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연구 논문

골관절염 진단 바이오마커로서의 miR-215-5p 임상 코호트 분석 및 IL-1β 유도 연골교구 모델에서의 EREG를 통한 기전

97 조회수

⸱

DOI:

10.3791/72124

⸱

2026년 7월 31일

 ,  ,  , 
1Fujian University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Orthopedics, Xianyou County General Hospital, 3Department of Rehabilitation, Xianyou County General Hospital, 4Department of Orthopedics, Putian 95th Hospital

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 연구는 혈청 miR-215-5p가 골관절염의 진단 바이오마커로서 평가하고, IL-1β 유도 연골혈구에서 그 조절 기전을 조사하는 것을 목표로 합니다.

초록

골관절염(OA)은 관절 연골의 퇴화와 활막 염증성 침윤이 특징인 퇴행성 관절 질환입니다. 본 연구는 혈청 miR-215-5p가 OA의 진단 바이오마커로서 평가하고, IL-1β 유도 연골세포에서 그 조절 기전을 조사하는 것을 목표로 합니다. 110명의 골관절염 환자와 105명의 건강한 대조군을 모집하였습니다. 혈청 miR-215-5p와 EREG 발현은 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응을 통해 결정되었습니다. miR-215-5p의 OA 진단 가치는 수신자 수술 특성 곡선을 사용하여 평가하였습니다. C28/I2 연골세포는 IL-1β로 자극되어 골골증 세포 모델을 구축하였습니다. 세포 생존성, 이동 능력, 염증성 사이토카인 수치는 Cell Counting Kit-8, Transwell 검사, 효소 결합 면역흡착 검사(ELISA)를 통해 평가하였습니다. miR-215-5p와 EREG의 연관성은 이중 루시퍼레이스 리포터 분석과 RNA 면역침전(RIP) 검사를 통해 검증되었습니다. 골관절염 환자에서는 혈청 miR-215-5p가 상향 조절되었고, EREG는 하향 조절되었습니다. MiR-215-5p는 골관절염(곡선 아래 면적, AUC = 0.883)에 대해 우수한 진단 성능을 보였습니다. 인터루킨-1β(IL-1β) 처리된 C28/I2 세포에서는 miR-215-5p 억제가 세포 생존력과 이동을 증가시키고, IL-1β, IL-6, 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 수치를 감소시켰습니다. EREG는 miR-215-5p의 직접적인 표적임이 확인되었습니다. EREG의 다운다운은 miR-215-5p 하향 조절이 IL-1β 처리 C28/I2 세포의 생존 및 이동 능력에 미치는 촉진 효과를 부분적으로 역전시키고, 염증 인자에 대한 억제 효과를 완화시켰다. miR-215-5p는 EREG를 조절함으로써 OA 발병 기전에 기여하며, OA의 유망한 진단 바이오마커이자 잠재적 치료 표적입니다.

서론

골관절염(OA)은 퇴행성 관절 질환으로, 그 병리적 특징은 연골 퇴행과 활막 염증 1,2를 특징으로 합니다. 전 세계적으로 골관절염 발생률은 여전히 높으며, 관련 연구들은 3,4년 차별로 발생률이 증가하는 추세를 보고하고 있습니다. 비만, 노화, 유전적 감수성, 골밀도 등의 요인이 OA5 발병과 관련이 있음이 밝혀졌습니다. 임상 증상 측면에서 OA 환자는 관절 통증, 부기, 이동성 제한, 뻣뻣함을 자주 보이며, 이는 환자의 삶의 질을 심각하게 저하시킵니다 6,7. 주목할 점은 OA의 다양한 표현형이 존재하며, 이러한 표현형은 질병의 발병 기전의 다양성을 적절히 반영한다는 것입니다8. 현재 골관절염 치료는 여전히 증상 개선에 집중되어 있으며, 일반적으로 사용되는 임상 약물로는 진통제와 비스테로이드성 항염증제가 있는데, 이들은 통증 완화에만 효과적이며 질병의 진행을 효과적으로 되돌릴 수는 없습니다9. 따라서 새로운 OA 바이오마커 탐색은 현재 연구에서 시급한 과제가 되었습니다.

마이크로RNA(miRNA)는 단백질10을 암호화하지 않는 단가닥 RNA 분자의 한 범주입니다. 이들은 다세포 생물에서 중요한 유전자 조절 분자로서 다양한 단백질 코딩 유전자의 발현 출력에 영향을 미칠 수 있습니다11. 수많은 연구에서 miRNA가 OA12 발달에 현저한 영향을 미친다는 것이 확인되었습니다. 이전 연구에서는 miR-215-5p가 자간전증에서 과발현되어 CDC6 발현을 조절함으로써 영양구세포의 이동 및 침습 능력을 감소시킨다는 것을 보여주었다13. miR-215-5p의 과발현은 패혈증14에서 H9c2 세포의 염증 손상을 완화시켰다. miR-215-5p는 XIAP의 발현을 억제하고 hBMSCs의 분화를 촉진함으로써 골다공증 발병 기전에서 보호 효과를 발휘할 수 있다15. 특히, 골관절염 환자의 滑막 조직에서 miRNA 발현 프로필을 분석했을 때 miR-215-5p가 상향 조절된 것으로 나타났다. 그러나 혈청 miR-215-5p 발현과 OA 진단 바이오마커로서의 잠재력은 아직 탐구되지 않았습니다. 골관절염 연골세포에서 miR-215-5p의 역할, 특히 세포 생존력, 이동 및 염증 반응에 미치는 영향은 아직 명확하지 않습니다. miR-215-5p가 특정 하류 표적을 통해 OA에서 조절 기능을 발휘하는지 여부는 보고된 연구가 없습니다. 이러한 공백을 메우면 OA 분자 기전에 대한 새로운 통찰을 제공하고 새로운 후보 치료 표적을 식별할 수 있을 것입니다.

EREG는 표피 성장 인자 계열에 속하며 조직 복구와 염증 반응에 관여하는 것으로 입증되었습니다17,18. Chen 등의 연구는 OA 환자의 연골 및 활막 조직에서 EREG 발현이 대조군에 비해 유의하게 감소했다고 보고했다19. 그러나 EREG가 골격증 연골세포에서 miR-215-5p의 하행 표적 역할을 하는지, 그리고 이 조절축이 OA 발병 기전에서 어떤 역할을 하는지는 현재로서는 명확하지 않습니다.

위의 배경을 바탕으로, 우리는 혈청 miR-215-5p 발현이 골관절염 환자에서 상향 조절되어 EREG를 직접 표적으로 하여 연골 염증성 기능 장애를 유발하는 반면, miR-215-5p 억제는 인터루킨-1β(IL-1β)에 의해 유발된 연골 손상을 완화한다고 가설을 세웠습니다. 이 연구는 임상 및 세포 검증을 위한 통합 측정 가능한 평가 지표와 판단 기준을 채택하였으며, 임상적으로는 110명의 골관절염 환자와 105명의 건강한 대조군이 등록되었습니다; 혈청 miR-215-5p와 EREG 수치는 qRT-PCR을 통해 정량화하였고, 진단 성능을 평가하기 위해 ROC 곡선을 적용하였다(AUC ≥ 0.7, P < 0.05 시 유효). miR-215-5p와 골관절염 임상 특징 간의 상관관계를 카이제곱 검정으로 분석하였으며, 다변량 로지스틱 회귀분석을 통해 독립적인 골관절염 위험 요인을 확인하였다(조정 P < 0.05). 시험관 내에서 C28/I2 연골교구에 10 ng/mL IL-1β를 24시간 동안 처리하여 OA 모델을 구축한 후, miR-215-5p 억제제/모방제와 si-EREG로 형질전환하였습니다. CCK-8, Transwell, ELISA 검사를 사용하여 세포 생존성, 이동 및 염증성 사이토카인 수치를 평가하였습니다. 구조 실험 기준: miR-215-5p 억제제가 연골세포의 생존력과 이동을 회복시켰으며(P < 0.05), EREG 침묵이 이 보호 효과를 부분적으로 제거했습니다(P < 0.05). 생물정보학적 타겟스캔 예측, 이중 루시퍼라제 리포터 분석법, RIP 분석은 이들의 직접 결합을 더욱 입증했습니다: miR-215-5p 모방 형질염화 후 WT-EREG 루시퍼라제 활성이 유의미하게 감소하고, Ago2 침전물과 IgG 조절 중 miR-215-5p/EREG 농축이 현저히 증가한 것으로 표적 상호작용 기준으로 정의되었습니다(둘 다 P < 0.05). 이 연구는 골관절증에서 miR-215-5p의 진단적 가치와 분자 기전을 체계적으로 명확히 하여 새로운 치료 후보를 규명하였습니다.

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프로토콜

이 연구는 헬싱키 선언의 원칙에 따라 수행되었다. 선유현종합병원 윤리위원회는 연구가 시작되기 전에 승인했습니다(승인번호 202514, 2025년 6월 18일).

프로토콜의 요약은 보충 그림 1에 제공되어 있습니다.

표본

이 병원에서 치료받은 골관절염 환자 총 110명과 건강한 대조군 105명이 이 연구를 위해 모집되었습니다. 골관절염 그룹의 포함 기준은 다음과 같다: 미국 류마티스학회가 정한 분류 기준에 따라 골관절염 진단이 확정됨20. 모든 환자는 X선 영상과 Kellgren-Lawrence(K-L) 영상 등급을 받았습니다; 입원 3개월 전 항생제 치료 없음; 완전한 임상 데이터; 모든 환자로부터 서면 동의를 받았습니다. OA 그룹의 제외 기준에는 관련 치료를 받았거나 말기 단계에 있는 환자가 포함되었으며; 통풍, 류마티스 관절염 등 다른 관절 질환을 앓고 있는 분들; 종양, 중증 간 및 신장 기능 부전, 자가면역 질환, 감염병, 신경학적 질환 또는 중증 심호흡기 질환이 복합적으로 있는 환자; 그리고 스스로를 돌볼 수 없는 신체적 장애를 가진 이들. 등록 시점에 모든 참가자의 기초 데이터가 기록되었으며, 여기에는 나이, 성별, 체질량지수(BMI), 흡연, 음주, 가족력, 질병 경과, K-L 등급, 시각 아날로그 척도(VAS) 점수, 웨스턴 온타리오 및 맥마스터 대학교 골관절염 지수(WOMAC) 점수, 병변 부위 등이 포함되었습니다. 관련 데이터는 분석 및 요약하여 표 1에 정리하였습니다. 모든 피험자는 공복 상태에서 8mL의 정맥혈을 채취한 후 4°C에서 3시간 동안 서 있다가, 4°C에서 3000 × g에서 15분간 원심분리하여 혈청을 분리했습니다. 세럼은 부드럽게 채취되어 추가 검사 전까지 −80°C에서 보관되었습니다.

인간의 혈액/혈청(카테고리 B 감염성 생물학적 물질)에는 알 수 없는 감염성 병원체를 보유할 수 있는 체액이 포함되어 있으며, 물 튀김, 바늘 찌르기, 손상된 피부와의 접촉으로 경피 또는 점막 감염을 일으킬 수 있습니다. 일회용 니트릴 장갑, 일회용 의료 격리복, 고글 또는 마스크, 수술용 마스크를 착용해야 합니다. 고압 멸균 후 중앙에서 수거되어 인증된 의료 폐기물 처리 기관에 의해 소각됩니다.

세포 배양 및 OA 세포 모델 구축

인간 C28/I2 연골세포는 5% CO₂가 채워진 가습 인큐베이터 내에서 37°C의 DMEM/F12 배지에 태아 소 혈청(FBS)을 포함한 배지에서 유지되었습니다. 모든 실험은 3번에서 6번 계통의 세포를 사용하여 안정적인 세포 표현형을 유지하였습니다. 세포 합류율이 80%에 도달하면 이후 실험적 조작이 수행되었습니다. 실험군 세포는 37°C에서 IL-1β 10 ng/mL를 24시간 동안 투여하여 시험관 내 OA 모델21을 확립했으며, 대조군 세포는 치료하지 않고 방치하였다.

세포 형질전환

음성 대조 억제제(inhibitor-NC), miR-215-5p 억제제, mimic-NC, miR-215-5p mimic, 음성 대조 소간섭 RNA(si-NC), 그리고 si-EREG가 상업적으로 합성되었습니다. 형질전환 분석은 세포의 로그 성장 단계에서 6웰 플레이트에서 형질전환 시약을 사용하여 수행되었습니다. 구체적으로, 50 nM의 억제제/모방 또는 음성 대조군을 웰당 125 μL Opti-MEM 배지에 희석하고, 5 μL 형질전환 시약을 125 μL Opti-MEM에 용해한 후 실온에서 15분간 보관하여 복합체를 형성했습니다. 그 혼합물을 세포에 첨가했습니다. 세포는 형질전환 후 48시간 후에 채취하여 후속 실험을 수행했습니다.

정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR 분석)

총 RNA는 제조사 프로토콜에 따라 TRIzol 시약을 사용해 분리했으며, 샘플에는 혈청과 세포가 포함되었습니다. 역전사를 위해서는 제조사의 PrimeScript 역전사효소 프로토콜에 따라 각 반응마다 총 RNA 1 μg가 사용되었습니다. 역전사 완료 후, 반응 시약으로 SYBR-Green Real Master 믹스를 사용한 실시간 PCR 기기에서 증폭 반응이 수행되었습니다. 열 사이클링 매개변수는 다음과 같았습니다: 95 °C에서 30초간 초기 변성, 이후 95 °C에서 5초, 60 °C 30초 40회 변성. qRT-PCR은 모든 샘플에 대해 기술적 3중으로 수행되었습니다. miRNA 및 mRNA 수준을 정량적으로 검출하기 위해, 주기 임계값(Ct) 값을 내인성 기준으로 U6와 β-액틴을 사용해 정규화하였고, 최종 데이터 분석은 2-ΔΔCT 방법으로 정량화하였습니다. qRT-PCR에 사용되는 프라이머 서열은 보충 표 1에 제시되어 있습니다.

트리졸 시약은 유해 화학물질입니다. 매우 부식성이 강하다; 직접 접촉은 피부와 눈에 심한 화상을 입힐 수 있으며, 휘발성 연기는 호흡기를 자극할 수 있습니다. 화학물질 저항성 니트릴 장갑, 실험실 코트, 화학 방보 고글을 착용해야 합니다; 이 장치는 훈 후드에서만 사용할 수 있습니다. 폐액은 라벨이 붙은 밀봉된 플라스틱 화학 폐기물 용기에 보관되며, 현지 규정에 따라 적절히 처리됩니다.

세포 생존성 검사

세포 생존성은 세포 계수 키트-8(CCK-8)을 통해 평가되었습니다. 세포는 5× 103 셀/ 웰에서 96웰 플레이트에 도판되었습니다. 0, 24, 48, 72시간의 배양 시점에 각 웰에 10 μL의 CCK-8 용액이 첨가되었다. 세포를 37°C에서 1시간 배양한 후, 각 웰의 광학 밀도는 450nm로 측정되었습니다.

트랜스웰 분석

세포 이동 용량은 8 μm 크기의 세포막을 가진 트랜스웰 챔버를 사용하여 평가하였습니다. 간단히 10개의4 셀/우물은 혈청 무첨가 배지를 포함한 상부 삽입물에 5개× 주입되었고, 하부 삽입물에는 완전한 배지로 보충되었습니다. 챔버들은 37°C에서 24시간 동안 인큐베이션되었습니다. 이동하지 않고 상부 막 표면에 남아 있는 세포는 면봉으로 부드럽게 닦아냈다. 하부 표면으로 이동한 세포는 4% 포름알데히드로 10분간 고정시키고, 0.1% 결정 바이올렛으로 20분간 염색했습니다. 마지막으로, 막을 관통한 세포들을 광학 현미경으로 관찰하고 세기를 측정했습니다(×200). 각 모델마다 겹치지 않는 다섯 개의 시야를 무작위로 선택하여 세었습니다. 각 실험 그룹에서 이동하는 세포의 평균 수를 계산하고 기록하였다.

포름알데히드(발암물질, 피부/호흡기 자극제, 휘발성 유독성 유기 화합물). 휘발성 가스는 점막 자극, 피부염, 알레르기 반응을 일으킬 수 있습니다. 모든 작업은 반드시 환기가 잘 되는 연기 후드에서 이루어져야 합니다. 화학물질 저항 장갑, 실험실 코트, 안개 방지 고글, 활성탄 호흡기를 착용하세요. PFA를 포함한 폐기물은 유해 폐기물 규정에 따라 처리되어야 합니다. 폐기물은 지역 규정에 따라 처리해야 합니다.

크리스탈 바이올렛은 생물학적 염색입니다. 피부를 통해 흡수되면 독성이 있습니다; 장기적으로 환경에 해로운 영향을 미칩니다. 피부와의 직접적인 접촉과 무작위 분비물을 피하세요. 일회용 니트릴 장갑과 실험실 코트를 착용하세요.

효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)

IL-1β, IL-6, 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 수치는 제품 매뉴얼에 명시된 운영 지침에 따라 인간 ELISA 키트를 통해 측정하였습니다.

이중 루시퍼레이스 리포터 유전자 분석법

TargetScan 데이터베이스는 miR-215-5p의 후보 표적 유전자를 예측하는 데 활용되었습니다. miR-215-5p와 표적 유전자 EREG의 상호작용은 이중 루시퍼레이스 분석키트를 통해 분석되었으며, EREG의 야생형 및 돌연변이 서열을 증폭하여 pGL3 벡터에 클로닝하였습니다. 이후 합성된 재조합 플라스미드는 각각 mimic-NC 또는 miR-215-5p 모방으로 C28/I2 세포에 공동 형질전환되었습니다. 루시페라제 활동은 48시간 동안 잠복 후에 검출되었습니다.

RNA 면역침전(RIP)

miR-215-5p와 EREG의 상호작용은 EZ-Magna RIP Kit을 통해 검증되었습니다. 단계는 다음과 같았습니다: 먼저 세포를 RIP 용해액으로 용해했습니다. 이후 세포 용해액은 RIP 버퍼 내에서 항-아르고노트 2(Ago2) 또는 항면역글로불린 G(IgG) 항체(인간)와 결합된 자기 구슬과 함께 공동 인큐베이킹하였습니다. 그 후 RNA는 단백질분해효소 K로 처리되어 정제되었습니다. 마지막으로 qRT-PCR을 이용해 miR-215-5p 및 EREG 수치를 측정하였다.

통계

데이터 분석과 이미지 플롯은 SPSS와 GraphPad Prism을 사용하여 수행되었습니다. Shapiro-Wilk 검정은 통계 분석 전에 분포의 정규성을 평가하기 위해 적용되었습니다. 정규 분포 이후의 측정값은 평균 ± 표준편차(SD)로 표현되었습니다. 학생 t-검정은 2그룹 비교에 사용되었고, 분산 분석(ANOVA)과 투키의 사후 검정은 다중 그룹 분석에 사용되었습니다. 비정규분포 연속 변수는 중앙값과 2분위 범위(IQR)로 보고되어 Mann-Whitney U 검정으로 비교하였습니다. 범주별 변수는 백분율(n(%))으로 표현되었고, 집단 간 차이는 카이제곱 검정을 통해 조사되었습니다. miR-215-5p의 OA 진단 효능은 수신자 작동 특성(ROC) 곡선을 사용하여 평가하였습니다. miR-215-5p와 골관절염 환자의 임상 특성 간의 연관성을 카이제곱 검정을 통해 평가하였다. OA 발병 위험 요인은 다변수 로지스틱 회귀분석을 통해 조사되었습니다. miR-215-5p와 EREG의 연관성은 Spearman 상관분석을 통해 평가하였다. P < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

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결과

기본 특성

대조군에는 105명의 환자가 포함되었으며, 이 중 남성 58명(55.24%)과 여성 47명(44.76%)이 포함되어 있었으며, 평균 연령은 12.57세± 52.81세, BMI는 24.25± 2.71 kg/m 2였습니다. 골관절증 그룹은 110명의 환자로 구성되었으며, 남성 69명(62.73%)과 여성 41명(37.27%)이 있었으며, 평균 연령은 12.33세± 54.42세, BMI는 24.88± 3.51 kg/m 2였습니다. OA 그룹에 대한 추가 기초 정보는 표 1에 제시되었습니다.

골관절염 환자의 혈청에서 miR-215-5p의 발현 특성 및 진단 가치

OA 환자에서는 혈청 miR...

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토론

임상 환경에서 흔한 관절 질환인 골관절증은 당뇨병과 치매에 이어 세 번째로 중요한 유기적 장애 원인이 되었습니다22,23. 그러나 OA의 발병 기전은 복잡하며, 진단은 임상 증상, 영상 검사 및 기타 수단의 조합이 필요하며, 긴 진단 주기는 환자의 적시 치료를 심각하게 지연시킵니다. 따라서 골관절염 진단에 사용할 수 있는 바이오마커를 임상적으로 탐색하는 것이 중요합니다.

본 연구에서 miR-215-5p는 높은 발현을 보였다. 이 발견은 Xiong 등이 심근세포 손상 모델에서 miR-215-5p 증가를 관찰한 결과와 일치하며, 이는 본 연구 결과의 신뢰성을 더욱 뒷받침한다25. 현재까지 골관절증에서 miR-215-5p에 대한 임상 연...

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공개 사항

저자들은 이 글에서 다루는 어떤 자료에도 재정적 또는 소유권적 이해관계가 없습니다.

감사의 글

저자들은 이 연구를 위해 별도의 자금을 받지 않았습니다.

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재료

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이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
96-well platesCorning/USA3903
Anti-Ago2Abcam/USAAB_867543
RRID: ab186733
Anti-IgGAbcam/USAAB_10673832
RRID: ab133470
C28/I2 chondrocytesMerck Millipore/USASCC043
CCK-8 KitBeyotime/ChinaC0038세포 생존율 분석 키트
Crystal violetSigma-Aldrich/USAV5265
DMEM/F12 mediumGibco/USA11320033
Dual-Luciferase Reporter Assay KitPromega/USAE1910
EZ-Magna RIP KitMerck Millipore/USA17701
FBSThermo Fisher Scientific/USA26010074
FormaldehydeSigma-Aldrich/USAF8775
Graphpad Prism 9.0GraphPad Software Inc. /USAhttps://www.graphpad.com/features
IL-1βSigma-Aldrich/USASRP3083
IL-1β ELISA kitNanjing Jiancheng/ChinaH002-1-2
IL-6 ELISA kitNanjing Jiancheng/ChinaH007-1-2
IncubatorThermo Fisher Scientific/USABB150-2TCS-L
Inhibitor-NCGenePharma (custom synthesis) /Chinahttps://www.genepharma.com/
Light Cycler 480Roche/Switzerlandhttps://lifescience.roche.com/global/en/article-listing/article/lightcycler-480-system-technology.html실시간 PCR 기기
Lipofectamine 3000Invitrogen/USAL3000015세포 형질전환에 사용되는 형질전환제
Microplate readerThermo Fisher Scientific/USAVA000010C
MicroscopyNikon/Japanhttps://www.nikon.com.cn/sc_CN/
Mimic-NCGenePharma (custom synthesis) /Chinahttps://www.genepharma.com/
MiR-215-5p inhibitorGenePharma (custom synthesis) /Chinahttps://www.genepharma.com/
MiR-215-5p mimicGenePharma (custom synthesis) /Chinahttps://www.genepharma.com/
Opti-MEMGibco/USA31985070
pGL3 vectorPromega/USAE1751
PrimeScript Reverse TranscriptaseTakara/Japan2680역전사 키트
Si-EREGGenePharma (custom synthesis) /Chinahttps://www.genepharma.com/
Si-NCGenePharma (custom synthesis) /Chinahttps://www.genepharma.com/
SPSS 24.0IBM Corp/USAhttps://spssau.com/index.html
SYBR Green SupermixBio-Rad/USA1725121
TNF-α ELISA kitNanjing Jiancheng/ChinaH052-1-2
Transwell chamberCorning/USA3422
TRIzol reagentThermo Fisher Scientific/USA15596026RNA 분리 시약
```

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