제2형 당뇨병에서 유제놀과 레파글리나이드 간의 약물 간 상호작용과 그 잠재적 메커니즘

요약

이 연구는 제2형 당뇨병(T2DM) 환자에서 유제놀(EUG)과 레팔글리나이드(RPG) 간의 약물 간 상호작용 가능성을 탐구하는 것을 목표로 했습니다.

초록

이 연구는 제2형 당뇨병(T2DM)에서 유제놀(EUG)과 레파글리나이드(RPG) 간의 잠재적 약물-약물 상호작용(DDI)을 조사하였습니다. 고지방 식이와 스트렙토조토신(STZ)을 사용하여 T2DM 쥐 모델이 확립되었습니다. 단회 투여군은 0.4 mg/kg RPG를 투여받았고, 병용 투여군은 7일간 EUG(50, 100, 150 mg/kg)로 사전 치료를 받은 후 단일 RPG(0.4 mg/kg)를 투여했습니다. RPG의 혈당 및 약동학 매개변수를 쥐 혈장 샘플에서 평가하였다. EUG가 RPG 대사 안정성과 사이토크롬 P3A(CYP3A) 활성에 미치는 영향은 쥐 간 미량체(RLM)에서 평가되었습니다. T2DM 쥐 에서 RPG 치료는 저혈당 효과를 보였으며, 이는 EUG 병용 투여를 통해 용량 의존적으로 촉진되었습니다(p < 0.001). EUG 병용 투여는 곡선 아래 면적(AUC, 단일 RPG 대비 88.64%, 164.59%, 244.72% 증가, p < 0.001), 혈장 최대 농도(C_max, 단일 RPG 대비 18.61%, 53.58%, 77.63% 증가, p < 0.01), 최대 농도(최대 증가, EUG 공동 투여 1.0시간 대 단일 RPG 0.5시간 증가), 최대 농도(T_max, EUG 병용 1.0시간 증가, 단일 RPG 0.5시간 증가), 반감기(T_1/2, 단일 RP 대비 33.86%, 49.61%, 88.19% 연장), 평균 유지율(MRT, 17.62%, 26.42%, 단일 RPG 대비 44.04%, < 0.001), 그리고 제거율(Clz/F, 단일 RPG 대비 48.92%, 63.31%, 74.10% 감소, p < 0.001) 용량 의존적으로 감소했다. 시험관 내 RLM 연구에 따르면, EUG는 반감기를 연장(44.09 ± 3.25분)하고 내요소 제거율(30.55 ± 3.69 μL/min/mg 단백질)를 감소시켜 RPG의 대사 안정성을 향상시켰습니다. EUG는 또한_IC-50 1.79 μM± CYP3A의 활성을 억제했습니다. EUG의 공동 투여는 T2DM 쥐에서 RPG 전신 노출을 증진시켜 RPG의 저혈당 효과를 촉진했으며, 이는 RPG 대사 안정성 향상과 CYP3A 활성 억제를 통해 잠재적으로 작용할 수 있습니다.

서론

제2형 당뇨병(T2DM)은 인슐린 저항성 또는 인슐린 효율 저하를 특징으로 하는 만성 대사 장애로, 전 세계 수백만 명에게 영향을 미칩니다^. 유전적 감수성 및 생활습관 요인과의 복잡한 상호작용이 T2DM에 관여하며, 이는 포도당 흡수 장애, 과도한 간 포도당신생, 만성 저등급 염증을 초래합니다^. T2DM은 부적절하게 치료될 경우 심혈관 질환, 신장 질환, 망막병증, 신경병증 등 심각한 합병증을 초래할 수 있으며, 이는 환자의 삶의 질에 큰 영향을 미치고 사망률을 증가시킵니다^. 현재 T2DM의 약물 치료제로는 메트포르민, 설포닐루레아(sulfonylurea) 약물, GLP-1 수용체 작용제, DPP-4 억제제 등이 있습니다. 레파글리나이드(RPG)는 인슐린 분비를 자극하여 작용하는 단기 작용 메글리티나이드의 한 종류로, 용량 유연성⁴의 특성을 가지고 있습니다. 설포니루레아와 비교할 때, 글리니드는 식후 고혈당 조절에 우수한 효과를 제공하며, 저혈당과 같은 특정 부작용 위험을 줄이고, 특히 신부전 환자에서 더 유리한 안전성 프로필을 제공합니다 ^5,6. RPG는 경구 투여 후 빠르게 흡수되며, 보통 30분에서 60분 이내에 혈장 농도의 최고 농도에 도달하며, 짧은 반감기 때문에 인슐린 분비가 잠시 촉진됩니다. 임상적으로 RPG는 단독 요법으로 사용되거나 다른 경구용 항고혈당제와 병용하여 혈당 조절을 최적화합니다^. 그러나 임상 적용은 낮은 경구 생체이용률(약 56%), 빠른 간 대사, 그리고 저혈당 위험 8,9,10,11,12,13,14로 인해 제한됩니다. 이러한 단점들은 포괄적인 치료 전략의 필요성을 강조합니다.

유제놀(EUG)은 화학적으로 4-알릴-2-메톡시페놀로 알려져 있으며, 화학식은 C₁₀H₁₂O₂¹⁵의 유기 화합물입니다. EUG는 무색에서 연한 노란색 액체이며, 주로 정향(Eugenia caryophyllata Thunb.)과 기타 향향성 식물에서 발견되는 활성 페놀 화합물입니다¹⁶. EUG는 항산화, 항염증, 항균, 진통, 항^{종양 활성} 등 다양한 약리학적 특성으로 많은 주목을 받고 있습니다. 최근 연구들은 EUG가 T2DM에 대한 보조 치료제로서의 잠재적 가치를 입증했으며, 시험관 내외 및 생체 내 실험 증거 모두 EUG가 인슐린 감수성을 개선하고, 말초 조직에서 포도당 흡수를 촉진하며, 간 혈당생성을 억제하고, 췌장 β세포 기능을 보호한다는 것을 보여줍니다^20,21. 이러한 다면적인 조치들과 비교적 낮은 독성²²는 EUG를 전통적인 임상 약물의 한계를 보완하고 시너지 메커니즘을 통해 T2DM 관련 합병증을 완화할 수 있는 매우 유망한 천연 약물 후보로 자리매김합니다.

사이토크롬 P450 효소(P450s)는 약물 대사 과정에서 중요한 역할을 하며, 특정 아형을 유도하거나 억제함으로써 약물-약물 상호작용(DDIs)을 매개하여 안전하고 효과적인 약물 치료에 매우 중요합니다²³. 특히 RPG는 주로 CYP2C8과 CYP3A4에 의해 간에서 대사됩니다^24,25. QCT와 함께 투여할 때, QCT는 CYP450s 26을 통해 간 1차 통과 및 전신 대사를 억제하여 RPG의 생체 내 생체이용률을 높인다. EUG는 1A2, 2C9, 2D6, 3A4를 포함한 CYP450의 활성을 농도에 따라 억제하는 것으로 보고되었으며, 이는 EUG가 이들 효소에 의해 대사되는 약물과 함께 투여될 때 잠재적 상호작용이 있음을 시사한다²⁷. EUG가 T2DM의 보조 치료제로서 유망한 잠재력을 가지고 있으며, RPG가 CYP 매개 DDIs에 취약하다는 점이 알려져 있음에도 불구하고, EUG가 RPG의 전신 노출, 대사 안정성 또는 CYP3A 매개 대사에 영향을 미치는지는 여전히 불분명합니다. EUG와 RPG가 임상 실무나 건강보충제 환경에서 동시에 투여될 가능성이 높기 때문에, 두 약물 간 DDI 데이터가 부족해 RPG 혈장 농도에 의도치 않은 변화가 발생할 수 있는 잠재적 위험이 있습니다. 이러한 변화는 치료 효과 저하나 저혈당 위험 증가로 이어질 수 있습니다. 따라서 이러한 증거 공백은 천연 제품과 기존 항당뇨제의 합리적이고 안전한 조합에 중대한 장애물이 됩니다. 따라서 EUG가 RPG의 약동학 및 약리역학에 미치는 영향을 체계적으로 평가하고, 특히 CYP3A 활성에 중점을 두고 근본적인 대사 기전을 밝히는 것이 필수적입니다. 위의 증거를 고려할 때, EUG가 CYP450 활성을 변화시켜 RPG 대사에 영향을 미칠 수 있다고 추측할 수 있습니다. 이 연구는 T2DM 환경에서 EUG–RPG 상호작용을 조사한 최초의 연구입니다. 이 연구 결과는 중요한 지식 공백을 메우고 T2DM 관리에서 EUG와 RPG의 안전한 공동 관리를 최적화하는 메커니즘적 기반을 제공할 것으로 기대됩니다. 동시 투여를 고려할 경우 RPG 노출 증가 가능성을 고려해야 하며, 특히 EUG를 고용량이나 농축 보충제로 복용할 경우 저혈당 징후를 모니터링해야 합니다. 또한, 쥐는 인간 CYP3A4와 기능적으로 유사한 CYP3A 아이소폼을 발현하지만, 종 간 효소 발현과 촉매 활성의 차이로 인해 정량적 결과를 인간에게 직접 적용하는 것은 주의가 필요합니다.

프로토콜

이 연구는 ARRIVE 지침에 따라 지림 중의학과학원 윤리위원회(날짜: 2024.11.21/No.2024112)의 승인을 받았습니다²⁸. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 동물 사육 조건

수컷 스프래그-도울리 쥐(200–250g)는 실험동물실에서 다음과 같은 조건으로 방치되었습니다: 온도: 22 °C ± 2 °C, 상대 습도: 40–60%, 12시간의 밝고 어둠 주기, 그리고 일주일간 고산 적응을 위해 자유롭게 먹이와 물을 사용할 수 있는 조건이 있었습니다 ^29,30.

2. 동물 모델링, 처리 및 샘플 처리

표본 크기는 F 검정(G*Power 3.1.9.7)을 이용한 검정력 분석을 기반으로 산출되었습니다. 사전 검정권 분석은 효과 크기 0.6, α 수준 0.05, 원하는 검정력 0.8로 수행되어 총 표본 크기는 55개였습니다. 이 계산에 따르면 그룹당 최소 9마리의 쥐가 필요하다고 나타났습니다. 따라서 그룹당 10마리의 쥐가 사용되어 실제 검정력은 0.86을 달성했다.

T2DM 모델이 확립되기 전에는 모든 쥐가 12시간 단식을 했습니다. 그 후 무작위로 두 그룹으로 나뉘었습니다: 대조군(n = 10)과 T2DM 그룹(n = 50). T2DM 쥐 모델의 확립은 이전에 보고된^방법에 따라 수행되었습니다. 간단히 말해, T2DM 그룹의 쥐들은 4주 연속 고지방(지방 함량 60%)을 먹인 후, 멸균 시트레이트 버퍼(pH 4.4)에 용해된 30 mg/kg의 STZ 복막 내 주사를 한 번 투여받았습니다. STZ 주사 3일 후, 혈당 측정기를 이용해 쥐의 꼬리 정맥 혈당을 측정했으며, 혈당 농도가 16.7 mmol/L을 초과하는 쥐는 T2DM을 성공적으로 확립한 것으로 간주되었습니다. 대조군에서는 쥐들이 정상적인 식단을 받고 2형 당군과 같은 시기에 0.9% 정상 식염수 복강 내 주사를 받았습니다.

T2DM 쥐는 각 그룹에 10마리씩 4개 그룹으로 추가로 나뉘었는데, T2DM + RPG 그룹(단일 RPG), T2DM + RPG + EUG (50 mg/kg) 그룹(공동 RPG+EUG 50 mg/kg), T2DM + RPG + EUG (100 mg/kg) 그룹(공동 RPG+EUG 100 mg/kg), T2DM + RPG + EUG (150 mg/kg) 그룹(공동 RPG+EUG 150 mg/kg)입니다. 12시간 금식 후, 단일 RPG 그룹의 쥐들은 0.4 mg/kg RPG(생리식염수에 현탁된 상태)를 가베지 바늘 26을 통해 경구 투여되었습니다. 공동 투여 그룹의 쥐들은 각각 7일 연속 하루 1회 50, 100, 150 mg/kg 심외도를 경구로 투여받았으며, 8일째에는 추가로 12시간 단식 후 공동 투여군에 위내 개고지를 통해 0.4 mg/kg RPG를 추가로 투여했습니다. 이후 꼬리 정맥에서 채취한 혈액 샘플을 사용하여 혈당 지표를 평가하였습니다.

약동학 분석을 위해 혈액 샘플(0.2mL)은 쥐의 후방 안와정맥신경총에서 다양한 시점(투여 후 0.25시간, 0.5시간, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간)에 헤파린화된 마이크로 원심분리관으로 채취되었습니다. 채취 후, 샘플은 원심분리(1500 × g, 10분, 4 °C)하여 혈장(연한 노란색, 투명함)을 분리했으며, 분석할 때까지 -80 °C에 보관되었습니다. 이후 4단계에서 설명한 HPLC 방법을 사용하여 혈장 샘플의 RPG 농도를 분석하였습니다.

3. 모인 쥐 간 미세체체에서의 대사 연구

생 체 내 약물동학 변화의 기전을 조사하기 위해, EUG가 RPG 대사 안정성과 CYP3A 활성에 미치는 영향을 RLM에서 평가하였다. RPG(3 μM)는 37 °C의 PBS 버퍼에서 EUG 유무 여부와 함께 배양했으며, 총 부피는 200 μL로 RLM(0.5 mg/mL 미세염체 단백질)과 NADPH 재생 시스템(1.3 mM NADP, 3.54 mM 포도당 6-인산, 0.4 U/mL 포도당 6-인산 탈수소효소, 3.3 mM MgCl₂)을 포함했습니다. NADPH 없이 37°C에서 5분간 사전 배양한 후, NADPH 재생 시스템을 추가하여 반응을 시작했습니다. 혼합물은 37°C에서 진동하는 물에서 배양되었다. 서로 다른 배큐 시점(0분, 5분, 15분, 30분, 45분, 60분)에서 30 μL 샘플을 수집하여 얼음처럼 차가운 아세토니트릴이 포함된 마이크로 원심분리관으로 옮겨 반응을 종료했습니다. 샘플은 원심분리(12000 × g , 4 °C에서 10분간 원심분리하여 상청액(투명)을 얻었습니다. 생성된 상청액은 4단계에서 설명한 동일한 HPLC 방법으로 RPG 농도를 분석했습니다.

4. HPLC 분석

혈장 내 RPG 농도(2단계부터)와 미소체체 배양(3단계부터)은 Kim 등이 보고한 HPLC 방법으로 분석하^였다. 구체적인 작업 단계는 다음과 같습니다: 샘플(120 μL)은 케토코나졸 함유 300 μL 아세토니트릴(내부 표준 100 ng/mL)과 혼합하여 단백질 침전을 달성했습니다. 그 후 혼합물을 15000 × g 에서 4 °C에서 10분간 원심분리하여 소용돌이로 가열했습니다. 상청액은 마이크로컬럼 원심분리관으로 옮겨져 질소 대기 하에서 25°C로 증발했습니다. 건조 후 잔류물은 50 μL 이동상으로 재용해한 후 소용돌이 및 원심분리되었습니다. 이후 상액 40 μL가 HPLC 컬럼(250 mm × 4.6 mm, 입자 크기 5 μm)에 주입되었습니다. 컬럼은 25°C에서 등크라틱 용출 모드로 10 mM 인산 완충제(pH 6.0)와 아세토니트릴(부피비 46.4: 53.6)을 사용하여 분당 1mL의 유량으로 용출되었습니다. 용출액은 240 nm 여기 파장의 형광 검출기를 사용해 모니터링되었습니다.

5. 통계 분석

약동학 분석 소프트웨어를 사용하여 AUC,_{C max}, T_max, t_1/2, MRT, 클리어런스 등 약물동학 매개변수를 계산하였습니다. 통계 분석 및 그래프 작성 소프트웨어가 도표 생성과 데이터 분석을 위해 사용되었습니다. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 제시되었습니다. 그룹 간 차이는 적절히 1원 ANOVA(혈당 수치 비교용) 또는 2방향 ANOVA(약동학 매개변수 비교용)로 분석되었으며, 다중 비교를 위해 Tukey의 사후 검정을 사용하였습니다. EUG가 CYP3A 활성에 미치는 영향은 비선형 회귀분석을 통해 평가하였다. p 값 0.05< 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

RLM에서 EUG의 RPG 대사 안정성에 대한 반감기는 다음과 같이 계산되었습니다:
t_1/2 (분) = 0.693/ln(C_t/C₀ × 100).

내인성 제거율(μL/min/mg 단백질) = v × 0.693/t_1/2;
v (μL/mg) = 배양 부피/단백질 농도.

결과

EUG는 T2DM 쥐에서 RPG의 저혈당 효과를 촉진했습니다
T2DM 그룹의 쥐 혈당 수치는 대조군에 비해 상승하여 (p < 0.001, 95% 신뢰구간: -13.90~-11.32)하여 T2DM 모델의 성공적인 수행을 나타냈다(그림 1A). 단일 RPG 투여로 T2DM 쥐의 혈당 수치가 억제되었습니다(p < 0.001, 95% 신뢰구간: 5.26~7.84). RPG와 EUG의 병용 투여는 단일 RPG 투여 시 T2DM 쥐와 비교했을 때 용량 의존적으로 T2DM 쥐의 혈당을 더욱 감소시켰습니다(p < 0.001, EUG 50 mg 95% CI: 2.01~4.59; EUG 100mg 95% CI: 4.12~6.70; EUG 150mg 95% CI: 5.12~47.70).

토론

T2DM은 장기 치료가 필요한 만성 대사 질환으로, 심혈관 질환과 신^{장 질환 등} 기저 질환으로 인해 여러 약물을 복용해야 하는 경우가 많습니다. DDI의 위험은 약물 병용 시 크게 증가하는데, 이는 저혈당제의 흡수, 대사 또는 효능에 영향을 줄 수 있으며, 이는 저혈당 혼수상태나 통제 불가능한 혈당 수치와 같은 급성 위험으로 이어질 수 있습니다^. 또한 장기 손상을 악화시키고 합병증의 진행을 가속화할 수 있습니다³⁴. 따라서 DDI 평가는 제2형 당뇨병 환자의 부작용 예방과 안정적인 혈당 유지를 위한 전제 조건일 뿐만 아니라, 합병증 발생률을 줄이고 환자의 장기 예후를 개선하는 중요한 수단으로, 약물 병용 투여의 안전성을 보장하는 데 있어 DDI 평가의 필수적 역할을 강조합니다.

STZ는...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아세토니트릴	Merck, Germany	34851	≥99.9%
크로마토그래피 컬럼	Phenomenex, USA	00G-4041-E0	250 mm × 4.6 mm, 입자 크기 5 μm
DAS	Beijing Bozhiyin, China	-	3.0
EUG	MUST Bio-technology, China	A0074	순도 ≥99%
GraphPad Prism	GraphPad Software, USA	-	9.0.0
고성능 액체 크로마토그래피	Shimadzu Corporation, Japan	228-45147-42	RF-20A
케토코나졸	Merck, Germany	K1003	순도 99.0-101.0%
남성 Sprague-Dawley 쥐	Shanghai Animal Center, China	-	200–250 g
NADPH	Merck, Germany	10107824001	97% (건조 중량)
OneTouch Ultra2 혈당 계	Life Scan Inc., USA	https://shop.onetouch.com/onetouch-sup-reg-sup-ultra-sup-reg-sup-2-meter/product/OTSUS05_0019	-
PBS	Merck, Germany	P4474	ph 7.4
RLM	Merck, Germany	M9066	-
RPG	Merck, Germany	R9028	순도 ≥98%
STZ	Merck, Germany	S0130	≥98% (HPLC)
EUG, 유젠올; RPG, 레파글리니드; RLM, 쥐 간 미세소체; NADPH, β-니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오타이드 인산; STZ, 스트렙토조토신; PBS, 인산 완충 식염수.