정량적 영상 분석을 이용한 폐 조직의 탄성 섬유 프로파일링

요약

여기서는 쥐 폐 조직에서 탄성 섬유 시각화와 정량적 프로파일링을 위한 조직 준비 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 생리적 및 병리학적 조건에서 조직 구조, 공간 섬유 조직, 세포외 기질 재형성을 견고하게 평가할 수 있게 합니다.

초록

폐세포외기질(ECM)의 재구성은 폐 손상과 질환의 핵심 특징입니다. 탄성 섬유는 폐 ECM의 핵심 구성 요소로, 정상적인 호흡 기능에 필요한 탄력성과 반동을 제공하며, 이들의 교란은 조직 역학 손상에 기여합니다. 이 프로토콜은 쥐 폐 조직의 준비 및 분석을 위한 견고하고 재현 가능한 워크플로우를 설명하며, 탄성 섬유의 시각화 및 정량적 프로파일링에 중점을 둡니다. 엘라스틴 구조를 보존하고 검출하기 위한 최적화된 조직 처리 및 조직학적 염색 방법을 개략적으로 설명합니다. 또한, 이 프로토콜은 폐 내 탄성 섬유 풍부도, 조직 및 공간 분포를 정량적으로 평가할 수 있는 영상 분석 파이프라인을 상세히 설명합니다. 워크플로우는 또한 QuPath의 스테인 벡터 추정, Fiji/ImageJ의 색상 디컨볼루션, TWOMBLI 기반 이미지 분석을 통합하여 탄성 섬유 풍부도, 분기 및 네트워크 복잡도를 정량적으로 평가할 수 있게 합니다. 이미지 획득, 관심 영역 선택, 매개변수 최적화, 품질 관리 전략이 포함되어 재현성을 보장하고 사용자 의존적 편향을 최소화합니다. 이 워크플로우를 사용하여 비만 마우스의 폐에서 탄성 섬유 조직과 네트워크 구조의 변화를 성공적으로 확인하여, 질병 관련 ECM 재형성 탐지에 적용 가능함을 입증했습니다. 이 방법들은 생리적 및 병리학적 조건에서 탄성 섬유 재형성과 조직 구조에 대한 기여를 조사하는 포괄적인 틀을 제공합니다. 이 방법은 섬유아세포에 의해 유발되는 구조 변화 연구를 용이하게 하며, 폐 질환의 기저 ECM 변화에 대한 기전적 통찰을 지원합니다.

서론

탄성 섬유는 주로 엘라스틴과 관련된 미세섬유 단백질로 구성되어 매우 조직적이고 탄탄한 네트워크로 조립되는 폐세포외기질(ECM)의 필수 구성 요소입니다^. 폐에서는 탄성 섬유가 폐포 중격과 기관지 주변 구조를 따라 배열되어 정상적인 호흡 역학에 필요한 탄력성과 반동을 제공합니다 ^1,2. 폐, 대동맥, 자궁과 같은 조직에서 가장 풍부한 구조적 ECM 구성 요소 중 하나로서, 조직 순응성을 유지하는 데 매우 중요합니다 ^1,2. 섬유증, 폐기종, 만성 염증성 질환 등 다양한 폐 질환에서 탄성 섬유 조직의 붕괴가 관찰되었으며, 섬유 구조 변화가 폐 기능과 기계적 특성 저하에 기여합니다 ^2,3.

폐 모형체는 최근 특성화되어 콜라겐과 라미닌과 같은 핵심 ECM 단백질과 사이토카인, ECM 조절자, ECM 관련 단백질(예: 인테그린 리간드, 갈렉틴)을 포함한 모성체 관련 성분이 밝혀졌습니다^4,5. 구조적 지지를 제공하는 것 외에도, 이 구성 요소들은 조직 기능을 적극적으로 조절하고 거주 및 이동 세포를 지원하는 특수한 지위를 형성합니다 ^6,7. 특히 최근 연구들은 비만과 같은 대사 상태가 탄성 섬유 조직의 유의미한 변화와 연관되어 있으며, 전신 대사 조절 장애가 폐 ECM 구조 및 섬유아세포 기능 변화와 연관되어 있음을 강조했습니다^. 이러한 발견은 탄성 섬유 재형성을 역동적이고 질병과 관련된 과정으로 이해하는 것이 얼마나 중요한지 강조합니다.

탄성 섬유의 기존 평가는 종종 질적 조직학적 평가, 반정량적 평가 시스템, 또는 엘라스틴 풍부도 측정에 의존하는데, 이는 섬유 조직, 연결성, 네트워크 복잡성에 관한 제한된 정보를 제공합니다 ^8,9. 이러한 접근법은 엘라스틴 함량의 큰 변화를 감지하는 데 유용하지만, 조직 재형성과 관련된 미묘한 구조적 변화를 포착하지 못할 수 있습니다. 정량적 이미지 기반 분석은 탄성 섬유 네트워크의 객관적이고 재현 가능한 특성화를 가능하게 하고 실험 조건과 연구 간 비교를 용이하게 함으로써 이러한 한계를 극복할 잠재력을 가지고 있습니다. 이를 해결하기 위해 여기서 설명한 프로토콜은 탄성 섬유 구조에 중점을 둔 폐 ECM 조직의 통합 분석을 가능하게 합니다. ECM 특성화 ^4,5를 위한 확립된 접근법 외에도, 이 워크플로우는 Elastica 염색과 TWOMBLI 기반¹⁰개 이미지 분석 파이프라인을 폐 조직 구조에 최적화하여 통합합니다. Elastica 염색과 정량적 네트워크 분석을 결합함으로써 이 워크플로우는 기존의 조직학적 평가를 넘어 섬유 풍부도, 단편화, 공간적 조직, 구조적 복잡성에 대한 상세한 특성 분석을 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 특히 섬유증, 폐기종, 비만 관련 폐 재형성, 염증성 폐 질환, 노화 및 폐에서 세포외 기질 재형성이 특징인 기타 상태를 조사하는 연구에 적합합니다.

프로토콜

여기서 설명된 모든 쥐 실험은 독일 노르트라인베스트팔렌 주 동물윤리위원회(AZ: 81-02.04.2021.A221)의 승인을 받아 수행되었습니다.

참고: 시술 내내 적절한 개인 보호 장비(실험복, 장갑, 안구 보호구)를 착용하세요.

1. 쥐 폐 조직의 샘플링 및 준비

참고: 쥐들은 조직 채취 전에 기관 및 정부 지침에 따라 이소플루란 과다복용으로 안락사되었습니다.

1. 흉강을 중앙선 절개로 조심스럽게 열고, 부착물을 따라 횡격막을 자르며 폐를 부드럽게 노출하세요.
2. 모든 엽을 유지하되 오른쪽과 왼쪽 엽을 함께 절제하여 폐 전체를 제거하세요.
3. 폐엽을 개별적으로 5mL 튜브에 넣고 10% 중성 완충 포르말린 2 mL를 넣어 4 °C에서 15–20시간 배양합니다.
   참고: 고정은 이후 조직학 및 탄성 섬유 분석을 위해 조직 구조를 보존합니다. 이 작업 흐름의 주요 목표가 폐포 형태측정 분석이 아닌 탄성 섬유 조직의 시각화 및 정량적 평가였기 때문에, 조직 처리 전에 폐는 팽창 고정되지 않았습니다.
   주의: 중성 완충 포르말린에는 독성이 있고 발암성이 있으며 피부, 눈, 호흡기 자극을 유발할 수 있는 포름알데히드가 포함되어 있습니다. 포르말린은 인증된 화학 연기 후드에서 적절한 개인 보호 장비(장갑, 실험복, 안전안경 등)를 착용하여 다루십시오.
4. 표준 조직학적 임베딩 프로토콜¹¹을 사용하여 고정된 폐 조직을 파라핀에 삽입합니다.
   참고: 완전한 탈수와 파라핀 침윤을 통해 조직 형태를 유지하여 이후 염색을 해야 합니다. 샘플 간 변동성을 최소화하고 실험 조건 간 호환성을 보장하기 위해 각 분석마다 항상 동일한 폐엽을 사용하세요. 조직학 검사는 왼쪽 엽을 사용하는 것이 권장됩니다.
5. FFPE 폐 조직을 5–7 μm 두께의 절편으로 절단하여 표준 유리 슬라이드에 부착합니다. 슬라이드를 60°C에서 1시간 동안 베이킹한 후 하류 적용을 진행하세요. 슬라이드는 먼지 없는 환경에서 몇 주간 RT에 보관하거나, 장기 보관을 위해 4°C에서 보관할 수 있습니다.
   참고: 보관 중에는 습기 노출을 피하세요. 습기는 파라핀 산화를 유발하고 염색 품질을 저하시킬 수 있습니다. 장기 보관이 필요할 경우 슬라이드를 건조제가 포함된 밀봉된 플라스틱 슬라이드 박스에 보관하세요.
   일시정지: 슬라이드는 RT 또는 4 °C에서 염색될 때까지 보관합니다.

2. 탄성 섬유 염색

1. 5–7 μm 파라핀 박박 폐 조직 절편에 Elastica(레소르신-푸신) 염색을 수행하여 폐포 및 혈관 구조 내 탄성 섬유를 시각화합니다.
   참고: 샘플 전반에 걸쳐 일관된 염색 강도와 재현성을 보장하기 위해 동시에 다룰 수 있는 만큼만 착색하세요.
   1. 디파라피네이트 슬라이드는 슬라이드를 자일렌(혼합 이성질체)에 두 번씩 각각 5분씩 담가서 사용합니다.
      주의: 자일렌은 독성이 강하고 가연성이 있습니다. 화학 연기 후드에 손을 대고 적절한 보호 장비를 착용하세요.
   2. 에탄올 계열을 따라 하강하는 슬라이드를 80% 에탄올까지 재수화합니다.
      1. 슬라이드를 100% 에탄올로 채워진 염색실에서 RT에서 3분간 배양하세요.
      2. 슬라이드를 신선한 100% 에탄올로 옮기고 RT에서 3분간 배큐하세요.
      3. 슬라이드를 95% 에탄올로 옮기고 RT에서 3분간 배양합니다.
      4. 슬라이드를 80% 에탄올로 옮기고 RT에서 3분간 배큐하세요.
   3. 슬라이드를 레조르신-푸신 용액이 포함된 새로운 염색실로 옮기고, RT에서 20–30분간 배양합니다.
      참고: 레조신-푸흐신 염색액은 여러 번 사용할 수 있으며 RT에서 안정적입니다.
      주의: 레소신-푸신 염색액에는 농산과 염료 등 잠재적으로 유해한 화학물질이 포함되어 있어 피부와 눈 자극을 유발할 수 있습니다. 용액을 환기가 잘 되는 곳이나 연기통에서 다루고, 기관 안전 지침에 따라 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요.
   4. 슬라이드를 스테인팅 챔버에 넣고 흐르는 증류수 아래에 넣고 1분간 세척하세요.
   5. 95–96% 에탄올에서 15–60초 분별하고, 현미경으로 관찰하세요.
      참고: 탄성 섬유가 짙은 보라색 상태를 유지하고 배경이 충분히 깨끗해질 때 중단하세요. 얼룩진 탄성 섬유는 짙은 보라색으로 보입니다. 콜라겐 섬유는 착색되지 않고 보통 연한 색을 띱니다. 과잉 염색은 배경을 증가시킬 수 있습니다; 조직 두께와 고정 정도에 따라 잠복 시간을 조정하세요.
   6. 분화를 즉시 증류수를 이중증류수로 옮기고 30초간 헹구세요. 선택 사항: 추가 폐 평가를 위해 필요 시 카운터 스테인팅을 할 수 있으나, 섬유 분할 효율이 저하될 수 있습니다. 인접한 상처의 폐를 평가하기 위해 H&E 염색을 시행할 것을 권장합니다.
   7. 슬라이드를 95% 에탄올에 순차적으로 1–2분간 건조시키고, 100% 에탄올을 두 차례 각각 1–2분씩 건조하여 잔여물을 제거합니다.
   8. 조직이 광학적으로 투명해질 때까지 자일렌에 2번 제거하세요.
   9. 자일렌 호환 영구 합성수지로 커버슬립을 장착하고, RT에서 슬라이드를 평평하게 건조시키세요.
      참고: 완전한 탈수와 제거는 흐림을 방지하고 얼룩진 부분의 장기적인 보존을 위해 필수적입니다.
      일시정지: 착색된 장착된 슬라이드는 RT에 보관하여 영상 검사를 기다립니다.

3. 탄성 섬유 영상 및 네트워크 분석

1. 이미지 획득
   1. 슬라이드 스캐너를 사용해 40× 대물렌즈를 가진 폐 조직 절편의 고해상도 밝시야 이미지를 획득합니다. 모든 샘플에서 노출과 화이트 밸런스 설정을 일정하게 유지하세요.
      참고: 이미지 촬영은 연구 전반에 걸쳐 확대율, 공간 해상도(0.25 μm/픽셀), 조명, 노출 등 동일한 스캐너 설정을 사용해 촬영되었습니다.
   2. 스캔 시 완전한 덮개를 위해 폐 조직 전체를 포함하는 관심 영역(ROI)을 그립니다.
   3. 조직이 없는 배경 기준 영역을 정의하여 이미지 분석 중 배경 강도를 측정하고 빼세요.
   4. 스캐너의 자동 초점 검출을 사용해 조직 전반에 최적의 초점 수를 할당하여 균일한 선명도와 이미지 품질을 보장합니다.
   5. 균일한 조명과 노출 설정을 사용해 이미지를 획득하세요.
      참고: 자동 초점이 밀집되거나 고르지 않은 영역에서 실패할 경우, 수동으로 미세 초점 조정을 사용하여 폐포와 혈관 부위를 포함한 모든 조직 구조가 선명하게 포착되도록 하세요.
2. 이미지 디컨볼루션: QuPath¹²에서의 스테인 벡터 추정. 염색 벡터는 각 조직학적 염료의 특정 RGB 흡수 값을 나타내며, 색상 디컨볼루션 중 겹치는 염색을 분리할 수 있게 합니다.
   참고: 이 프로토콜에서는 피지에서 레소신-푸신에 대한 사전 정의된 스테인 벡터가 없기 때문에 얼룩 벡터가 QuPath에서 정의되었습니다.
   1. QuPath에서 이미지를 열고 밝은 필드 이미지 유형을 선택하세요.
      참고: 편향을 최소화하기 위해 데이터셋에서 대표적인 이미지를 사용해 스테인 벡터를 계산하고 모든 이미지에 동일한 값을 적용하세요.
   2. 주로 탄성 섬유가 포함된 관심 영역(ROI)을 그리며 첫 번째 얼룩 성분을 정의합니다.
   3. 이미지 탭에서 스테인 벡터 섹션으로 이동하세요.
   4. 스테인 1을 클릭한 후, ROI에서 스테인 벡터를 설정해 탄성 섬유(보통 보라색-보라색)의 색상 벡터를 정의하세요.
   5. 비탄성 조직(예: 배경 또는 콜라겐)을 포함하는 ROI를 선택하고 스테인 2를 클릭한 후, ROI에서 스테인 벡터를 설정하여 2차 색상 성분을 정의합니다.
   6. QuPath는 배경에 해당하는 스테인 3을 자동으로 계산합니다.
   7. 피지에서 계산되고 적용된 벡터 예시: Resorcin-Fuchsin R:0.6201225, G:0.6541292, B:0.43308553; 불특이 신호 R:0.31585205; G: 0.815618; B: 0.48477295; 배경 R:-0.105005614, G:-0.4780256, B:0.87204665.
      참고: 이 값은 레소르신-푸신만으로 염색된 이미지에 대해 염색되었습니다. 카운터 스테인이 있으면 새로운 스테인 벡터를 계산해야 합니다.
   8. 이 데이터를 사용자 지정 스테인 벡터로 저장하고 모든 샘플에서 일관된 색상 디컨볼루션을 적용하세요.
      참고: 대표 영역에서 맞춤형 스테인 벡터를 정의하면 색상 디컨볼루션 정확도가 향상되며, 특히 엘라스틴과 배경 색조가 배치에 따라 다를 수 있는 레조신-푸신 염색의 경우 더욱 그렇습니다.
3. 피지의 컬러 디컨볼루션^{이미지 13, 14}.
   1. Fiji(ImageJ)를 열고 염색된 조직 단면의 밝은 필드 이미지를 불러오세요.
   2. 선택 사항: 이미지가 이미 RGB가 아니라면(예: 8비트 이미지) RGB 포맷(이미지 → 유형 → RGB 색상)으로 변환할 수 있습니다. 이 단계는 새로운 이미지 창을 엽니다; 원본 원시 데이터를 보존하기 위해 저장하세요.
   3. 사용자 값> 이미지 색상 > 색상 디컨볼루션을 선택하여 색상 디컨볼루션을 수행>.
   4. 이전에 QuPath에서 얻은 맞춤 스테인 벡터를 입력하세요.
   5. 플러그인을 실행하면 탄성 섬유, 탄성 섬유를 제외한 조직, 배경에 해당하는 세 개의 별개의 그레이스케일 이미지를 생성합니다.
   6. 추가 전처리 없이 TWOMBLI에 직접 이미지를 사용하세요. TWOMBLI는 충분한 해상도의 선명한 이미지를 필요로 하며; 구조적 세부를 보존하기 위해 부드럽게(예: 가우시안 블러) 사용은 피해야 합니다.
      참고: 벡터 추정을 위해 QuPath에서 선택한 영역이 일반적인 염색을 대표하는지 확인하세요. 이 맞춤형 벡터는 일관된 비교를 위해 모든 이미지에 균일하게 적용됩니다.
   7. 탄성 섬유 채널을 TIFF 파일로 저장하여 후속 정량화 및 분석을 수행하세요.
4. 섬유 분석을 위한 ROI 선택
   1. 각 폐 절개별로 폐포 영역에 5개의 편향 없는 정사각형 ROI를, 기관지 주변 영역에 5개의 ROI(각각 100 μm x 100 μm)를 선택합니다.
   2. 원본 데이터를 보존하기 위해 원본 이미지에 각 ROI를 복제하세요(이미지 > 복제).
   3. 디컨볼루트드 탄성 섬유 분석에서도 동일한 ROI를 복제하세요.
   4. 중복된 모든 ROI를 개별 TIFF 파일로 저장하여 후속 분석을 하세요.
      참고: 조직 주름, 절편 인공물, 파열, 큰 혈관, 보존이 좋지 않은 폐포 구조가 포함된 부위는 분석에서 제외되었습니다. TWOMBLI 분석의 입력값은 반전된 탄성 섬유 ROI만 사용되었으며, 해당 원시 이미지 복제본은 품질 관리 및 시각적 검사를 위한 참조 파일로 유지되었습니다. 관심 영역(ROI)은 조직의 편향 없는 표현을 위해 체계적인 무작위 샘플링을 통해 선정해야 합니다. 운영자 편향을 더욱 줄이기 위해, QuPath와 호환되는 자동 ROI 선택 스크립트가 보조 파일 1 과 보조 파일 2에 제공되며, 그 구현은 섹션 3.5에 설명되어 있습니다.
5. QuPath에서 자동화된 ROI 선택 스크립트를 사용해 적용하는 과정입니다.
   1. QuPath에서 이미지를 열고 이미지 유형을 Brightfield로 설정하세요.
   2. 도구 메뉴에서 원하는 주석 도구를 선택하여 초기 주석을 생성하세요. 사각형 주석을 사용하는 것이 권장됩니다.
   3. 폐 조직 내에 정사각형 주석을 그려보세요. 각 주석은 분석을 위해 치포 영역 또는 기관지 주변 영역 중 하나의 관심 영역(ROI)만 포함해야 합니다.
   4. 주석이 생성되면, 주 석 으로 이동하여 ' 잠금 주석 '을 선택하여 실수로 이동하거나 수정되는 것을 방지하세요.
   5. 주석 패널의 클래스 목록 옆에 있는 "+" 버튼을 클릭하여 클래스 목록에 "폐포"와 "기관지 주변 영역"을 추가하세요.
   6. 각 주석을 적절한 클래스에 할당하세요. 주석을 선택하고 해당 클래스를 선택한 후 선택된 설정을 클릭하세요. 주석 색상이 바뀌고, 할당된 분류("폐포" 또는 "기관지 주변 영역")가 주석 속성 패널에 표시됩니다.
   7. 해당 스크립트를 열고 실행하세요. 완료 시 ROI가 성공적으로 생성되었음을 알리는 메시지가 표시됩니다. 새로 생성된 ROI는 원래 클래스 정의 주석의 자식 주석으로 주석 계층 구조에 나타납니다.
   8. ROI를 내보내려면 선택하고 파일 → 원본 픽셀 →이미지 내보내기로 이동하세요. 내보낸 ROI를 TIFF 파일로 저장하세요.
      참고: 문자는 "폐포"와 "기관지 주변 영역"이라는 분류명만 인식하도록 설계되었습니다. 이 이름들은 지정된 대로 정확히 입력해야 합니다. 기본적으로 스크립트는 각 주석 내에서 100 μm × 100 μm 크기의 겹치지 않는 다섯 개의 정사각형 ROI를 무작위로 생성합니다. 후보 ROI는 모서리와 중앙이 주석 경계 내에 완전히 포함되어 선택된 영역 내에 완전히 포함되어야 합니다. ROI의 수와 크기 모두 스크립트 내에서 특정 실험적 요구사항에 맞게 수정할 수 있습니다. 분석에는 최소 3개의 생물학적 복제와 최소 5개의 ROI/샘플이 권장됩니다.
6. 트웜블리 분석
   1. 모든 ROI 탄성 섬유 이미지를 전용 폴더에 저장하여 분석을 하세요.
   2. 작업 디렉터리 내에 두 개의 하위 폴더를 만드세요: a. TWOMBLI가 생성한 이진 마스크용 마스크 폴더 b. HDM 폴더 – TWOMBLI가 생성한 고밀도 매트릭스(HDM) 이미지용.
   3. TWOMBLI 플러그인 실행: 피지를 열고 TWOMBLI (플러그인 -> 매크로 -> 실행)를 실행하세요.
   4. 적절한 분석 매개변수 파일을 선택하세요. 다음 TWOMBLI 매개변수는 탄성 섬유 분석에 사용되었으며, 표 1에 나열되어 있습니다.
      참고: 이 매개변수는 염색 강도에 따라 달라질 수 있습니다. 매개변수는 표준화된 조건에서 염색된 폐 조직 절편의 여러 대표 이미지를 사용하여 경험적으로 최적화되었습니다. 최적화는 생성된 마스크와 원본 염색 패턴을 비교하고, 분할된 마스크와 기저 탄성 섬유 네트워크 간 가장 잘 겹치는 설정을 선택하여 수행했습니다. 설정이 완료되면 동일한 매개변수가 데이터셋 내 모든 이미지에 적용되었습니다.
   5. "밝은 배경 위에 어두운 섬유" 옵션을 선택하세요.
   6. Mask 폴더에 바이너리 마스크를 생성하고 저장하세요.
   7. 이진 이미지를 생성하고 HDM 폴더에 저장하세요.
   8. 광섬유 길이, 분기 지점, 곡률, 밀도, 정렬 등 정량적인 네트워크 매개변수를 추출합니다.
      참고: TWOMBLI 분석은 선명하고 고해상도 이미지(>1 픽셀/μm)를 필요로 합니다. 불량한 색상 디컨볼루션, 초점이 맞지 않는 영역, 이미지 압축은 광섬유 네트워크 정량화의 정확도를 저해할 수 있습니다.
7. 정량화 및 통계 분석
   1. TWOMBLI 네트워크 파라미터를 CSV 파일로 내보내세요.
   2. 원시 CSV 데이터를 GraphPad Prism에 가져와 통계 분석 및 시각화를 하세요.
      참고: 다음 매개변수가 권장됩니다: 마스크 총 길이(Mask Total Length)로, ROI 내 탄성 섬유의 총 수를 반영하여 섬유 풍부도와 손실을 정량화할 수 있습니다. 광섬유 종점(Fiber Endpoints)은 광섬유 단편화의 정도를 나타내며; 종점이 많아지면 섬유가 파손되거나 파손되었음을 시사합니다. 광섬유 분기점은 광섬유가 얼마나 상호 연결되어 있는지를 측정하여 ECM 네트워크의 구조적 복잡성과 무결성을 반영합니다. 분기 지점 수가 많을수록 네트워크가 더 복잡하고 얽혀 있음을 나타냅니다. Lacunarity는 ROI 전반에 걸친 섬유 분포의 균일성을 정량화합니다. 낮은 결핍성은 유사한 크기의 갭을 가진 균일한 네트워크를 나타내며, 높은 결핍성은 더 복잡한 구조를 설명하는 가변 간격 크기를 가진 이질적인 네트워크를 반영합니다. 박스 카운팅-프랙탈 차원은 섬유 아키텍처의 복잡성을 포착합니다. 프랙탈 차원 값이 높을수록 더 복잡하고 세밀한 네트워크를 나타내며, 낮은 값은 더 단순하거나 파괴된 구조를 나타냅니다.
   3. 각 정량화된 네트워크 매개변수(예: 광섬유 길이, 분기, 곡률, 밀도)에 대한 평균 ± SEM을 보여주는 열형 그래프를 생성합니다.
   4. 샤피로-윌크 검정을 사용한 검정 데이터 정규성. 모수 데이터의 경우, 쌍이 없는 양측 학생 t-검정을 적용합니다. 비모수 데이터의 경우, Mann-Whitney U 검정을 적용합니다. 두 개 이상의 실험 그룹이 포함된 비교의 경우, 일방향 분산 분석(ANOVA)과 적절한 사후 다중 비교 검정 또는 비모수 데이터에 대한 Kruskal–Wallis 검정을 적용해야 합니다.
      참고: 재현성과 데이터 추적성을 보장하기 위해 모든 원시 CSV 파일은 변경하지 마세요. 각 조건별로 분석된 ROI 및 생물학적 복제 수를 도표 전례에 보고하세요.

결과

이 프로토콜은 다양한 폐 영역과 실험 조건에 걸친 탄성 섬유 네트워크의 정량적 매개변수를 제공합니다. 앞서 설명한 TWOMBLI 분석은 섬유 길이, 분기 밀도, 결핍도, 프랙탈 차원 등 세포외 기질 평가를 위한 매개변수를^{제공합니다.} 이 틀을 바탕으로 우리의 접근법은 탄성 섬유 조직의 포괄적인 특성화를 가능하게 하여, 생리적 및 병리적 폐 조직 모두에서 섬유 풍부도, 연결성, 균일성, 구조적 복잡성의 변화를 평가할 수 있게 합니다.

건강한 폐 조직에서는 탄성 섬유가 폐포 중격과 기관지 주변 구조를 따라 길고 연속적이며 잘 정렬된 네트워크를 형성합니다. 반면, 비만 쥐와 같은 병리적 또는 대사적으로 변형된 폐는 종종 갈라지가 증가하고 네트워크 복잡성이 증가하여 탄성 섬유 조직의 변화를 반영합니다^. 이진 마스크와 정량적 매개변수를 포함한 대표적인 출력은 그림 1A, B에 나타났습니다. 이 결과물들은 조직학 및 분자 분석 과 통합되어 ECM의 무결성과 재형성 정도를 평가할 수 있습니다^. 건강한 폐 조직에서 허공과 틈 채움이 ECM 조직의 차이를 시각화하기 위해 예시된다(그림 1C). 다른 정량적 지표와 결합하여 이 매개변수들은 네트워크 복잡성을 포착하고 ECM 재조직에 의해 촉진된 조직 구조 변화를 드러내어 탄성 섬유 네트워크 내 구조 재형성의 뚜렷한 패턴에 대한 통찰을 제공합니다.

이러한 정량적 결과물의 정확한 해석은 고품질 이미지 획득과 처리에 매우 중요합니다. 초점 저하, 조명 불일정, 착색 벡터 추정 부정확성 등 최적의 이미징 또는 처리 조건은 마스크가 단편화되거나 노이즈가 발생하여 결과적으로 신뢰성 없는 정량적 출력을 초래할 수 있습니다(그림 1D). 따라서 해석 전에 데이터 품질을 보장하기 위해 원시 이미지와 세분화 결과를 신중히 시각적으로 검사하는 것이 필수적입니다. 최적이 아닌 마스크는 일반적으로 연속 섬유의 과도한 단편화, 불연속 또는 불완전한 분할, 섬유 구조로 배경 잡음의 포함, 또는 원본 염색 패턴과 생성된 마스크 간의 불량한 겹침으로 인식될 수 있으며, 이는 이미지 획득, 얼룩 벡터 추정 또는 분할 매개변수를 재평가해야 함을 나타냅니다. 이러한 특징을 설명하기 위해, 카운터 스테인이 있는 절면을 의도적으로 분석했는데, 이는 탄성 섬유 식별에 방해가 되어 최적의 분할이 아님을 초래합니다. 이러한 저품질 마스크의 예시는 그림 1E에 나와 있습니다. 워크플로우의 견고성과 재현성을 추가로 평가하기 위해, 두 명의 연구자가 동일한 최적화된 분석 매개변수를 사용하여 독립적으로 이미지 데이터셋을 분석했습니다(그림 2A). 또한, 생물학적 변이를 평가하기 위해 독립 동물에서 추출한 샘플도 포함되었습니다(그림 2B). 운영자와 생물학적 복제체 간에 유사한 정량적 결과가 얻어져 제안된 이미지 분석 파이프라인의 재현성과 사용자 독립성을 뒷받침하였습니다. 이 분석들은 이 워크플로우가 탄성 섬유 조직의 견고한 평가를 가능하게 하고 생리적 조건과 병리적 조건 간의 비교를 용이하게 함을 보여줍니다.

그림 1. Elastica 염색 분석 워크플로우. (A) 대표적인 원본 이미지, 이미지 디컨볼루션으로 얻은 고립된 탄성 섬유 신호, TWOMBLI로 생성된 이진 마스크, 그리고 원본 탄성 섬유와 해당 마스크를 겹쳐 정확한 분할을 입증함. (B) TWOMBLI 분석으로 생성된 대표적인 정량적 매개변수. (C) 건강한 쥐 폐 조직에서 세포외 기질 조직의 차이를 보여주기 위한 결석 및 빈 채우기 분석 예시. (D) 최적이 아닌 이미지 획득 또는 이미지 처리로 인해 발생하는 단편화되고 노이즈가 많은 마스크의 일러스트레이션. (E) 헤마톡실린과 에오신으로 변색한 조직 절편으로, 탄성 섬유 식별 저하와 마스크 생성 비최적화가 나타났습니다. 원래 염색 패턴과 생성된 마스크 사이에 불량한 부위가 표시되어 있습니다. 스케일 바 A, D = 100 μm, E = 50 μm. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2. 탄성 섬유 분석 워크플로우의 재현성과 견고성. (A) 두 명의 연구자가 TWOMBLI 분석 매개변수를 사용하여 독립적으로 이미지 데이터셋을 분석하여 운영자 간 재현성을 평가하였습니다. 정량적인 TWOMBLI 기반 지표가 제시되어 있습니다. A와 B는 두 독립적인 연산자를 나타냅니다. (B) 독립 동물에서 추출한 샘플을 분석하여 생물학적 변이를 평가하였다. TWOMBLI에서 유래한 정량적 지표가 제시되어 생물학적 복제체 간 유사한 결과물을 보여주고 분석 파이프라인의 견고함을 뒷받침합니다. M1, M2, M3는 개별 건강한 동물을 나타냅니다. n = 3, 통계 분석은 일원 ANOVA를 사용한 후 Dunnett의 다중 비교 검정을 사용하였습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

매개변수	가치
대비 포화	0.75
최소 선폭	5
최대 선폭	10
최소 곡률 창	20
최대 곡률 창	80
최소 가지 길이	10
맥시먼 HDM 디스플레이	175
최소 갭 직경	0

표 1: TWOMBLI 유도 정량 매개변수 요약. TWOMBLI가 생성한 매개변수와 폐 조직의 탄성 섬유 구조 평가를 위한 해석에 대한 개요. 지표로는 광섬유 풍부도, 분기, 정렬, 연결성, 네트워크 조직 등이 포함됩니다.

보조 파일 1: 편향 없는 ROI 폐포 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하세요.

보조 파일 2: 편향되지 않은 ROI 기관지 주변 영역 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하세요.

토론

이 프로토콜은 특히 섬유아세포 구동 탄성 섬유 재형성에 중점을 두어 쥐 폐 세포외 기질(ECM) 구조를 연구하기 위한 견고하고 재현 가능한 워크플로우를 제공합니다. 탄성 섬유는 폐의 순응과 반동을 유지하는 데 필수적이며, 이들의 교란은 섬유증, 폐 손상, 노화, 대사 장애 등 여러 폐 질환의 특징입니다. 핵심 기능적 역할에도 불구하고, 탄성 섬유의 조직 및 조립에 대한 정량적 평가는 여전히 제한적이었습니다. 이 워크플로우는 탄성 광섬유 네트워크 아키텍처의 체계적이고 정량적인 특성화를 가능하게 하여 이 격차를 해소합니다.

이 방법의 주요 강점은 정량적 영상 워크플로우와 구조 조직학 분석을 통합한다는 점입니다. 기존 접근법이 ECM 구성이나 조직학적 특징을 별도로 평가하는 경우가 많지만, 이 프로토콜은 섬유 길이, 가지, 네트워크 복잡성 등 탄성 섬유 조직을 객관적으로 정량화할 수 있게 합니다. 이를 통해 생리적 상태와 병리적 상태를 직접 비교할 수 있으며, 섬유아세포 매개 ECM 재형성에 대한 통찰을 제공합니다^.

하지만 실험의 일관성과 데이터 품질을 보장하기 위해서는 여러 기술적 측면이 매우 중요합니다. 레조르신-푸신 염색은 고정 시간, 단면 두께, 시약 일도성 등의 변수에 민감하여 재현성을 위해 표준화가 필수적입니다. TWOMBLI의 정량적 출력은 이미지 품질, 해상도, 관심 영역 선택의 일관됨에 따라 달라지므로, 조직학적 평가와 함께 해석하고 여러 샘플에 걸쳐 검증되어야 합니다. 또한, 섬유 밀도와 형태는 치조와 기관지 주변 부위에서 차이가 있어 부위별 최적화가 필요합니다. 이 접근법은 탄성 섬유 네트워크의 전역 조직을 2차원으로 포착하며, 전자현미경과 같은 고해상도 기법이 필요한 초구조적 특징을 해독하지 않습니다. 공초점 현미경이나 다광자 현미경을 포함한 3차원 영상 방식은 섬유 기하학과 연결성의 분석을 더욱 향상시킬 수 있습니다.

워크플로우 내 여러 단계는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 결과를 보장하는 데 특히 중요합니다. 조직 고정, 절절 품질, 일관된 레소신-푸신 염색은 탄성 섬유 시각화에 큰 영향을 미치므로 신중하게 표준화되어야 합니다.  염색 강도가 낮거나, 염색이 고르지 않거나, 높은 배경은 시약 품질의 변동, 염색 조건의 불일치, 또는 조직 보존 부족으로 인해 발생할 수 있습니다. 또한, 건강한 폐 조직과 병든 폐 조직, 기술적 염색 통제, 실험 배치 전반에 걸쳐 처리된 참조 샘플의 포함이 염색의 일관성과 분석적 견고성을 모니터링하는 것이 권장됩니다. 탄성 섬유가 풍부한 조직은 이미지 획득 및 분할 절차를 검증하는 긍정적 대조군 역할도 할 수 있습니다. 이미지 디컨볼루션 중 정확한 스테인 벡터 추정도 중요한 단계로, 부적절한 벡터 선택은 불완전한 섬유 추출과 단편화된 마스크로 이어질 수 있습니다. 실험 질문에 따라 ROI 크기와 수를 조정하거나, 이미지 처리 매개변수를 조정하거나, 3차원 영상 접근법을 통합하여 탄성 섬유 조직을 더 깊이 연구함으로써 워크플로우를 수정할 수 있습니다.

전반적으로 이 방법은 생리학적 및 병리학적 맥락 모두에서 ECM 재형성을 연구할 수 있는 다재다능한 플랫폼을 제공합니다. 탄성 섬유 무결성이 폐 순응성 및 기계적 기능과 직접적으로 연결되어 있기 때문에, 이 접근법은 ECM의 구조적 변화가 폐 기능 변화로 어떻게 이어지는지 이해하는 데 특히 중요합니다. 섬유아세포에 의해 유발되는 구조 변화를 연구하는 데 적합하며, ECM 재형성과 질병 진행 및 조직 기능에 미치는 기여를 더 잘 이해할 수 있는 새로운 기회를 제공합니다. 이 접근법은 심혈관 조직, 피부, 자궁, 결합조직 질환, 섬유화 장기, 인간 표본 등 다른 조직에도 확장될 수 있으며, 고급 공간 및 고해상도 영상 기술과 결합하여 적용 범위를 더욱 넓힐 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Axio CS2 Slide Scanner	Carl Zeiss
Coplin Glass Staining jar	Sigma-Aldrich	S6016
DPX Mountant	Sigma-Aldrich	6522
Ethanol (100%) for histology	Carl Roth	9065.4
Fiji		https://imagej.net/software/fiji/	version 1.54t
Formalin solution, neutral buffered 10%	Sigma	HT501128
HISTOSETTE I Tissue Processing/Embedding Cassettes	Sigma-Aldrich	H0542
microtome	Thermo Fischer Scietific	HM355S
Micrsocope Slides	VWR	631-0108
Mouse: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:000664	Strain #:000664
paraffin embedding system	Epredia HistoStar embedding module
Prism		https://www.graphpad.com	version 11
Qupath		https://qupath.github.io	version 0.7.0
Resorcin-Fuchsin	Waldeck	2.00E-30
TWOMBLI plugin		https://github.com/wershofe/TWOMBLI
Xylene	Applichem GmBH	14020172