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방법 논문

미세아세포 대체 및 계통 분석을 위한 신생아 뇌 이식

142 조회수

⸱

DOI:

10.3791/72119

⸱

2026년 7월 28일

 ,  , 
1Department of Human Genetics, University of Utah School of Medicine, 2Department of Pathology & Laboratory Medicine, Abramson Family Cancer Research Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 정의된 미세아교세포 집단의 신생아 뇌내이식을 효율적으로 가능하게 하여, 장기적으로 강력한 미세교세포 계통의 부착과 분석, 그리고 여러 기증자 및 수혜자 모델에 걸친 생 체 내 통합을 지원합니다.

초록

미세아교세포 이식을 통한 미세아교세포 대체는 신경학적 과정과 질병을 연구하는 유망한 실험적 접근법으로 떠올랐습니다. 그러나 기존 이식 전략은 비효율적인 이식, 방사선 기반 조건 의존, 기증자와 수혜자 시스템 간의 유연성 제한 등으로 인해 제한되는 경우가 많습니다. 여기서는 정제된 미세아교세포 집단(Hoxb8 및 비Hoxb8 미세아교세포)을 발달 중인 마우스 뇌에 도입하기 위한 신생아 뇌내이식 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 생리학적으로 허용된 조건 하에서 뇌 실질에 기증 세포를 효율적으로 부착하고 통합할 수 있게 합니다. 중요한 점은, 이 프로토콜이 배아 조혈 전구세포와 출생 후 뇌 유래 미세아교세포를 포함한 여러 기증자 출처와 호환되며, 조건부 Csf1r 결핍 마우스와 Csf1rΔFIRE 마우스를 포함한 내인성 미세아교세포가 감소하거나 없는 서로 다른 수혜자 모델에 적용할 수 있다는 점입니다. 기증 세포는 형광 활성화 세포 분류로 정제되어 유리 마이크로피펫을 이용해 신생아 쥐 뇌에 양측 전달하여 효율적이고 최소 침습적인 전달을 합니다. 수혜자 쥐는 기증 세포가 확장하고 미세교세포 지위를 채우도록 나이를 먹으며, 기증자 세포 분포와 마커 발현에 대한 조직학적 분석을 통해 결과를 평가합니다. 이 접근법은 다양한 실험 환경에서 미세아교세포 발생 및 생체 내 통합을 연구할 수 있는 견고하고 확장 가능한 플랫폼을 제공합니다.

서론

미세아교세포 이식을 통한 미세아교세포 대체는 미세아교세포 생물학을 탐구하는 강력한 전략이자 신경학적 질환의 잠재적 치료 패러다임으로 부상했습니다. 지난 몇 년간 이 분야는 중추신경계에서 광범위하게 미세아교세포 대체를 할 수 있는 전략으로 발전해 왔습니다1. 최근 연구들은 기증자 유래 대식세포와 전구세포가 뇌를 이식하고, 미세아교세포 유사 전사 프로그램을 채택하며, 경우에 따라 질병 관련 표현형 2,3,4,5,6,7,8을 개선할 수 있음을 보여주었습니다. 이 발견들은 뇌 대식세포 대체가 신경학적 질환 과정을 연구하고 잠재적으로 수정하는 데 활용될 수 있다는 개념을 뒷받침합니다.

미세아교세포 이식에서 핵심 과제는 실험적 혼란 요소를 최소화하면서 견고한 부착을 달성하는 것입니다. 많은 확립된 대체 전략은 방사선 치료, 화학요법, 미세아교세포 고갈(microglia delolation) 패러다임에 의존하여 표시 가능한 지위(6,9,10,11,12,13)를 생성합니다. 이러한 방법들은 효과적임에도 불구하고, 미세아교세포 노화를 유도하고, 혈액-뇌 장벽을 교란하며, 염증 신호를 변화시킬 수 있어 기증자 세포 행동 해석을 복잡하게 만들 수 있습니다 9,14. 최근 연구에서는 미세아리아 대체에 대한 조건 독립적 또는 독성 감소 접근법을 탐구하기 시작했습니다 5,8,15.

발달 시기는 이식 성공을 결정짓는 중요한 요소입니다. 신생아 뇌는 구조적 장벽 감소와 내인성 미세교세포 지위의 지속적인 형성 덕분에 기증 세포 확장과 장기적인 통합을 지원하는 허용된 환경을 제공합니다. 최근 출생 후 조기 분만(P0–P5)을 이용한 이식 연구는 견고한 실질 부착과 미세아교세포 유사 정체성 획득을 입증하여, 효율적인 대체 효과를 위한 발달적 맥락의 중요성을 강화합니다 7,8,16,17.

Hoxb8 미크로글리아는 미세아리아 생물학에 대한 계통별 기여를 연구하는 데 특히 유용한 정보를 제공합니다. 이 세포들은 배아 조혈 전구세포에서 유래하며, 기능장애 시 행동에 영향을 미치는 실질 미소아교세포의 명확한 하위 집합을 대표합니다 17,18,19,20,21. 최근 Hoxb8 1차 전구세포와 미세아교세포 및 에스트로겐 수용체(ER)-Hoxb8 전구세포 시스템을 이용한 연구는 이 세포들이 증식되고 유전적으로 조작되어 뇌에 성공적으로 이식될 수 있음을 보여주었으며, 뇌에서 미세아교세포 유사 전사 프로필과 기능적 특성을 채택함 7,8,17. 이러한 발전은 미세아교세포 계통과 이질성 해부에 이식 기법의 유용성을 더욱 부각시킵니다.

여기서는 기증자와 수혜자 시스템 간에 최적화된 신생아 뇌내이식 플랫폼을 설명합니다. 방사선 치료나 전신 조건화에 의존하는 접근법과 달리, 이 방법은 신생아 쥐에 양측 뇌내를 직접 전달하여 기증자 세포를 발달적으로 허용하는 뇌 환경에 배치하면서 전신 교란을 최소화합니다. 이 기법은 배아 조혈 전구세포와 출생 후 뇌 유래 미세아교세포 등 여러 기증자 출처와 호환되며, 내인성 미세아교가 감소하거나 없는 서로 다른 수혜자 모델에 적용할 수 있습니다. 주요 실용적 장점은 얇은 신생아 두개골이 유리 마이크로피펫으로 수동적으로 주입할 수 있게 하여 드릴링이나 입체고정이 필요 없으면서도 넓은 실질 부착을 달성한다는 점입니다.

이 접근법은 다양한 실험 맥락에서 미세아교세포의 발생, 이질성, 생체 내 통합을 연구할 수 있는 견고하고 유연하며 확장 가능한 시스템을 제공합니다. 이로 인해 신생아 뇌내이식은 전신 미세아세포 대체 전략에 대한 보완적이고 실험적으로 통제된 대안으로 자리매김합니다.

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프로토콜

본 연구의 모든 방법과 실험은 쥐를 대상으로 수행되었습니다. 실험 절차는 유타 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 공중보건 서비스 보증 #D16-00018 (A3031-01)에서 승인되었습니다.

1. 기증자와 수혜자 새끼를 위한 번식 쌍 준비

  1. 저녁에 번식기 쌍을 같은 우리에 넣어 시간 제한 교미를 시작하세요.
  2. 매일 아침 암컷에게 질 플러그가 있는지 검사하여 성공적인 교미를 확인하세요.
  3. 플러그가 막힌 암컷은 수컷에게서 떼어내어 각각 키우며, 분만까지 약 18–20일이 걸립니다.
  4. 임신한 암은 출산 7–10일 전 매일 5분간 부드럽게 만져서 신생아 다루는 스트레스를 줄이세요.
  5. 수술 후 강아지가 돌아왔을 때 모성 스트레스를 줄이기 위해 매일 다루는 작업 중에 베타딘 향이 나는 면봉에 댐을 노출시키세요.
  6. 임신한 암컷을 위한 산란 재료가 포함된 깨끗한 우리를 준비하세요.

2. 신생아 뇌 채취 및 처리

  1. 신생아 기증 마우스(P0–P4)는 마취제와의 직접적인 접촉을 막기 위해 가짜 바닥이 설치된 벨자나 유사한 밀폐 챔버를 사용해 이소플루란 과다복용으로 안락사시킵니다.
  2. 호흡이 멈추고 반사 신경이 없다는 것이 확인되면 즉시 참수하세요.
  3. 뇌 전체, 소뇌와 후각구까지 채취하세요. 뇌를 3mL의 차가운 1× 행크스 균형 소금 용액(HBSS)을 플라스틱 페트리 접시에 얼음 위에 넣어 넣습니다.
  4. 멸균 메스와 겸자를 사용해 뇌를 약 1–2 mm 크기의3 조각으로 갈아냅니다.
  5. 다진 뇌 조직(조직 해리 튜브당 1개의 뇌)을 제조사 권장 프로토콜에 따라 신경 조직 해리 시스템에 포함된 효소 소화 시약이 포함된 조직 해리 튜브로 옮깁니다.
  6. 튜브를 가열 기능이 있는 기계적 해리 장치에 넣고, 제조사가 권장하는 신경 조직 해리 프로그램에 따라 37°C에서 30분간 인큐베이팅합니다.
  7. 1× HBSS 400 μL 용량으로 70 μm 셀 체를 미리 담글 수 있습니다.
  8. 해리된 조직을 미리 적셔 50mL 원뿔형 튜브 위에 얼음 위에 올려놓은 체에 통과시킵니다.
  9. 튜브를 10mL 1× HBSS로 세척하고 필터를 통과시켜 최대 세포 회복을 보장합니다.
  10. 필터를 버리고 셀을 300 × g에서 실온에서 10 분간 돌 립니다. 상정액을 흡인하세요.
  11. 각 샘플당 1mL의 적혈구 용해 완충제를 멸균 초순수수에 재현탁하고 4°C에서 10분간 배양합니다.
  12. 용해 반응을 1× HBSS/1% BSA/5% FBS 10mL로 소집합니다.
  13. 필터를 버리고 셀을 300 × g에서 4 °C에서 10 분간 돌 립니다. 상정액을 흡인하세요.
  14. 혈구계를 사용해 세포 수를 측정하세요. 분류 전 세포 수확량의 일반적인 범위는 3.2–4.0 × 106 입니다.
  15. 세포를 5% FBS를 1× HBSS에 원하는 농도로 재현탁하여 항체 염색을 진행합니다.

3. 미세아교세포 집단의 FACS 분류를 위한 세포 항체 염색

  1. 세포를 1mL의 염색 완충제(5% FBS 1× HBSS에 포함)에 재현탁하고, Fc 수용체 차단 항체(정제된 CD16/32, 1:2000)를 포함하고 4°C에서 10분간 세포를 배양합니다.
  2. 240 × g 에서 4 °C에서 3분간 셀을 다운시킵니다. 상정액을 흡인하세요.
  3. 형광 접합 항체로 세포를 인큐베이팅한다(CD45 APC, 1:160; CD11b Alex Fluor 700, 1:160) 1mL 염색 완충제에 얼음 위에 30분간 어두운 환경에서 사용했습니다.
  4. 세포를 240 × g에서 4 °C에서 3분간 돌립니다. 상정액을 흡인하세요.
  5. 생존 염료(예: 3 μM DAPI in 1× HBSS)를 첨가하여 죽은 세포를 제거합니다.
  6. DAPI, GFP, tdTomato, CD45-APC, CD11b-Alexa Fluor 700 검출을 위한 적절한 레이저가 장착된 고속 세포 분류기를 사용하여 FACS 분류를 수행합니다.
  7. 가능한 경우 100 μm 노즐과 낮은 피압을 사용하여 세포 생존력을 극대화하세요. 시술 내내 샘플 채취관과 분류된 세포를 얼음 위에 보관하세요.
  8. 필요할 때 염색되지 않은 셀, 단색 보상 제어, 형광-1 조절을 사용하여 전압, 보상, 게이트를 설정하세요.
  9. 첫 번째 게이트 셀은 전방 산란 면적과 측면 산란 면적을 기준으로 하여 잔해를 배제합니다.
  10. 측면 산란 높이와 측면 산란 폭을 이용한 게이트 싱글렛.
  11. DAPI⁻ 세포에 게이트를 적용하여 죽은 세포를 배제합니다.
  12. 생 싱글렛에서 게이트는 CD45에 CD11b⁺ 미크로글리아가낮 습니다.
  13. CD45저 CD11b⁺ 미세아리아 게이트 내에서 GFP와 tdTomato 형광을 사용하여 기증자 미세아교세포 집단을 분리합니다(Hoxb8 미세아교: DAPI⁻ CD45낮은 CD11b⁺ tdTomato⁺ GFP⁺, 비Hoxb8 미세아교도: DAPI⁻ CD45낮은 CD11b⁺ tdTomato⁻ GFP⁺).
  14. 각 개체군을 냉기 1x HBSS가 포함된 멸균 채집관에 분류합니다.
  15. 분류 후에는 소량의 분리된 세포를 재분석하여 순도와 생존 가능성을 확인한 후 이식합니다.
  16. 멸균 1× HBSS에서 분리된 세포를 수집하여 이식 전까지 어둠 속에서 얼음 위에 보관하세요.
    참고: Hoxb8 미세아리아의 일반적인 수확량은 신생아 뇌당 3.70–4.60 x 104 세포, 비Hoxb8 미세아세포는 1.10–14 x 105 세포 사이이지만, 나이, 유전자형, 조직 처리 효율에 따라 다를 수 있습니다. 정제된 생세포는 가능한 한 빨리, 이상적으로는 세포 분류 후 60분 이내에 이식하세요.

4. 태아 간 조혈 전구세포 채취 및 처리

  1. 임신한 암기를 산소 공급기로 5% 이소플루란을 정밀 증발기를 투여해 호흡이 멈추고 반사 사가 사라질 때까지 안락사시키세요.
  2. 이소플루란 과다복용 후에는 기관 동물 관리 및 사용 지침에 따라 자궁경부 탈구를 통한 2차 신체적 방법으로 사망을 보장해야 합니다.
  3. 임신한 쥐의 자궁 뿔을 제거하여 1× HBSS 3mL 소액의 차가운 플라스틱 페트리 접시(60mm × 15mm)에 넣어 넣으세요.
  4. 자궁에서 E12.5 배아를 해부하여 1× HBSS 3mL를 신선한 차가운 플라스틱 페트리 접시에 넣습니다.
  5. 미세한 겸자로 태아 간을 해부하고, 5% FBS가 포함된 1× HBSS 3mL의 신선한 페트리 접시에 넣습니다.
  6. 26G 바늘과 3mL 주사기를 사용해 모인 태아 간 조직을 기계적으로 해리합니다.
  7. 세포를 240 × g에서 4 ° C에서 5 분간 돌립니다. 상정액을 흡인하세요.
  8. 1× HBSS로 셀을 세척하세요.
  9. 세포 현탁액을 80 μm 셀 체에 통과시킵니다.
  10. 세포를 20 μL 적혈구 용해 버퍼(0.15 M 염화암모늄, 1 mM KHCO3)에 5분간 배양한 후 1× HBSS 13 mL를 첨가하여 소환합니다.
  11. 적혈구를 용해하기 위해 5분간 배양을 계속하세요.
  12. 세포를 200 × g 에서 4 °C에서 5분간 돌립니다.

5. 조혈 전구세포의 FACS 분류를 위한 세포 항체 염색

  1. 형광 접합 항체로 태아 간 세포를 인큐베이팅한다(Ter119 PerCP-Cy5.5, 1:50; 키트 PE-Cy7, 1:100) 5% FBS/1% BSA 1× HBSS를 어둠 속 얼음 위에서 30분 동안 사용했습니다.
  2. 1× HBSS로 셀을 세척한 후 4°C에서 240 × g에서 5분간 돌립니다.
  3. 생존 염료(예: 3 μM DAPI in 1× HBSS)를 첨가하여 죽은 세포를 제거합니다.
  4. DAPI, Ter119 PerCP-Cy5.5, Kit PE-Cy7, tdTomato, GFP 검출을 위한 적절한 레이저 및 필터가 장착된 고속 셀 분류기를 사용하여 FACS 분류를 수행합니다.
  5. 가능한 경우 100 μm 노즐과 낮은 피압을 사용하여 세포 생존력을 극대화하세요. 시술 내내 샘플 채취관과 분류된 세포를 얼음 위에 보관하세요.
  6. 필요할 때 염색되지 않은 셀, 단색 보상 제어, 형광-1 조절을 사용하여 전압, 보상, 게이트를 설정하세요.
  7. 첫 번째 게이트 셀은 전방 산란 영역과 측면 산란 영역을 사용하여 잔해를 배제합니다.
  8. 게이트 싱글렛은 전방 산란 높이와 전방 산란 폭을 비교하고, 그 다음에는 측면 산란 높이와 측면 산란 폭을 사용합니다.
  9. DAPI⁻ 세포에 게이트를 적용하여 죽은 세포를 배제합니다.
  10. 살아있는 싱글렛에서 적혈구 계통 세포를 Ter119⁻ 세포에 게이트하여 배제합니다.
  11. Ter119⁻ 집단 내에서 Kit의 게이트는고 조혈 전구세포를 가지고 있습니다.
  12. DAPI⁻ Ter119⁻ Kit고집단 내에서 tdTomato⁺ 세포에 게이팅하여 Hoxb8 계통 양성 전구세포를 분리합니다.
  13. 기증 계통에 Cx3cr1-GFP 보고체도 함께 있을 경우, GFP 형광을 사용하여 이 단계에서 분류된 태아 간 전구세포 집단이 GFP⁻ 또는 GFP 수치가낮 음을 확인하여, 전구세포와 분화된 Cx3cr1 발현 골수세포를 구분합니다.
  14. 최종 DAPI⁻ Ter119⁻ 키트높은 tdTomato⁺ GFP 개체 군을 콜드 1× HBSS가 포함된 멸균 수집관에 분류하세요.
  15. 분류 후에는 소량의 분리된 세포를 재분석하여 순도와 생존 가능성을 확인한 후 이식합니다.
  16. 멸균 1× HBSS에서 분리된 세포를 수집하여 이식 전까지 어둠 속에서 얼음 위에 보관하세요.
    참고: 일반적인 수확량은 배아 크기와 분류 효율에 따라 E12.5 태아 간 제제당 약 5.0–7.0 × 10 4 Hoxb8 조혈 전구세포 사이입니다. 정제된 생세포는 가능한 한 빨리, 이상적으로는 분류 후 60분 이내에 이식하세요.

6. 주사 바늘 준비

  1. 붕규산 유리 모세관(외경 1.0mm, 내경 0.58mm, 필라멘트 포함)을 마이크로피펫 풀러에 장전합니다.
  2. 신생아 뇌내이식에 적합한 길고 테이퍼링 바늘을 생성하도록 최적화된 2선 당김 프로그램을 사용하여 모세혈관을 당깁니다.
    1. 일반적인 설정은 다음과 같습니다: 열 = 645, 당기기 = 30, 속도 = 120, 지연 = OFF, 압력 = 200. 특정 유리 종류, 환경 조건, 풀러 보정에 맞게 최종 설정을 최적화하세요. 그 후 얻은 바늘을 다듬고 베벨을 넣어 최종 바깥쪽 끝 직경 약 30 μm를 만듭니다.
  3. 뽑은 바늘을 큰 플라스틱 페트리 접시 안에 두 개의 퍼티 스트립 위에 올려 끝을 손상으로부터 보호한 후 다듬고 베벨을 베블링하세요.
  4. 뽑은 바늘을 약 10×–20× 배율의 해부 입체 현미경 아래에 놓고 부드러운 브레이스로 지지합니다.
    참고: 팁 점검 시 적절한 테이퍼 형성을 확인하고 결함을 확인하기 위해 더 높은 배율(20×–40×)을 사용할 수 있습니다.
  5. 멸균 면도날을 사용해 바늘 끝을 다듬어 약 30 μm 정도의 외경을 얻으세요.
  6. 다듬은 바늘을 마이크로그라인더 홀더에 고정하세요.
  7. 베벨 각도를 30°–35°로 조절하세요.
  8. 그라인더와 조명을 켜세요.
  9. 증류수를 연마석에 약 4–5초마다 한 방울씩 꾸준히 떨어뜨리게 합니다.
  10. 바늘 끝을 회전하는 연삭석에 부드럽게 닿게 하여 경사진 가장자리가 형성될 때까지 만든다.
  11. 가능한 경우 팁 측정 장치를 사용해 경사면 팁의 외경을 측정하세요.
  12. 이식 시에는 외경 약 30 μm의 바늘을 선택하세요.
  13. 바늘에 멸균 완충제를 채우고 부드럽게 액체를 배출하여 끝이 열려 있고 막히지 않는지 확인하세요.

7. 주입 장치 준비

  1. 유연한 튜빙, 마우스피스, 인라인 필터, 모세관 홀더로 구성된 수동 마우스 컨트롤 피펫을 조립하세요.
    참고: 입으로 제어하는 피펫팅 장치에 인라인 필터가 포함되어 오염을 방지합니다.
  2. 바늘에 2mm마다 표시하세요(한 바늘당 최대 2개). 2 mm당 ~2 μL에 해당합니다.
  3. 준비된 유리 주입 바늘을 모세관 홀더에 ~1.5cm 삽입하고 조립체가 안전하게 밀폐되어 있는지 확인하세요.
  4. 마우스피스를 통해 부드러운 흡입력을 하여 공기 흐름이 방해되지 않고 적절한 저항이 있는지 확인하세요.
  5. 시스템이 흡인과 주입을 원활하게 조절할 수 있는지 확인해 주세요.
  6. 미세한 피펫 팁을 사용해 준비된 공여 세포 현탁액(총 4.5 μL)을 유리 주입 바늘에 역채우세요.
    참고: 이식을 시작하기 전에 바늘 안에 기포가 남아 있지 않은지 꼭 확인하세요. 마우스당 바늘 하나씩 사용하세요.

8. 신생아 수혜자의 마취 및 수술 부위 준비

  1. 신생아 마우스를 수술대에서 누운 자세로 배치하고, 정밀 증기기를 통해 산소 공급된 2.0%–5.0% 이소플루란을 사용해 마취를 유도합니다.
  2. 마우스 코를 코 콘 안에 넣어 시술 내내 이소플루란과 산소가 지속적으로 공급되도록 하세요.
  3. 호흡을 모니터링하면서 마취 유도를 위해 약 1분을 두세요.
  4. 팔다리를 부드럽게 만지고 마취 부사가 없음을 확인하여 적절한 마취를 확인하세요.
  5. 적절한 마취 평면이 확보되면, 유지 치료를 위해 이소플루란 농도를 0.5%–2.0%로 낮추고, 이식 수술 중 최대 10분간 마취를 계속합니다.
  6. 신생아 쥐를 약 38°C로 유지하며, 수술대 아래에 놓은 온열 패드를 사용하세요.
  7. 베타딘과 70% 에탄올을 번갈아 사용해 멸균 면봉으로 머리 주사 부위를 청소하세요.
  8. 마지막으로 베타딘을 한 겹 바르고 피부가 건조될 때까지 기다렸다가 주사하세요.
    주의: 이소플루란은 위험한 마취제입니다. 적절한 마취 청소 시스템을 사용하고 기관 안전 지침에 따라 적절한 실내 환기를 보장하세요.

9. 신생아 뇌내이식 시행

  1. 주사 중 움직임을 최소화하기 위해 장갑 낀 손가락이나 부드러운 지지대를 사용해 머리를 부드럽게 안정시키세요.
    참고: 수혜 쥐는 P1과 P4 사이에 이식됩니다.
  2. 전쪽 등쪽 종뇌(미래 전두엽 피질 영역)에 양측 주사 부위를 식별하며, 시상 중앙선 외측 약 1–2mm 지점에 위치하며 후각 구근 바로 옆에 위치합니다. 각 반구에서 주사 부위를 대칭적으로 배치하되, 표면 혈관이 보이지 않도록 하세요.
    참고: 신생아 마우스의 두개골이 얇고 크기가 작기 때문에, 주사는 입체 좌표 대신 시각적 해부학적 랜드마크를 사용하여 시행됩니다.
  3. 두개골을 시각적으로 살펴보고 눈에 보이는 혈관 근처에 바늘을 꽂지 마세요.
  4. 경사진 유리 마이크로피펫을 피부와 발달 중인 두개골을 부드럽게 통과시킵니다.
  5. 바늘을 두개골 표면에서 약 1–2mm 아래 전두엽 쪽으로 유도합니다.
  6. 입으로 제어되는 피펫 장치를 통해 수동 압력을 조절하여 기증자 세포를 전달합니다.
    참고: 정제된 조혈 전구세포나 신생아 미세아교세포를 이식할 때는 반구당 2–3 μL을 주입하는데, 이는 주사당 약 2.5 × 104개의 세포 에 해당합니다. 이로 인해 쥐 뇌당 약 5× 10개의4 개의 세포가 존재합니다.
  7. 주입된 세포의 역류를 최소화하고 조직 손상을 줄이기 위해 뇌에서 마이크로피펫을 천천히 빼내세요.
  8. 반대쪽 주사를 시행하세요.
    참고: 쥐 간 교차 오염을 피하려면 쥐당 바늘 한 개를 사용하세요.

10. 이식된 신생아 회복

  1. 시술 직후 각 강아지를 보열 패드 위에 올려놓으세요.
  2. 강아지들을 정상적인 체색, 자발적인 움직임, 전반적인 활동이 돌아올 때까지 관찰하세요.
    참고: 회복 시간은 5분에서 10분 사이입니다.
  3. 새끼들을 댐으로 돌려보내세요.
  4. 각 새끼를 집 케이지 침구와 둥지 재료로 꼼꼼히 문지르세요.
  5. 새끼들을 다시 암컷과 함께 우리에 넣으세요.
  6. 암컷이 돌아온 새끼들을 회수하고 받아들인다는 것을 확인해 주세요.

11. 수술 후 건강 모니터링

  1. 이식 후 처음 3일 동안 새끼를 매일 10분씩 관찰하세요.
  2. 강아지의 정상적인 활동, 젖 먹기 행동, 암컷과의 상호작용을 평가하세요.
    참고: 이 기간 동안 쥐 우리를 건드리지 마세요. 이로 인해 댐에 가해지는 스트레스가 증가할 수 있습니다.
  3. 강아지들을 격일로 관찰하다가 3일 후 이유할 때까지 계속하세요.
  4. 강아지의 정상적인 발달, 먹이 습관, 활동량, 그리고 어미 돌봄을 평가하세요.
  5. 수술 후 초기 기간 동안 매일 체중을 측정하고 기록하세요.
  6. 강아지의 고통, 비정상적인 자세, 무기력, 수유 장애 등의 징후를 평가하세요.
  7. 기관 동물 관리 지침에 따라 필요 시 인도적 안락사를 시행하세요.
    1. 신생아 쥐의 경우, 마취제와의 직접적인 접촉을 막기 위해 벨자나 가짜 바닥이 설치된 밀폐된 챔버를 사용해 이소플루란 과다복용으로 안락사시킵니다. 호흡이 멈추고 반사 신경이 없다는 것이 확인되면 즉시 참수하세요.
    2. 성체 쥐의 경우, 호흡이 멈추고 반사가 사라질 때까지 산소 공급을 통해 5% 이소플루란을 정밀 증기기로 투여하여 안락사시키고, 이후 자궁경부 탈구를 통해 2차 신체적 방법으로 사망을 보장한다.
      참고: 실험 평가 지점에서 수술 후 사망률이 나타나거나 기증자 세포 착립이 검출되지 않은 동물은 분석에서 제외되었습니다. 신생아 뇌내이식이 최소 침습으로 간주되어 수술 후 진통은 시행되지 않았다.

12. 냉동절부 및 면역형광 염색을 위한 뇌 조직 채취

  1. 뇌를 조심스럽게 꺼내 냉동 절편 분석을 준비하세요.
  2. 출생 후 뇌 조직을 냉동절부를 위해 처리하고, 앞서 설명한 절차에 따라 크라이오스탯을 이용해 관상절개를 절단합니다.
    참고: 각 마우스에 대해 체성감각 피질을 아우르는 9–12개의 관상 절면을 분석합니다.
  3. 절편을 현미경 슬라이드에 부착하고 -20 °C에서 염색할 때까지 보관합니다.
  4. 0.2% Triton X-100과 1% 디옥시콜레이트 나트륨이 포함된 투과성 버퍼에서 절편을 잠시 배양합니다.
  5. 1차 항체(닭 항GFP 1:500; 기니피그 항td토마토 항체, 1:250; 토끼 반(反)Iba1; 적절한 항체 희석 버퍼에 희석된 1:500.
  6. 1차 항체로 조직 절편을 4°C에서 하룻밤 배양합니다.
  7. 인산염 완충 식염수로 절면을 세척하여 결합되지 않은 1차 항체를 제거합니다.
  8. 염소 항체 반토끼 Alexa Fluor 647, 1:500; 염소 반기니피그 Alexa Fluor 555, 1:500; 염소 반닭 알렉사 Fluor 488, 1:500)로 2시간 동안 실온 어두운 환경에서 인큐베이트 절편을 인큐베이팅합니다.
  9. 세포 핵을 시각화하기 위해 DAPI로 반염색 절면을 적용합니다.
  10. 안티페이드 마운팅 매체를 사용해 섹션을 장착하고 유리 커버슬립을 붙입니다.

13. 공초점 현미경 이미지 획득

  1. 10× 또는 20× 대물렌즈가 장착된 공초점 현미경을 사용하여 형광 이미지를 획득합니다.
  2. 200–400 Hz의 스캔 속도를 사용하여 512 × 512 또는 1024 × 1024 픽셀 해상도로 이미지를 획득할 수 있습니다.
  3. 조직을 통해 2–5 μm z-단계 간격의 광학 절편을 수집합니다.

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결과

정제된 미세아세포 집단의 신생아 뇌내이식은 장기 생존과 수혜자 뇌 실질 내 기증자 유래 세포의 광범위한 착착을 초래합니다. 정제된 기증자 미세아리아 집단은 형광 계통 보고기를 이용한 형광 활성화 세포 분류(Hoxb8 미세아교: tdTomato⁺ GFP⁺; 비Hoxb8 미세아교세포: tdTomato⁻ GFP⁺)를 이용해 이식 전에 분리되었습니다(그림 1A). 신생아 뇌내이식 후, 기증자 유래 세포는 장기간 생존하며 수혜자 뇌 실질 전반에 걸쳐 광범위한 부착을 보였습니다. 이식 후 5개월째, 정제된 신생아 Hoxb8 미세아교세포, 비Hoxb8 미세아교세포, E12.5 배양된 Hoxb8 태아 간 유래 전구세포에서 유래한 이식 세포가 형광 계통 보고자들에 의해 쉽게 확인되었으며, 성숙한 실질 미소교세포의 특징적인 분기 형태를 보였습니다(

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토론

정제된 미세아교세포 전구세포 또는 정의된 미세아교세포 아집단의 신생아 뇌내이식은 생체 내에서 미세아교세포 구획을 재구성하고 뇌 대식세포의 계통 특이적 특성을 조사하는 견고한 접근법을 제공합니다. 이 방법은 유전적으로 정의된 기증 세포를 이용한 선택적 재구성을 가능하게 하여, 뇌 환경 내에서 기증자 세포 착립과 성숙을 직접 평가할 수 있게 합니다.

이 전략의 주요 장점은 여러 기증자 출처와 수혜 시스템과의 호환성입니다. 본 연구와 이전 연구(8,17)에서 태아 간 유래 Hoxb8 전구와 신생아 뇌 유래 미세아교세포 모두 성숙한 실질 미세아교세포를 성공적으로 접합하여 생성하였습니다. 이 이식 전략은 기증자 유래 세포가 장기간 착립 후 Tmem119와 P2ry12를 포함한 정규 미세교세포 ...

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공개 사항

저자들은 경쟁하는 재정적 이해관계가 없다고 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 국립보건원(NH, R01 MH093595)(M.R.C.), 다우튼 가족 재단, 유타 대학교 유동 세포 분석 시설의 지원을 받았습니다. Csf1rΔFIRE 마우스는 유타 대학교의 벤 쉬 박사에 의해 생성되었습니다.

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재료

```html
이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Bell jarVariousN/A수면 유도에 사용
Borosilicate glass capillaries with
filament		Sutter InstrumentBF100-78-15주사 바늘 제조에 사용
Bovine serum albumin (BSA)Sigma AldrichA8806PB 완충액 준비에 사용. 다양한 브랜드가 있습니다. 여기 나열된 것은 예시일 뿐입니다.
CD11b Alexa Fluor 700BioLegend101222골수 세포
CD45 APCBioLegend103112조혈 세포
Cell strainers (70 µm)Falcon352350단일 세포 현탁액 생성에 사용. 다양한 브랜드가 있습니다. 여기 나열된 것은 예시일 뿐입니다.
Chicken anti-GFP antibodyAves LabsGFP-1020면역형광 염색
c-Kit PE-Cy7 antibodyBioLegend105814조혈 전구체
Confocal microscopeLeicaTCS SP5형광 이미징에 사용
Conical tubes (15 mL/ 50 mL)Eppendorfhttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/Lab-Consumables/Lab-Tubes/Eppendorf-Tubes-BioBased-p-PF-4440301조직/세포 처리. 다양한 브랜드가 있습니다. 여기 나열된 것은 예시일 뿐입니다.
Cryostat machineLeicahttps://www.leicabiosystems.com/en-de/histology-equipment/cryostats/동결 조직 섹션 생성. 다양한 브랜드가 있습니다. 여기 나열된 것은 예시일 뿐입니다.
DAPI nuclear stainThermo Fisher ScientificD1306생존성 및 핵 염색에 사용
Dissecting microscopeLeicahttps://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/stereo-microscopes/주사 바늘 준비 및 트리밍에 사용. 다양한 브랜드가 있습니다. 여기 나열된 것은 예시일 뿐입니다.
FACSAria Flow Cytometer SorterBD BioscienceFACSAria 세포 정제
Fc block (purified CD16/32)Biolegend101302Fc 수용체를 발현하는 마우스 세포에 대한 원치 않는 항체 결합 차단
Fetal bovine serum (FBS)ThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/fbs.html세포 준비 버퍼에 사용. 다양한 브랜드가 있습니다. 여기 나열된 것은 예시일 뿐입니다.
Flexible tubing for mouth pipetteVariousN/A수동 주사 장치의 구성 요소
Flow cytometry analysis softwareFlowJov10.8.1FACS 데이터 분석에 사용
Flow cytometry cell sorterBD BiosciencesFACSAria세포 정제에 사용
gentleMACS Octo Dissociator with
heaters		Miltenyi Biotec130-096-427뇌 조직 분리에 사용
Goat anti-chicken Alexa Fluor 488
secondary antibody		Thermo Fisher ScientificA-110392차 항체
Goat anti-guinea pig Alexa Fluor
555 secondary antibody		Thermo Fisher ScientificA-214282차 항체
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 647
secondary antibody		Thermo Fisher ScientificA-212452차 항체
Goat anti-rat Alexa Fluor 647
secondary antibody		Thermo Fisher ScientificA-482652차 항체
Guinea pig anti-tdTomato antibodyFrontier InstituteAB_2631185면역형광 염색
Hanks’ balanced salt solution
(HBSS)		Gibco14175-079세포 준비 중 사용
HemocytometerVariousN/A세포 계수
Inline filter for mouth pipetteVariousN/A오염 방지
MicrogrinderNarishigeEG-400유리 주사 바늘 베벨에 사용
Micropipette pullerSutter InstrumentP-1000미세 주사 바늘 제조에 사용
Mouth pipette mouthpieceVariousN/A수동 주사 제어에 사용
Neural Tissue Dissociation Kit (P)Miltenyi Biotec130-092-628뇌 조직의 효소 분리에 사용
Petri dishesThermo Fisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/search/browse/category/us/en/90111022당근 바늘이나 조직 수확 저장에 사용. 다양한 브랜드가 있습니다. 여기 나열된 것은 예시일 뿐입니다.
Rabbit anti-Iba1 antibodyWako019-19741미세교세포 마커
Rabbit anti-TMEM119 antibodyAbcam209064미세교세포 특이 마커
Rat anti-CD206 antibodyBioLegend141712대식세포 군집 식별에 사용
Rat anti-P2RY12 antibodyBioLegend848002미세교세포 마커
Razor blades/scalpelsVariousN/A바늘 끝 트리밍 또는 조직 수확에 사용
RBC lysis bufferChemCruzsc-296258적혈구 제거에 사용
Stereotaxic apparatusKopf Instrumentshttps://kopfinstruments.com

참고문헌

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