보신건비청창방(Bushen Jianpi Qingchang Formula)이 담즙산 대사 및 장내 미생물군 조절을 통해 쥐의 결장염을 개선한다

요약

본 연구는 보신건비청장탕(Bushen-Jianpi-Qingchang formula) 및 그 하위 처방이 쥐의 결장염에 미치는 치료 효과를 조사하고, 멀티오믹스 분석을 통해 장내 미생물-담즙산 대사 축을 표적으로 하는 조절 메커니즘을 밝힙니다.

초록

전통 중의학(TCM)은 검증된 효능과 양호한 안전성 프로파일 덕분에 궤양성 대장염(UC) 관리에 널리 사용됩니다. 만성 난치성 UC의 핵심 병태생리는 비장 및 신장 결핍과 그에 따른 장내 습열 축적을 포함하며, 보신건비청창탕(BJQF)은 이러한 상태에 대해 임상적으로 검증된 복합 처방입니다. 본 연구는 DSS(dextran sulfate sodium)로 유도된 쥐의 대장염 모델에서 BJQF 및 이를 세 가지로 분해한 하위 처방(보신방, BSF; 건비방, JPF; 청창방, QCF)의 치료 효과를 조사하고, 분변 담즙산(BA) 프로파일 및 장내 미생물 군집에 미치는 조절 효과를 특성화하는 것을 목표로 했습니다. DSS 유도 UC 쥐의 분변 박테리아 구성과 BA 농도는 16S rRNA 유전자 시퀀싱과 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS)을 통해 정량화되었으며, 장내 미생물 군집과 BA 대사 사이의 잠재적 연관성을 분석했습니다. BJQF는 UC 모델에서 대장 염증과 궤양을 유의하게 개선했습니다. 대장염 쥐와 건강한 대조군 사이에서 박테리아 다양성과 구성의 뚜렷한 변화가 확인되었습니다. 차이 나는 박테리아와 BA 간의 연관성은 23-deoxycholic acid(23-DCA)를 핵심 대사 노드로 중심으로 나타났습니다. 특히, taurolithocholic acid-3-sulfate(TLCA-3S)와 lithocholic acid-3-sulfate(LCA-3S)가 잠재적인 효능 바이오마커로 작용할 수 있습니다. JPF 하위 처방은 완전한 BJQF와 가장 유사한 효능을 보였습니다. BJQF 및 그 분해 처방의 투여는 UC 쥐의 조직병리학적 손상, 염증, 장내 미생물 불균형 및 BA 대사 장애를 효과적으로 개선하여, 중의학 복합 요법의 기전적 근거를 제공합니다.

서론

염증성 장질환(IBD)의 주요 형태인 궤양성 대장염(UC)은 대장 점막에 국한된 만성적이고 지속적인 비특이적 염증을 특징으로 합니다. 궤양성 대장염 환자는 설사, 복통, 의도치 않은 체중 감소, 혈변 또는 점액변 등의 임상 증상을 보이며, 이는 삶의 질을 심각하게 저하시킵니다. 궤양성 대장염의 병태생리는 환경적, 유전적, 미생물학적 및 면역학적 요인이 관여합니다. 궤양성 대장염은 일반적으로 장내 미생물 불균형 이후에 발생하며, 이러한 미생물 군집의 불균형(dysbiosis)은 궤양성 대장염의 진행을 현저히 가속화할 수 있습니다¹. 축적된 증거들에 따르면 장내 미생물-담즙산(BA) 대사 축이 궤양성 대장염 병태생리의 핵심 조절 모듈로 확인되었습니다. 담즙산 대사 이상은 IBD에서 장 점막 손상의 잘 알려진 특징입니다. 이차 담즙산은 이 생물전환을 위해 7α-dehydroxylase와 같은 핵심 효소를 발현하는 장내 미생물에 의해 숙주 유래 일차 담즙산으로부터 독점적으로 생합성됩니다. 따라서 분변 담즙산 풀은 TCM 치료로 유도된 마이크로바이옴 재구성(remodeling)을 반영하는 이상적인 기능적 판독값 역할을 합니다.

이러한 이차 담즙산(BAs)은 장내 면역 항상성, 점막 장벽의 무결성 및 상피 세포의 생존을 유지하는 핵심 신호 분자로 작용합니다². 미생물 불균형으로 인한 이차 담즙산 결핍 및 담즙산 신호 전달 체계의 교란을 포함하여 이 축에 이상이 생기면 장내 염증성 반응과 장벽 기능 장애가 직접적으로 유발되므로, 이는 궤양성 대장염(UC) 치료를 위한 유망한 치료 표적이 됩니다. 장내 미생물군은 궤양성 대장염의 발생에 중요한 역할을 하며, 발효 반응을 통해 생성되는 담즙산과 같은 대사 산물을 통해 숙주에 영향을 미칩니다. 장내 미생물군 및 담즙산 대사의 비정상적인 변화는 궤양성 대장염과 밀접하게 연관되어 있습니다³. 장내 미생물군이 이차 담즙산 생성을 매개하기 때문에, 미생물 조성과 풍부도의 변화는 담즙산 대사를 방해하고 염증성 장질환(IBD)의 발생에 기여할 수 있습니다⁴.

전통 중의학(TCM)은 항염증제 또는 면역억제제의 대안이나 보조 요법으로서 장기 치료 시의 효과와 안전성 덕분에 궤양성 대장염(UC) 관리에 널리 채택되어 왔습니다⁵. 비장과 신장을 따뜻하게 하고 보하며, 장을 깨끗이 하고 습기를 제거하는 것이 궤양성 대장염 치료의 핵심 원칙입니다⁶. TCM 이론에 따르면, 만성 궤양성 대장염의 핵심 병인은 비장 및 신장 결핍(부정, 정기 보강)과 장내 습열 축적(거사, 병원성 인자 제거)이 결합된 것이며, 이 두 가지 전략을 시너지 있게 적용하는 것이 효과적인 궤양성 대장염 치료에 필수적입니다.

이전의 실험적 연구들을 통해 BJQF의 두 가지 핵심 하위 처방인 JPF와 QCF가 UC에 대해 치료 효과를 나타낸다는 것이 확인되었습니다. JPF는 NF-κB/HIF-1α 신호 전달 경로를 통해 점막 염증과 장 상피 장벽 기능 장애를 개선하며⁷, QCF는 장내 미생물-대사 항상성을 회복시키고 장 상피 장벽을 보호하며 NLRP3/IL-1β 경로를 조절합니다⁸. Fu-Zheng 및 Qu-Xie 기능 모듈이 장내 미생물-BA 축에 기여하는 구체적인 생물학적 역할을 분석하기 위해, 본 연구는 전체 BJQF 처방과 세 가지 분해된 하위 처방인 BSF (Bushen 처방, 비장-신장 보익, 순수 Fu-Zheng), JPF (Jianpi 처방, 비장 강화, 핵심 Fu-Zheng), QCF (Qingchang 처방, 장내 습열 제거, 순수 Qu-Xie)를 포함하도록 설계되었습니다. 이러한 실험 설계는 UC 치료에서 각 기능 모듈의 시너지 효과와 독립적 효과를 분석할 수 있게 하며, 이는 중의약 복합 처방을 근거 기반 치료법으로 전환하는 데 매우 중요합니다.

작업 가설은 BJQF가 장내 미생물 조성의 재구성과 담즙산 대사의 정상화를 통해 DSS로 유도된 결장염을 완화하며, 건비(Jianpi) 모듈이 장내 미생물-담즙산(BA) 축에 대한 조절 효과를 이끄는 핵심 기능 성분으로 작용한다는 것이다. 본 연구는 다음과 같은 내용을 체계적으로 분석하기 위해 설계되었다. "화합물-모듈 변환" BJQF의 메커니즘. 본 연구는 전체 처방과 그에 대응하는 표적 생리학적 하위 모듈을 평가함으로써, 이 중의약 화합물의 생물학적 시너지 효과를 해독하고 장내 미생물-담즙산 대사 축을 조절하여 IBD 치료를 위한 현대적 약리학적 근거를 제공하고자 한다. 이에 따라, DSS 유도 UC에 대한 완전한 BJQF와 이를 세 가지로 분해한 기능적 처방의 치료 효능을 체계적으로 비교한다. UC 발병 기전에서 장내 미생물-담즙산 대사 축의 중추적인 역할을 고려하여, 본 연구는 BJQF의 화합물-모듈 시너지 메커니즘을 분석하고, Bushen, Jianpi, Qingchang 모듈의 구체적인 조절 기여도를 규명하며, 각 모듈이 장내 미생물 조성 및 분변 담즙산 프로파일의 재구성에 미치는 영향을 특성화한다. 핵심 목표는 UC 완화에 있어 BJQF의 현대적 생물학적 근거를 밝히고, 중의약 개입을 위한 핵심 미생물-대사 표적을 식별하며, IBD에서 복합 중의약 처방의 합리적 적용 및 중개 연구를 위한 기전적 참고 자료를 제공하는 것이다.

프로토콜

본 연구를 위해 200 ± 20 g 무게의 건강한 수컷 Sprague-Dawley 랫 44마리를 확보하였다. 모든 동물은 표준 펠릿 사료와 물을 자유롭게 섭취할 수 있는 특정 병원균 부재(specific pathogen-free) 조건에서 사육되었으며, 실험 전 1주 동안 적응 기간을 거쳤다. 모든 동물 복지 및 실험 절차는 중국 과학기술부가 발행한 실험동물 관리 및 사용 가이드라인에 따라 수행되었다. 본 연구는 난징 중의학 대학 동물윤리위원회의 승인을 받았으며(승인 번호 2023DW-029-01), 동물 출처 및 사육 용품에 관한 상세 내용은 재료 표에 제공되어 있다.

TCM 처방 조제
전체 보신건비청장탕(Bushen-Jianpi-Qingchang formula, BJQF)은 미리 정의된 용량의 9가지 약재로 구성되었습니다: 15 g Astragali Radix, 10 g 초 Atractylodis Macrocephalae Rhizoma, 10 g Scutellariae Radix, 4 g Coptidis Rhizoma, 10 g Sanguisorbae Radix, 6 g Aucklandiae Radix, 5 g Glycyrrhizae Radix, 15 g Psoraleae Fructus, 그리고 15 g Alpiniae Oxyphyllae Fructus. 모든 생약 재료를 생리식염수에 1 h 동안 침지시킨 후, 1 h 동안 달여 최종 부피 1500 mL를 얻었습니다. 동일한 전탕 프로토콜을 사용하여 세 가지 분리 처방을 조제하였습니다. 보신탕(Bushen formula, BSF)은 15 g Psoraleae Fructus와 15 g Alpiniae Oxyphyllae Fructus를 포함하며 최종 부피 500 mL로 달였습니다. 건비탕(Jianpi formula, JPF)은 15 g Astragali Radix, 10 g 초 Atractylodis Macrocephalae Rhizoma, 5 g Glycyrrhizae Radix로 구성되었으며, 최종 전탕 부피는 500 mL였습니다. 청장탕(Qingchang formula, QCF)은 10 g Scutellariae Radix, 4 g Coptidis Rhizoma, 10 g Sanguisorbae Radix, 그리고 6 g Aucklandiae Radix로 구성되었으며, 마찬가지로 최종 부피를 500 mL로 맞추었습니다. 모든 약재의 상세한 제조사 사양 및 배치 번호는 재료 표(Table of Materials)에 제공되어 있습니다. 본문 전체에서는 일반적인 약재 명칭을 일관되게 사용하였으며, 제조사별 세부 정보는 재료 표(Table of Materials)에만 한정하여 기재하였습니다.

결장염 유도 및 실험군 분류
쥐를 무작위로 6개의 실험군으로 나누었다: 대조군 (n = 6): 일반 음용수 + 위내 생리식염수 투여. UC 모델군 (n = 6): 3.5% (wt/vol) DSS 음용수 + 위내 생리식염수 투여. BJQF 처리군 (n = 8): 3.5% DSS 음용수 + 위내 BJQF (0.6 g/kg 체중) 투여. BSF 처리군 (n = 8): 3.5% DSS 음용수 + 위내 BSF (0.6 g/kg 체중) 투여. JPF 처리군 (n = 8): 3.5% DSS 음용수 + 위내 JPF (0.6 g/kg 체중) 투여. QCF 처리군 (n = 8): 3.5% DSS 음용수 + 위내 QCF (0.6 g/kg 체중) 투여.

음용수에 3.5% DSS를 10일 연속 첨가하여 실험적 결장염을 유도하였으며, 대조군은 DSS가 없는 증류수를 제공받았습니다. 각 TCM 처방의 용량(0.6 g/kg)은 체표면적 정규화 방법(Meeh-Rubner 공식)을 사용하여 임상적 유효 성인 용량에서 쥐 등가 용량으로 전환되었습니다. 처방 비교에 집중한 발견 단계 연구로서, 단일 임상 등가 용량을 채택하였습니다. 1일부터 각 TCM 처방을 1일 1회 경구 투여하였습니다. 대조군과 모델군은 동일한 부피의 생리식염수(10 mL/kg)를 투여받았습니다. 11일째에 쥐를 경추 탈골로 희생시켰습니다. 분석을 위해 혈청, 분변 샘플 및 결장 조직을 수집하였습니다. 체중은 매일 측정하였습니다. 모든 군은 초기에 n = 8로 설계되었습니다. DSS 유도 과정 중 대조군과 모델군에서 각각 2마리의 쥐가 심각한 결장염으로 사망하여, 이 두 군의 최종 n = 6이 되었습니다. 사후 검정력 분석 결과, 최종 표본 크기가 모든 주요 결과 지표(조직학적 점수, 주요 사이토카인, 체중)에 대해 통계적 검정력 ≥ 0.8을 달성하여 표준 통계 요구 사항을 충족함을 확인하였습니다.

염증성 사이토카인 농도 측정
상용 ELISA 키트를 사용하여 IL-1β, IL-10 및 TNF-α의 혈청 수치를 정량화하였으며, 제조사의 프로토콜을 엄격히 준수하였다. 흡광도 값은 자동 마이크로플레이트 리더를 사용하여 측정하였다. 통계 분석: 그룹 간의 전반적인 차이를 확인하기 위해 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 수행하였으며, 오믹스 데이터 분석 방식에 따라 사후 쌍별 비교를 위해 Benjamini-Hochberg FDR 보정을 실시하였다.

조직병리학적 평가
결장 조직 표본을 10% formalin에 고정하고, 탈수, 파라핀 포매, 절편 제작 후 hematoxylin 및 eosin(HE)으로 염색하였다. 조직학적 점수 산정은 실험적 결장염을 위해 검증된 반정량적 루브릭인 수정된 Cooper 결장염 점수 체계(modified Cooper colitis scoring system)를 사용하여 수행하였다⁹. 점수 산정은 염증성 침윤, 은와(crypt) 구조 손상, 점막 부종, 궤양 범위의 네 가지 항목을 포함한다(총점 0–12점). 블라인딩 진술: 모든 슬라이드는 점수 산정 전 숫자 코드로 익명화되었다. 그룹 배정을 알지 못하는 두 명의 독립적인 병리학자가 각 슬라이드를 독립적으로 판독하였다. 최종 점수는 두 점수의 평균값으로 하였으며, 2점 이상의 차이가 발생하는 경우 제3의 상급 병리학자가 이를 해결하였다. 다른 표현형 데이터와 동일하게, 쌍별 비교를 위해 Benjamini-Hochberg FDR 보정을 적용한 일원 분산 분석(One-way ANOVA)을 실시하였다.

시료 수집 및 DNA 추출
신선한 쥐 분변 시료를 1 mL 멸균 원심분리 튜브에 수집하여 즉시 −80 °C에서 급속 냉동한 후 드라이아이스로 운반하였다. 제조사의 지침에 따라 DNA Isolation Kit를 사용하여 분변 250 mg으로부터 분변 세균 게놈 DNA를 추출하였다. DNA 농도는 분광광도계로 정량하였으며, 무결성은 0.8% 아가로스 겔 전기영동을 통해 확인하였다. 추출 및 정량 과정 중에 음성 버퍼 대조군을 포함하였다. 추출물은 사용 전까지 -20 °C에서 보관하였다.

16S rRNA 유전자 시퀀싱 및 생물정보학 분석
16S rRNA 유전자의 V3–V4 가변 영역(338F–806R)을 대상으로 PCR 증폭을 수행하였다. PCR 산물을 정제한 후, Illumina MiSeq 플랫폼을 이용하여 2 × 300-bp paired-end 시퀀싱을 진행하였다. 품질 필터링 후, 샘플당 평균 68,450 ± 28,297개의 고품질 clean reads를 얻었다 (최대 158,361개, 최소 28,294개). 시퀀스는 97% 유사도에서 OTU로 클러스터링되었다. 희소화 곡선(Rarefaction curves), 풍부도 지수 및 다양성 지수를 계산하였다. 분류학적 주석 처리는 RDP Classifier를 사용하여 수행하였다. 커뮤니티 유사성을 평가하기 위해 R에서 UniFrac 거리에 기반한 PCoA 및 계층적 클러스터링을 수행하였다. 상대적 풍부도가 차이 나는 분류군을 식별하기 위해 Galaxy 플랫폼에서 LEfSe 분석을 수행하였다 (임계값: LDA > 3, Kruskal-Wallis p < 0.05, post-hoc Wilcoxon p < 0.05). 미생물 풍부도의 다중 비교를 위해 Benjamini-Hochberg FDR 보정을 적용하였으며, p(FDR) < 0.05인 경우를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

분변 담즙산의 LC-MS/MS 분석
20 mg의 분변 샘플을 200 µL의 메탄올과 함께 균질화하였다. 원심분리 후, 상층액을 농축하고 100 µL의 50% 수성 메탄올로 재구성하여 LC-MS/MS로 분석하였다. 검출 시스템으로는 Shimadzu UPLC 시스템과 Applied Biosystems 6500 QTRAP MS/MS 시스템을 사용하였다. 정성 및 정량 분석은 담즙산 표준 검정 곡선을 이용하여 수행하였다. 대사 프로필의 분리 여부를 평가하기 위해 PCA를 사용하였다. 차이나는 담즙산은 VIP ≥ 1 및 fold change ≥ 2 또는 ≤ 0.5로 정의하였다. 차이나는 BA 분포를 시각화하기 위해 바이올린 도표를 사용하였다. 다중 비교의 경우, 미생물 데이터 분석 방식과 동일하게 Benjamini-Hochberg FDR 보정을 적용하였다.

통계 분석
Spearman 상관관계는 R의 cor 함수를 사용하여 계산하였습니다. 상관관계의 유의성은 WGCNA R 패키지의 corPvalueStudent 함수를 사용하여 검정하였습니다. 표현형 데이터는 평균 ± 표준편차(Mean ± SD)로 표시하였습니다. 모든 다중 그룹 비교(표현형, 미생물군, 대사체)에는 사후 검정을 위한 Benjamini-Hochberg FDR 보정을 적용한 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 실시하였습니다. 보정된 p < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였습니다. 모든 분석은 GraphPad Prism 7.00 및 R 4.2.0에서 수행되었습니다. 사후 표본 크기 검정력 계산은 G*Power 3.1을 사용하여 수행하였습니다.

결과

TCM 처방이 DSS로 유도된 대장염의 염증 및 결장 손상을 개선함
TCM 처방의 보호 효능을 먼저 체중 변화를 통해 평가하였습니다. 대조군과 비교했을 때, UC 모델군은 지속적인 체중 감소를 보였습니다. BJQF, BSF, JPF 및 QCF는 모두 DSS로 유도된 체중 감소를 유의하게 완화하였습니다(그림 1A). HE 염색 결과, 대조군에서는 결장 점막이 온전하며 염증이 없는 것으로 나타났습니다. 반면, 모델군의 결장 조직에서는 심각한 상피 왜곡, 움(crypt) 파괴, 그리고 점막 및 점막하층의 광범위한 염증 세포 침윤이 관찰되었습니다. 모든 TCM 처방은 조직 회복을 촉진하고 염증을 감소시켰으며, 그중 BJQF가 가장 뚜렷한 개선 효과를 보였습니다(그림 1B–C). 정량적 조직학적 점수 산정 결과, TCM이 조직병리학적 손상을 유의하게 개선했음을 확인하였습니다(p < 0.05).

BJQF, BSF, JPF 및 QCF는 모두 혈청 IL-1β(그림 1D)와 TNF-α(그림 1F)를 다양한 정도로 감소시켰습니다. 치료군의 IL-10 수치는 대조군 수준에 도달하지는 않았으나, 모델군보다 유의하게 높았습니다(그림 1E). 이러한 결과는 TCM 처방이 DSS로 유도된 장 염증을 억제함을 나타냅니다.

그림 1: 쥐의 DSS 유도 결장염에 대한 BJQF 및 그 분해 하위 처방의 치료 효과. (A) 10일의 실험 기간 동안 각 그룹의 기초 체중 대비 체중 비율의 동적 변화; (B) 모든 실험 그룹의 결장 조직에 대한 정량적 조직학적 점수; (C) 각 그룹의 대표적인 헤마톡실린-에오신(HE) 염색 결장 조직 절편 (스케일 바 = 200 µm); (D–F) 각 그룹의 염증성 사이토카인 혈청 농도: (D) IL-1β, (E) IL-10, (F) TNF-α. 데이터는 평균 ± SD로 표시됨. *p < 0.05, **p < 0.01, ****p < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

TCM 처리가 UC 쥐의 장내 미생물 군집 구조를 재편함
품질 필터링 후, 샘플당 평균 68,450 ± 28,297개의 고품질 클린 리드(clean reads)를 얻었다. TCM 처리는 박테리아의 α 다양성을 변화시켰다(Chao1 지수, 그림 2A). BJQF는 UC 쥐에서 상승된 α 다양성을 유의미하게 감소시켰다(p(FDR) < 0.05). 하위 처방 중에서는 JPF가 다양성을 유의미하게 감소시켰으나(p(FDR) < 0.05), BSF와 QCF는 유의미한 효과를 보이지 않았다. β 다양성의 경우, UniFrac 거리의 unweighted PCoA 분석 결과 그룹 간의 명확한 분리가 나타났으며, 이는 TCM이 전반적인 미생물 조성을 재편했음을 나타낸다(그림 2B). 계층적 군집 분석 결과, 모델군과 처리군 사이에 뚜렷한 군집화가 확인되었다(그림 2C).

총 13개의 문(phyla), 22개의 강(classes), 36개의 목(orders), 65개의 과(families), 그리고 158개의 속(genera)이 검출되었다. 문 수준에서는 Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Verrucomicrobia, Proteobacteria가 우세하였다(전체 상대 풍도 >99%, 그림 2D). Firmicutes는 대조군에서 우세하였으나(86.98%), UC군에서는 유의미하게 감소하였으며(p(FDR) < 0.05), TCM에 의해 회복되었고(p(FDR) < 0.05), 특히 BJQF에서 가장 강력한 효과를 보였다. Bacteroidetes와 Proteobacteria는 UC군에서 유의미하게 증가하였으며, 모든 TCM 처방에 의해 다시 감소하였다. 속 수준(풍도 >1%, 그림 2E)에서 Lactobacillus는 대조군에서 우세하였으나(59.77%), UC군에서는 현저히 감소하였고(3.57%, p(FDR) < 0.05), TCM에 의해 회복되었다(p(FDR) < 0.05). BJQF와 JPF는 Lactobacillus 회복에 더 강력한 효과를 보였다. 또한 UC는 Bacteroides, Ruminococcus_2, Bifidobacterium, Blautia를 증가시키고 Enterorhabdus와 Corynebacterium_1을 감소시켰으며, 이들 대부분은 TCM에 의해 반전되었다. 전반적으로 모든 처방이 UC 관련 미생물 불균형(dysbiosis)을 개선하였으며, BJQF와 JPF가 가장 뚜렷한 효과를 나타냈다.

그림 2: 그룹별 장내 미생물군집의 조성. (A) Chao 1을 사용하여 평가한 박테리아 α 다양성 지수 (p(FDR) < 0.05 vs Model); (B) 서로 다른 그룹의 OTU 조성 및 풍부도를 기반으로 한 UniFrac 거리의 PCoA; (C) 거리 행렬을 기반으로 한 계층적 군집 분석; (D) 문(phylum) 수준의 상대적 풍부도 (p(FDR) < 0.05 vs Model); 및 (E) 속(genus) 수준의 상대적 풍부도 (p(FDR) < 0.05 vs Model). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

LEfSe를 통한 UC 관련 및 TCM 관련 차이 분석 분류군 식별
그룹 간에 차별적으로 풍부한 분류군을 식별하기 위해 LEfSe 분석을 수행하였습니다(LDA > 3, p < 0.05, 그림 3). UC 농축 분류군에는 다음이 포함되었습니다. Bacteroidaceae, Bacteroides, Clostridiales, Clostridia, Bacteroidia, Bacteroidales, Bacteroidetes, Faecalibaculum, Ruminococcaceae 주로 ~에서 기인한 박테로이데테스(Bacteroidetes) 및 피르미쿠테스(Firmicutes)TCM 처리 후, BJQF로 농축된 대부분의 분류군은 다음에서 확인되었습니다. 피르미쿠테스(Firmicutes), ~만 사용하여 비피도박테리아과(Bifidobacteriaceae), 비피도박테리아목(Bifidobacteriales), 그리고 비피도박테리움 (Bifidobacterium) ~로부터 방선균 (Actinobacteria)BSF가 풍부한 분류군 또한 주로 피르미쿠테스 (Firmicutes)JPF가 농축된 다음과 같은 분류군 Turicibacter 및 Dorea ~에 속했다 피르미쿠테스(Firmicutes)QCF에서 가장 강력한 농축이 나타났으며 베루쿠미크로비아(Verrucomicrobia) (포함하여 아커만시아(Akkermansia)), 이는 해당 문(phylum)이 QCF 중재에 매우 민감함을 나타냅니다. 일반적으로, 피르미쿠테스 BJQF, BSF 및 JPF에 대해 가장 민감하게 반응한 문(phylum)이었다.

그림 3: LEfSe를 통해 서로 다른 그룹에서 가장 차별적으로 풍부한 OTU를 식별하였다. 클래스 간(Kruskal–Wallis 검정) 및 서브클래스 간(Wilcoxon 검정) LDA 점수에서 유의미한 차이(p < 0.05)가 나타났다. 차별적 분류군은 LDA 임계값 점수 > 3 및 통계적 유의 수준 0.05를 기준으로 결정되었다. (p: 문, c: 강, o: 목, f: 과, g: 속). 여기에서 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.

TCM 중재를 통해 UC 쥐의 분변 담즙산 프로필이 정상화됨
IBD에서 담즙산(BA) 흡수 장애가 발생한다는 점을 고려하여, 저자들은 LC-MS/MS를 사용하여 분변 BA를 정량화했습니다. PCA 분석 결과, 대조군과 모델군 사이에 명확한 분리가 나타난 반면, 모든 치료군은 대조군에 더 가깝게 군집화되어 BA 대사가 부분적으로 정상화되었음을 보여주었습니다 (Figure 4A). 모델군에서 가장 크게 변화한 BA는 LCA-3S의 증가와 GDCA의 감소였습니다 (Figure 4B). 치료 후 가장 많이 상향 조절된 BA는 ILCA (BJQF), GCDCA (BSF), DLCA (JPF), GCDCA (QCF)였으며, 가장 많이 하향 조절된 BA는 TLCA-3S (BJQF), LCA-3S (BSF), LCA-3S (JPF), TLCA-3S (QCF)였습니다 (Figure 4C–F). 바이올린 플롯을 통해 그룹 간 공통적인 차이 BA를 시각화했습니다 (Figure 5). 특히, 모든 TCM 처방은 23-DCA, 3-oxo-DCA, DLCA를 증가시켰으며 HCA, LCA-3S, TCA, TLCA-3S를 감소시켰습니다.

그림 4: UC 모델에서 DSS로 유도된 담즙산 장애를 조절하는 TCM 처방. (A) Control, Model, BJQF, BSF, JPF, QCF 군의 담즙산 PCA 플롯. (B) Control 대비 Model의 배수 변화를 나타낸 막대 그래프. (C) Model 대비 BJQF의 배수 변화를 나타낸 막대 그래프. (D) Model 대비 BSF의 배수 변화를 나타낸 막대 그래프. (E) Model 대비 JPF의 배수 변화를 나타낸 막대 그래프, 및 (F) Model 대비 QCF의 배수 변화를 나타낸 막대 그래프. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 각 비교군에서의 차등 발현 BA 바이올린 도표. (A) Model 대비 BJQF의 차등 발현 BA. (B) Model 대비 BSF의 차등 발현 BA. (C) Model 대비 JPF의 차등 발현 BA 및 (D) Model 대비 QCF의 차등 발현 BA. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

분변 담즙산과 장내 미생물 풍부도 간의 상관관계
차이가 있는 문(phyla)과 차이가 있는 담즙산(BAs) 간의 Spearman 상관관계 분석을 수행하였다(그림 6A–F, 그림 7A–D). 코드 차트는 |r| ≥ 0.8인 상관관계를 보여준다(그림 6B, 6D, 6F). 모델군과 대조군의 비교에서, 23-DCA는 Saccharibacteria 및 Firmicutes와 양의 상관관계를 보였으며, Proteobacteria 및 Bacteroidetes와는 음의 상관관계를 보였다(그림 6B). BJQF군과 모델군의 비교에서, Proteobacteria는 TLCA-3S, LCA-3S, TCA, α-MCA, 6,7-DKLCA, HCA, CDCA 및 THCA와 연관되었다(그림 6D). BSF군과 모델군의 비교에서, Proteobacteria는 TDCA, 6,7-DKLCA 및 LCA-3S와 양의 상관관계를 보였으며, Saccharibacteria는 GUDCA 및 23-DCA와 양의 상관관계를 보였다(그림 6F).

그림 6: 분변 내 차별적 담즙산(BAs)과 문(phylum) 수준에서 차별적 박테리아의 풍부도 간의 상관관계. (A, C, E) 각각 대조군 vs. 모델군, BJQF vs. 모델군, BSF vs. 모델군에 대한 Spearman 상관 분석. (B, D, F) 각각 대조군 vs. 모델군, BJQF vs. 모델군, BSF vs. 모델군에서 강한 상관관계(|r| ≥ 0.8)를 나타내는 해당 코드 차트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

코드 차트는 |r| ≥ 0.8인 상관관계를 보여줍니다(그림 7B, 7D). JPF 대 모델 비교에서 Saccharibacteria는 TLCA-3S, LCA-3S, HCA와 음의 상관관계를 보였으며, 23-DCA와는 양의 상관관계를 나타냈습니다(그림 7B). QCF 대 모델 비교에서 Saccharibacteria는 HCA, CA, LCA-3S, THCA, TLCA-3S와 음의 상관관계를 보였고, 23-DCA와는 양의 상관관계를 나타냈습니다(그림 7D). 이러한 결과는 서로 다른 TCM 처방이 각기 다른 패턴을 통해 박테리아-BA 상호작용 네트워크를 조절한다는 것을 나타냅니다.

그림 7분변 내 차이성 담즙산(BAs)과 차이성 박테리아 풍부도 간의 상관관계. (A, C) 각각 JPF 대 Model 및 QCF 대 Model 그룹에 대한 Spearman 상관 분석. (B, D) 각각 JPF 대 모델 및 QCF 대 모델 그룹에서 강한 상관관계(|r| ≥ 0.8)를 보여주는 해당 코드 차트. 빨간색은 양의 상관관계를, 파란색은 음의 상관관계를 나타냄. p < 0.05, p < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

데이터 가용성:
모든 원시 데이터는 NCBI Sequence Reads Archive (SRA) 데이터베이스에 업로드되었습니다 (등록 번호: PRJNA749732). https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA749732

토론

본 연구는 장내 미생물-담즙산 대사 축을 통해 DSS로 유도된 궤양성 대장염(UC)을 완화하는 BJQF 및 그 분해 하위 처방의 치료 기전을 조사합니다. 이 멀티오믹스 분석은 BJQF가 UC 관련 미생물 불균형을 복원하고 분변 담즙산(BA) 풀을 정상화함으로써 항염증 효과를 나타낸다는 것을 시사합니다. 하위 처방들은 뚜렷한 모듈별 조절 효과를 보였으며, 특히 JPF가 전체 처방과 가장 유사한 효능을 보여 건비(Jianpi) 전략의 핵심적인 역할을 밝혔습니다. 또한 저자들은 미생물 재구성 및 UC 개선을 연결하는 핵심 담즙산 노드로 23-DCA를, 잠재적 효능 바이오마커로 TLCA-3S/LCA-3S를 식별하였습니다.

BJQF에 의한 미생물 불균형의 회복은 담즙산(BA) 풀의 정상화 및 염증 감소와 잠재적으로 연관되어 있습니다. 궤양성 대장염(UC)은 면역-미생물군-대사 네트워크의 조절 장애로 인해 발생하며, 핵심 문(phyla)의 불균형은 환자와 동물 모델 모두에서 나타나는 전형적인 특징입니다¹⁰. 이러한 결과는 DSS로 유도된 UC 쥐에서 Firmicutes와 Lactobacillus는 감소하고 Bacteroidetes와 Proteobacteria는 증가했음을 확인해주며, 이는 임상 UC 프로필과 일치합니다¹¹. BJQF와 JPF가 이러한 이상 현상을 가장 효과적으로 되돌렸으며, BSF와 QCF는 중간 정도의 효과를 보였습니다. Lactobacillus 및 Clostridium과 같은 Firmicutes 분류군이 2차 BA 생합성을 위한 핵심 효소 기전을 보유하고 있다는 점이 잘 알려져 있다는 점을 고려할 때¹², 이는 잠재적인 연관성을 시사합니다. 즉, BJQF, 특히 그 중 Jianpi 모듈이 BA 생합성 능력을 갖춘 Firmicutes를 회복시킴으로써 2차 BA의 생물학적 전환을 강화하고 대사 장애를 교정할 수 있다는 것입니다. 속(genus) 수준에서 BJQF와 JPF는 Bacteroides, Ruminococcus_2, Enterorhabdus 및 Corynebacterium_1에서 UC로 인해 발생한 변화를 또한 되돌려, 미생물 불균형과 BA 합성 관련 기능을 더욱 복구하였습니다.

미생물 불균형의 회복은 항염증 효과의 핵심 대사 기전인 담즙산(BA) 풀의 정상화에 기여할 수 있습니다. BA 대사는 미생물 활동에 크게 의존하며, 이차 담즙산은 면역 항상성과 장벽 무결성 유지에 매우 중요합니다¹³. LC-MS/MS 데이터에 따르면, UC 쥐는 보호성 이차 BA(23-DCA, 3-oxo-DCA, DLCA)가 감소하고 황산화 BA(TLCA-3S, LCA-3S)가 축적되었으며, 이는 UC와 관련된 BA 조절 장애에 대한 이전 보고들과 일치합니다¹⁴. 황산화 BA는 장 흡수력이 낮아 장간 순환으로 들어갈 수 없으며¹⁵, 이러한 축적은 손상된 BA 대사를 반영하고 전염증 경로의 활성화와 연관되어 있습니다¹⁶. 모든 처방은 이러한 장애를 역전시켰으며, 특히 BJQF와 JPF가 가장 강력한 효과를 보였습니다.

상관 분석 결과, 23-DCA가 핵심 문(phyla)의 변화와 관련된 주요 담즙산(BA) 노드임이 확인되었으며, Firmicutes와는 양의 상관관계를, Proteobacteria와는 음의 상관관계를 보였습니다. 항염증 및 장벽 보호 효과를 가진 2차 담즙산으로서¹⁷, BJQF/JPF에 의한 23-DCA의 상향 조절은 Firmicutes의 풍부도 증가 및 생합성 강화에 기인했을 가능성이 있으며, 이는 사이토카인 감소 및 조직학적 개선과 상관관계가 있습니다. 이러한 상관관계 분석 결과를 바탕으로 저자들은 다음과 같은 가설적 기전 모델을 제시합니다: BJQF가 Firmicutes의 풍부도를 회복시키고 > 미생물의 2차 담즙산 생합성을 강화하며 > 보호 작용을 하는 23-DCA를 상향 조절하여 > 장내 염증을 억제한다는 것입니다. 이 모델은 향후 기능적 실험을 통해 검증되어야 합니다.

본 연구는 BJQF의 기능적 모듈을 특정 미생물 및 대사 변화에 매핑함으로써 TCM 이론과 현대 분자 생물학을 연결합니다. Jianpi 개념이 핵심적인 연결 고리입니다. "비장과 신장의 상호 보완"이라는 TCM 이론¹⁸과 일치하게, BSF는 적절한 Firmicutes 풍부도 증가와 23-DCA 상향 조절을 보였습니다. QCF는 주로 Verrucomicrobia (Akkermansia)를 풍부하게 하고 제노바이오틱 대사를 조절하여 "습열 제거" 효과를 반영했습니다. 전체 처방은 개별 모듈보다 우수한 시너지 효과를 나타내며, 이는 증상 분별에 기반한 TCM 복합 처방 설계의 합리성을 입증합니다.

상관관계 분석 결과, 각 처방에 의해 형성된 뚜렷한 박테리아-담즙산(BA) 상호작용 네트워크가 추가로 확인되었습니다. 이러한 차이는 모듈별 조절 특성을 반영하며, 개별화된 임상 적용의 근거를 제공합니다. 즉, Firmicutes 중심의 미생물 불균형을 동반한 비장허증 중심 UC에는 JPF를, 점막 장벽 손상을 동반한 습열증 중심 UC에는 QCF를, 그리고 전형적인 복합 증후군에는 BJQF 전체 처방을 적용하는 것입니다. 이러한 결과와 일치하게, 최근 연구들 또한 장내 미생물-담즙산 축이 UC와 중의학적(TCM) 개입의 핵심 치료 표적임을 뒷받침하고 있습니다^19,20,21,22. 미생물 불균형으로 인한 이차 담즙산 결핍은 활동성 UC의 핵심 특징이며, 담즙산 항상성을 회복함으로써 염증과 점막 손상을 효과적으로 완화할 수 있습니다²³.

본 연구에는 몇 가지 한계점이 있습니다. 첫째, 미생물 리모델링과 담즙산(BA) 정상화 사이의 모든 연관성은 상관관계 기반의 멀티오믹스 분석에 근거하고 있으며, 분변 미생물 이식과 같은 기능적 실험을 통해 인과 관계가 검증되지 않았습니다. 둘째, 표본 크기가 비교적 적어 통계적 검정력과 일반화 가능성이 제한될 수 있습니다. 셋째, 분변 BA만 정량화되었으며, 장간 순환을 반영하는 혈청 및 점막 BA 프로파일은 측정되지 않았습니다. 넷째, 미생물군과 BA를 조절하는 구체적인 활성 식물성 화학물질이 규명되지 않았습니다. 향후 연구에서는 FMT 및 무균 동물 실험을 통해 인과 관계를 검증하고, BJQF의 핵심 활성 성분을 규명하며, 임상 파일럿 연구를 수행하여 중개 가치를 확인할 예정입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.2 mL PCR 튜브	Axygen	PCR-02-C	16S rRNA 유전자 PCR 증폭 반응용
1.5 mL 멸균 원심분리 튜브	Axygen	MCT-150-C	시료 수집, 보관 및 원심분리를 위한 멸균 용기
10% 중성 완충 포르말린	Solarbio Science & 기술	1008128	결장 조직 검체 고정용
6500 QTRAP MS/MS 시스템	Sciex	5009065	분변 담즙산의 MRM 기반 정량적 프로파일링을 위하여
-80 º초저온 냉동고	Thermo Fisher Scientific	702-UR	분변 샘플 및 생물학적 시료의 냉동 보존을 위해
아가로스	Sigma-Aldrich	A9539	겔 전기영동을 통한 DNA 무결성 검출을 위해
산청목과 열매	Nanjing TCM Co., Ltd.	배치 20230321	BJQF 및 BSF에 사용된 생약 원료, 1회 투여당 15g
황기	Nanjing TCM Co., Ltd.	배치 20230312	BJQF 및 JPF에 사용된 1회 투여당 15g의 생약 원료
Aucklandiae Radix	Nanjing TCM Co., Ltd.	배치 20230217	BJQF 및 QCF에 사용된 생약 원료, 1회 투여량당 6 g
담즙산 표준 혼합물	Sigma-Aldrich	B4893	분변 담즙산의 정성 및 정량적 교정을 위해
황련	Nanjing TCM Co., Ltd.	배치 20230118	BJQF 및 QCF에 사용된 1회 투여량 4g의 생약 원료
덱스트란 황산나트륨 (DSS, 36–50 kDa)	MP Biomedicals	160110	쥐의 궤양성 대장염(UC) 유도를 위해, 3.5% (중량/부피) 음용수로 조제하여 10일 연속으로 투여함
감초	Nanjing TCM Co., Ltd.	배치 20230411	BJQF 및 JPF에 사용된 조제 전 생약 원료, 1회 투여당 5g
GraphPad Prism	GraphPad 소프트웨어	v7.00	통계 분석, 유의성 검정 및 과학적 그래프 작성을 위해
헤마톡실린-에오신 (H&E)&E) 염색 키트	Beyotime Biotechnology	C0105S	결장 조직 절편 염색, 조직병리학적 관찰 및 염증 점수 산정을 위해
고속 냉장 원심분리기	Eppendorf	5810R	핵산 추출 및 대사체학 준비를 위한 시료 원심분리용
HPLC 등급 메탄올	Merck KGaA	1.06007.4008	LC-MS/MS 시료 준비 및 이동상 준비를 위해
Illumina MiSeq 시퀀싱 플랫폼	Illumina Inc.	SY-410-1003	16S rRNA 유전자 고처리량 시퀀싱 및 장내 미생물군집 프로파일링을 위해
KEGG 데이터베이스	Kanehisa Laboratories	릴리스 107.0	미생물 기능 경로 주석 분석을 위해
수컷 SPF 등급 SD 랫드	Shanghai Xipu-Bikai 실험동물 유한공사	/	체중 200g의 쥐 44마리 ± 20 g, UC 모델 구축 및 후속 실험용
Multiskan™ GO 마이크로플레이트 리더	Thermo Fisher Scientific Oy	51119080	ELISA 흡광도 측정 및 사이토카인 정량을 위해
NanoDrop 2000 분광광도계	Thermo Fisher Scientific	ND-2000	분변 세균 게놈 DNA의 정량 및 순도 평가를 위해
파라핀 매립 카세트	Leica Biosystems	3801520	결장 조직의 탈수 및 파라핀 임베딩을 위해
PowerFecal® DNA 분리 키트	MoBio (Qiagen)	12830-50	분변 박테리아 게놈 DNA의 추출 및 정제를 위해
보골지	Nanjing TCM Co., Ltd.	배치 20230129	BJQF 및 BSF에 사용된 생약 원료, 1회 투여량당 15g
R 통계 환경	R 통계 계산 재단	v4.2.0	생물정보학 분석 및 통계 컴퓨팅을 위해
쥐 IL-10 ELISA 키트	Lun Chang Shuo Biotech	YD-30194	혈청 IL-10 농도의 정량적 검출을 위하여
랫 IL-1β ELISA 키트	Lun Chang Shuo Biotech	YD-30206	혈청 IL-1의 정량적 검출을 위해β 농도
쥐 TNF-α ELISA 키트	Lun Chang Shuo Biotech	YD-31063	혈청 TNF-α의 정량적 검출을 위해α 농도
거미취뿌리	Nanjing TCM Co., Ltd.	배치 20230309	BJQF 및 QCF에 사용된 가공되지 않은 한약재, 1회 투여량당 10g
황금 뿌리	Nanjing TCM Co., Ltd.	배치 20230407	BJQF 및 QCF에 사용된 생약재, 1회 투여당 10 g
Shim-pack UFLC UPLC 시스템	Shimadzu Corporation	CBM-20A	분변 담즙산 시료의 크로마토그래피 분리를 위하여
볶은 창출	Nanjing TCM Co., Ltd.	배치 20230225	BJQF 및 JPF에 사용되는 조제 전 약재, 1회 복용량당 10 g