방법 논문

안정적으로 형질도입된 녹아웃(Knockout) HEK293 세포에서 구조 실험을 수행하기 위한 Cas9 타겟팅

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DOI:

10.3791/72172

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2026년 8월 28일

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1Department of Biological and Environmental Sciences, Le Moyne College, 2Department of Immunology and Microbial Disease, Albany Medical College

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 게놈 편집 후 Cas9 단백질을 제거하여, 안정적으로 형질전환된 녹아웃 세포주에서 강력한 구조 실험(rescue experiments)이 가능하도록 합니다.

초록

CRISPR-Cas9 유전자 편집 기술은 분자생물학에 혁신을 가져왔습니다. 흔히 이 기술은 관심 단백질을 인코딩하는 유전자를 제거하는 데 사용됩니다. 그 결과로 나타나는 표현형은 해당 단백질의 기능에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 표적 단백질의 기능적 중요성은 소실된 기능을 복구하기 위해 단백질을 재도입(rescue)함으로써 확인할 수 있습니다. 이는 일반적으로 발현 벡터를 사용하여 단백질 코딩 cDNA를 trans 방식으로 도입함으로써 수행됩니다. 하지만 CRISPR-Cas9 시스템을 안정적으로 발현하는 녹아웃 세포주의 경우, 새로 도입된 발현 플라스미드 또한 Cas9에 의해 절단될 수 있습니다. 본 프로토콜은 구조 실험의 잠재적 장애물을 극복하기 위한 전략을 제공합니다. 이 접근 방식은 E3 유비퀴틴 리가아제 스캐폴드 단백질 CUL4B를 인코딩하는 유전자가 CRISPR-Cas9에 의해 파괴된 HEK293 세포를 사용하여 입증되었습니다. 통합된 Cas9 트랜스진을 표적으로 하는 가이드 RNA(gRNA)를 이 세포들에 형질 도입한 결과, 검출 가능한 Cas9 단백질이 소실되었습니다. Cas9 제거를 통해 CUL4B 발현 플라스미드를 도입한 후 CUL4B의 발현과 기능이 복구될 수 있었습니다. 이러한 결과는 구조 실험을 통해 단백질 기능을 연구하는 광범위하게 적용 가능한 접근 방식에 대한 개념 증명을 제공합니다.

서론

CRISPR-Cas9은 원핵생물이 박테리오파지 감염에 대항하여 사용하는 천연 적응 면역 체계에서 유래한 강력한 게놈 편집 도구입니다. 낮은 비용, 높은 성공률, 사용 편의성 덕분에 CRISPR-Cas9 기술은 특히 세포 배양에서의 정밀한 유전자 변형을 위해 아연 집게 핵산분해효소(ZFN) 및 전사 활성제 유사 작동체 핵산분해효소(TALEN)와 같은 다른 게놈 편집 도구들을 능가하게 되었습니다. 이 2성분 시스템은 Cas9 핵산분해효소와 가이드 RNA(gRNA)로 구성됩니다. gRNA는 Watson-Crick 염기 쌍 형성을 통해 Cas9을 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 인접한 게놈 표적으로 유도합니다. PAM 서열은 핵산분해효소 활성을 허용하는 중요한 인식 부위 역할을 합니다. 해당 부위에서 Cas9은 이중 가닥 절단(DSB)을 생성합니다. 상동 수선 템플릿이 없는 경우, 세포는 비상동 말단 연결(NHEJ)을 통해 DSB를 수선합니다. 이러한 수선 기전은 삽입 또는 결실(indel)을 유도하여 프레임시프트 돌연변이를 일으키고 표적 유전자의 기능적 넉아웃을 초래할 수 있습니다. 따라서 설계된 gRNA와 함께 Cas9을 도입함으로써 표적 유전자의 파괴를 달성할 수 있습니다. 20뉴클레오타이드의 gRNA 서열은 PAM에 바로 인접한 게놈 부위와 상보적입니다. 결과적으로 나타나는 표적 유전자의 기능 상실은 세포 과정에서 해당 유전자의 구체적인 역할을 밝혀줍니다1.

구제 실험(rescue experiment) 또는 상보성 분석(complementation assay)은 결손된 단백질을 다시 복원하여 관찰된 표현형이 반전됨을 입증하는 과정입니다. 이 접근 방식은 '오프타겟(off-target)' CRISPR-Cas9 결실과 같이 의도하지 않은 실험적 효과를 배제하기 위한 엄격한 대조군 역할을 합니다. 표적 단백질을 재도입하는 가장 일반적인 방법은 외래 발현 벡터를 통한 형질전환(transfection) 또는 형질도입(transduction)입니다. 그러나 이렇게 도입된 DNA는 내인성 유전자좌와 마찬가지로 CRISPR-Cas9 표적이 될 가능성이 있습니다. 이러한 위험은 특히 안정적으로 형질도입된 세포주에서 높게 나타나는데, 여기서는 균질하고 일관된 녹아웃(knockout) 집단을 확보하기 위해 지속적인 Cas9 발현과 항생제 선택이 결합됩니다. 이러한 전략은 면역, 조혈 또는 신경 계통 유래 세포주와 같이 형질전환이나 형질도입이 어려운 세포주에서 흔히 요구됩니다.

벡터 타겟팅을 우회하는 한 가지 방법은 관심 단백질을 인코딩하는 외인성 mRNA를 도입하여, Cas9 매개 절단과 핵 전사의 필요성을 배제하는 것입니다. 그러나 플라스미드 DNA와 비교하여 합성 mRNA는 생산 비용이 더 높고, 본질적으로 안정성이 낮으며, 발현 기간이 매우 일시적입니다. 또한, 세포질의 선천성 면역 반응을 유발하지 않기 위해 특정한 화학적 변형이 필요합니다2.

발현 플라스미드가 Cas9/gRNA 복합체에 의해 표적화되는 것을 방지하기 위해, 코딩 서열의 워블 염기 공학(wobble base engineering)을 적용할 수 있습니다. 유전 암호의 중복성을 이용하여, 암호화된 단백질의 아미노산 서열을 변경하지 않으면서 필요한 PAM 서열을 제거하거나 gRNA 상보성을 파괴하는 동의 치환(synonymous mutations)을 도입할 수 있습니다. 그러나 동의 치환의 적용에는 위험이 따릅니다. 이러한 변경은 최적화되지 않은 코돈 사용을 유도할 수 있으며, 이는 번역 역학을 방해하여 단백질의 미스폴딩, mRNA 안정성 감소 또는 RNA 2차 구조의 해로운 변화를 초래할 수 있습니다3,4. 빈도는 낮지만, 그 외 잠재적인 결과로는 잠재적 폴리아데닐화 신호(cryptic polyadenylation signals)의 도입, 전사 후 조절 모티프의 파괴, CpG 밀도의 증가 등이 있습니다5,6. 또한, 공학적으로 설계된 서열로 인해 생성된 mRNA 구조가 리보솜의 진행을 방해할 경우, 의도치 않게 세포 스트레스 반응을 유발할 수 있습니다7,8.

합성 mRNA 사용이나 워블 염기 공학(wobble-base engineering)과 관련된 어려움 외에도, 편집 후 Cas9의 지속적인 발현은 하위 분석에서 여러 교란 변수를 유발합니다. Cas9의 특이성이 불완전할 수 있기 때문에, 지속적인 발현은 오프타겟 절단(off-target cleavage)의 가능성을 높여 시간이 지남에 따라 의도하지 않은 돌연변이가 누적적으로 획득되게 합니다9,10,11. 또한, 만성적인 게놈 감시와 반복적인 DSB는 지속적인 DNA 손상 응답을 촉발하여, 궁극적으로 세포를 세포 주기 정지, 노화 또는 세포 사멸로 유도할 수 있습니다12,13. 이러한 지속적인 생산은 대사적 부담을 가하며, 이로 인해 발현 수준이 낮은 세포가 발현 수준이 높은 세포보다 경쟁 우위를 점하는 클론 표류(clonal drift)를 촉진하여 계대 배양이 진행됨에 따라 도입 유전자의 수준이 일관되지 않게 됩니다. 마지막으로, Cas9은 거대한 원핵생물 단백질로서 선천성 면역 신호 전달을 통해 스트레스를 유발하거나 호스트의 단백질 항상성 기구에 과부하를 주어 소포체 스트레스 응답(unfolded protein response)을 유도할 수 있습니다14,15,16.

이러한 합병증을 완화하기 위해 파지 유래 Anti-CRISPR 단백질(Acrs)17,18, 저분자 억제제 또는 PROTACs와 같은 degron 융합 시스템19,20, 그리고 광유전학적 제어 기전19,21을 포함한 여러 일시적 Cas9 억제 전략이 개발되었습니다. 하지만 이러한 접근 방식들은 구조 assays에서의 유용성을 제한하는 실질적인 장애물들을 수반합니다. Acrs는 분자 모방을 통해 억제하므로 정밀한 제어를 위해 화학양론적 최적화가 필요합니다. 또한 Acrs는 Cas9 과발현과 관련된 동일한 단백질 항상성 및 면역원성 스트레스를 악화시킬 수 있습니다. 화학적 조절은 약동학적 복잡성, 잠재적 세포 독성, 그리고 과도한 리간드 농도가 역설적으로 생산적인 삼원 복합체 형성을 방해하는 PROTAC 관련 'hook 효과'를 유발합니다22. 광유전학적 플랫폼은 세포의 광독성과 일정한 빛 전달을 유지하기 위한 특수 장비의 필요성으로 인해 제한적입니다19,21. 중요한 점은, 이러한 방법들은 일시적이거나 가역적인 억제만을 제공하기 때문에 Cas9이 구성적으로 발현되는 응용 분야에서는 흔히 불충분하다는 것입니다.

반면, 자가 불활성화 CRISPR 시스템은 표적 유전자 편집이 성공적으로 이루어진 직후 Cas9 트랜스진을 자율적이고 영구적으로 파괴함으로써 영구적인 해결책을 제공합니다. 이 접근 방식은 잔류 뉴클레아제 활성을 제거함으로써 이후의 구조 벡터가 절단되는 것을 영구적으로 방지하는 동시에, 장기적인 단백질 항상성 스트레스와 오프타겟 게놈 표류를 줄여줍니다. 자가 지향적 gRNA는 일시적인 리보핵산단백질 또는 지질 기반 형질전환을 통해 전달될 수 있지만23,24, 이러한 방법들은 희석 및 확률적 변동이 일어나기 쉬워 일부 세포가 불활성화를 회피하는 "모자이크" 집단이 생성될 가능성이 있습니다25,26,27.

이러한 한계를 극복하기 위해 본 프로토콜에서는 Cas9 자기불활성화를 위한 렌티바이러스 전달 시스템을 활용하며, 이는 안정적인 세포주 변형에 있어 뚜렷한 실질적 이점을 제공합니다. 렌티바이러스 전달은 Cas9 트랜스진과 그 자기지향적 조절자의 연관 유전을 보장하여, 빠르게 분열하는 세포군에서 전형적으로 나타나는 '희석 회피(dilution escape)' 현상을 효과적으로 방지합니다. 또한, 렌티바이러스 벡터의 확장된 화물 적재 용량은 선택 마커의 공동 발현을 가능하게 하여 Cas9이 제거된 균일한 세포군을 확보할 수 있게 하며, VSV-G 가성형화(pseudotyping)로 부여된 광범위한 친화성(tropism) 덕분에 형질전환이 어려운 세포 유형에도 고효율로 전달할 수 있습니다25,28,29.

이 방법의 개념 증명 시연으로서, 본 프로토콜은 CUL4B 결손 HEK293 세포30에서 E3 유비퀴틴 연결 효소 스캐폴드 단백질 CUL4B의 표현형 복구를 촉진하기 위한 Cas9의 자가 불활성화를 상세히 다룹니다.

프로토콜

본 연구는 기설정된 불멸화 인간 세포주(HEK293 및 HEK293FT)를 사용하였으며, 인간 대상자, 일차 인간 조직 또는 동물 실험을 포함하지 않았습니다. 따라서 기관 윤리 위원회의 승인은 필요하지 않았습니다.

1. Cas9-특이적 gRNA 렌티바이러스 벡터 생성

  1. Cas9 전용 gRNA 서열(표 1)을 pLentiGuide-Puro 렌티바이러스 벡터에 삽입합니다.
  2. 항생제 내성 유전자를 안정적으로 형질전환된 CRISPR-Cas9 세포주를 선택하는 데 사용된 내성 마커와 다른 유전자로 교체합니다.
  3. 벡터 전용 프라이머를 이용한 Sanger 시퀀싱을 통해 Cas9 전용 gRNA와 교체된 항생제 내성 유전자의 삽입 성공 여부 및 서열 정확성을 확인합니다.
    참고: 본 프로토콜에서는 Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro 벡터를 생성하기 위해 퓨로마이신 내성(PuroR) 유전자를 하이그로마이신 B 내성(HygroR) 유전자로 교체하였습니다. 대체 가능한 항생제 내성 유전자로 blasticidin S (BlastR), G418/Geneticin (NeoR) 및 zeocin (ZeoR) 등이 있습니다.

2. Cas9 특이적 gRNA를 인코딩하는 렌티바이러스 생성

  1. 10 cm 조직 배양 처리 접시에 2.5 × 106 개의 HEK293FT 세포를 분주한다.
    참고: 10% 소 태아 혈청(FBS)이 첨가된 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; high glucose)(이하 cDMEM)에서 세포를 유지하고, 5% CO2가 포함된 습윤 인큐베이터에서 37 °C로 배양한다. HEK293FT 세포는 다른 HEK293 유래 세포주보다 높은 렌티바이러스 역가를 생성하기 때문에 사용된다31.
  2. 형질전환 전, 세포가 최소 60%의 합류도(confluence)에 도달할 때까지 12시간 동안 배양한다.
    주의: 3세대 렌티바이러스 벡터와 관련된 모든 절차는 Pauwels 등32이 설명한 대로 적절한 개인 보호 장구(PPE) 및 승인된 오염 제거 절차(예: Class II 생물 안전 작업대, 2차 밀폐 용기 및 70% 에탄올)를 사용하여 생물 안전 2등급(BSL-2) 조건에서 수행한다.
  3. 표준 인산 칼슘(CaPhos) 형질전환 혼합물을 준비한다. 20 µg의 총 플라스미드 DNA를 멸균된 분자생물학 등급수에 희석하여 최종 부피를 450 µL로 맞춘다. 여기에 2.5 M CaCl2 50 µL를 추가하고, 이어서 2× HEPES 완충 식염수(HBS; pH 7.05) 500 µL를 추가하여 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브 내의 최종 부피를 1 mL로 만든다.
    참고: A260/A280 = 1.8–2.0, A260/A230 = 2.0–2.2, 엔도톡신 <0.1 EU/µg의 품질 기준을 충족하며 서열이 검증된, 주로 초나선(supercoiled) 형태의 플라스미드 DNA를 사용한다. 형질전환 혼합물은 5 µg Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro, 5.6 µg pLP1 (Gag/Pol), 3.8 µg pLP2 (Rev), 5.6 µg pLP/VSVG (vesicular stomatitis virus glycoprotein)로 구성된 대략적인 등몰비(equimolar ratio)를 사용하여 준비한다.
  4. 부드러운 피펫팅으로 CaPhos 형질전환 용액을 충분히 혼합한다.
  5. HEK293FT 세포 배양액에 CaPhos 형질전환 혼합물 1 mL를 한 방울씩 떨어뜨려 추가한다.
  6. 배양 접시를 부드럽게 흔들어 형질전환 복합체가 균일하게 분포되도록 한다.
  7. 세포를 12시간 동안 배양한다.
    참고: 인산 칼슘 형질전환은 일반적으로 표준 유지 항생제에 의해 영향을 받지 않는다33. 그러나 다음이온성(polyanionic) 항생제는 DNA-지질 복합체 형성을 방해할 수 있으므로, 리포펙션(lipofection)과 같이 더 민감한 형질전환 방법에는 항생제가 없는 배지를 권장한다34.
  8. 배양액을 흡입하여 제거한다.
  9. 실온의 멸균된 1× 인산 완충 식염수(PBS) 10 mL로 세포를 한 번 세척한다.
  10. PBS를 흡입하여 제거한다.
  11. 실온의 신선한 cDMEM 10 mL를 추가한다.
  12. 세포를 인큐베이터로 옮기고 36시간 동안 배양액에 렌티바이러스 입자가 축적되도록 한다.
    참고: 이러한 조건에서 농축되지 않은 렌티바이러스 상층액은 48시간 후 약 1.0 × 106 transduction units (TU)/mL의 수율을 낼 것으로 추정되나, 실제 역가는 Kutner 등35 또는 Barde 등36이 설명한 대로 실험적으로 결정해야 한다. 렌티바이러스 상층액은 −80 °C에서 최대 2년 동안 보관한다. 반복적인 동결-해동 사이클은 바이러스 역가를 약 55% 감소시킬 수 있으므로 피해야 한다37,38,39,40.

3. Cas9 특이적 gRNA를 인코딩하는 렌티바이러스 수확 및 표적 세포의 형질도입

  1. 시드 1.0 × 106 10 cm 조직 배양 처리 접시에 부착된 표적 세포.
  2. 렌티바이러스 형질전환 전, 대상 세포를 12시간 동안 배양하십시오.
    참고: 표적 세포는 안정적으로 발현하는 HEK293 세포입니다. Streptococcus pyogenes Cas9, a CUL4B-표적 gRNA (표 1), 그리고 퓨로마이신 내성(PuroR) 유전자. 다음을 포함하는 cDMEM에서 세포를 배양한다. 10 µg/mL puromycin으로 선별하고, Cas9 자가 불활성화 전에 웨스턴 블롯 분석을 통해 CUL4B 결손을 확인하십시오. 이후의 모든 실험은 초기 계대 HEK293 세포를 사용하여 수행하십시오.ΔCUL4B 세포
  3. HEK293FT 생산 세포의 세포 단층이 손상되지 않도록 주의하며, 상층액을 멸균된 15 mL 원뿔형 튜브로 조심스럽게 옮겨 렌티바이러스가 포함된 배지를 수확하십시오.
    참고: 기설정된 생물안전 지침에 따라 HEK293FT 생산 세포를 폐기하십시오.32.
  4. 수집한 상청액을 1,000에서 원심분리하십시오. × g 잔류 HEK293FT 생산 세포를 침전시키기 위해 실온(RT)에서 10분 동안 원심분리합니다.
  5. 이전에 파종한 HEK293의 배양액을 흡입하여 제거한다.ΔCUL4B 세포
  6. 정제된 렌티바이러스 상층액 7 mL를 HEK293 세포가 들어있는 10 cm 디쉬에 옮깁니다.ΔCUL4B 세포. 원심분리관 바닥의 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하고, 생산 세포의 유입을 최소화하기 위해 상층액을 최소 1mL 남겨둡니다.
    참고: 상층액을 다음을 통해 여과하십시오. 0.45 µm 원하는 경우, 잔류 생산 세포를 추가로 제거하기 위해 여과하십시오. 남은 상층액은 생물 안전 가이드라인에 따라 폐기하십시오.32추정 역가 1.0에서 × 106 TU/mL일 때, 7 mL의 접종물을 통해 3.5에서 5.5 사이의 감염 다중도(MOI)를 생성할 것으로 예상됩니다.41.
  7. 형질도입된 HEK293 세포를 배양합니다.ΔCUL4B 렌티바이러스의 완전한 형질전환 및 통합이 이루어지도록 세포를 24시간 동안 배양합니다.
  8. 바이러스 상층액을 흡입하여 제거합니다.
  9. 실온의 멸균된 1을 이용해 세포를 10 mL로 1회 세척하십시오.× 인산완충식염수(PBS).
  10. PBS를 흡입하여 제거합니다.
  11. 실온의 신선한 cDMEM 10mL를 첨가합니다.
  12. 세포를 인큐베이터로 옮겨 4일 동안 배양하여 외래 유전자(transgene) 발현과 Cas9에 의한 절단이 일어나도록 합니다.
    참고: 렌티바이러스 Cas9 gRNA 벡터에 형광 리포터가 인코딩되어 있지 않은 경우, 유사하게 제작된 형광 리포터 발현 렌티바이러스 벡터를 병행 감시 배양(sentinel culture)에 형질도입하십시오. 정성적 형광 현미경 관찰 또는 정량적 유세포 분석법을 통해 감시 배양에서 형질도입 효율과 표적 유전자 고갈 시점을 추정하십시오. 본 연구에서는 형질도입 4일 후 형광 현미경으로 GFP 발현을 쉽게 검출할 수 있었습니다.

4. Cas9 특이적 gRNA 형질도입 세포의 항생제 선택

참고: 형질전환 4일 후, 표적 세포는 합류(confluence) 상태이거나 그에 가까운 상태여야 하며 더 큰 배양 용기로 옮겨주어야 합니다. 세포 전이는 항생제 선택 시작과 동시에 수행하십시오.

  1. HEK293ΔCUL4B 세포에서 배양액을 흡입하여 제거한다.
  2. 실온의 멸균된 1× phosphate-buffered saline (PBS) 10 mL로 세포를 1회 세척한다.
  3. PBS를 흡입하여 제거한다.
  4. 배양 접시에 실온의 멸균된 trypsin-EDTA 용액 2 mL를 첨가한다.
  5. 세포의 탈착을 촉진하기 위해 5분 동안 배양한다.
  6. trypsin을 중화시키기 위해 실온의 cDMEM 8 mL를 첨가한다.
  7. 세포 현탁액을 멸균된 15 mL 원추형 튜브로 옮긴다.
  8. 세포 응집체를 완전히 해체하기 위해 세포 현탁액을 15-20회 파이펫팅(triturate)한다.
  9. 실온에서 200 × g로 10분 동안 세포를 원심 분리한다.
  10. 세포를 원심 분리하는 동안, 250 µg/mL hygromycin B가 첨가된 cDMEM 20 mL가 들어 있는 T150 조직 배양 처리 플라스크를 준비한다.
    참고: 선택에 필요한 hygromycin B 농도는 세포 유형에 따라 다를 수 있다. 50–500 µg/mL hygromycin B를 사용하여 킬 커브(kill curve)를 수행하여 7–10일 이내에 모든 비형질전환 세포를 제거하는 데 필요한 최소 농도를 결정한다. Cas9 gRNA 벡터에 다른 항생제 내성 마커가 사용된 경우, 2–10 µg/mL blasticidin S, 400–800 µg/mL G418/Geneticin 또는 50–400 µg/mL zeocin을 사용하여 킬 커브를 수행한다.
  11. 세포 펠릿이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 흡입하여 제거한다.
  12. 250 µg/mL hygromycin B가 첨가된 cDMEM 10 mL에 세포 펠릿을 재현탁한다.
  13. 10 mL의 세포 현탁액을 20 mL의 선택 배지가 들어 있는 준비된 T150 플라스크로 옮긴다.
  14. 플라스크를 살살 흔들어 세포를 고르게 분산시킨다.
  15. 선택 배지 조건에서 세포를 3일 동안 배양한다.
  16. 선택 배양 3일째에 선택 배지를 흡입하여 제거하고, 250 µg/mL hygromycin B가 첨가된 신선한 cDMEM 30 mL로 교체한다.
    참고: 선택 배지를 교체하면 부착되지 않은 사멸 세포를 제거하고, 영양분을 보충하며, 항생제 활성을 유지할 수 있다.
  17. 생존한 세포 단일층이 약 90%의 합류도(confluence)에 도달할 때까지 배양을 계속하며, 이는 보통 추가로 4일 후에 이루어진다.

5. Cas9 제거 및 in trans CUL4B 구조의 검증

참고: 세포가 약 90%의 합류도(confluence)에 도달하면, 초기 실험에서 Cas9 절제(ablation)를 확인하고 즉시 나머지 세포 집단을 동결 보존하십시오42. 이 방법은 2차 보상 기전의 발생을 최소화합니다.

  1. Cas9 표적 gRNA를 안정적으로 발현하는 조기 계대 HEK293ΔCUL4B 세포(이하 HEK293ΔCUL4BΔcas9로 명명)를 6-well 조직 배양 처리 플레이트의 4개 웰에 웰당 2.5 × 105 cells 밀도로 분주한다.
  2. 별도의 6-well 플레이트의 4개 웰에 HEK293ΔCUL4B 세포를 분주한다. 대조군으로 사용하기 위해 최소 하나 이상의 추가 웰에 모세포 HEK293 세포를 분주한다.
    참고: HEK293ΔCUL4B 및 모세포 HEK293 배양물은 각각 Cas9 및 CUL4B 발현의 대조군으로 사용한다.
  3. 모든 배양물을 12시간 동안 배양하여 세포가 완전히 부착되고 활발하게 증식하도록 한다.
  4. 0, 0.5, 1.0 또는 2.0 µg의 pCMV-FLAG-CUL4B를 포함하는 인산칼슘(CaPhos) 형질전환 혼합물을 준비한다. 빈 pCMV 벡터를 추가하여 각 혼합물의 총 플라스미드 DNA 양을 10 µg으로 일정하게 맞춘다.
  5. 각 DNA 혼합물을 멸균된 분자생물학 등급 물에 희석하여 최종 부피를 180 µL로 만들고, 2.5 M CaCl2 20 µL를 추가한 다음, 2× HEPES 완충 식염수(HBS; pH 7.05) 200 µL를 추가하여 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브 내의 최종 부피를 400 µL로 맞춘다.
    참고: 강한 프로모터(예: CMV)에 의해 구동되는 발현 플라스미드를 사용할 때는 내인성 발현과 유사한 단백질 발현 수준을 얻기 위해 DNA 적정(titration)을 수행한다. 서열이 검증되었으며, A260/A280 값 1.8–2.0, A260/A230 값 2.0–2.2, 엔도톡신 수준 <0.1 EU/µg인 주로 초나선형(supercoiled) 플라스미드 DNA를 사용한다.
  6. 부드럽게 피펫팅하여 각 CaPhos 형질전환 용액을 충분히 혼합한다.
  7. 각 형질전환 혼합물 200 µL를 HEK293ΔCUL4BΔcas9 세포가 포함된 지정된 웰에 한 방울씩 떨어뜨려 추가한다. 교차 오염을 방지하기 위해 샘플 간에 피펫 팁을 교체한다.
  8. 각각의 대응하는 형질전환 혼합물 나머지 200 µL를 HEK293ΔCUL4B 세포가 포함된 지정된 웰에 한 방울씩 떨어뜨려 추가한다.
  9. 형질전환된 배양물을 12시간 동안 배양한다.
  10. 각 웰에서 배양액을 흡입하여 제거한다.
  11. 실온의 멸균된 1× PBS 1 mL로 세포를 한 번 세척한다.
  12. PBS를 흡입하여 제거한다.
  13. 각 웰에 신선한 실온의 cDMEM 2 mL를 추가한다.
  14. CUL4B 발현 및 하위 기능적 반응이 일어날 수 있도록 배양물을 24시간 더 배양한다.
  15. 표준 트립신화 절차를 사용하여 세포를 수확한다.
  16. 각 세포 현탁액을 개별 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴다.
  17. 각 세포 현탁액을 1× PBS로 한 번 세척한다.
  18. 실온에서 14,000 × g로 짧게 원심분리하여 세포 펠릿을 형성한다.
  19. PBS 상청액을 흡입하여 제거한다.
    주의: β-mercaptoethanol은 강한 냄새가 나는 휘발성 피부 및 호흡기 자극제이다. 내화학성 장갑, 실험복, 보안경을 포함한 적절한 개인 보호 장구를 착용한 상태에서 인증된 화학 흄후드 내에서 스톡 용액을 취급한다. 오염된 팁, 튜브 및 폐기물은 기관의 유해 폐기물 지침에 따라 폐기한다.
  20. 5% (v/v) β-mercaptoethanol이 첨가된 200 µL Laemmli 샘플 버퍼에 각 세포 펠릿을 직접 용해한다.
  21. 샘플을 95 °C에서 15분 동안 가열하여 단백질을 변성시킨다.
  22. 표준 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 사용하여 레인당 20–40 µg의 총 단백질을 분리한다.
  23. 분리된 단백질을 PVDF(polyvinylidene fluoride) 막으로 전이시킨다.
  24. 블로킹 버퍼를 사용하여 실온에서 30분 동안 막을 블로킹한다.
    참고: 블로킹 버퍼는 5% (w/v) 무지방 건조 우유 또는 5% (w/v) 소 혈청 알부민(BSA)을 표준 세척 버퍼(1× Tris 완충 식염수 또는 1× PBS 내의 0.1% Tween 20)에 녹여 준비한다.
  25. 표준 세척 버퍼를 사용하여 막을 10분씩 3회 세척한다.
  26. CUL4B, Cas9, WDR5, CDC6 또는 α-TUBULIN에 대한 1차 항체와 함께 4 °C에서 부드럽게 흔들어주며 12시간 동안 막을 배양한다.
    참고: 1차 항체는 표준 세척 버퍼에 1:1,000으로 희석한다.
  27. 1차 항체 용액을 제거하고 표준 세척 버퍼를 사용하여 막을 10분씩 3회 세척한다.
  28. 적절한 HRP(horseradish peroxidase) 접합 항마우스 또는 항토끼 IgG 2차 항체와 함께 4 °C에서 부드럽게 흔들어주며 12시간 동안 막을 배양한다.
    참고: 2차 항체는 블로킹 버퍼에 1:3,000으로 희석한다.
  29. 2차 항체 용액을 제거하고 표준 세척 버퍼를 사용하여 막을 10분씩 3회 세척한다.
  30. ECL(enhanced chemiluminescent) 기질을 막 전체에 균일하게 도포하고 1분 동안 배양한다.
  31. 디지털 이미징 시스템을 사용하여 화학발광 신호를 캡처한다.
    참고: 원하는 경우, 분리된 게놈 DNA의 PCR 증폭 후 표적 게놈 영역의 생거 시퀀싱(Sanger sequencing)을 통해 유전자 파괴 성공 여부를 확인한다43.

결과

실험적 재구성을 위한 Cas9 결손 녹아웃 라인을 생성하기 위해, 표준 패키징 플라스미드(pLP1, pLP2 및 pLP/VSVG)를 사용하여 HEK293FT 세포에서 Cas9 타겟팅 gRNA(Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro)를 인코딩하는 렌티바이러스를 제작하였습니다. 생성된 바이러스 상청액을 수확하여 표적 세포에 트랜스덕션하였습니다. hygromycin B 선택 과정 중의 생존 여부를 통해 렌티바이러스 트랜스덕션의 성공을 확인하였으며, 이후 웨스턴 블롯 분석을 통해 Cas9 결손을 검증하였습니다(그림 1).

CUL4B 단백질은 모체 HEK293 세포에서 쉽게 검출되었으나, 공벡터가 형질전환된 HEK293ΔCUL4B 및 HEK293ΔCUL4BΔcas9 세포에서는 나타나지 않았다. CUL4B의 소실과 일치하게, WDR5와 CDC6는 각각 예상되는 정상 상태 발현의 증가 및 감소를 보여 CUL4B 기능의 파괴를 확인해주었다. Cas9 단백질은 HEK293ΔCUL4B 세포에서 검출되었으나 모체 HEK293 및 HEK293ΔCUL4BΔcas9 세포에서는 검출되지 않아 Cas9 절제가 성공적으로 이루어졌음을 확인했다. 예상대로 HEK293ΔCUL4B 세포에 CUL4B 발현 플라스미드를 형질전환시켰을 때 CUL4B 단백질 발현은 최소한으로만 회복되었다. 반면, HEK293ΔCUL4BΔcas9 세포를 형질전환시켰을 때는 강력한 CUL4B 발현이 관찰되었으며, WDR5 수준의 감소와 CDC6 수준의 증가로 입증되는 하위 단백질 발현의 회복이 동반되었다. 종합적으로, 이러한 결과는 Cas9 절제가 구조 플라스미드의 Cas9 매개 절단을 방지함으로써 CUL4B의 발현과 기능의 효율적인 회복을 가능하게 함을 보여준다(Figure 2).

figure-results-1
그림 1: Cas9의 전략적 제거 및 CUL4B 복구 검증을 위한 실험 워크플로우. 이 워크플로우는 인산칼슘 transfection을 통해 HEK293FT 생산 세포에 pLP1, pLP2, pLP/VSVG 및 Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro 컨스트럭트를 공동 transfection하여 Cas9이 제거된 CRISPR knockout 세포를 생성하는 과정을 보여줍니다. 생성된 렌티바이러스 상청액을 수집하고 원심분리하여 잔류 생산 세포를 제거한 후, 표적 세포를 형질도입하는 데 사용합니다. 선택 과정을 거친 후, western blot 분석을 통해 Cas9의 성공적인 제거를 확인하여 실험적 CUL4B 재구성에 적합한 깨끗한 knockout 세포주를 구축합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: CRISPR-Cas9으로 편집된 HEK293 세포에서 CUL4B 발현 및 기능의 복구. (A) 형질전환 워크플로우의 실험 모식도. HEK293ΔCUL4B   및 HEK293ΔCUL4BΔcas9 세포에 공벡터(empty vector) 또는 농도가 증가된 pCMV-FLAG-CUL4B를 형질전환하였다. 형질전환 36시간 후에 세포를 회수하고, 용해물 단백질을 SDS-PAGE로 분석하였다. (B) 복구 효율 및 하위 기능 대조군의 웨스턴 블롯 분석. 표시된 단백질들을 웨스턴 블롯으로 시각화하였다. WDR5와 CDC6는 CUL4B 기능의 대조군으로 사용되었다. α-TUBULIN은 로딩 대조군으로 사용되었다. Parental HEK293 세포는 기저 발현의 대조군으로 사용되었다. 블롯은 반복 실험(n = 2)의 대표 결과이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

표적 유전자gRNA 서열 (5′→3′)PAM (5′→3′)표적 위치표적 설명
CUL4BATCAAACCCTACAAACTCCAAGGXq24 Exon 3프레임시프트 넉아웃을 위한 인간 CUL4B ORF의 N-말단 영역
cas9CGTGATCACCGACGAGTACAAGGORF (hSpCas9)자가 불활성화 인델을 유도하기 위한 cas9 트랜스진의 보존된 내부 영역

표 1: CRISPR-Cas9 가이드 RNA 서열 및 게놈 표적 사양.

토론

본 프로토콜은 편집 후 Cas9이 제거된 CRISPR-Cas9 편집 녹아웃 세포주에서 표적 단백질의 발현과 기능을 강력하게 복원할 수 있게 합니다. 본 연구의 주목할 만한 관찰 결과는 Cas9의 구성적 발현이 플라스미드 기반의 외래 유전자 발현을 상당 수준 억제한다는 점입니다. 본 프로토콜의 강점은 소실된 단백질과 그와 관련된 표현형을 모두 회복시킬 수 있다는 능력에 있습니다. 또한, 이 방법은 광범위한 단백질 변형의 표현형 탐색을 위한 프레임워크를 제공합니다. 예를 들어, 인산화 모방(예: 세린을 아스파르트산으로 치환) 변이체를 도입함으로써, 기존 단백질의 간섭 없이 해당 번역 후 변형의 역할에 대한 귀중한 통찰을 얻을 수 있습니다.

따라서 이 프로토콜은 표준 부착성(예: HeLa, A549) 및 부유(예: Jurkat, THP-1) 세포주에 광범위하게 적용 가능합니다. 하지만 이러한 순차적 선택 프레임워크는 일차 세포나 비분열 세포(예: 일차 신경세포 또는 대식세포)에는 비실용적일 수 있습니다. 이러한 민감한 시스템에서는 형질전환되지 않은 주변 세포(bystander cells)가 빠르게 제거되면서 공유 미세환경으로 세포독성 파편과 프로-아포토시스(pro-apoptotic) 스트레스 신호를 방출하여 간접적인 독성을 유발합니다46,47. 마찬가지로, 빠른 염색체 재배열이나 기존의 내성 클론의 빠른 선택을 통해 CRISPR 매개 표현형을 회피하기 쉬운 적응력이 매우 높은 이배성(aneuploid) 암 세포주(예: U87 교모세포종 또는 A375 흑색종)에서도 실패할 수 있습니다48,49. 궁극적으로, 적합성은 이중 벡터 발현의 대사 부하를 견디고, 이러한 간접적인 선택 압력을 이겨내며, 수주에 걸친 프로토콜 전반에 걸쳐 안정적인 성장 역학을 유지할 수 있는 세포주의 능력에 달려 있습니다.

이러한 접근 방식은 대부분의 세포주에 대해 다각적인 개념 증명(proof of concept) 역할을 하지만, 이를 구현하기 위해서는 전달 효율과 게놈 무결성 사이의 세심한 균형이 필요합니다. 앞서 설명한 바와 같이, '자기-지향성' gRNA를 위해 렌티바이러스 전달 방식을 사용하면 특히 형질전환이 어려운 세포에서 Cas9이 결핍된 균질한 집단을 확보할 수 있습니다. 그러나 반무작위적 통합(semi-random integration)으로 인한 삽입 돌연변이 유발 위험은 여전히 우려 사항입니다. 이러한 위험은 MOI를 최적화함으로써 관리할 수 있습니다. HEK293과 같은 허용성 세포주의 경우, 1–5의 MOI로 통합 기반 돌연변이 유발 및 세포 독성을 최소화하면서 높은 포화도를 달성할 수 있습니다41. 반면, 난치성 면역 세포나 신경 세포는 일반적으로 10–50의 MOI가 필요하며, 유사한 효율을 달성하기 위해 종종 polybrene 및/또는 스피노큘레이션(spinoculation)과 같은 촉진제가 필요합니다50,51,52,53,54,55.

이러한 기술적 트레이드오프는 다클론(polyclonal) 및 단클론(monoclonal) 선택 군 사이의 선택으로까지 확장됩니다. 본 연구에서 생성된 HEK293ΔCUL4BΔcas9 세포는 다클론이며, 이는 단일 세포 서브클로닝에 필요한 수주간의 확장 과정을 생략함으로써 실험 일정을 단축하기 위한 선택입니다. 또한, 다클론 풀은 배양액의 평균적인 표현형을 포착하여 클론성 아티팩트나 부위 특이적 통합 문제에 효과적으로 대응할 수 있게 합니다. 단클론 라인은 유전적 균일성 덕분에 일관된 결과를 얻을 가능성이 더 높지만, 본 연구의 결과는 속도와 집단 대표성이 우선시될 때 다클론 선택이 실행 가능하며 종종 더 나은 대안이 될 수 있음을 시사합니다.

결과로 나타나는 표현형의 시간적 안정성 또한 중요한 변수가 될 수 있습니다. 본 연구에서 제시한 시스템의 경우, 녹아웃 세포주의 계代 배양이 진행됨에 따라 WDR5 및 CDC6에 미치는 CUL4B의 조절 영향이 감소했으며, 이는 파라로그인 CUL4A의 보상적 상향 조절과 상관관계가 있었습니다(데이터는 제시되지 않음). 이는 CUL4B가 결핍된 세포에서 CUL4A가 CUL4B의 기능을 부분적으로 복원할 수 있음을 보여준 Nakagawa 등의 연구 결과와 일치합니다44. 이러한 항상성 보상은 세포 생물학에서 흔히 나타나며, 특히 다른 세포 단백질과 구조적 상동성이 높고 기능적 중복성이 있는 단백질을 표적으로 할 때 두드러집니다.

이러한 이차적 보상 기전을 관리하기 위해, 실험 목적과 사용된 세포주에 따라 두 가지 뚜렷한 전략적 접근 방식을 채택할 수 있습니다. 효율성을 우선시하거나 적응력이 매우 높은 세포주를 사용하는 연구자의 경우, 응축된 실험 일정이 필수적입니다. 이 전략은 선택 과정 이후 배양 세포가 90% 합류도(confluence)에 도달하는 즉시 표적 단백질의 소실을 검증하고, 곧이어 자가 불활성화 Cas9 표적화 및 기능 분석을 수행하는 과정을 포함합니다. 이러한 가속화된 워크플로우를 도입함으로써, 세포의 항상성 기제가 중복 파라로그(paralog)를 상향 조절하거나 결과 표현형을 혼동시킬 충분한 시간을 갖기 전에 넉아웃의 일차적인 생물학적 결과를 포착할 가능성이 더 높아집니다.

대안적으로, 장기적인 안정성이 필요하거나 고정밀 구조 실험(rescue experiments)이 요구되는 연구, 특히 면역 세포나 신경 세포와 같이 형질전환이 어려운 모델의 경우, 테트라사이클린 조절(Tet-On/Off) 시스템이 실행 가능한 해결책이 될 수 있습니다56,57. 이러한 유도성 프레임워크를 구현하려면 추가적인 렌티바이러스 형질도입 과정과 서로 다른 항생제 내성 마커의 사용이 필요하지만, 이는 일시적인 독시사이클린 매개 '손실 및 구조(loss and rescue)' 이벤트를 유발하기 전에 세포 환경을 안정화하기 위해 표적 단백질을 지속적으로 복원할 수 있는 메커니즘을 제공합니다57.

공개 사항

저자들은 기술 용어를 정교화하고 원고를 편집하기 위해 Google Gemini의 도움을 받았습니다. AI는 언어적 개선을 위한 도구로 사용되었으며, 데이터의 독창적인 합성, 연구의 개념화 또는 텍스트의 1차 초안 작성에는 기여하지 않았습니다. 저자들은 출력물을 검토 및 편집하였으며 최종 원고의 내용에 대해 모든 책임을 집니다. 저자들은 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

본 연구는 Le Moyne College의 스타트업 펀드, Le Moyne College 연구개발위원회, Le Moyne College 학생연구위원회, Walter L. '66 및 MaryAnne Poland Jesuit 연구 및 교육 혁신 센터 기금, 그리고 Le Moyne College 생물환경과학과의 지원을 받았습니다. 저자들은 그래픽 도해 작성에 BioRender.com을 사용했음을 밝힙니다. 그림 1은 BioRender(Sharifi, J., 2026; https://BioRender.com/72u0wl3)에서 작성되었으며, 그림 2의 상단 패널은 BioRender(Sharifi, J., 2026; https://BioRender.com/lc6o2lu)에서 작성되었습니다.

재료

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anti-Cas9 항체세포 신호 전달65832이 마우스 단클론 항체는 인간 용해물 내의 S. pyogenes Cas9을 특이적으로 검출하여, 자체 지향적 gRNA 매개 Cas9 제거를 확인하는 데 이상적입니다.
anti-CDC6 항체세포 신호 전달3387이 토끼 단클론 항체는 인간 CDC6를 특이적으로 검출하여 CUL4B의 하위 기능적 영향력을 모니터링하는 데 적합합니다.
anti-CUL4B 항체Sigma-AldrichC9995이 친화성 정제 토끼 다클론 항체는 밀접하게 연관된 파라로그인 CUL4A와 교차 반응 없이 인간 CUL4B를 특이적으로 검출합니다.
anti-mouse IgG, HRP-결합 2차 항체세포 신호 전달7076이 말 항-마우스 IgG 항체는 고추냉이 퍼옥시다아제(HRP)가 접합되어 있으며, 마우스 단클론 1차 항체의 화학 발광 검출에 최적화되어 있습니다.
HRP 결합 토끼 IgG 항-2차 항체세포 신호 전달7074이 염소 항-토끼 IgG 항체는 horseradish peroxidase(HRP)와 결합되어 있으며, 토끼 다클론 및 단클론 1차 항체의 화학발광 검출에 최적화되어 있습니다.
anti-WDR5 항체세포 신호 전달13105이 토끼 단클론 항체는 인간 WDR5를 특이적으로 검출하여 CUL4B의 하위 기능적 영향력을 모니터링하는 데 이상적입니다.
항-α-TUBULIN 항체세포 신호 전달3873이 마우스 단클론 항체는 인간 alpha-tubulin을 표적으로 하며, 웨스턴 블롯 분석의 정규화를 위한 균일한 로딩 컨트롤로 사용하기에 적합합니다.
인산칼슘 형질전환 키트ThermoFisher ScientificK278001본 키트는 부착성 HEK293FT 생산 세포에서 렌티바이러스 벡터를 확장 가능하고 비용 효율적으로 생산할 수 있도록 최적화된 효율적인 일시적 형질전환 시약을 제공합니다.
Cas9 gRNA1_pLentiGuide-HygroGenScript Biotech Corporation 맞춤형 합성cas9 gRNA 서열: CGTGATCACCGACGAGTACA, PAM 서열: AGG
Cas9 gRNA1_pLentiGuide-PuroGenScript Biotech Corporation 맞춤형 합성cas9 gRNA 서열: CGTGATCACCGACGAGTACA, PAM 서열: AGG
Dulbecco's Modified Eagle Medium GibcoD5796L-글루타민과 피루브산나트륨이 첨가된 이 고포도당 배지는 빠르게 증식하는 포유류 세포주(예: HEK293FT)의 성장, 생존력 및 대사 안정성을 유지하는 데 최적화되어 있습니다.
소태아혈청, 프리미엄 (열불활성화)Corning35-016-CV이 프리미엄 등급의 열 불활성화 혈청은 포유류 세포주에 대해 보체 매개 세포독성을 최소화하는 동시에 필수적인 성장 인자와 호르몬을 제공합니다.
HEK293American Type Culture CollectionCRL-1573특성이 잘 규명된 이 인간 배아 신장 세포주는 형질전환 효율이 매우 높아, 유전자 결손 표현형 및 단백질 구조 복원 체계를 연구하기 위한 강력하고 표준적인 모델로 활용됩니다.
HEK293FT 세포 ThermoFisher ScientificR70007빠르게 성장하고 형질전환 효율이 매우 높은 이 인간 배아 신장 세포주 변이체는 SV40 large T 항원을 안정적으로 발현하여, 렌티바이러스 벡터 생산 시 바이러스 역가를 최대화하는 데 최적화되어 있습니다.
하이그로마이신 BsigmaaldrichH7772이 아미노뉴클레오사이드 항생제는 하이그로마이신 내성 마커를 발현하는 안정적 형질전환체를 분리하기 위해 포유류 세포 배양의 선택제로 사용됩니다.
pCLIP-All-hCMV-Puro 플라스미드 (CUL4B gRNA)Skyang Bio LLCsgRNA3:1019408_bCUL4B gRNA 서열: ATCAAACCCTACAAACTCCA, PAM 서열: AGG
pCMV-FLAGCUL4B제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주시기 바랍니다.제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.이 포유류 발현 플라스미드는 FLAG 태그가 붙은 Cullin 4B 단백질(CUL4B)의 지속적인 발현을 유도하기 위해 cytomegalovirus(CMV) 프로모터를 사용하며, Jianping Jin으로부터 기증받았습니다.
pCMV-M1 포유류 발현 벡터Addgene23007공백 발현 벡터 대조군 (Linda Wordeman 제공)
pLentiGuide-PuroAddgene52963이 렌티바이러스 전달 벡터는 Cas9 발현 세포에서의 CRISPR 타겟팅을 위해 EF-alpha 프로모터 기반의 퓨로마이신(puromycin) 저항성 마커와 함께, 사용자가 맞춤 설정 가능한 gRNA의 인체 U6 프로모터 발현을 유도하며, Feng Zhang으로부터 기증받았습니다.
pLX302 EGFP-V5Addgene141348 형질전환 효율 평가용 GFP 인코딩 렌티바이러스 벡터 (Kevin Janes 제공)
퓨로마이신Sigma-AldrichP8833이 아미노뉴클레오사이드(aminonucleoside) 항생제는 포유류 세포 배양에서 퓨로마이신(puromycin) 내성 마커를 발현하는 안정적인 형질도입체를 분리하기 위한 선택 제제로 사용됩니다.
멸균 인산완충식염수 (PBS)Corning21-040-CV이 표준 균형 염 용액은 삼투압이나 세포 생존력에 영향을 주지 않으면서 잔류 배양액, 혈청 단백질 또는 효소를 효과적으로 제거하기 위해 세포 단층을 세척하는 데 사용됩니다.
Trypsin EDTA 1XCorning25-051-CI이 표준 효소 해리 용액은 펩타이드 결합을 끊어 배양 용기에서 부착성 포유류 세포를 분리하는 데 사용되며, 이때 EDTA는 2가 양이온을 킬레이트화하여 세포 간 접착을 파괴합니다.
ViraPower 렌티바이러스 패키징 믹스ThermoFisher ScientificK497500최적화된 패키징 플라스미드 혼합물(pLP1, pLP2 및 pLP/VSVG)은 생산 세포로의 공동 형질도입(co-transfection)에 활용되어, 고역가의 조립 및 복제 불능 렌티바이러스 발현 벡터 생산을 용이하게 합니다.

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