄올 시리즈를 통해 재수화했습니다. 시트르산 완충액으로 열 유도 항원 회복을 수행했습니다. 내인성 과산화효소 활성은 3% 과산화수소로 10분 동안 차단하였고, 비특이적 결합은 일반 염소 혈청을 사용하여 실온에서 30분 동안 차단했습니다. 그 후 절편을 CHOP, ATF5, Bcl-2 및 Bax에 대한 1차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 동안 배양했습니다. PBS로 세척한 후, 절편을 해당 horseradish peroxidase-접합 2차 항체와 함께 배양했습니다. 면역 반응 신호는 DAB 발색 용액을 사용하여 시각화한 후, 헤마톡실린으로 대조 염색했습니다. 절편을 탈수, 투명화, 봉입한 후 광학 현미경으로 관찰했습니다. 대표 이미지를 캡처하고 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 양성 염색 영역을 정량화했습니다.
면역형광 염색
파라핀 임베딩된 위 조직 절편을 탈파라핀화하고 재수화시킨 후, 시트르산 완충액(citrate buffer)을 사용하여 열 유도 항원 회복 과정을 거쳤습니다. 정상 염소 혈청으로 30분 동안 블로킹한 후, CHOP (1:50), ATF5 (1:100), Bcl-2 (1:50) 및 Bax (1:200)에 대한 1차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 동안 배양했습니다. PBS로 세척한 후, 해당 형광 2차 항체(1:500)와 함께 상온의 암실에서 1시간 동안 배양하고 DAPI로 대조 염색했습니다. 이미지는 형광 현미경을 사용하여 ×200 배율로 캡처했습니다. 각 동물당 무작위로 선택한 겹치지 않는 3개의 영역을 Image-Pro Plus 6.0을 사용하여 분석했으며, 형광 강도는 IOD/Area로 표시했습니다. 그룹당 3마리의 동물이 분석에 포함되었습니다.
효소 결합 면역 흡착 분석법 (ELISA)
처치 후 Sprague–Dawley 쥐로부터 혈액 샘플을 채취하여 실온에서 응고시켰다. 원심분리를 통해 혈청을 분리하고 분석 전까지 −80°C에서 보관하였다. IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 혈청 수치는 키트 설명서에 따라 ELISA 키트를 사용하여 측정하였다. 흡광도는 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 측정하였으며, 사이토카인 농도는 표준 곡선에 따라 계산하였다.
통계 분석
통계 분석은 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 데이터는 평균 ± SD로 표시되었습니다. 정규성과 분산의 동질성은 각각 Shapiro–Wilk 검정과 Levene 검정을 사용하여 평가되었습니다. 두 그룹 간의 비교는 Student's t-test를 사용하여 수행되었습니다. 여러 그룹 간의 비교는 일원 분산 분석(one-way analysis of variance) 후 Dunnett의 사후 검정을 통해 수행되었습니다. P < 0.05 값을 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였습니다. 모든 세포 실험은 최소 3회 이상의 독립적인 생물학적 반복 실험을 통해 수행되었습니다.
결과
Clopidogrel은 GES-1 세포의 생존력을 감소시키고 In Vitro에서 세포 사멸을 증가시킨다
먼저 clopidogrel이 GES-1 세포의 생존력과 세포 사멸에 영향을 미치는지 조사하였습니다. CCK-8 분석 결과, clopidogrel 처리는 GES-1 세포의 생존력을 유의하게 감소시켰으며(그림 1A,B), 이는 세포 생존력이 감소했음을 나타냅니다. 테스트한 농도 범위 전체에서 나타난 전반적인 세포 생존력 감소를 바탕으로, 이후의 모든 세포 실험에는 0.1 mM clopidogrel을 24시간 동안 처리하는 조건을 선택하였습니다. 이어서 세포 사멸 및 세포 주기 분포를 분석하기 위해 유세포 분석을 수행하였습니다(그림 1C–F). 유세포 분석 결과, G0/G1기 세포군은 감소하고 G2/M기 세포군은 뚜렷한 증가 없이 S기 세포의 비율이 증가한 것으로 나타났으며, 이는 G2/M기 정체보다는 S기 축적이 일어났음을 시사합니다. 결과적으로 clopidogrel은 대조군과 비교하여 GES-1 세포의 세포 사멸을 유의하게 증가시키고 세포 주기 분포를 변화시켰음을 입증하였습니다. 종합적으로, 이러한 발견은 clopidogrel이 GES-1 세포의 생존력을 감소시키며 세포 사멸 증가 및 세포 주기 진행 변화와 연관되어 있음을 나타냅니다. 이러한 결과는 선택된 실험 조건 하에서 clopidogrel 모화합물에 직접 노출되었을 때의 세포 독성 반응을 보여줍니다. 다만, 이것이 임상적으로 유의미한 노출 수준에서도 동일한 효과가 나타나거나 관찰된 반응이 활성 clopidogrel 대사체에 의해 매개됨을 입증하는 것은 아닙니다.
그림 1Clopidogrel은 GES-1 세포의 생존율을 감소시키고 세포 사멸을 증가시킨다. (A인간 위상피세포주 GES-1의 세포 생존율은 clopidogrel을 농도별(0–1.0 mM)로 24시간 동안 처리한 후 CCK-8 분석법을 사용하여 평가하였다.B) 대조군과 0.1 mM 클로피도그렐(clopidogrel)을 24시간 동안 처리한 군 간의 세포 생존율 정량 비교. (C) Watson 모델을 사용하여 분석한 대표적인 유세포 분석 세포 주기 프로파일. (D) G0/G1, S, 및 G2/M기에 있는 세포 비율의 정량화. Clopidogrel 처리는 G2/M기 세포군의 뚜렷한 증가 없이 S기 세포군을 증가시켰다. (E) Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC) 및 propidium iodide (PI) 염색 후 세포 사멸을 나타내는 대표적인 유세포 분석 도트 플롯. (F) 전체 세포 사멸 세포군의 정량화. 모든 세포 실험은 3회의 독립적인 생물학적 반복 실험(n = 3)을 통해 수행되었다. 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 표시되었다. 통계적 유의성은 대조군과의 비교를 통해 결정되었다. ***P < 0.001. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
클로피도그렐(Clopidogrel)로 유도된 위 손상은 전신 염증과 관련이 있습니다
Sprague–Dawley 쥐를 대조군과 매일 경구 투여를 통해 클로피도그렐(clopidogrel)을 투여받은 클로피도그렐 투여군의 두 그룹(그룹당 n = 6)으로 무작위 배정하였습니다. 클로피도그렐의 용량과 3일간의 처리 regimen은 이전에 보고된 클로피도그렐 유도 위 손상 쥐 모델16을 기반으로 선정하였습니다. 3일 후, 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 위해 위 조직을 수집하였습니다. 조직병리학적 검사 결과, 대조군과 비교하여 클로피도그렐 투여군에서 위점막 미란, 부종 및 염증 세포 침윤이 확인되었습니다(그림 2A). 혈청 염증성 사이토카인 수치는 ELISA로 측정하였습니다. 클로피도그렐 투여군은 대조군보다 인터루킨(IL)-1β, IL-6 및 종양괴사인자-α(TNF-α)의 혈청 수치가 유의하게 높게 나타났습니다(그림 2B–D). 이러한 결과는 클로피도그렐 처리가 위점막 손상 및 전신 염증 반응의 증가와 관련이 있음을 나타냅니다15,16.
그림 2클로피도그렐(Clopidogrel)은 쥐에서 위점막 손상을 유발하고 혈중 염증성 사이토카인 수치를 증가시킨다. (A) 대표적인 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)&대조군 및 클로피도그렐(clopidogrel) 투여 Sprague–Dawley 쥐의 위점막 H&E 염색 절편. 조직학적 검사 결과, 대조군에서는 위점막 구조가 유지되었으나 클로피도그렐 투여군에서는 형태학적 변화가 관찰되었다. 노란색 화살표는 위점막 상피세포를, 빨간색 화살표는 점막층 내의 국소적 충혈을, 검은색 화살표는 경미한 염증 세포 침윤을 나타낸다. 원래 배율 ×20; 스케일 바 = 100 µm. 그룹당 동물 수 n = 6. (B–D인터루킨(IL)-1β, IL-6 및 종양괴사인자-α(TNF-α)의 혈청 농도는 효소결합면역흡착측정법(ELISA)을 사용하여 측정하였습니다. 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 나타내었으며, 그룹당 동물 수는 n = 6마리입니다.P < 대조군과 비교하여 0.01이었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
클로피도그렐(Clopidogrel)은 쥐의 위점막에서 ER 스트레스 및 세포사멸 관련 마커를 변화시킨다
클로피도그렐(clopidogrel)로 유도된 위 손상과 관련된 분자적 변화를 조사하기 위해 위 조직 절편에 대해 면역조직화학 염색을 수행하였다. 대표 이미지는 대조군에 비해 클로피도그렐 투여군에서 CHOP, ATF5 및 Bax 염색이 더 강하게 나타난 반면, Bcl-2 염색은 더 약하게 나타난 것을 보여주었다.그림 3A). IOD/면적의 정량 분석 결과, clopidogrel 처리 후 CHOP, ATF5 및 Bax 염색이 유의하게 증가한 것으로 나타났다(그림 3B,C,E). Bcl-2 염색 결과는 감소하는 경향을 보였으나, 그 차이는 통계적 유의성에 도달하지 않았다 (그림 3D). 이러한 결과는 클로피도그렐(clopidogrel) 투여가 쥐의 위점막 내 스트레스 및 세포사멸 관련 단백질의 발현 변화와 연관이 있음을 나타냅니다. 면역형광 분석 결과, 클로피도그렐 투여군의 위점막 조직에서 CHOP 및 ATF5 신호가 더 강하게 나타났습니다. 정량 분석을 통해 CHOP의 유의미한 증가를 확인하였습니다.그림 4A 및 5A) 및 ATF5 (그림 4B 및 5B), 반면 Bcl-2 (그림 4C 및 5C) 및 Bax (그림 4D 및 5D) 각각 감소 및 증가 추세를 보였으나, 통계적 유의성에 도달하지는 않았다. 종합적으로, 이러한 결과는 클로피도그렐(clopidogrel) 치료가 쥐의 위점막에서 ER 스트레스 및 세포사멸 관련 마커의 발현 변화와 관련이 있음을 나타낸다.
그림 3위 조직 내 소포체 스트레스 및 세포사멸 관련 단백질의 면역조직화학적 검출. (A) 대조군 및 클로피도그렐(clopidogrel) 투여 Sprague–Dawley 쥐의 위점막 조직에서 C/EBP 상동 단백질(CHOP), 활성 전사 인자 5(ATF5), B-세포 림프종 2(Bcl-2) 및 Bcl-2 관련 X 단백질(Bax)의 대표적인 면역조직화학 염색 이미지. 갈색 염색은 양성 면역반응을 나타내며, 핵은 헤마톡실린으로 대조 염색하였다. 제시된 이미지는 분석된 모든 샘플의 대표 이미지이며, 각 그룹당 3마리의 동물이 포함되었다. 원배율, ×200; 스케일 바 = 100 µm. (B–E) CHOP, ATF5, Bcl-2 및 Bax의 단위 면적당 통합 광학 밀도(IOD/Area)의 정량 분석 결과. 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 나타내었다. *P < 0.05 및 **P < 대조군과 비교하여 0.01이었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4위장 조직 내 소포체 스트레스 및 세포사멸 관련 단백질의 면역형광 검출. 대조군 및 클로피도그렐 처리 Sprague-Dawley 쥐의 위점막 조직에서 C/EBP homologous protein (CHOP), activating transcription factor 5 (ATF5), B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) 및 Bcl-2-associated X protein (Bax)의 국소화를 보여주는 대표 면역형광 이미지. 핵은 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (청색)로 대조 염색되었으며, 양성 면역형광 염색은 적색으로 표시되었다. 병합된 이미지는 오른쪽 열에 제시되었다.A) CHOP. (B) ATF5. (C) Bcl-2. (D) Bax. 원래 배율, ×20; 스케일 바 = 100 µm제시된 이미지는 분석된 모든 샘플을 대표하며, 그룹당 동물 수는 n = 3입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5위 조직 내 소포체 스트레스 및 세포사멸 관련 단백질의 면역형광 정량 분석. (A–D) 대조군 및 클로피도그렐 처리 Sprague–Dawley 쥐의 위점막 조직 내 C/EBP homologous protein (CHOP), activating transcription factor 5 (ATF5), B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) 및 Bcl-2-associated X protein (Bax)의 단위 면적당 통합 광학 밀도(IOD/Area) 정량 분석. 각 동물당 조직 절편에서 무작위로 선택한 3개의 비중첩 현미경 시야를 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 분석하였으며, 그 평균값을 통계 분석에 사용하였다. 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 표시되었으며, 그룹당 동물 수는 n = 3마리이다. *P < 0.05 및 **P < 대조군과 비교하여 0.01이었습니다. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
Clopidogrel은 GES-1 세포와 쥐 위 조직에서 ER 스트레스 및 세포사멸 관련 유전자와 단백질 발현을 변화시킨다
이전 연구들은 ER 스트레스가 세포 스트레스 반응 및 세포 사멸에서 핵심적인 역할을 한다는 것을 보여주었습니다17,18. clopidogrel 처리 후 ER 스트레스 관련 마커의 변화를 평가하기 위해, GES-1 세포에서 CHOP 및 ATF5의 발현을 조사하였습니다. qRT-PCR 결과, clopidogrel 처리 후 CHOP 및 ATF5의 mRNA 발현이 증가한 것으로 나타났습니다. Western blot 분석을 통해 CHOP 및 ATF5 단백질 발현의 증가를 추가로 확인하였습니다(그림 6A–E). 이어서 GES-1 세포와 쥐 위 조직에서 세포 사멸 관련 단백질의 발현을 평가하였습니다. 대조군과 비교하여, clopidogrel 처리는 Bax 발현을 증가시키고 Bcl-2 발현을 감소시켜, 결과적으로 Bax/Bcl-2 비율을 증가시켰습니다(그림 6A–J). 이러한 발현 패턴은 GES-1 세포와 쥐 위 조직 모두에서 mRNA 및 단백질 수준 모두에서 일관되게 관찰되었습니다. 종합적으로, 이러한 결과는 clopidogrel 처리가 두 실험 모델 모두에서 ER 스트레스 및 세포 사멸 관련 마커의 발현 변화와 관련이 있음을 입증합니다.
그림 6클로피도그렐 처리 후 GES-1 세포 및 쥐 위 조직에서 소포체 스트레스 및 세포사멸 관련 마커의 발현. (A–D정량적 실시간 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR)으로 측정한 인간 위상피 세포주 GES-1에서 C/EBP 유사 단백질(CHOP), 활성화 전사 인자 5(ATF5), B-세포 림프종 2(Bcl-2) 및 Bcl-2 관련 X 단백질(Bax)의 상대적 전령 RNA(mRNA) 발현량.E) GES-1 세포에서 CHOP, ATF5, Bcl-2 및 Bax 단백질 발현의 대표적인 Western blot 이미지와 그에 따른 밀도 측정 정량 결과. 단백질 발현 수준은 β-actin을 기준으로 표준화하였다. 세포 실험은 3회의 독립적인 생물학적 반복 실험(n = 3)을 통해 수행되었다. (F–I) qRT-PCR로 분석한 쥐 위 조직 내 CHOP, ATF5, Bcl-2 및 Bax의 상대적 mRNA 발현량. (J) 쥐 위 조직 내 CHOP, ATF5, Bcl-2 및 Bax 단백질 발현의 대표적인 웨스턴 블롯 이미지와 그에 따른 밀도 측정 정량 결과. 단백질 발현 수준은 β-actin으로 표준화되었다. 조직 실험에는 그룹당 n = 3마리의 동물이 포함되었다. 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 나타내었다. 통계적 유의성은 대조군과의 비교를 통해 결정되었다. *P < 0.05, **P < 0.01, 그리고 ***P < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
종합적으로, 이러한 결과는 클로피도그렐 치료가 GES-1 세포의 생존능을 감소시키고, 세포사멸을 증가시키며, 소포체(ER) 스트레스 및 세포사멸 관련 마커의 발현을 변화시켰음을 보여주며, 쥐 모델에서 순환 염증성 사이토카인 수치의 증가를 동반한 위점막 손상과 관련이 있음을 입증합니다. 이러한 발견은 클로피도그렐 치료가 위점막 손상 및 이에 수반되는 소포체 스트레스와 세포사멸 관련 마커의 변화와 연관되어 있다는 연구 가설을 뒷받침합니다.
데이터 가용성:
본 연구 중에 생성되거나 분석된 모든 데이터는 본 논문 및 보충 자료에 포함되어 있습니다. RT-PCR에 사용된 프라이머 서열은 보충 표 1에 제공되어 있습니다. 원본 실험 데이터 세트와 소스 파일을 포함하여, 모든 도표 및 개별 도표 패널을 뒷받침하는 원시 데이터는 첨부된 원시 데이터(Raw Data) 보충 아카이브(압축 파일)에서 확인할 수 있습니다.
보충 표 1. RT-PCR 분석에 사용된 프라이머 서열. 본 연구에서 GAPDH, CHOP, ATF5, Bcl-2 및 Bax의 RT-PCR 분석에 사용된 정방향(F) 및 역방향(R) 프라이머 서열이 5′–3′ 방향으로 나열되어 있습니다.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
토론
Clopidogrel은 심혈관 질환의 예방 및 치료에 널리 사용되지만, 임상적 사용 시 소화성 궤양, 출혈 및 천공을 포함한 출혈 위험과 위장관 합병증이 수반됩니다19. 따라서 clopidogrel로 유발된 위 손상과 관련된 분자적 변화를 이해하는 것은 이러한 부작용의 예방 및 관리를 개선하는 데 중요합니다. 본 연구에서는 clopidogrel이 위 상피 세포와 쥐의 위 조직에 미치는 영향을 조사하였으며, 세포 생존율, 세포 사멸(apoptosis), 염증 반응, 그리고 ER 스트레스 및 세포 사멸 관련 마커의 발현 변화를 관찰하였습니다. 이러한 결과는 clopidogrel로 유발된 위점막 손상이 ER 스트레스 및 세포 사멸 관련 마커 발현의 변화와 연관되어 있음을 시사합니다. 다만, 약리학적 구조(pharmacological rescue) 실험이나 유전적 기능 상실(genetic loss-of-function) 실험이 수행되지 않았으므로, 이러한 결과가 ER 스트레스와 세포 사멸 사이의 인과 관계를 입증하는 것은 아닙니다.
이전 연구들은 clopidogrel이 위점막 복구를 저해하고 위궤양 치유를 지연시킬 수 있음을 시사했습니다20. 본 연구에서 CCK-8 분석 결과, clopidogrel이 GES-1 세포의 생존력을 감소시켰으며, 유세포 분석을 통해 세포 사멸 증가와 세포 주기 진행의 변화가 확인되었습니다(그림 1). 이러한 결과는 위상피세포에서 clopidogrel로 유도된 세포 사멸에 관한 이전 보고들과 일치합니다21. 이러한 관찰 결과는 clopidogrel 치료가 위상피세포의 생존력 저하 및 세포 사멸 증가와 관련이 있으며, 이것이 위점막 손상에 기여할 수 있음을 시사합니다11. 쥐 모델의 경우, H&E 염색을 통해 clopidogrel 투여 후 위점막 손상이 나타남을 확인했습니다(그림 2A). 또한 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 혈청 수치가 유의하게 증가하여(그림 2B–D), 위점막 손상과 관련된 염증 반응이 있음을 나타냈습니다22.. 또한, 면역조직화학 및 면역형광 분석 결과, 대조군과 비교하여 clopidogrel 투여 쥐의 위 조직에서 ER 스트레스 및 세포 사멸 관련 마커의 발현 변화가 나타났습니다(그림 3, 그림 4, 그림 5).
CHOP, ATF5, Bcl-2 및 Bax는 세포 스트레스 반응과 세포사멸의 중요한 조절 인자입니다23,24,25,26. 본 연구에서 clopidogrel 처리는 GES-1 세포와 쥐 위 조직 모두에서 CHOP 및 ATF5의 발현 증가와 Bax 및 Bcl-2의 발현 변화와 관련이 있었습니다(그림 6). 이러한 결과는 스트레스 및 세포사멸 관련 마커들이 동시에 변화했음을 나타냅니다. 하지만 본 연구에서는 발현 변화만을 평가하였으며, 이러한 분자들이 clopidogrel로 유도된 위점막 손상을 직접적으로 매개하는지 여부는 결정하지 않았습니다. 마찬가지로, Bax/Bcl-2 비율의 증가가 관찰되었으나, 미토콘드리아 세포사멸 경로의 활성화를 직접적으로 증명하지는 않았습니다. 따라서 이러한 결과는 인과적인 신호 전달 기전의 증거라기보다 상관관계로 해석되어야 합니다.
본 연구는 클로피도그렐(clopidogrel) 처리에 따른 형태학적 및 분자적 변화를 평가하기 위해 쥐 in vivo 모델과 GES-1 세포를 이용한 탐색적 직접 노출 실험을 결합하였습니다. in vivo 모델은 위점막 손상의 일차적 근거를 제공하며, GES-1 실험은 모화합물에 직접 노출된 후의 세포 반응에 관한 보조적 근거를 제공합니다. 조직병리 분석, 염증성 사이토카인 측정, 면역조직화학, 면역형광법, qRT-PCR 및 Western blotting을 결합함으로써 위 손상과 관련된 형태학적 및 분자적 변화를 종합적으로 평가할 수 있습니다. 이러한 실험적 접근 방식은 항혈소판제의 위장관 영향을 조사하고 향후 연구에서 잠재적인 보호 중재법을 평가하는 데 유용할 수 있습니다.
몇 가지 제한 사항을 인정해야 한다. Clopidogrel은 간의 대사 활성화가 필요한 전구약물(prodrug)인 반면, GES-1 세포에 모화합물을 직접 노출시키는 것은 이러한 과정을 재현하거나 임상 약동학을 완전히 반영하지 못한다. 또한, 인 비트로(in vitro)에서 사용된 상대적으로 높은 농도가 비특이적 세포 독성을 유발했을 가능성이 있다. 따라서 GES-1 실험은 직접 노출 조건에서의 세포 반응에 대한 탐색적 근거로 간주되어야 한다. CCK-8 분석에서는 세포 생존율 감소에 대한 양성 대조군이 포함되지 않아, 분석 성능의 독립적인 검증이 제한적이었다. 관찰된 ER 스트레스 관련 변화를 일으키는 상위 기전이 조사되지 않았으며, ER 스트레스가 Bax/Bcl-2 균형과 세포 사멸을 직접적으로 조절하는지 확인하기 위한 약리학적 억제, 유전자 녹다운 또는 유전자 녹아웃 실험이 수행되지 않았다. 향후 연구에서는 모화합물과 그 활성 대사물을 비교하고, 적절한 대사 활성 시스템을 통합하며, 이러한 관계를 명확히 하기 위한 기능적 개입 실험을 수행해야 한다. 또한, Annexin V-FITC/PI 분석에 잘 확립된 세포 사멸 유도 양성 대조군이 포함되지 않았다. 따라서 clopidogrel 처리가 차량 대조군에 비해 Annexin V 양성 세포 집단의 증가와 관련이 있었으나, 세포 사멸 분석의 기술적 성능이 양성 대조군 조건을 통해 독립적으로 검증되지는 않았다. 향후 연구에서는 동일한 실험 배치에 staurosporine과 같은 세포 사멸 유도제를 포함해야 한다.
결론적으로, 쥐에게 클로피도그렐을 경구 투여한 결과 위점막 손상이 유발되었으며, 이는 ER 스트레스 및 세포사멸 관련 마커의 변화를 동반하였습니다. GES-1 세포에 클로피도그렐 모화합물을 직접 노출시켰을 때에도 실험 조건 하에서 세포 생존력이 감소하고 관련 분자 마커가 변화하였습니다. 하지만 세포 모델은 간의 생물학적 활성화를 재현하지 못하며 비교적 높은 농도가 사용되었기 때문에, 인 비트로(in vitro) 실험 결과를 임상적 노출에 직접적으로 적용할 수는 없으며 비특이적 세포독성 가능성을 배제할 수 없습니다. 종합적으로, 클로피도그렐로 유발된 위점막 손상은 ER 스트레스 및 세포사멸 관련 마커 발현의 변화와 연관이 있는 것으로 나타났으나, 인과 관계를 확립하기 위해서는 추가적인 기전 연구가 필요합니다.
공개 사항
이해관계 충돌:
저자들은 본 연구에서 보고된 작업에 영향을 미칠 수 있는 알려진 경쟁적 재정적 이해관계나 개인적 관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
본 연구는 “클로피도그렐 유도 위점막 상피세포 세포사멸에서의 CHOP/ATF5/Bcl-2 신호전달 경로에 관한 기초 연구”(과제 번호 2023BWKY009) 프로젝트의 지원을 받아 수행되었습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit | Elabscience | E-CK-A211 | 세포사멸 검출 키트 |
| ATF5 Antibody | Proteintech | 67066-1-AP | 1차 항체 |
| BCA Protein Assay Kit | Solarbio | PC0020 | 단백질 농도 분석 |
| Bax Antibody | Proteintech | 50599-1-AP | 1차 항체 |
| Bcl-2 Antibody | Proteintech | 26593-1-AP | 1차 항체 |
| β-actin Antibody | Proteintech | 66009-1-Ig | 1차 항체 |
| Blocking Buffer | Beyotime | P0252 | 웨스턴 블롯 블로킹 용액 |
| CCK-8 Cell Counting Kit | KeyGen Biotech | KGA317 | 세포 생존율 분석 |
| cDNA Synthesis Kit | TransGen Biotech | AU341 | 게놈 DNA 제거 기능 포함 1차 가닥 cDNA 합성 키트 |
| Cell Cycle Detection Kit | Lianke Biotechnology | CCS012 | 세포 주기 분석 키트 |
| CHOP Antibody | Proteintech | 15204-1-AP | 1차 항체 |
| Clopidogrel Hydrogensulfate (순도 ≥99%) | Macklin | C874834 | 실험용 약물 |
| DAB Chromogen Kit | Beyotime | P0201M | 면역조직화학 염색 기질 |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | MedChemExpress | HY-Y0320C | 용매 |
| Enhanced Chemiluminescence (ECL) Reagent | Meilunbio | MA0186 | 화학발광 기질 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099-141 | 세포 배양 보충제 |
| GES-1 Human Gastric Epithelial Cell Line | iCell Bioscience | iCell-h062 | 인간 위상피 세포주 |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) Staining Kit | Beyotime | C0105S | 조직학적 염색 |
| Horseradish Peroxidase (HRP)-Conjugated Secondary Antibody | Proteintech | RGAM001/RGAR001 | 2차 항체 |
| Hydrogen Peroxide Solution | Absin | ABS9333-100mL | 내인성 퍼옥시다아제 블로킹 시약 |
| IL-1β ELISA Kit | MEIMIAN | MM-0047R2 | 혈청 사이토카인 분석 |
| IL-6 ELISA Kit | MEIMIAN | MM-0190R2 | 혈청 사이토카인 분석 |
| Microplate Reader | Beijing Liuyi Biotechnology | WD-2102B | 흡광도 측정 |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Solarbio | P1400 | 항생제 용액 |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Servicebio | G4202-500ML | 1× PBS |
| Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane | Millipore | IPVH00010 | 웨스턴 블롯 멤브레인 |
| Primary Antibody Diluent | Beyotime | P0023A | 항체 희석액 |
| Protein Molecular Weight Marker | Yeasen | WJ103 | 사전 염색된 단백질 래더 |
| Quantitative Real-Time PCR Master Mix (SYBR Green) | CWBio | CW3008 | qPCR 시약 |
| Radioimmunoprecipitation Assay (RIPA) Lysis Buffer | Solarbio | R0010 | 단백질 추출 완충액 |
| RNase A | Lianke Biotechnology | CCS012 | 세포 주기 분석 시약 |
| RPMI-1640 Medium | Servicebio | G4535-500ML | 기초 세포 배양 배지 |
| Sprague-Dawley Rats | Hangzhou Ziyuan Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | N/A | SPF 등급 |
| TNF-α ELISA Kit | MEIMIAN | MM-0180R2 | 혈청 사이토카인 분석 |
| Total RNA Extraction Kit | TransGen Biotech | ER501-01 | RNA 추출 키트 |
| Trypsin-EDTA Solution | Solarbio | T1300 | 세포 해리 시약 |
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