방법 논문

쥐의 경추증에 대한 도침 요법: 모델 구축 및 중재를 위한 시각화 프로토콜

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DOI:

10.3791/72132

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2026년 9월 3일

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1School of Acupuncture, Moxibustion and Tuina, Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of Dermatology, Beijing Tsinghua Changgung Hospital, School of Clinical Medicine, Tsinghua Medicine, Tsinghua University, 3Acupuncture and Moxibustion Clinic, Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 연구는 쥐의 경추증 모델링 방법과 도침 요법 중재 전략을 상세히 설명하여 관련 연구를 위한 시각화된 조작 프로토콜을 제공합니다.

초록

경추증(Cervical spondylosis, CS)은 만성 퇴행성 질환입니다. 경추 추간판의 퇴행성 변화와 그에 따른 병리적 변화는 주변 조직과 구조에 영향을 미치며, 이는 목 통증, 강직, 가동성 제한, 그리고 때로는 상지의 감각 저하 및 방사통과 같은 임상 증상으로 이어집니다. 이 중 신경근 압박이 가장 흔하게 나타납니다. 따라서 본 연구에서는 경추 신경근 압박을 통해 유도된 CS 쥐 모델을 구축하였습니다. 도침 요법은 국소 연부조직 유착을 해소하고 신경 압박을 완화함으로써 CS의 임상 치료에서 잠재적 효과를 보여주었습니다. 그러나 현재 동물 실험에서 시각화된 절차 프로토콜이 부족한 실정입니다. 본 연구는 CS 쥐 모델 구축을 위한 신뢰할 수 있는 방법과 그에 따른 도침 중재 프로토콜에 대한 상세한 설명을 제공합니다. 본 절차에서 우리는 모델 유도 과정, 도침 조작 단계, 치료 부위 선정, 쥐 보정 기술 및 주요 주의 사항에 대해 상세히 설명합니다. 또한, 본 연구에서는 근전도(EMG)를 사용하여 CS 모델의 성공적인 구축을 확인하였으며, 기계적 회피 역치, 보행 분석 및 신경근 조직 병리학을 통해 중재 효과를 평가하였습니다. 본 연구는 CS 쥐 모델 구축 및 도침 중재를 위한 참고 자료를 제공할 뿐만 아니라, 향후 작용 기전을 조사하는 연구를 위한 체계적이고 실행 가능한 실험적 틀을 제공합니다.

서론

경추증(Cervical spondylosis, CS)은 흔한 퇴행성 척추 질환입니다. 핵심 병리 과정은 추간판의 퇴행에서 시작되며, 이는 추간 공간 협착, 골극 형성, 인대 비대 등 일련의 이차적 병리 변화를 유발합니다1,2. 이러한 병리적 변화는 목과 어깨의 뻐근함과 통증, 상지의 방사성 저림과 같은 다양한 임상 증상을 초래합니다. 심한 경우 운동 기능 장애나 심지어 사지 마비를 포함한 신경학적 손상이 발생할 수 있습니다2,3. 특히 최근 몇 년 사이 경추증의 발생률이 점차 증가하고 발병 연령이 낮아지면서 상당한 사회경제적 부담이 되고 있습니다4. 경추 추간판의 퇴행과 골극 증식은 인접한 뼈 및 연부 조직 구조를 침범하여 경추 척수강이나 추간공의 협착을 일으키고, 결과적으로 경추 신경근, 척수 및 척추 동맥을 포함한 주변 구조물을 압박할 수 있습니다1,2,3,4. 이 중 경추 신경근 압박이 가장 빈번하며, 전체 CS 사례의 약 60%–70%를 차지합니다5,6,7. 임상에서는 물리치료, 약물 중재 및 수술을 포함한 여러 치료법이 사용 가능하지만, 수술적 절차는 높은 비용, 상당한 외상 및 불확실한 수술 후 결과로 인해 대부분의 환자에게 비수술적 치료가 선호되는 옵션이 되었습니다4. 현대 의학 실무에서는 비스테로이드성 항염증제와 신경영양제가 흔히 사용됩니다. 이러한 약물들은 어느 정도 통증을 완화하고 질병의 진행을 늦출 수 있지만, 소화기계 손상 및 신장 손상과 같은 부작용이 동반됩니다8,9.

도침 요법은 전통 중의학의 침구 이론을 바탕으로 현대의 최소 침습 수술 기법을 결합하여 개발된 특징적인 치료 방식입니다. 이는 연부 조직의 유착을 박리 및 해소하고, 국소 염증 인자를 조절하며, 지역 미세 순환을 개선함으로써 효과를 나타냅니다10,11,12. 최근 몇 년 동안 경추증에 대한 도침의 임상적 효능이 널리 인정되었으며, 신경 압박 완화, 통증 경감 및 경추 운동 기능 개선에 있어 유망한 잠재력을 보여주었습니다13,14. 그럼에도 불구하고 동물 실험에 적용할 때, 도침 중재는 부정확한 위치 선정과 조작 깊이 제어의 어려움과 같은 과제에 직면해 있습니다. 한편, 이러한 임상적 관찰을 강력한 근거 기반의 결론으로 전환하기 위해서는 안정적이고 재현 가능한 동물 모델의 구축이 필수적인 전제 조건입니다. 척추 내 나일론 봉합사 방법은 추간공에 나일론 봉합사를 삽입하여 직접적인 기계적 압박을 유도함으로써, 임상적 신경근 압박의 병태생리학적 과정을 정밀하게 모사합니다15. 이러한 모델링 접근 방식은 모델링 주기가 짧고 압박 분절을 조절할 수 있다는 장점 또한 제공합니다15. 그러나 그 수술 절차는 상당 부분 개인의 경험에 의존하고 있으며, 상세하고 시각화된 조작 설명이 현재 부족한 실정입니다.

본 연구는 경추증 쥐 모델의 구축과 침도요법 중재의 전 과정에 대한 완전하고 상세하며 시각화된 실험 프로토콜을 제시합니다. 마취제가 기계적 회피 역치 측정에 영향을 주어 결과적으로 실험 결과에 간섭을 일으킬 수 있으므로16,17,18,19, 본 연구에서는 전용 쥐 보정 장치를 채택하였습니다. 본 논문은 쥐 모델 유도 과정, 단계별 침도 조작, 치료 부위의 정밀한 위치 선정, 쥐의 보정 및 고정 방법, 그리고 기타 주요 실험적 주의 사항에 대해 상세히 설명합니다. 기계적 회피 역치 측정, 전기생리학적 기록, 보행 분석 및 신경근 조직병리학적 관찰을 포함한 다각적인 평가 차원이 도입되었습니다. 본 연구는 경추증 쥐 모델의 모델 유도 및 침도 중재를 위한 시각화된 프로토콜을 제공함으로써, 기전 연구와 경추증 치료에 있어 침도요법의 효능 평가를 위한 방법론적 근거를 제공하는 것을 목표로 합니다.

프로토콜

모든 실험 절차는 Beijing MDKN Biotech Company의 실험동물윤리위원회의 검토 및 승인을 받았으며 엄격하게 모니터링되었습니다(승인 번호: MDKN-2025-096). 모든 프로토콜은 미국 국립보건원(NIH)에서 발행한 실험동물 관리 및 사용 가이드라인을 엄격히 준수하여 수행되었습니다. 본 연구에 사용된 시약과 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 실험 동물 및 그룹

  1. 체중이 230.0 g ± 20 g인 성체 수컷 Sprague–Dawley (SD) 랫드를 선택하여 실험에 포함시킵니다.
  2. 동물을 전용 실험동물 시설에 수용합니다.
  3. 주변 온도는 24 °C ± 2 °C, 상대 습도는 50%–60%로 유지하며, 12시간 명/암 주기로 관리합니다. 연구 기간 동안 표준 사료와 물을 ad libitum으로 제공합니다.
  4. 7일간의 적응 기간 후, 24마리의 랫드를 네 그룹(그룹당 n = 6)으로 무작위 배정합니다: 정상 대조군(Control), 위수술군(Sham), CS 모델군(Model), 그리고 침도자절개술(acupotomy)군입니다. 실험 설계의 타임라인은 그림 1에 나타나 있습니다.

2. CS 모델의 구축

참고: 모델링 전 12시간 동안 모든 쥐에게 음식과 물을 제공하지 마십시오. 체중을 측정하고 기록합니다. 모든 수술 기구는 고압 증기 멸균기로 멸균합니다(그림 2A).

  1. 수술 1일 전에 나일론 실을 직경 0.5mm, 길이 약 1cm의 조각으로 절단하여 준비한다. 필라멘트를 75% 에탄올에 4시간 동안 담근 후 멸균 조건에서 건조시키고, 조직 접착력을 높이기 위해 0.1% poly-L-lysine 용액에 8시간 동안 담근다.
  2. 쥐를 유도 챔버에 넣습니다. 4% isoflurane으로 마취를 유도한 후, 1.5%~2.0% isoflurane으로 마취 상태를 유지합니다. ~을 통해 안면 마스크를 착용시킵니다. (기관에서 승인된 프로토콜에 따라) 동물을 복와위로 고정합니다.
  3. 수술 부위를 완전히 노출시키기 위해 경추 등쪽 부위를 면도한다. 포비돈 아이오딘을 사용하여 수술 부위를 안쪽에서 바깥쪽으로 3회 소독하고, 75% 에탄올로 소독 과정을 반복한다.
  4. 쥐의 등 쪽에서 가장 높게 솟은 가시돌기(T2)를 촉진하여 표시합니다. T2 가시돌기 정점에서 머리 쪽으로 약 3cm 길이의 정중선 등 피부 절개를 가합니다. 피하 조직과 후경부 근육을 둔성 박리합니다.그림 2B).
  5. C5에서 T1까지 좌측 척추궁을 완전히 노출시키고, 그 위에 덮인 근육 및 결합 조직을 철저히 긁어냅니다(그림 2C).
  6. 마이크로포셉을 사용하여 C6–C7 및 C7–T1 추간 공간의 황색인대와 결합 조직을 조심스럽게 절개합니다. 모스키토 포셉으로 C7의 왼쪽 척추궁을 열어 척수를 노출시킵니다.
  7. 안과용 신경 박리기로 척수를 오른쪽으로 조심스럽게 견인합니다. 미세 수술용 핀셋을 사용하여 척수의 세로축을 따라 C6–C7 및 C7–T1 신경근 아래에 멸균된 나일론 실을 배치하며, 척추 정맥 손상을 방지하기 위해 과도한 압박을 피합니다.
    참고: 샴(sham) 군에서는 나일론 실을 삽입하지 않고 동일한 해부학적 부위의 척수를 노출시키십시오.
  8. 시술이 완료되면 절개 부위를 층별로 봉합하여 폐쇄하십시오.
  9. 설정 온도가 유지되는 항온 가열 패드로 쥐를 옮깁니다. 37 °C및 의식이 완전히 회복될 때까지 활력 징후를 모니터링합니다.
  10. 수술 후 감염 예방을 위해 페니실린 나트륨 용액 50,000단위를 뒷다리에 근육 주사하십시오. 수술 후 회복을 위해 동물을 원래의 케이지로 돌려보내십시오.

3. 보정 절차

  1. 쥐를 검은색 구속용 메쉬 슬리브로 고정합니다.
  2. 나일론 케이블 타이 두 개를 플라스틱 프레임에 고정합니다. 상단 케이블 타이는 겨드랑이 부위에, 하단 케이블 타이는 골반 부위에 고정합니다(그림 3B).
    참고: 크기가 200 mm × 300 mm × 5 mm인 플라스틱 판을 사용하며, 이 판은 긴 모서리를 따라 10 mm 간격으로, 짧은 모서리를 따라 3 mm 간격으로 20 mm × 4 mm 슬롯이 뚫려 있어야 하며, 중앙과 네 모서리에 5개의 지지대가 장착되어 있어야 합니다(그림 3A).
  3. 모델 유도 후, 모든 그룹의 각 쥐에 대해 위의 구속 절차를 3일 연속으로 반복하여 충분한 순응이 이루어지도록 합니다. 각 구속 세션은 하루 최소 5 min 동안 유지합니다.

4. 도침 치료

  1. 모델 구축 후 4일째에 도침 요법 중재를 시작한다.
  2. 일회용 멸균 도침(직경: 0.40 mm; 길이: 40 mm)을 준비한다.
  3. 수술 부위를 완전히 노출시키기 위해 경추 부위의 털을 제거한다.
  4. 경추 극돌기 양측의 연부 조직을 촉진하여 경결된 결절이나 끈 모양의 구조물을 확인한다. C6 또는 C7에서 극돌기 지점 하나를 결정한 다음, 이 극돌기의 양측으로 약 0.5 cm 떨어진 지점에 추가로 두 지점을 잡는다.
  5. 이 세 지점을 도침 자입점으로 지정하고 표시한다(그림 3C).
  6. 표시된 자입점을 의료용 포비돈 요오드로 소독한 후 75% 의료용 에탄올로 소독한다.
  7. 자입 시 도침의 절단면을 후방 정중선과 평행하게 맞추고, 침체는 후방 경추 관상면에 수직을 유지한다.
  8. 오른손 엄지와 검지로 도침을 안정적으로 잡은 상태에서, 왼손 엄지로 자입 부위를 가볍게 압박한다. 피하 조직을 수직 방향으로 빠르게 관통한 후, 골 표면에 도달할 때까지 침을 천천히 전진시킨다.
  9. 병변 부위 내에서 수직 범위 1 mm 이내로 제한하여 국소 세로 절개를 3회, 가로 연부 조직 박리를 2회 실시한다. 조작이 완료되면 침을 뽑는다(그림 3D).
  10. 지혈을 위해 자입 부위를 3분 동안 강하게 압박한다. 도침 중재는 5일마다 1회씩, 총 3회 실시한다.
    참고: 도침군을 제외한 나머지 세 그룹은 어떠한 치료적 중재도 받지 않는다. 다만, 이 그룹의 동물들도 도침군과 동일한 방식으로 동일한 시간 동안 고정된다.

5. 기계적 회피 역치 (MWT) 테스트

참고: 쥐 및 마우스용 발바닥 기계적 통증 자극기를 사용하여 모델 구축 수술 전날, 수술 후 3rd일 및 14th일에 측정을 수행하십시오.

  1. 24 °C ± 2 °C로 유지되는 조용한 환경에서 금속 메시 바닥 위에 놓인 투명한 테스트 챔버에 각 쥐를 넣습니다.
  2. 쥐가 챔버 내에서 최소 5분 동안, 또는 탐색 및 그루밍 행동이 대부분 가라앉을 때까지 적응하도록 합니다.
  3. von Frey 필라멘트의 끝을 왼쪽 앞발 바닥면의 세 번째와 네 번째 중수골 사이에 수직으로 위치시킵니다. 발을 빠르게 떼거나, 핥거나, 흔드는 반응이 나타날 때까지 금속 메시를 통해 아래에서 자극을 가합니다.
  4. 발을 떼는 순간에 표시된 값을 기계적 통증 역치로 기록합니다.
  5. 각 쥐의 테스트가 끝나면, 다음 행동 테스트에 영향을 줄 수 있는 잔류 냄새를 제거하기 위해 75% 의료용 알코올로 금속 메시 바닥과 챔버 내벽을 철저히 닦아낸 후 깨끗한 거즈로 건조시킵니다. 장치가 완전히 건조된 후에만 다음 쥐를 넣습니다.
    ​참고: 모든 쥐를 순차적으로 교대로 세 라운드 동안 테스트합니다. 동일한 쥐의 두 번의 연속적인 MWT 측정 사이에는 최소 10분의 간격을 둡니다. 세 번의 측정값 평균을 각 쥐의 최종 MWT 값으로 사용합니다.

6. 근전도(EMG) 기록

참고: 모델 구축 후 3일 차에 생체 신호 수집 및 분석 시스템을 사용하여 휴지기 EMG를 수행하십시오.

  1. 이소플루레인 흡입(유도 농도 3%~4%, 유지 농도 1.5%~2.0%)으로 쥐를 마취합니다. 실험대 위에 동물을 복와위로 고정하고 왼쪽 전지를 완전히 노출시킵니다.
  2. 기록 전극의 리드선을 지정된 획득 채널에 연결하십시오. 획득 소프트웨어를 실행하고, 다음을 선택하십시오. 근전도(EMG) 신호 모드를 설정하고, 샘플링 주파수를 20 kHz로, 밴드패스 필터 범위를 15 Hz–5 kHz로 설정한다.
  3. 75% 의료용 에탄올에 적신 탈지 솜을 사용하여 왼쪽 앞다리 근육(요측수근굴근, 척측수근굴근, 상완이두근 및 상완삼두근)을 소독하십시오.
  4. 바늘 기록 전극을 근복에 수직으로 삽입하되, 근섬유의 방향과 직교하도록 배치하십시오. 기준 전극으로 사용할 두 번째 바늘 전극을 3~5mm 떨어진 곳에 삽입하고, 접지 전극을 꼬리 기저부에 삽입하십시오.
  5. 바늘 삽입 직후의 삽입 활성도를 관찰하십시오. 삽입 전위가 사라지고 근육이 완전히 이완되면, 쥐마다 1분 동안 휴식기 EMG 신호를 기록하십시오.
    주의: 기록 전 과정 동안 조용한 환경을 유지하고 외부 전자기 간섭을 최소화하십시오. 일반적인 간섭으로는 교류 전원에 의한 전원 주파수 간섭과 다른 실험 장비에서 발생하는 고주파 노이즈가 있으며, 이는 근전도에 중첩되는 규칙적인 사인파 형태로 나타납니다. 이러한 간섭은 접지, 필터 설정 및 환경 관리를 통해 줄일 수 있습니다.
  6. 모든 바늘 전극을 조심스럽게 제거하고 쥐를 홈 케이지로 옮겨 마취에서 자연적으로 회복되도록 합니다.
  7. 각 쥐의 EMG 기록을 마친 후, 탈지 솜을 사용하여 75% 의료용 에탄올로 바늘 전극을 세척하고 멸균 거즈로 완전히 건조시켜 교차 오염을 방지하십시오.

7. 쥐의 보행 분석

참고: 침도요법 중재를 완료한 다음 날(모델 수술 후 수술 후 15일째)에 보행 분석을 수행하십시오. 보행 분석 시스템은 투명 벨트가 장착된 트레드밀, 벨트 아래에 위치한 고속 디지털 카메라 및 컴퓨터 워크스테이션으로 구성됩니다.

  1. 쥐를 트레드밀 트랙 위에 놓고 3분 동안 자유롭게 적응하도록 합니다.
  2. 트레드밀 벨트를 작동시키고, 쥐가 탐색 행동 없이 안정적인 보행을 보일 때까지 속도를 5.0 cm/s부터 점진적으로 높입니다.​
  3. 고속 카메라를 사용하여 쥐의 복측(하단 뷰) 보행 영상을 10초 동안 촬영합니다.
  4. 각 쥐의 테스트가 완료되면, 이후의 행동 평가에 영향을 줄 수 있는 잔류 냄새를 제거하기 위해 트레드밀 벨트와 테스트 챔버를 75% ethanol로 철저히 닦아냅니다. 다음 쥐를 투입하기 전 벨트를 완전히 건조시킵니다.
  5. 녹화된 영상을 분석 소프트웨어로 불러옵니다. 소프트웨어를 사용하여 각 사지의 발바닥 접지 위치를 식별하고 일련의 보행 파라미터를 추출합니다.
  6. 자동 분석이 완료되면, 이후 통계 분석을 위해 보행 파라미터 데이터를 내보냅니다.
  7. 본 연구에서는 다음의 보행 파라미터를 포함합니다: 왼쪽 앞발의 평균 접지 면적(전체 지지기 동안 발자국 크기의 평균), 왼쪽 앞발의 최대 지지 면적(전체 지지기 동안 발자국의 최대 크기), 그리고 왼쪽 앞발의 지지 압력(보행 분석 시스템에 기록된 지지기 동안의 상대적인 발바닥 압력 강도를 반영함).
    ​참고: 각 쥐당 3회의 유효한 보행 시퀀스를 확보하고, 3회 측정값의 평균을 분석에 사용하십시오.

8. 신경근 조직의 HE 염색

참고: 모델 수술 후 15일째에 행동 테스트를 수행한 다음, HE 염색을 위한 신경근 조직 샘플을 수집하십시오.

  1. 2% sodium pentobarbital (0.3 mL/100 g)을 복강 내 주사하여 쥐를 마취시킨 후, paraformaldehyde로 심장 관류 고정을 수행합니다.
  2. C6–T1 척수 신경근을 적출하여 4 °C의 4% paraformaldehyde에 48시간 동안 담가 후고정합니다.
    주의: paraformaldehyde는 자극성 물질이므로 환기가 잘 되는 환경이나 화학 흄 후드 내에서 취급하십시오.
  3. 고정된 신경근 조직을 흐르는 수돗물에 1시간 동안 씻어 잔류 고정액을 제거합니다.
  4. 조직을 단계별 에탄올 탈수 처리하고, xylene (I)과 xylene (II)에서 순차적으로 투명화한 후, 파라핀에 매립하여 3–5 µm 두께로 절편을 만듭니다. 절편을 65 °C에서 건조시킵니다.
  5. 절편을 xylene (I)과 xylene (II)에서 각각 8분씩 순차적으로 탈파라핀 처리합니다. 단계별 에탄올 시리즈(100% 15분, 95% 5분, 80% 5분, 70% 3분)를 통해 절편을 재수화시킨 후, 증류수에 2분 동안 담급니다.
  6. 절편을 hematoxylin 용액으로 5초 동안 염색한 후, 흐르는 물에 2분 동안 씻어 과잉 염색약을 제거합니다.
  7. 증류수에서 30초 동안 절편을 분별 염색합니다. 절편을 70% 에탄올에 10초, 이어서 80% 에탄올에 10초 동안 담급니다.
  8. 절편을 eosin 용액으로 4분 동안 염색한 후, 흐르는 물에 씻어 표면의 염색약을 제거합니다. 단계별 에탄올(70% 10초, 80% 10초, 95% 10초, 100% 160초)로 절편을 탈수하고, xylene에서 4분 동안 투명화합니다.
  9. 중성 수지로 슬라이드를 봉입합니다.
  10. 광학 현미경의 400× 배율로 척수 신경근 조직의 병리학적 및 형태학적 변화를 관찰하고, 대표적인 대상 영역의 현미경 이미지를 획득합니다.

9. 통계 분석

  1. SPSS 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행합니다. 정규 분포를 따르는 연속 변수는 평균 ± 표준 편차로 표기합니다.
  2. 정규성과 분산의 동질성 가정을 전제로, 기계적 회피 역치는 반복 측정 분산 분석(repeated-measures ANOVA)을 사용하여 분석하고, 보행 매개변수는 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용하여 분석합니다. 그룹 간 사후 쌍별 비교는 최소 유의차(LSD) 검정을 사용하여 수행합니다.
  3. 정규 분포 또는 분산의 동질성 가정을 충족하지 않는 경우 비모수 검정을 적용합니다.
  4. p < 0.05일 때 통계적으로 유의미한 차이가 있는 것으로 간주합니다.

결과

기계적 철회 역치(MWT) 평가 결과, 모델 유도 전 모든 그룹에서 유사한 기저값이 나타났다. 모델링 및 가짜 수술 후 3일째에 가짜 수술군과 대조군 사이에 유의미한 차이는 관찰되지 않았다(p > 0.05). 반면, 모델군과 침도요법군은 가짜 수술군에 비해 MWT가 현저히 감소하였다(p < 0.01, 그림 4). 치료 완료 후, 침도요법군은 모델군에 비해 MWT가 유의하게 상승한 것으로 나타났다(p < 0.05, 그림 4).

근전도(EMG) 기록 결과, 3일 차에rd 모델링 및 가짜 수술 다음 날, 모델군과 침도요법군 모두의 휴식기 침 근전도(needle EMG)에서 세동 전위(fibrillation potentials) 및 양성 예파(positive sharp waves)와 같은 비정상적 자발 활동이 검출되었다. 이와 대조적으로, 대조군 또는 가짜 수술군의 휴식기 침 근전도 파형에서는 비정상적인 자발적 방전이 관찰되지 않았다.그림 5). 환측에서 비정상적인 자발 전위가 나타나지 않는다면, 이는 모델의 표적 신경근 손상이 성공적으로 이루어지지 않았을 가능성을 시사하며, 수술 절차를 재확인해야 합니다.

보행 분석 결과, 치료 완료 후 sham 군의 평균 발자국 면적, 최대 지지 면적 및 지지 압력은 대조군과 유의미한 차이가 없었습니다(p > 0.05). 반면, 모델 군의 모든 보행 파라미터는 sham 군에 비해 현저히 감소했습니다(p < 0.001). 모델 군과 비교하여, acupotomy 군은 이러한 각 보행 지표에서 유의미한 상승을 보였습니다(p < 0.05, 그림 6). 평균 발자국 면적은 전체 지지 단계 동안의 발자국 크기의 평균입니다. 최대 지지 면적은 전체 지지 단계 동안의 발자국 최대 크기입니다. 지지 압력은 보행 분석 시스템에 기록된 지지 단계 동안의 상대적인 발바닥 압력 강도를 나타냅니다.

경추 신경근 조직의 HE 염색 결과, 대조군과 sham 군에서는 신경근 조직의 형태가 기본적으로 정상적으로 나타났다. 신경 섬유와 신경세포체는 비교적 질서 정연하고 조밀하게 배열되어 있었으며, 구조적 경계가 뚜렷하고 뚜렷한 간질 부종은 관찰되지 않았다. sham 군과 대조적으로, 모델 군에서는 신경근 손상을 나타내는 뚜렷한 병리학적 변화가 나타났으며, 이는 신경 섬유와 세포체의 무질서하고 느슨한 배열, 일부 신경세포의 파열 및 변형, 부분적인 섬유 단편화 및 현저한 간질 부종으로 특징지어졌다. 모델 군과 비교하여, 도침 요법 치료는 신경 섬유와 세포체의 정렬이 더 규칙적으로 변하고, 간질 부종이 완화되며, 신경 조직의 구조적 무결성이 부분적으로 회복된 것으로 나타나 이러한 병리학적 병변을 현저히 개선시켰다(그림 7).

MWT 검사, EMG 기록 및 보행 분석을 포함한 도침 치료 과정의 타임라인 다이어그램.
그림 1실험 설계의 시간축 도표. 7일간의 적응 급여 기간 후, 모델군과 침도자법(acupotomy)군 쥐 모두에서 척수 손상(CS) 모델을 구축하였다. 위sham군은 모델군과 동일한 척수 부위에 노출되었으나, 낚싯줄(fish line)은 배치하지 않았다. 침도자법 중재는 4일째에 시작되었다.th 침도절제술(acupotomy) 군에서 모델링이 성공적으로 이루어진 다음 날에 실시하였다. 쥐의 기계적 통증 역치는 모델링 전날, 수술 후 3일째, 그리고 중재가 종료되는 수술 후 14일째에 측정하였다. 신경근 압박을 평가하기 위해 수술 후 3일째에 근전도 검사를 수행하였다. 쥐의 운동 조정 기능을 평가하기 위해 중재 후 수술 후 15일째에 보행 분석을 실시하였다. 검출 시료는 수술 후 15일째에 행동 테스트를 마친 후 수집하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

수술 도구 세팅, 설치류 해부 과정, 해부학 연구를 위한 척추 노출 표시도.
그림 2: CS 랫 모델 구축. (A) 모델 유도에 사용된 수술 기구. (B) 경추 배측 절개 및 조직 박리. (C) 좌측 C5–T1 경추 척추경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

의료 절차 설정을 위한 쥐 고정 도식도를 포함한 동물 연구 준비 과정.
그림 3: 침도요법 중재 절차. (A) 쥐 고정에 사용되는 플라스틱 보드. (B) 쥐 고정의 도식적 설명. (C) 쥐의 C6 및 C7 극돌기에 해당하는 해부학적 표면 지표. (D) 쥐의 침도요법 치료에 대한 도식적 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

대조군, 가짜 수술군, 모델군, 침도자술군 간의 기계적 회피 역치를 나타내는 막대 그래프.
그림 4: 4가지 실험 쥐 그룹 간의 기계적 회피 역치 비교 (그룹당 n = 6). **p < 0.01 가짜 수술군 대비; #p < 0.05 모델군 대비. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

파형 진폭 비교; A, B는 높은 노이즈를, C, D는 낮은 노이즈를 보여줌; 오디오 신호 분석 차트.
그림 5: 모델 유도 후 4개 실험군에서 측정된 휴식 상태의 전지 근전도. (A) 모델군의 전지 근전도. (B) 침도절제술(acupotomy)군의 전지 근전도. (C) 대조군의 전지 근전도. (D) 가짜 처치(sham)군의 전지 근전도. 여기를 클릭하여 이 그림의 확대 버전을 확인하십시오.

네 그룹 간의 평균 발자국 면적, 최대 지지 면적 및 지지 압력을 비교한 막대 그래프.
그림 6: 네 가지 실험 쥐 그룹 간의 보행 파라미터 비교 (그룹당 n = 6). (A) 평균 발자국 면적 비교. (B) 최대 지지 면적 비교. (C) 지지 압력 비교. ***p < 0.001 가짜 수술 그룹 대비; #p < 0.05 모델 그룹 대비. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

조직학적 조직 비교, 4개의 슬라이드, 현미경 이미지, 세포 분석을 위한 100μm 스케일.
그림 7: 400× 배율에서 관찰한 4가지 실험 쥐 그룹의 신경근 조직 HE 염색. (A) 대조군의 HE 염색. (B) sham 그룹의 HE 염색. (C) 모델 그룹의 HE 염색. (D) acupotomy 그룹의 HE 염색. 스케일 바 = 100 µm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

토론

적절한 동물 모델의 선택은 경추증(CS)의 병인 기전을 규명하고 치료적 중재를 엄격하게 평가하기 위한 필수 전제 조건입니다. 현재는 상대적으로 간단한 방법, 짧은 모델링 주기, 높은 재현성 및 신뢰성이라는 장점 덕분에 척추 내 나일론 봉합사법이 널리 채택되고 있습니다15,20. 이 방법은 압박 물질을 쥐의 척수강 내에 삽입하여 경추 신경근에 지속적인 압박을 가함으로써, 임상 상황에서 추간판 탈출증이나 골극 증식으로 인해 발생하는 신경근 압박의 병리적 상태를 재현합니다. 경추증과 관련된 이차적 손상 중 신경근 압박은 가장 흔하며, 일반적으로 목의 통증, 강직 및 상지로 방사되는 증상으로 나타나는 뚜렷한 임상적 발현의 주요 원인이 됩니다5,7,21. 이에 따라, 본 연구에서는 척추 내 나일론 봉합사법을 채택하여 쥐의 CS 모델을 구축하였으며, CS 쥐 모델의 구축 및 침도자술(acupotomy) 중재를 위한 시각화된 조작 프로토콜을 제공하였습니다.

신경근 압박 후 발생하는 국소 허혈, 염증 반응 및 기계적 자극은 말초 및 중추 감작을 모두 유도하여 궁극적으로 통각과민증으로 이어질 수 있습니다22,23,24,25,26. 본 연구 결과, 모델 유도 후 쥐의 동측 앞발에서 기계적 통증 임계값이 현저히 감소한 것이 확인되었으며, 이는 해당 절차가 기계적 통각과민증을 성공적으로 유발했음을 나타냅니다. 침도요법 중재를 받은 쥐에서는 기계적 회피 임계값이 유의하게 회복되었으며, 이는 침도요법 해방술이 통증 감작 상태를 효과적으로 완화함을 시사합니다. 통증은 감각 임계값에 영향을 미칠 뿐만 아니라 동물의 자발적인 운동 패턴 또한 변화시킵니다. 보행 분석 시스템은 이동 중 발바닥 자국의 시공간적 파라미터를 포착함으로써 통증으로 인한 보상적 보행 변화를 객관적으로 정량화하며, 이를 통해 기존의 행동 점수 산정 방식에 내재된 강한 주관성을 극복할 수 있게 합니다27. 본 연구에서 모델군의 쥐는 동측 앞발의 평균 접지 면적, 최대 지지 면적 및 지지 압력이 감소하는 양상을 보였는데, 이는 통증으로 인한 하중 회피 행동과 보호적 보행 변화를 반영합니다. 이와 대조적으로 침도요법 중재를 받은 쥐는 이러한 보행 파라미터들이 정상화되는 경향을 보였으며, 이는 침도요법 치료가 통증을 완화하는 동시에 운동 협응력을 개선함을 나타냅니다. 조직형태학적 관찰 결과, 신경근 내 신경 섬유와 신경세포체의 배열 및 형태, 그리고 간질성 부종의 정도에서 군간 차이가 추가로 확인되었습니다. 이러한 결과는 침도요법 치료가 신경근의 병리적 변화를 완화할 수 있음을 시사합니다.

신경근의 압박은 감각 전도의 장애를 유발할 뿐만 아니라, 신경 지배를 받는 근육의 탈신경이나 비정상적인 과흥분성을 초래할 수 있습니다. 완전히 이완된 근육에서 자발적 전기 활동(섬유성 전위 및 양성 예파 등)을 기록하는 휴지기 근전도(EMG)는 신경성 손상에 따른 비정상적인 근초 흥분성을 나타내는 민감한 지표이며, 임상 및 실험 환경 모두에서 신경근병증을 평가하기 위한 핵심적인 전기생리학적 방법입니다28,29,30. 생리학적 조건에서 완전히 이완된 근육은 자발적 방전이 없는 전기적 정적 상태를 보입니다. 본 연구에서는 모델 유도 후 쥐의 동측 전지 휴지기 근육에서 뚜렷한 자발적 방전이 검출되었습니다. 이러한 비정상적인 휴지기 EMG 활동은 신경성 손상의 특징적인 징후이며, 이 쥐들의 경추 신경근이 지속적인 압박을 받았을 가능성을 시사합니다31. 모델 그룹과 침도자술(acupotomy) 그룹에서 모델링 후 나타난 비정상적인 EMG 결과는 전기생리학적 관점에서 CS 쥐 모델이 성공적으로 구축되었음을 추가로 확인해 주었습니다.

반복적인 마취의 누적 효과가 행동 평가에 혼란을 주는 것을 방지하기 위해, 본 연구의 침도자절제술(acupotomy) 중재는 깨어 있는 동물에게 보정 장치를 사용하여 수행되었습니다32. 이전 보고들에 따르면, 적절한 습관화 훈련과 반복적인 노출이 보정으로 유발된 스트레스 반응을 현저하게 완화할 수 있음이 입증되었습니다33,34,35,36. 이는 본 프로토콜의 중재 전 습관화 훈련이 급성 보정 스트레스가 실험 지표에 미치는 간섭을 효과적으로 최소화할 수 있음을 시사합니다.

본 연구에는 몇 가지 한계점이 있습니다. 첫째, 척추 내 나일론 봉합사 방법은 주로 급성 또는 아급성 기계적 압박을 재현하는 반면, 인간의 CS는 일반적으로 만성 퇴행성 경과를 따릅니다. 둘째, 본 구속 프로토콜은 스트레스를 최소화하도록 설계되었으나, 향후 연구에서는 구속 장치의 영향을 보다 종합적으로 평가하기 위해 혈청 cortisol과 같은 스트레스 관련 바이오마커를 측정해야 합니다.

결론적으로, 본 연구는 CS 쥐 모델을 구축하고 이후 침도요법(acupotomy)으로 치료하는 상세한 작동 절차를 제공합니다. 연구 결과, 침도요법 시술은 기계적 통증 역치를 유의하게 높이고, 통증 회피성 보행 패턴을 개선하며, 신경근의 병리적 변화를 완화하는 것으로 나타났습니다. 따라서 본 연구는 CS 치료를 위한 침도요법의 기저 기전을 규명하기 위한 체계적이고 실용적인 실험적 프레임워크를 제공합니다.

공개 사항

모든 저자는 잠재적인 이해상충이 없음을 선언하였습니다.

감사의 글

본 연구는 중국 국가 핵심 연구 개발 프로그램(Grant No. 2023YFC3502703)과 후베이성 자연과학 재단 혁신 개발 공동 기금 핵심 프로젝트(Grant No. 2024AFD271)의 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.5 mL 주사기Hebei Yunsheng Biotechnology Co., LtdSN-04442
1 mL 주사기Shanghai Zhiyu Medical Equipment Co., LTDZSQ-1
바늘 부착 4-0 봉합사, 단일암 (4×12)GLASSJZZSX193
75% 알코올Shandong Anjie Gaoke Disinfection Technology Co. LTD75-500ml
침도(Acupotomy Needle)Beijing Huaxia Blue Chip Biotechnology Co., Ltd.HY0440
부착 슬라이드CITOTEST188105
생체 신호 획득 및 분석 시스템TechmanBL-420N
생체 신호 획득 및 분석 시스템 (소프트웨어)TechmanBL-420N Version 3.0.0.237
커버 글라스Citotest Labware Manufacturing Co.,Ltd10212432C
탈수기DIAPATHDonatello
전자 저울Mettler-ToledoME203E/02
전열 송풍 건조기LaboteryGEL-70
포매기Wuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-P5
친환경 탈파라핀 투명액ServicebioG1128-1L
ESD-Safe 블랙 스테인리스 핀셋 (곡선 팁)solomenESD-15
에탄올SCRC100092683
무지방 솜뭉치Caoxian Hualu Sanitary Material Co. LTDTZMQ-500
Hematoxylin-eosin (HE) HD 정량 염색 키트 ServicebioG1076
지혈 겸자solomenB0557
IBM SPSS StatisticsIBM CorporationVersion 22.0
이미징 시스템NikonNIKON DS-U3
요오도포르Shandong Anjie Gaoke Disinfection Technology Co. LTDDF-500
이소플루란RWD life scienceR510-22-10
라텍스 장갑Beijing Ruijing Latex Products Co. LTDRJJC-S
기계적 발 찌르기 테스트 장치Kew basisKW-CT-1
의료용 포셉AIZANCHENGAZN00008
모스키토 지혈 겸자ServicebioQX1310D
중성 고무액SCRC10004160
생리식염수SHIMENSLYS-500ml
안과용 가위solomenB0754
파라핀 액Macklin8012-95-1
파라포름알데히드 고정액 (중성)ServicebioG1101
병리 절편기Shanghai Leica Instrument Co., LtdRM2016
주사용 페니실린 G 나트륨Jilin Huamu Animal Health Product Co., Ltd.Veterinary Drug Approval No.070011248
Poly-L-lysine 용액Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.R23126-50ml
설치류용 클리퍼solomenB1564
설치류 보행 이미징 및 분석 시스템CleverTreadScan; BCamCapture
설치류 보행 이미징 및 분석 시스템 (소프트웨어)CleverTreadScan Version 4.00; BCamCapture Version 3.00
SD 랫드Beijing Sibefei Biotechnology Co., LtdA102
소동물 마취기 YuYAN ABM
고압 증기 멸균기 (오토클레이브)YamatoSQ810C
수술용 메스 날solomenB1177
수술용 마스크winnerWJKZ-1
수술용 지침기solomenB0772
수술용 가위GLASSJZZSX-ZC544R
조직 확장기Zhejiang Kehua Instrument Co., Ltd KD-P
초순수 정제 시스템Aiken water ElAK-RO-C2
범용 조직 고정액 (중성)ServicebioG1101-15ML
정립 광학 현미경NikonNIKON ECLIPSE E100
자일렌SCRC10023418

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