방법 논문

다종 완보동물 RNA 분리 프로토콜

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DOI:

10.3791/72120

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2026년 9월 1일

 ,  , 
1Biology Department, The University of North Carolina Asheville, 2Department of Biological Sciences, Florida International University, 3Biology Department, The University of North Carolina at Chapel Hill

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 소량의 조직에서 RNA를 분리하여 RNA 시퀀싱 및 상보적 DNA 합성과 같은 후속 응용 분석에 충분한 양의 고품질 RNA를 얻을 수 있도록 설계된 컬럼 기반 RNA 분리 키트를 사용하여 다양한 곰벌레 종으로부터 RNA를 분리하는 절차를 상세히 설명합니다.

초록

물곰(Tardigrades)은 환경적 스트레스에 대한 탁월한 내성으로 잘 알려진 미세 동물입니다. 이 동물들은 건조, 극한의 압력, 저온 및 고수준의 이온화 방사선 환경에서도 생존할 수 있습니다. 하지만 이러한 극한 내성 능력의 기저에 있는 분자적 기제는 아직 완전히 밝혀지지 않았습니다. RNA 시퀀싱, RNA 간섭(RNAi), 박테리아와 같은 시스템에서의 물곰 유전자 이종 발현 등을 포함하여 이러한 기제를 조사하는 데 사용되는 분자 생물학적 접근법들은 제한된 생물학적 시료로부터 고품질의 전령 RNA(mRNA)를 분리하는 과정이 필요합니다. 본 연구에서는 (1) 헤테로타르디그라다(heterotardigrade) 종을 포함한 여러 종에 걸쳐 효과적이며, (2) 체구에 따라 25~200마리 정도의 적은 수만으로 가능하고, (3) 하위 응용 분석에 충분한 양과 품질의 RNA를 얻을 수 있는, 재현 가능한 물곰의 총 RNA 분리 프로토콜을 설명합니다. 본 프로토콜은 적절한 수의 물곰으로부터 효율적인 RNA 회수를 가능하게 하며, 다양한 물곰 종의 스트레스 내성에 대한 분자적 연구를 지원합니다.

서론

곰벌레(Tardigrades)는 건조, 극심한 압력, 극한 온도, 그리고 화학요법 약물이나 전리 방사선과 같은 DNA 손상 유발 인자를 포함하여 다른 동물이라면 견디지 못했을 극심한 스트레스 환경에서 생존하는 능력으로 잘 알려져 있습니다1,2,3,4,5,6,7,8. 최근 몇 년 동안 과학자들은 RNA 시퀀싱, RNA 간섭(RNAi), 그리고 인간 세포 및 박테리아를 포함한 다른 시스템에서의 곰벌레 유전자 이종 발현과 같은 분자 생물학적 접근법을 사용하여 곰벌레의 극단적인 회복력의 근저에 있는 메커니즘을 연구해 왔습니다8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. 이러한 접근법들은 곰벌레가 어떻게 그토록 극심한 스트레스 내성을 가질 수 있는지에 대한 구체적인 통찰을 제공하는 강력한 도구가 되었습니다8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22. 그러나 곰벌레의 스트레스 내성을 이해하기 위한 이러한 모든 분자 생물학적 접근법은 이 작은 동물로부터 후속 공정에 사용할 수 있을 만큼 충분한 양과 적절한 품질의 RNA를 분리해낼 수 있는 능력에 의존합니다.

이전에 발표된 완보동물 RNA 분리 방법은 Hypsibius exemplaris를 연구하는 연구자들에게 유용함이 입증되었습니다23. 하지만 H. exemplaris에서 이 프로토콜을 재현하려 했을 때, 결과물인 RNA의 농도와 품질이 일정하지 않아 신뢰도가 낮다는 것을 발견했습니다(미발표 데이터). 대안으로 페놀 기반의 RNA 분리 방법이 H. exemplaris, Ramazzottius varieornatus 및 헤테로타디그레이드(heterotardigrade) 종에서 효과적인 것으로 나타났습니다13,21,22,24,25,26. 이 프로토콜은 단일 개체 및 개체 풀(~50마리) 모두에서 후속 공정에 충분한 품질과 양의 RNA를 제공하는 것으로 입증되었습니다. 다만, 이 프로토콜은 사용자가 페놀 함유 시약을 취급해야 합니다. 페놀은 주의 깊은 취급이 필요한 위험 화학 물질이며, 프로토콜을 부적절하게 수행할 경우 페놀이 잔류하여 RNA 순도와 후속 응용 단계에 영향을 줄 수 있습니다. 완보동물 RNA 분리를 위해 이전에 발표된 또 다른 프로토콜은 단일 개체에서 RNA를 분리하는 능력에 집중하고 있습니다27. 이는 정량 PCR(qPCR)과 같은 응용 분야에는 가치 있는 프로토콜이지만27, 동물이 특정 스트레스 요인이나 조건에 어떻게 반응하는지에 대해 보다 전체적인 관점을 얻고자 하는 RNA 시퀀싱과 같은 후속 응용 분야에는 덜 적합합니다.

기존의 RNA 분리 프로토콜들의 이러한 한계로 인해, 완보동물로부터 RNA를 분리하기 위한 대안적 방법들에 대한 연구가 진행되었습니다. 본 프로토콜에서 사용된 컬럼 기반 RNA 분리 키트는 소량의 조직에서 RNA를 분리하도록 시판된 제품입니다. 이 키트는 이전에 후속 RNA 시퀀싱 분석을 위해 곤충 조직에서 RNA를 분리하는 데 사용된 바 있으며, 이는 완보동물과 같이 큐티클을 가진 다른 소형 동물들의 RNA 분리에도 적합할 수 있음을 시사합니다.28본 연구에서는 완보동물을 대상으로 한 컬럼 기반 RNA 분리 키트의 단계별 프로토콜을 설명하며, 완보동물로 본 프로토콜을 수행할 때 주의해야 할 구체적인 사항에 대한 설명을 포함합니다. 본 논문은 6종의 완보동물 종에서 이 프로토콜을 성공적으로 적용했음을 보고합니다.*H. exemplaris*, Milnesium sp., Paramacrobiotus experimentalis, Paramacrobiotus fairbanksi, Paramacrobiotus gadabouti및 이형완보동물(heterotardigrade) Viridiscus celatus). 본 연구는 25마리의 적은 수의 동물로부터도 상당한 품질과 양의 RNA를 얻을 수 있음을 검증하였습니다. 결과물인 RNA 농도 및 품질 데이터의 예시 또한 제공되며, 이는 RNA 시퀀싱(최소 편향, 지수적 라이브러리 증폭 방식) 및 상보적 DNA(cDNA) 합성과 같은 후속 응용 단계에 적합합니다. 본 RNA 분리 프로토콜은 이미 다음과 같은 방사선 내성 메커니즘을 밝히는 데 유용한 것으로 입증되었습니다. H. exemplaris8다양한 완보동물 종에서 이 프로토콜의 성공적인 적용 결과는, 이 방법이 스트레스 내성 기전, 발달 기전 및 진화 과정 연구에 더 광범위하게 적용될 수 있음을 시사합니다.

프로토콜

무척추동물은 이 요건에서 제외되므로, 다음 프로토콜은 기관 동물 윤리 승인을 필요로 하지 않습니다. 사용된 시약과 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. RNA 분리를 위한 장비 및 구역 준비

  1. RNA 추출 준비를 위해 히트 블록 또는 항온 수조를 42 °C로 켭니다.
  2. 마이크로 원심분리관 랙, 피펫(2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) 및 이에 적합한 크기의 필터 팁을 준비합니다.
  3. 잔류 RNase를 변성시키기 위해 RNase Away, 희석된 표백제 용액(10%) 또는 70% 에탄올로 실험대, 튜브 랙, 피펫 및 팁 박스를 세척합니다.
    참고: 장비나 RNA 분리 작업 구역에 RNase가 과도하게 존재할 경우, 분리 후 RNA가 분해되어 품질이 저하될 수 있습니다. RNase 변성 화학 물질이 충분히 작용할 수 있도록 시간을 두고, 작업을 진행하기 전 해당 구역과 장비를 완전히 건조시켜 이러한 위험을 줄이십시오.
  4. 본 프로토콜의 모든 단계에서 장갑을 착용하고, RNA가 RNase에 의해 분해되는 것을 방지하기 위해 프로토콜 전반에 걸쳐 장갑을 RNase 변성 용액으로 자주 처리하십시오.

2. RNA 분리를 위한 동물 수집

  1. 유리 모세관이 장착된 흡입 튜브 조립 챔버에 연결된 피펫 벌브(그림 1A), Irwin 루프 또는 마이크로피펫을 사용하여, 25~200마리의 동물(종의 크기에 따라 다름)을 배양 접시에서 깨끗한 샘물 적신 접시로 옮겨 비-완보동물 물질(종에 따라 조류 또는 선충, 윤충과 같은 기타 먹이원)의 양을 줄입니다.
  2. 1.5 mL RNase-free 튜브와 페스틀을 준비합니다.
  3. 유리 모세관이 장착된 흡입 튜브 조립 챔버에 연결된 피펫 벌브 또는 Irwin 루프를 사용하여, 동물을 1.5 mL RNase-free 튜브 바닥으로 옮기되 동물을 옮길 때 물이 최대한 적게 섞이도록 각별히 주의합니다.
  4. 4,500 g에서 3분간 원심분리하여 완보동물을 마이크로 튜브 바닥에 펠렛으로 침전시킵니다.
  5. 해부 현미경으로 완보동물이 펠렛된 튜브를 관찰하면서, 20 µL 피펫 또는 RNA를 분리하려는 완보동물보다 개구부가 작은 유리 모세관이 장착된 흡입 튜브 조립 챔버 연결 피펫 벌브를 사용하여 완보동물 펠렛을 건드리지 않고 최대한 많은 물을 조심스럽게 제거합니다. 남겨두어도 적절한 물의 양에 대한 예시는 그림 1B를 참조하십시오.
    참고: 물 제거 후 추출 완충액(XB)을 추가하기 전의 짧은 시간 동안 동물이 건조되지 않도록 소량의 물 층을 남겨두어야 합니다. 동물이 건조되면 분리 후 RNA 품질이 저하될 수 있습니다.
  6. 완보동물이 들어 있는 튜브에 100 µL의 추출 완충액(XB)을 추가합니다.

3. 완보동물의 기계적 파쇄 및 RNA 추출

  1. RNase-free 페스틀을 사용하여, 페스틀로 튜브 바닥을 부드럽지만 단단하게 약 30초 동안 갈아 완보동물을 파쇄합니다. 완보동물을 파쇄하는 데 총 20~30회의 연마 동작이면 충분합니다.
  2. 최대한 많은 양의 액체가 튜브 바닥에 남을 수 있도록 주의하며 튜브에서 페스틀을 제거합니다.
  3. 해부 현미경으로 마이크로 원심분리 튜브의 내용물을 확인하여, 파쇄되지 않은 동물이 남아 있지 않은지 확인합니다.
  4. 혼합물을 쉐이킹 히팅 블록에서 부드럽게 흔들며(300 rpm), 42 °C에서 30분 동안 배양합니다.
    참고: 추출 완충액(XB)은 이 온도에서 RNA가 분해되지 않도록 안정화합니다.

4. RNA 분리 컬럼 컨디셔닝

  1. 추출 배양의 마지막 10분 동안, RNA 수집 및 정제를 위한 컬럼을 조립합니다. 정제 컬럼을 수집 튜브에 넣고 컬럼에 적절한 라벨을 부착합니다.
  2. 250 µL의 Conditioning Buffer (CB)를 컬럼에 직접 첨가합니다.
  3. 실온에서 5분 동안 배양합니다.
  4. 16,000 × g 로 1분 동안 원심분리하고 통과액을 버립니다. 이제 컬럼은 다음 단계의 RNA 상층액을 받을 준비가 되었습니다.
  5. 아래의 6단계를 수행하기 전까지 10x DNase I Reaction Buffer와 Nuclease-Free Water를 냉동고에서 꺼내 완전히 해동합니다.

5. 컬럼에 RNA 결합시키기

  1. 추출 배양 후, 기계적으로 파쇄된 완보(tardigrades)와 추출 완충액(Extraction Buffer, XB)이 들어 있는 튜브를 3,000 × g에서 2분 동안 원심분리합니다.
  2. 새로운 RNase-free 튜브를 준비하고 적절하게 라벨링합니다.
  3. 필터 팁이 장착된 200 µL 피펫을 사용하여, 침전된 완보 큐티클에서 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 이때 큐티클 펠렛이 섞이지 않도록 주의하며 상층액만 제거하십시오.
    참고: 큐티클이 다음 단계로 전이되면 컬럼의 물리적 막힘으로 인해 RNA 수율 효율이 낮아질 수 있습니다. 이러한 오류를 방지하기 위해, 현미경으로 상층액이 담긴 피펫 팁을 관찰하여 큐티클이 없는지 확인하십시오. 큐티클이 발견되면 상층액을 다시 튜브에 넣고 원심분리 단계를 반복하십시오.
  4. 상층액을 새로 라벨링한 RNase-free 튜브로 옮깁니다.
  5. RNA가 포함된 튜브에 70% 에탄올 100 µL를 넣고, 피펫팅으로 여러 번 섞어 충분히 혼합합니다. 이 단계에서 에탄올을 추가하면 투명하고 끈적한 필라멘트가 보여야 하며, 이는 상층액에 RNA가 존재한다는 좋은 징후입니다.
  6. 혼합액 전체(200 µL)를 4단계에서 준비한 컬럼에 분주합니다.
    참고: 본 단계 및 이후 단계에서 용액을 컬럼에 분주할 때, 액체를 컬럼 중앙에 분사하고 피펫 팁이 컬럼에 물리적으로 닿지 않도록 주의하십시오. 컬럼에 물리적인 구멍이 생기면 이후 RNA의 품질과 양에 문제가 발생할 수 있습니다.
  7. RNA를 컬럼에 결합시키기 위해 100 × g에서 2분 동안 원심분리한 후, 16,000 × g에서 30초 동안 원심분리하여 통과액(flowthrough)을 제거합니다.

6. DNase I 용액 제조

  1. 용액을 만들기 전 10x DNase I Reaction Buffer와 Nuclease-Free Water를 완전히 해동하십시오.
  2. 각 RNA 분리를 위해, 별도의 1.5 mL microfuge tube에 32 µL Nuclease-Free Water, 4 µL 10x DNase I Reaction Buffer, 4 µL DNase I Enzyme을 혼합하여 40 µL 용액을 준비하십시오. 이 용액은 단계 7.3에서 컬럼에 적용할 때까지 얼음에 보관하십시오.

7. RNA 세척 및 DNase I 처리

  1. RNA가 결합된 정제 컬럼(단계 5.7 참고)에 Wash Buffer 1 (W1) 100 µL를 직접 분주합니다.
  2. 8,000 × g에서 1분간 원심분리하고 통과액을 제거합니다.
  3. 단계 6에서 준비한 DNase I 용액 40 µL를 정제 컬럼에 직접 분주하고, DNA 오염을 제거하기 위해 상온에서 15분간 배양합니다.
  4. 정제 컬럼에 Wash Buffer 1 (W1) 40 µL를 분주하고 8,000 × g 에서 30초간 원심분리합니다.
  5. 정제 컬럼에 Wash Buffer 2 (W2) 100 µL를 분주하고 8,000 × g에서 1분간 원심분리합니다.
  6. 정제 컬럼에 Wash Buffer 2 (W2) 100 µL를 추가로 분주하고 16,000 × g에서 2분간 원심분리합니다. 통과액은 버립니다.
  7. 컬럼을 건조시키기 위해 16,000 × g에서 1분간 원심분리합니다.

8. RNA 용출

  1. 각 RNA 분리를 위해 0.5 mL 튜브(키트에 포함됨)를 준비하고 적절하게 라벨을 부착합니다. 이 튜브는 분리 후 RNA가 담길 튜브가 됩니다.
  2. RNA가 결합 및 세척된 컬럼을 라벨이 부착된 0.5 mL 튜브로 옮깁니다. 컬럼이 튜브에 딸깍 소리가 나며 단단히 고정되어야 합니다.
  3. 튜브의 측면을 보면서 피펫 팁을 컬럼 막 바로 위에 위치시킨 후, 11 µL의 Elution Buffer (EB)를 컬럼 위에 분사하고 실온에서 1분 동안 배양합니다.
    참고: Elution Buffer (EB)를 컬럼 위에 직접 분산시키지 않으면 RNA 회수율이 감소합니다. 컬럼 주변으로 액체 방울이 관찰된다면 Elution Buffer (EB)가 컬럼에 적절하게 분산되지 않았음을 의미합니다. 이 경우, Elution Buffer (EB)가 컬럼 중앙에 직접 분사되도록 하여 단계 8.5의 통과액(flowthrough)으로 이 단계를 반복하는 것을 권장합니다.
  4. 원심분리 시 적절하게 고정될 수 있도록 컬럼이 들어 있는 0.5 mL 튜브를 키트에 제공된 수집 튜브에 넣습니다(그림 2).
  5. 1,000 × g에서 1분 동안 원심분리하여 Elution Buffer (EB)를 분산시킨 다음, 16,000 × g에서 1분 동안 회전시켜 RNA를 용출합니다.
  6. RNA가 담긴 0.5 mL 튜브를 즉시 얼음에 둡니다.

9. 마이크로볼륨 분광광도계를 이용한 RNA 양 및 품질 검증

참고: RNA의 양과 질을 평가하기 위해 다른 방법들을 사용할 수 있습니다. 여기서는 마이크로볼륨 분광광도계를 이용한 방법을 사용합니다. 형광 광도계 또는 마이크로유체 젤 전기영동 도구 또한 사용할 수 있습니다29.

  1. 마이크로볼륨 분광광도계의 페데스탈을 보풀 없는 와이프로 닦아 다른 액체가 남아있지 않도록 깨끗하게 합니다.
  2. 분석을 위해 분광광도계에서 RNA 설정을 선택합니다.
  3. 단계 8.3에서 사용한 용출 완충액(Elution Buffer, EB) 1 µL를 사용하여 분광광도계를 블랭킹(blank)합니다.
  4. 블랭킹 후, 보풀 없는 와이프로 페데스탈에 묻은 용출 완충액(EB)을 닦아냅니다.
  5. RNA가 들어있는 0.5 mL 튜브를 얼음 위에 둔 상태에서, RNA 1 µL를 분광광도계의 페데스탈 위에 피펫팅합니다. 분광광도계의 암(arm)을 내려 샘플의 흡광도를 측정함으로써 분리된 RNA의 양을 정량하고 품질을 평가합니다.
    참고: 후속 응용 단계에서 허용되는 품질 및 양에 대한 자세한 내용은 아래의 “결과(Results)” 섹션을 참조하십시오.

결과

앞서 언급했듯이, 이 프로토콜의 중요한 단계는 RNA 추출을 위한 추출 버퍼(XB)를 첨가하기 전, 수집된 곰벌레로부터 적절한 양의 물을 제거하는 것입니다. 물이 너무 많이 남아 있으면 추출 버퍼(XB)가 희석되어 동물로부터의 RNA 추출 효율이 떨어지게 되며(즉, RIN < 7, 260/280 비율 < 1.8, 260/230 비율 < 1.8 및/또는 농도 < 5 ng/µL), 이는 용출 후 RNA 농도와 품질 저하로 이어집니다. 반면 물을 너무 많이 제거하면 동물이 빠르게 건조되어 잠재적으로 사망에 이를 수 있으며, 사망 후 RNase 활성 증가로 인해 RNA 품질이 저하될 수 있습니다. 이 프로토콜을 성공적으로 완료하는 것을 돕기 위해, 추출 버퍼(XB)를 첨가하기 전 곰벌레가 들어 있는 튜브에 남겨두어야 할 적절한 양의 물을 보여주는 시각적 자료가 제공됩니다(그림 1B).

현재까지 이 프로토콜은 이형완보동물(heterotardigrade)을 포함하여 6종의 서로 다른 완보동물 종에 적용되었습니다.V. celatus). 이러한 분리 결과, RNA 농도는 11 ng/µL 106.6 ng/까지µL (마이크로볼륨 분광광도계로 확인하였으며, 표 1) 및 9 ng/µL 113 ng/로µL (미세유체 젤 전기영동을 통해 확인됨, 표 2). RNA 분리를 위해 필요한 동물의 수는 분리 대상 종의 크기에 따라 달라집니다. 다음과 같은 더 큰 곰벌레의 경우, Paramacrobiotus 종 및 Milnesium sp., 최소 25마리의 동물로부터 충분한 RNA 농도를 얻을 수 있으며 (표 1). 더 작은 종의 경우, 다음과 같이 H. exemplaris 그리고 *V. celatus*, 100마리 이상의 동물로부터 분리했을 때 성공률이 더 높습니다 (표 1). 대부분의 분리물은 260/280 비율이 약 2로 나타나며, 이는 RNA가 깨끗하게 분리되었음을 나타냅니다.30일부 종으로부터의 분리물(V. celatus 및 H. exemplaris, 그리고 그/그녀의/그것의 Paramacrobiotus 종)의 경우 때때로 260/230 비율이 낮게 나타나며, 이는 시약에 의한 오염 가능성을 시사합니다.30이는 종종 더 적은 수의 동물(100마리 미만의)을 사용할 때 발생했습니다. V. celatus 및 H. exemplaris, 그리고 25개는 ~을 위해 Paramacrobiotus 종), 이는 동물 수가 너무 적을 경우 최종 용출된 RNA의 시약 오염 위험이 증가할 수 있음을 시사합니다. RNA 품질 평가를 통해 ~을 통해 / ~을 경유하여 미세유체 젤 전기영동을 통해 RNA 무결성 수치(RIN)를 계산할 수 있습니다. 9~10 사이의 RIN 값은 분해가 거의 일어나지 않은 고품질의 RNA임을 나타냅니다.31 일반적으로 RIN 값이 7 미만인 경우 RNA 시퀀싱과 같은 하위 공정을 진행하지 않는 것이 권장됩니다. 몇 가지 미세유체 젤 전기영동 결과 예시가 제공됩니다 (그림 3RIN 값이 높거나 낮음/검출되지 않는 샘플로부터( ) 일부 샘플은 추가 분석에서 제외되었습니다(표 2, 그림 3A,D). 하지만 RIN 수치가 낮거나 검출되지 않은 일부 샘플들을 RNA 시퀀싱을 위한 라이브러리 제작 단계로 진행하도록 선정하였으며, 이들 역시 양질의 RNA 시퀀싱 결과로 이어졌습니다(표 2, 그림 3B,F, 미발표 데이터, 자세한 내용은 “고찰” 참조).

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그림 1: RNA 분리 설정. 동물 이동 및 물 제거를 위해 유리 모세관이 장착된 흡입기 튜브 어셈블리 챔버에 피펫 벌브가 연결된 모습(A)과 Paramacrobiotus 곰벌레에 추출 완충액(Extraction Buffer, XB)을 추가하기 전 적절하게 남아 있는 물의 양을 나타낸 이미지(B). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 최종 용출을 위한 용출 튜브 설정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: H. exemplaris 및 P. gadabouti의 대표적인 미세유체 겔 전기영동 결과. (A) 전리 방사선에 노출된 H. exemplaris의 RNA 겔. (B) 대조군 조건 하의 P. gadabouti 및 H. exemplaris의 RNA 겔. (C–F) 고품질 H. exemplaris RNA 샘플(C), 품질이 의심스러운 H. exemplaris 샘플(D), 우수한 품질의 P. gadabouti 샘플(E), 그리고 명백한 분해가 일어난 H. exemplaris 샘플(147 bp에서 피크 확인)(F)의 대표적인 피크 프로파일. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 마이크로볼륨 분광광도계로 측정한 다양한 완보동물 종의 대표 RNA 농도 및 품질 정보. *마이크로볼륨 분광광도계로 검출된 20 ng/µL 미만의 농도는 흡광도 비율이 부정확하게 측정될 수 있습니다. **단계 5.7에서 잘못된 원심분리 속도로 인해 260/230 비율이 낮게 나타났습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 2: 마이크로플루이딕 젤 전기영동 시스템으로 수집한 두 가지 완보동물 종의 대표적인 RNA 농도 및 품질 정보. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

본 프로토콜의 목적은 완보동물의 스트레스 내성 연구를 위한 하위 응용 분석에 적용할 수 있을 만큼 충분한 양과 품질의 RNA를 완보동물로부터 분리하는 것을 돕는 것입니다. 여기에 제시된 프로토콜에서는 추출 버퍼(Extraction Buffer, XB)를 추가하기 전 충분한 수분을 제거하는 단계(단계 2.5), 완보동물의 신체를 파쇄하는 단계(단계 3.1-3.3), 정제를 위해 상층액을 컬럼으로 옮기는 단계(단계 5.3), 그리고 RNA를 용출하는 단계(단계 8.3) 등 사용자가 어려움을 겪을 수 있는 부분들을 명시하였습니다. 이러한 단계 중 어느 하나에서라도 오류가 발생하면 결과 RNA의 농도나 품질이 저하될 수 있습니다. (마이크로 볼륨 분광광도계로 확인했을 때) 결과 RNA 농도가 5 ng/µL 미만인 경우, 사용자는 (1) 더 많은 수의 개체(소형 종의 경우 >100마리, 대형 종의 경우 >50마리)를 사용하여 RNA 분리를 다시 수행하거나, (2) 수분 제거, 완보동물 파쇄 및 용출 단계에 특별히 주의하며 프로토콜을 반복하는 것을 고려해야 합니다.

이 논문은 RNA 시퀀싱에 적절하거나 부적절하다고 판단된 RNA 품질 평가(RIN, 260/280 비율, 260/230 비율)의 사례를 제공합니다(표 1, 표 2, 그림 3). 때때로 이 프로토콜을 이용한 일부 RNA 분리 과정에서 낮은 (<1.0) 260/230 비율이 관찰되는데(표 1), 이는 잔류 유기 화합물이 존재함을 시사합니다. 보통 이는 동물 개체 수가 적은 경우와 관련이 있었습니다. 동물 투입량을 늘릴 수 없는 상황이거나 사용자가 지속적으로 낮은 260/230 비율을 겪는 경우, Wash Buffer 2 (W2)를 이용한 추가 세척 단계를 포함하거나(단계 7.6 반복), 단계 7.7의 건식 원심분리 시간을 연장하여 이러한 오염 물질을 확실히 제거하는 것이 권장됩니다. 또한, 낮은 260/230 비율을 보인 하나의 대표적인 H. exemplaris 분리 사례(표 1)는 프로토콜을 처음 사용하는 학부생에 의해 수행되었으며, 사후 검토 결과 단계 5.7(RNA를 컬럼에 결합시킨 후 에탄올을 제거하기 위한 원심분리)이 잘못된 원심분리 속도(너무 느림)로 수행되었음을 확인했습니다. 이로 인해 에탄올이 컬럼에 남아 프로토콜 전체 과정으로 유입되었고, 결과적으로 낮은 260/230 비율이 나타난 것으로 보입니다. 이 사용자가 이후에 수행한 분리에서는 260/230 값이 합리적인 범위(1.5 이상) 내로 나타났습니다. 따라서 모든 사용자, 특히 처음 사용하는 사용자는 이러한 잠재적 문제를 피하기 위해 프로토콜을 진행할 때 원심분리 속도에 세심한 주의를 기울여야 합니다. H. exemplaris에서 때때로 낮은 260/230 비율이나 낮은 RIN이 나타났음에도 불구하고, 유사한 품질 측정값을 가진 RNA를 전리 방사선 또는 기타 스트레스 요인 노출 후의 차등 유전자 발현을 조사하기 위한 후속 RNA 시퀀싱에 여전히 사용할 수 있었습니다8 (표 1, 표 2 및 미출판 데이터). 마찬가지로, 이 프로토콜로 분리한 P. gadabouti RNA는 높은 농도와 품질을 보였으며(RIN으로 확인, 표 2, 그림 3), 유의미한 RNA 시퀀싱 데이터를 얻었습니다(미출판 데이터). 일화적으로, 본 연구에서는 저농도(5–9 ng/µL)의 H. exemplaris RNA를 사용하여 cDNA를 제작함으로써 H. exemplaris 유전자의 후속 클로닝을 성공적으로 수행하였습니다8. H. exemplaris RNA의 농도와 RIN(미세유체 젤 전기영동으로 측정)이 낮거나 검출되지 않은 경우에는 RNA 시퀀싱을 위한 라이브러리 제작 단계로 넘어가기 전, 해당 처리군에 대해 RNA를 재분리하였습니다(표 2, 그림 3A,D). RIN이 검출되지 않은 다른 H. exemplaris 샘플들의 경우 시퀀싱을 그대로 진행했던 것과 달리(그림 3B,F), 이 샘플(그림 3A,D)에 대해 RNA 분리를 다시 하기로 결정한 이유는 미세유체 젤에서 명확한 밴드가 보이지 않았기 때문이며, 이는 로딩 오류, RNA 분해 또는 불충분한 RNA 농도를 나타낼 수 있습니다. 반면, H. exemplaris에서 분리한 RNA의 농도가 상대적으로 낮고 RIN이 검출되지 않았으며, 작은 크기의 RNA 수치가 높게 나타나 일부 RNA 분해 증거가 있었음에도 불구하고, 라이브러리 제작 후 사용 가능한 RNA 시퀀싱 데이터를 얻었습니다(미출판 데이터, 표 2, 그림 3B,F). 따라서 RNA 샘플이 후속 응용 단계에 적합한지 판단하기 위한 일부 가이드라인이 여기에 제공되지만, 사용자는 자신의 재량으로 판단하고 구체적인 후속 응용 목적을 고려하여 RNA의 품질과 양이 진행하기에 충분한지 평가해야 합니다.

완보동물(tardigrades)에서 RNA를 분리하고자 하는 연구자들은 자신의 목적에 가장 적합한 프로토콜을 결정할 때 여러 가지 측면을 고려해야 합니다. 이전에 보고된 모든 RNA 분리 방법(본 연구에서 보고하는 방법 포함)은 RNA 시퀀싱, cDNA 합성 및 qPCR8,12,13,17,21,22,25,27와 같은 후속 응용 분석을 지원하기에 충분한 양과 질의 RNA를 얻었습니다. 비용은 특히 예산이 적은 연구실이나 교육용 실험실에서 자주 고려되는 사항입니다. 본 프로토콜은 분리 반응당 비용이 이전에 보고된 프로토콜보다 더 비쌉니다. 하지만 이러한 비용 증가는 이전 프로토콜과 비교하여 그만한 이점이 있다고 생각합니다. 다른 컬럼 기반 RNA 분리 프로토콜23과 비교했을 때, 본 RNA 분리 프로토콜은 더 적은 양의 투입 재료(더 적은 수의 동물)로도 충분한 질의 RNA를 넉넉하게 생산할 수 있습니다. 또한, 서론에서 언급했듯이, 이전에 보고된 컬럼 기반 RNA 분리 프로토콜은 저희 실험 환경에서 일관성 없게 작동하여, 종종 후속 공정에 불충분할 정도로 매우 낮은 RNA 수득률을 보였습니다(미출판 데이터). 또한, 본 프로토콜은 페놀 기반의 RNA 분리 방식에 비해 훨씬 안전한데, 이는 흄후드가 필요한 위험 화학 물질을 다룰 필요가 없기 때문입니다. 아울러, 페놀 기반 RNA 추출 프로토콜의 일반적인 사용자 문제는 페놀 잔류로, 이는 RNA 순도에 영향을 미치고 후속 응용 분석을 방해할 수 있습니다. 이러한 문제들로 인해 페놀 기반 RNA 추출은 학부생들(연구실 또는 강의실)이 접근하기에 어려움이 있습니다. 하지만 페놀 기반 방법이 가장 비용 효율적이기는 합니다. 본 프로토콜은 (Kirk et al.에서 발표한 바와 같이) 단일 개체의 전사체 반응을 평가하기 위해 단일 동물로부터 RNA를 분리하는 것에는 적합하지 않으나, 대신 스트레스 요인에 반응하여 개체 간에 공유되는 변화를 조사하는 데 유용하며, 이를 통해 스트레스 반응에 대한 보다 총체적인 관점을 제공합니다. 따라서 사용자는 비용, 동물 확보 가능성, 기존 프로토콜의 사용자 접근성 등의 중요도를 따져보고 자신의 요구에 가장 적합한 프로토콜을 결정해야 합니다.

본 보고서는 Heterotardigrada의 대표종을 포함하여 6종의 서로 다른 완보동물 종으로부터 충분한 양과 질의 RNA를 생성하는 이 프로토콜을 검증하였습니다. 또한, 이 RNA 분리 방법은 적절한 수의 동물(종의 크기에 따라 25–200마리)로부터 충분한 RNA를 얻을 수 있게 합니다. 여러 종에서 이 RNA 분리 프로토콜을 검증함으로써 완보동물 생물학의 매혹적인 측면들을 이해할 수 있는 길이 열렸습니다. 이는 스트레스 내성에 대한 조사뿐만 아니라, 저항 기전의 진화와 발달을 포함하여 이들 동물의 진화를 이해하는 것까지 확장됩니다. 이 프로토콜은 특히 생물량이 제한적이고 표준화된 RNA 분리 방법이 부족한 비모델 및 야생 수집 완보동물 종에 매우 유용합니다. 마지막으로, 이 프로토콜은 연구자들이 쉽게 접근할 수 있으며 학부생 연구자들도 재현성 있게 수행할 수 있어, 주로 학부생들이 있는 교육 기관의 강의 또는 연구실에서 유용한 자산이 될 것입니다.

공개 사항

저자들은 공개할 사항이 없습니다.

감사의 글

본 연구는 UNC Asheville의 스타트업 펀드(CCH 대상)와 Jason Pienaar(PK의 박사후 지도교수)에게 제공된 NSF 그랜트 2225683의 지원을 받았습니다. 기술적 지원을 제공해 준 UNC High Throughput Sequencing Facility에 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.5 mL Microfuge TubesUSA Scientific1615-5500Seal-Rite 1.5 mL 눈금 표시 마이크로 원심분리 튜브, 내추럴, 폴리프로필렌, 500개/백
70% EthanolVWR71001-654벤치 및 장비 세척용
Arcturis PicoPure RNA Isolation KitFisherKIT0204본 논문에 기술된 분리 프로토콜을 위한 구성 성분이 포함된 키트
원심분리기Eppendorf5405000441Centrifuge 5425, 회전 노브, 비냉장식, Rotor FA-24x2 포함, 120 V/50-60 Hz (US)
Deer Park 생수Any Grocery StoreN/A곰벌레 배양용 배지이자 RNA 분리 전 곰벌레 세척에 사용
해부 현미경ZeissN/AZeiss Stemi 305, 줌 비율 5:1 및 총 배율 8x-40x, transillumination Unit M LED 포함
DNase IFisherFEREN0521Thermo Scientific DNase I, RNase-free (1 U/uL)
필터 팁 10 uLVWR76322-528모든 필터 파이펫 팁 사용 가능
필터 팁 1000 uLVWR76322-154모든 필터 파이펫 팁 사용 가능
필터 팁 20 uLVWR76322-134모든 필터 파이펫 팁 사용 가능
필터 팁 200 uLVWR76322-150모든 필터 파이펫 팁 사용 가능
유리 모세관Fisher50-821-811World Precision Instrument 표준 유리 모세관 - 1B120-6 (6 inch, 외경 1.2 mm, 필라멘트 없음). 이를 화염 상에서 끝이 좁아진 두 개의 유리 모세관으로 뽑아낸 후, 선택한 곰벌레 종을 마우스 파이펫으로 채취하기에 적절한 직경으로 절단하여 사용함.
히팅 블록Eppendorf5382000023Eppendorf ThermoMixer C, 서모블록 제외 기본 장치, 100-130 V/50-60 Hz (US/JP/South America/TW)
High Sensitivity RNA Screen Tape LadderAgilent5067-5581TapeStation 시스템에서 총 RNA의 고감도 분석을 위한 래더
High Sensitivity RNA ScreenTapeAgilent5067-5579TapeStation 시스템에서 총 RNA의 고감도 분석용
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample BufferAgilent5067-5580TapeStation 시스템에서 총 RNA의 고감도 분석을 위한 버퍼
미세유체 젤 전기영동 장치AgilentG2991BAAgilent 4200 TapeStation System
마이크로볼륨 분광광도계Fisher13400607Thermo Scientific NanoDrop UltraC FL, 검출기 유형: 2048-element, CMOS Linear Image Sensor, 디스플레이: 10 in. 고해상도 컬러 디스플레이, 지원 언어: 중국어, 영어, 프랑스어, 일본어, 독일어, 광원: Xenon Flash, 스펙트럼 대역폭: 1.8 nm 이하 (Hg 254 nm에서 FWHM), 전압: 12 VDC
마우스 파이펫Millipore SigmaA5177교정된 마이크로 모세관 파이펫용 흡입 튜브 어셈블리
Nuclease-Free WaterFisherFERR0581Thermo Scientific Water, nuclease-free
파이펫 (2.5 uL, 20 uL, 200 uL, 1000 uL)Eppendorf2231300004Eppendorf Research plus, 4-pack
RNase AwayFisher21-402-178Thermo Scientific RNase AWAY 표면 오염 제거제
RNase-Free 튜브 및 페스틀Fisher12-141-368RNA 분리용 RNase-free 튜브 및 페스틀

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