본 논문은 설치류의 동적 대비 증강 MRI(DCE-MRI) 연구에 최적화된 뇌실 내 캐뉼라 삽입 및 추적자 주입 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜을 통해 영상 획득 중에 추적자를 지속적으로 전달할 수 있어, 단일한 무중단 영상 촬영 세션 내에서 추적자의 운송 및 뇌 내 제거 과정에 대한 전뇌 매핑이 가능합니다.
이 논문에서
요약
초록
뇌실 내(ICV) 캐뉼라 삽입술을 통해 뇌척수액(CSF) 순환 경로의 기점인 외측 뇌실로 외인성 추적자 또는 치료제를 직접 전달할 수 있습니다. 주입된 분자들은 뇌척수액의 벌크 흐름(bulk flow)에 의해 뇌실 구획을 거쳐 지주막하 공간으로 운반되며, 이후 뇌 실질로 진입합니다. ~을 통해 혈관주위 공간(perivascular space). 그러나 기존의 뇌실 내(ICV) 캐뉼라 삽입법은 일반적으로 강자성 캐뉼라를 사용하는데, 이는 MRI 연구와 호환되지 않아 스캐너 외부에서 주입을 수행하고 영상 촬영 전 캐뉼라를 제거해야 한다. 동물 이동 및 영상 촬영 설정에 소요되는 시간으로 인해 추적자 운송의 초기 단계이자 아마도 가장 결정적인 단계의 데이터를 놓치는 경우가 많다. 본 연구에서는 동적 MRI 획득 중에 스캐너 내부에서 추적자를 지속적으로 전달할 수 있는, 설치류를 위한 MRI 호환 ICV 캐뉼라 삽입 및 주입 프로토콜을 기술한다. 주입 라인은 전체가 비자성 물질로 제작되어 단일 세션 내에서 중단 없는 영상 획득이 가능하다. 이러한 접근 방식은 뇌척수액(CSF) 역학, 글림파틱 운송(glymphatic transport), 용질 제거 및 척수강 내 약물 전달의 동적 조영 증강 MRI 연구에 매우 적합하다.
서론
뇌는 신체에서 대사적으로 가장 활발하고 역동적인 기관 중 하나로, 정상적인 신경 기능을 유지하기 위해 효율적으로 제거되어야 하는 노폐물을 지속적으로 생성합니다1. 대사 노폐물의 축적은 신경 퇴행 및 뇌 노화의 특징입니다2. 글림파틱 체계(glymphatic system)는 이러한 제거 과정에서 중심적인 역할을 하며, 대량의 뇌척수액(CSF) 흐름과 뇌척수액과 간질액(ISF)의 교환을 통해 대사 부산물 및 독성 노폐물의 제거를 촉진하는데3,4,5, 이 과정은 성상교세포 종말발(astrocytic endfeet)에 위치한 aquaporin-4 (AQP4) 수분 통로에 의해 촉진됩니다6. 다양한 CSF 추적자의 이동을 연구함으로써 CSF 역학에 대한 상당한 이해를 얻을 수 있었습니다. 가돌리늄 기반 조영제(GBCAs)를 이용한 동적 대비 증강 MRI (DCE-MRI)는 뇌 전체의 추적자 이동을 평가하는 데 특히 적합합니다7,8. 이 접근법의 임상적 관련성은 인간을 대상으로 한 중개 연구를 통해 입증되었습니다. 인간의 뇌에서 CSF 역학을 평가하기 위해 GBCAs를 척수강 내로 투여한 후 연속적인 MRI 촬영이 수행되었습니다9. 후속 연구에서는 뇌 전체의 추적자 이동과 이후 하룻밤 동안의 제거 과정이 입증되었습니다10. 최근 이 접근법을 적용하여 두개강 내 압력-부피 예비 용량이 감소한 피험자와 특발성 정상압 수두증 환자에서 동맥 주위 추적자 이동이 손상되었음을 밝혔습니다11. 이러한 연구들은 CSF 추적자 이동의 DCE-MRI가 임상적으로 적용 가능한 접근법임을 확립하였으며, CSF 역학 및 노폐물 제거 조절의 기전적 조사를 위한 엄격하고 재현 가능한 전임상 방법의 개발 동기를 제공합니다.
추적자 전달을 위한 글림파틱 연구에서는 대조정맥강(intra-cisterna magna, ICM) 캐뉼라 삽입법이 일반적으로 사용됩니다.12하지만 전달된 GBCAs의 약 20%만이 ~을 통해 이 경로는 뇌 실질로 운반되며, 대부분은 척수나 림프관으로 직접 배출됩니다.8이러한 접근 방식은 소뇌나 뇌간을 손상시킬 위험이 있으며, 종단 연구를 위해 캐뉼라를 고정하는 것은 여전히 기술적으로 까다롭습니다. 이에 따라 뇌실 내(ICV) 캐뉼라 삽입법이 더 견고한 대안으로 부상했습니다.13,14,15최근의 연구를 통해 형광 추적물질을 전달하는 데 있어 본 방법의 재현성과 주요 장점이 입증되었으며, 여기에는 동물의 자유로운 이동을 가능하게 하여 종단적 연구에서 반복적인 추적물질 주입을 지원하는 안정적인 캐뉼라 고정 방식이 포함됩니다.13.
이러한 장점에도 불구하고, 기존의 ICV 캐뉼라 삽입 프로토콜은 MRI 연구와 직접적으로 호환되지 않습니다16. ICV 캐뉼라 삽입은 뇌 실질의 관통이 필요하기 때문에 일반적으로 강자성 캐뉼라를 사용하며, 이는 MRI 영상에서 심각한 자화율 아티팩트를 유발합니다. 그 결과, 추적자 주입은 스캐너 외부에서 수행되어야 하며, 동물을 영상 촬영을 위해 이동시키기 전에 캐뉼라를 제거해야 합니다. 전형적인 작업 흐름은 기저 스캔을 획득하고, 캐뉼라 삽입 및 추적자 주입을 위해 동물을 꺼낸 후, 후속 동적 스캔을 위해 동물을 다시 배치하는 과정을 포함합니다. 이렇게 중단된 작업 흐름은 기저치 기준의 연속적인 획득을 방해하며, 복셀별 동역학 분석을 혼동시킬 수 있는 재배치 정렬 오류를 야기합니다. 더욱 중요한 점은, 초기 섭취 단계가 일반적으로 추적자 동역학에서 가장 역동적이면서도 일시적인 부분이기 때문에, 이 시간 window 동안 동물을 이동시키고 스캐너 설정을 수행하면 가장 유용한 데이터가 손실된다는 것입니다.
본 연구에서는 MRI 호환 ICV 주입 라인과 스캐너 내 조영제 전달 기능을 통합하여 설치류의 연속적인 동적 MRI 획득이 가능하게 함으로써 기존의 한계점을 해결한 프로토콜을 제시합니다. 이러한 접근 방식은 단일한 중단 없는 영상 촬영 세션 내에서 뇌척수액(CSF) 추적자의 운송에 대한 정량적인 전뇌 매핑을 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 뇌 전체의 CSF 역동성, 글림파틱 운송 및 용질 제거 동역학을 연구하는 데 적합합니다. 본 프로토콜은 성체 랫(rat)을 대상으로 설명되었으나, 캐뉴레이션 좌표와 주입 파라미터를 적절히 조정하면 마우스에도 적용할 수 있습니다15.
프로토콜
아래에 기술된 프로토콜은 실험동물 보호 및 사용 가이드라인과 실험동물의 인도적 보호 및 사용에 관한 공중보건서비스 정책에 따라 Case Western Reserve University의 기관동물관리 및 사용위원회(IACUC, A-3145-01-2023-0015)의 승인을 받았습니다. 사용된 시약 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 주입 라인 준비
- 톱니 가위로 30-mm 길이의 구리 캐뉼라 분절과 2-m 길이의 폴리에틸렌(PE) 튜브를 자릅니다.
- 현미경 하에서 30 G 바늘을 사용하여 PE 튜브의 한쪽 끝을 조심스럽게 넓힌 다음, 확장된 끝부분에 구리 캐뉼라를 삽입하고 접합부를 시아노아크릴레이트 접착제로 고정합니다. PE 튜브의 반대쪽 끝을 30 G 바늘에 연결합니다.
참고: 구리는 연성이 매우 높으므로 절단 시 내강이 찌그러지지 않도록 주의하십시오. 조립 중에 캐뉼라가 변형되거나 튜브가 뚫리지 않도록 하십시오. PE 튜브의 길이는 시린지 펌프를 스캐너의 주변 자기장 외부에 배치할 수 있을 정도여야 합니다. - 캐뉼라-튜브 조립체에 탈기된 추적자 용액을 채우고 이를 50 µL Hamilton 시린지에 연결합니다. 누출을 방지하기 위해 시린지 팁을 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 나사 밀봉 테이프로 감쌉니다. 이 과정에서 공기 방울이 유입되지 않도록 주의하십시오.
- Hamilton 시린지를 시린지 펌프에 장착하고 30 µL의 추적자 용액을 시린지로 추가로 흡입합니다.
2. 캐뉼라 삽입 절차
- 쥐의 체중을 측정하고 케타민(90 mg/kg)과 자일라진(10 mg/kg)을 복강 내 주사하여 마취합니다. 발가락 꼬집기 반사(toe pinch reflex)를 통해 마취 깊이가 적절한지 확인합니다. 필요한 경우 초기 용량의 3분의 1을 추가 투여하고, 진행 전 다시 확인합니다.
- 머리와 목 부위를 삭모하고 잔털을 제거한 후, 70% 에탄올 패드로 노출된 피부를 소독합니다.
- 쥐를 정위 고정기(stereotaxic frame)에 고정하고, 동물 아래에 흡수성 종이로 덮인 가열 패드를 배치합니다. 각막 건조를 방지하기 위해 양쪽 눈에 안연고를 도포합니다.
- 코 클램프를 조절하여 두개골의 수평을 맞춥니다. 정중앙 절개를 시행하고 네 개의 지혈 클립으로 피부를 견인하여 브레그마(bregma)와 람다(lambda)를 노출시킵니다. 두개골에 3% 과산화수소를 도포하여 잔여 골막을 제거하고 랜드마크의 가시성을 높입니다.
참고: 정확한 두개골 수평 맞추기는 재현 가능한 캐뉼라 삽입을 위해 매우 중요합니다. 실질적인 품질 관리 조치로서, 브레그마와 람다에서의 내외측(ML) 및 배복측(DV) 좌표를 비교하십시오. 두개골 수평이 제대로 맞았다면, 두 랜드마크 간의 차이가 ML 또는 DV 축 모두에서 0.2 mm를 초과하지 않아야 합니다. - 미세 드릴 비트가 장착된 전동 드릴을 정위 고정기 암에 장착하고, 암이 단단히 잠겼는지 확인합니다.
- 드릴 비트를 브레그마에 위치시킨 후, 후방으로 0.7 mm, 우측 외측으로 1.4 mm 이동합니다. 드릴 비트가 두개골 표면에 닿을 때까지 내린 후 DV 좌표를 기록합니다.
- 현미경 관찰 하에 드릴을 0.1 mm씩 단계적으로 전진시킵니다. 두개골이 관통되면 즉시 중단합니다(성체 쥐의 일반적인 두개골 두께는 0.3–0.4 mm입니다).
- 정위 고정기 암의 드릴을 미리 장착된 캐뉼라로 교체합니다. 주입 펌프를 짧게 작동시켜 캐뉼라 팁에서 액체가 막 나오기 시작하는지 확인하여 유로에 막힘이 없음을 확인합니다.
- 캐뉼라가 두개골 표면에 수직으로 장착되었는지 확인한 후, 천공 부위(burr hole) 위에 정렬합니다. 캐뉼라를 0.1 mm/s의 속도로 전진시켜 경막 표면 아래 최종 목표 깊이인 3.5 mm까지 삽입합니다.
- 캐뉼라와 두개골의 접합부에 조직 접착제를 한 방울 도포합니다. 접착제가 경화되면 봉합사로 두피 절개 부위를 닫고, MRI 코일과의 접촉을 피하기 위해 구리 캐뉼라를 두개골 표면과 평행하게 조심스럽게 구부립니다.
3. MRI 설정 및 동적 획득
- 볼륨 송신 코일을 스캐너의 등중심점에 배치하십시오.
- 동물을 MRI 호환 크래들에 엎드린 자세(prone position)로 옮깁니다. 호흡 센서와 직장 온도 프로브를 포함한 생체 신호 모니터링 시스템을 연결합니다. 체온을 ~로 유지하기 위해 순환식 온수욕조를 켭니다.37 °C.
- 추가적으로 공급되는 이소플루레인(isoflurane)을 사용하여 스캔 세션 전반에 걸쳐 적절한 마취 상태를 유지하십시오. ~을 통하여 / ~을 통해 코 콘(nose cone). 호흡수를 분당 50~70회로 유지하기 위해 이소플루란(isoflurane) 농도를 0.25%에서 1.0% 사이로 조절하십시오.
참고: 캐뉼라 삽입 수술 전 투여한 케타민-자일라진 마취로 인해 MRI 크래들로 처음 이동하는 동안 잔여 진정 효과가 유지됩니다. 이소플루레인을 점진적으로 도입하고 스캔하는 동안 호흡수를 지속적으로 모니터링하십시오.
주의: 이소플루란(Isoflurane)은 흡입 위험이 있는 휘발성 제제이므로, 능동형 가스 제거 장치를 사용하고 작업자 노출을 최소화하십시오. - 인퓨전 펌프를 자기장 주변 영역(magnet fringe field) 밖에 두고, 주입 속도를 다음으로 설정하십시오. 1 µL/min 그리고 주입 시간을 20분으로 설정하며, 이는 총 주입량인 다음 수치에 해당합니다. 20 µL주입 라인이 당겨지거나 위치가 변하지 않도록 크레이들(cradle)을 따라 주의 깊게 배치하고 고정하십시오.
주의: 강자성체는 MRI 스캐너 근처에 놓일 경우 위험한 발사체가 될 수 있습니다. 모든 MRI 비호환 장비는 주변 자기장(fringe field) 외부로 유지하십시오. - 표면 어레이 코일을 뇌 중심의 두개골 등쪽에 직접 장착하십시오. 코일과 절개 부위 사이에 흡수성 종이를 작게 잘라 배치하여 상처에서 나오는 삼출물을 흡수하도록 하십시오.
- 뇌가 등중심점(isocenter)에 위치할 때까지 크레들(cradle)을 자석 안으로 전진시키십시오. 주입 라인과 생체 신호 모니터링 리드선이 방해받지 않고 유지되는지 확인하십시오.
- 초기 스캐너 설정을 수행하고 해부학적 영상을 획득하여 캐뉼라가 성공적으로 배치되었는지 확인하십시오.
- 기초 영상을 획득한 후, 주입 펌프와 동적 스캔을 동시에 시작하고 총 3시간 동안 획득을 계속하십시오(참조 표 1 (취득 세부 사항 참조).
결과
수술 워크스테이션은 측뇌실을 표적으로 드릴을 정밀하게 배치할 수 있도록 구성됩니다 (bregma 기준 후방 0.7 mm 및 외측 1.4 mm; 그림 1A,D). 주입 라인은 30-mm 구리 캐뉼라, 2-m 길이의 PE 튜브 세그먼트, 그리고 Hamilton 주사기에 연결된 30 G 바늘로 구성됩니다 (그림 1B). 튜브 길이를 연장함으로써 주사기 펌프를 스캐너의 주변 자기장 외부로 배치할 수 있습니다. 천공 드릴링 후, 미리 준비된 주입 라인을 정위 고정 장치 암에 장착하고, 캐뉼라를 경막 표면 아래 3.5 mm 깊이까지 측뇌실 내부로 진입시킵니다 (그림 1C). 고정이 완료되면, MRI 코일과의 접촉을 방지하기 위해 캐뉼라를 두개골 표면과 평행하게 구부립니다 (그림 1E).
성공적인 ICV 캐뉼라 삽입은 뇌실 시스템과 캐뉼라 경로가 명확히 분해된 해부학적 영상을 통해 확인할 수 있으며, 이를 통해 시상면(그림 2A) 및 축면(그림 2B) 뷰 모두에서 뇌실 내강 내의 캐뉼라 팁을 직접 시각화할 수 있습니다. 이러한 영상은 또한 DCE-MRI 스캔에서 캐뉼라가 잘못 배치된 동물을 제외하는 것을 가능하게 하는데, 여기에는 팁이 뇌량 내에서 끝나는 과소 삽입과 팁이 시상까지 연장되는 과다 삽입이 포함됩니다. DCE-MRI 스캔에서 추적자의 시공간적 분포는 정확한 캐뉼라 배치를 추가로 확인해 줄 수 있는데, 이는 잘못 배치된 경우 추적자가 뇌 실질로 전달되어 뇌실 추적자 전파와 일치하지 않는 역학을 나타내기 때문입니다.
DCE-MRI 스캔의 경우, 기저선 획득 후에 조영제의 ICV 주입이 시작되며, 동적 이미지 획득은 최대 3시간 또는 그 이상 지속될 수 있습니다(그림 2C). 그림 2D는 조영제 주입 후 서로 다른 시점에서 획득한 대표적인 3D T1 가중 영상을 보여줍니다. 20분간의 주입이 끝날 무렵, 주입된 (동측) 측뇌실, 제3뇌실, 제4뇌실 및 대조(cisterna magna)에서 이미 조영 증강이 뚜렷하게 나타나며, 이는 뇌실-지주막 경로를 통한 추적자의 빠른 벌크 흐름 전파를 반영합니다. 동측 측뇌실 주변의 실질에서도 신호 증강이 관찰되며, 이는 뇌실막을 통해 뇌실 주변 조직으로 추적자가 이동했음을 시사합니다.
자기공명 핑거프린팅(MRF; 그림 3)을 이용한 T1 및 T2 매핑과 같은 파라메트릭 매핑 기술을 사용하면 조영제 수송에 대한 더 정량적인 평가를 얻을 수 있습니다. 뇌척수액강 전반에서 T1은 주입 중에 빠르게 감소하며, 동측 측뇌실에서 제3뇌실과 제4뇌실로 전파되고, 대조조(cisterna magna)에서는 T1 단축 시작이 약간 지연되어 나타납니다. 뇌실내(ICV)로 투여된 조영제는 뇌 실질로의 광범위한 침투 또한 보여주는데, 뇌실 주변 영역(근위부)에서는 더 빠르고 뚜렷한 T1 감소가 나타나는 반면, 더 먼 원위부 영역에서는 T1 감소가 지연되고 감소된 형태로 나타납니다. 3시간 스캔 프로토콜을 통해 뇌 실질에서 조영제가 제거되는 과정을 T1 회복의 역학으로 평가할 수 있습니다. 종합적으로, 이 프로토콜은 단일 연속 MRI 세션 내에서 빠른 뇌실 분포, 뇌척수액강 내 전파, 실질 흡수 및 이후의 제거를 포함한 CSF 추적자 수송의 주요 단계들을 동적으로 모니터링할 수 있도록 지원합니다.
그림 1: MRI 호환 ICV 캐뉼라 삽입을 위한 외과적 설정 및 주입 라인 조립. (A) 외과적 워크스테이션. 천공술(burr-hole drilling)을 위해 전기 드릴이 수술 부위 위에 배치되어 있다. (B) 조립된 주입 라인으로, 30 G 바늘(빨간색 화살표), 2-m 폴리에틸렌 튜브 세그먼트(초록색 화살표), 30-mm 구리 캐뉼라(파란색 화살표)로 구성된다. (C) 캐뉼라 식립을 위해 정위 고정 장치(stereotaxic arm)에 장착된 사전 로드된 주입 라인. (D) 캐뉼라 식립을 위한 좌표. (E) 봉합 전 최종 모습; MRI 코일과의 접촉을 피하기 위해 구리 캐뉼라를 두개골 표면과 평행하게 굽혔다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: ICV 주입 후 캐뉼라 배치 및 조영제 이동의 동적 모니터링. (A,B) 각각 시상면 및 축상면 해부학적 영상에서의 캐뉼라 배치(빨간색 화살표) 시각화. (C) 영상 프로토콜의 모식도. (D) 선택된 시간대의 시상면(상단), 축상면(중단), 관상면(하단) 뷰에서의 대표적인 3D T1-가중 영상. 스케일 바, 5 mm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
그림 3: 자기공명 핑거프린팅(MRF)을 이용한 추적자 이동의 정량적 평가. (A) ICV 주입 후 특정 시점에서 3D MRF 데이터로부터 재구성한 T1 (상단) 및 T2 (하단) 맵. 스케일 바, 5 mm. (B) 동측 외측 뇌실(LV), 제3뇌실(V3), 제4뇌실(V4) 및 대조조(CM)를 포함한 뇌척수액 구획 내의 평균 T1 시간 경과 곡선. 회색 음영 영역은 20분간의 주입 기간을 나타냄. (C) V4 및 동측 LV에 인접한 실질 조직의 평균 T1 시간 경과 곡선. 시간 경과 곡선을 위한 ROI의 위치는 (A)에 표시되어 있음. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4ICV 주입 후 CSF 추적자의 이동 모식도. (A) 추적자 주입을 묘사한 시상면도 ~을 통해 ICV 캐뉼라와 이후 뇌실계를 통해 지주막하 공간으로 이어지는 대량 흐름 분포(빨간색 화살표), 그리고 뇌실막을 가로질러 인접한 뇌 실질로 이동하는 경로(파란색 화살표). LV: 측뇌실; V3: 제3뇌실; V3v: 제3뇌실 복측; V4: 제4뇌실; CM: 대조(cisterna magna).B( ) 내 박스 영역의 확대 모식도A) CSF-ISF 교환 경로를 나타낸 그림. CSF는 성상교세포 종말발(astrocytic endfeet)에 발현된 아쿠아포린-4(AQP4) 수분 통로의 도움을 받아 혈관 주변 공간(para-arterial space)을 통해 실질로 유입되며, 간질 공간을 통해 대류 흐름으로 이동한 후 유출된다. ~을 통해 / ~을 경유하여 정맥 주위 공간에서 배출 정맥으로. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
| 매개변수 | DCE-MRI (3D FLASH) | 3D 자기공명플루오린(MRF) |
| 서열 유형 | T1-가중 3D FLASH | 3D MRF (스택-오브-스파이럴) |
| TR / TE (ms) | 20.0 / 2.7 | 10.0 / 2.0 |
| 플립 각도 | 10° | 가변 (가변-플립각 일정) |
| 자화 준비 | 제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요. | 반전 또는 T2 준비 (8개 세그먼트 중 6개) |
| 시야 | 36 × 24 × 24 mm³ | 60 × 60 mm² (평면 내); 15 mm (평면 외) |
| 매트릭스 크기 | 144 × 96 × 96 | 300 × 300 (면내); 30 (면외) |
| 공간 분해능 | 0.25 mm 등방성 | 0.2 × 0.2 mm² (면내); 0.5 mm (면외) |
| 시간 분해능 | 프레임당 3분 | 프레임당 7분 |
| k-공간 궤적 | 데카르트의 | 스택-오브-스파이럴 궤적; 완전 샘플링을 위한 48개 인터리브 |
| 가속도 | 없음 (단일 평균) | 48배 (24× 인플레인, 2× 평면 관통) |
| 참고 | 모든 영상 실험은 ParaVision 360 v3.4 플랫폼에서 작동하는 9.4 T Bruker BioSpin 시스템을 사용하여 수행되었습니다. 송신기로는 86-mm quadrature 볼륨 코일을 사용하였으며, 수신기로는 4채널 표면 어레이 코일을 사용하였습니다. | |
표 1: MRI 획득 파라미터.
토론
본 프로토콜은 ICV 캐뉼라 삽입을 스캐너 내 주입 및 동적 MRI 획득과 통합하여, 단 한 번의 영상 촬영 세션 내에서 뇌 전체의 CSF 추적자 운송을 정량적으로 평가할 수 있게 합니다. ICV 주입의 가치와 한계는 ICM 주입과 비교했을 때 가장 잘 평가됩니다. ICM 주입은 뇌 실질을 관통하는 캐뉼라 삽입을 피하므로 침습성이 더 낮습니다. 그러나 대조조(cisterna magna)가 CSF 순환 경로의 중간에 위치하기 때문에, 특히 높은 주입 속도에서의 ICM 주입은 CSF 순환을 유도하는 압력 구배의 일시적인 역전을 일으킬 수 있습니다17. 더 중요한 점은, ICM으로 투여된 추적자는 하류의 지주막하 공간과 이후 혈관주위 공간으로 빠르게 분포된다는 것입니다. 성상교세포 말단발의 AQP4 채널이 CSF-ISF 교환을 촉진하지만, 이 채널들은 GBCAs의 큰 분자 크기로 인해 투과성이 없습니다. 결과적으로 ICM 투여 추적자는 ICV 주입에 비해 뇌 실질에서의 조영 증강이 현저히 감소하여15, 뇌의 용질 제거 연구에 ICM 주입이 덜 적합하게 만듭니다. ICV 주입은 추적자를 내인성 CSF 생성 부위 근처에 전달함으로써 이러한 한계를 해결합니다13,14. 또한, ICV 주입 중의 압력 및 농도 구배는 추적자가 뇌실막 층을 통해 직접 운송되는 것을 촉진하여13,14,15, 이러한 추적자들을 노폐물 제거의 마커로 사용할 수 있게 합니다 (그림 4).
재현 가능한 결과를 얻기 위해서는 몇 가지 기술적 세부 사항이 매우 중요합니다. 뇌실의 크기가 매우 작아 캐뉼라 배치 시 허용 오차 범위가 매우 좁으므로, 측뇌실을 일관되게 타겟팅하기 위해서는 정확한 두개골 수평 잡기가 필수적입니다. 막힘이나 누출이 없는 주입 라인을 조립하는 것 또한 마찬가지로 중요합니다. 기포나 부분적인 폐쇄는 주입 프로파일을 변화시켜 초기 단계 역학의 해석을 저해할 수 있으며, 최악의 경우 큰 기포가 라인을 완전히 막아 실험 실패로 이어질 수 있습니다. MRI 설정 중에 흔히 발생하는 문제로는 시린지-바늘 접합부의 누출이 있으며, 이는 PTFE 나사 밀봉 테이프로 완화할 수 있습니다. 또한 크래들 삽입 시 주입 라인에 가해지는 장력은 튜브를 크래들을 따라 고정하여 당겨지거나 꺾이지 않도록 함으로써 방지할 수 있습니다.
여기에서 제시된 표적 좌표와 삽입 깊이는 12주령의 Wistar 랫트에 최적화되었으며, 다른 연령이나 계통의 경우에는 조정이 필요할 수 있습니다. ICV 주입은 더 작은 체중과 뇌실 크기를 고려하여 적절히 수정하면 마우스에서도 수행할 수 있습니다15. 주입 속도와 총 부피는 분자 크기 및 이완도(relaxivity)를 포함한 추적자의 물리화학적 특성에 따라 조정할 수 있습니다. 다만, 뇌실 구획의 부피가 작으므로 주입 속도가 너무 빠르면 뇌실압이 크게 증가할 수 있어 주의해서 사용해야 합니다. 또한, 본 연구에서 사용된 구리 캐뉼라는 경막을 관통하고 실질을 한 번의 직선 경로로 가로지르는 데 필요한 기둥 강도를 제공합니다. 구리의 연성 특성 덕분에 쉽게 구부릴 수 있어 공간이 제한된 코일 구성에서 유리합니다18. 캐뉼라의 매립 길이가 짧기 때문에 RF 유도 가열은 최소화됩니다. 그러나 구리가 과도하게 부식되면 자유 구리 이온이 방출되어 신경독성을 유발할 수 있으므로, 구리 캐뉼라는 만성 이식에는 적합하지 않을 가능성이 높습니다. 돌출된 캐뉼라를 수용할 수 있는 코일 구성의 경우에는 실리카 또는 PEEK 카테터가 이러한 독성 문제를 피하면서 삽입에 충분한 기계적 강도를 제공합니다14,19,20.
여기에서 사용된 조영제(Gd-DOTA)는 분자량이 558.65 Da로, 젖산(90 Da) 및 포도당(180 Da)과 같은 내인성 대사 용질보다 수 배 더 크지만, 아밀로이드-β 단량체(~4.5 kDa) 또는 tau(~45–65 kDa)와 같이 신경퇴행성 질환에서 관심 대상이 되는 더 큰 단백질 기반 응집체보다는 훨씬 작습니다. 이러한 특성으로 인해 GBCA는 소분자 용질 제거 동태의 적절한 대리 지표가 될 수 있으나, 그 결과를 더 큰 거대분자 용질의 제거에 직접적으로 외삽해서는 안 됩니다. 또한, AQP4 수분 통로는 GBCA에 대해 투과성이 없으므로, AQP4에 의해 촉진되는 CSF-ISF 교환에 이 결과를 직접적으로 외삽할 수 없습니다.
본 연구에서는 타당성을 입증하기 위해 캐뉼라 삽입 절차 직후에 영상 촬영 세션을 진행하였습니다. 캐뉼라 식립이 글림파틱 기능을 억제할 수 있는 염증 반응을 유발할 수 있으며13, 24시간의 대기 기간을 거치면 글림파틱 기능이 기저 수준으로 회복될 수 있다는 점에 유의해야 합니다21. 연구자들은 글림파틱 기능 조사를 목적으로 하는 연구를 설계할 때 이러한 요인을 고려해야 합니다. 또한, 이전 연구에 따르면 케타민/자일라진 마취 하에서의 뇌척수액(CSF) 유입량이 이소플루레인 마취 하에서보다 더 높은 것으로 보고되었습니다18. 이에 따라 본 프로토콜에서는 초기 유도를 위해 케타민/자일라진을 사용합니다. 그러나 단회 투여된 케타민/자일라진만으로는 캐뉼라 삽입과 영상 촬영이 결합된 전체 프로토콜 기간 동안 안정적인 마취 상태를 유지하기에 불충분합니다. 여기서 사용된 마취 요법은 덱스메데토미딘과 저용량 이소플루레인을 사용한 이전 연구를 바탕으로 수정되었습니다22. 이는 장시간의 프로토콜 동안 생리적 안정성을 유지하는 것과 마취로 인한 글림파틱 기능 억제를 최소화하는 것 사이의 절충안을 나타냅니다.
이러한 장점에도 불구하고, ICV 주입에는 몇 가지 한계가 있습니다. 두개강 내 CSF의 부피가 작기 때문에 (~300 µL)23, 주입할 수 있는 추적자의 양이 제한적입니다. 또한, 주입 속도(1 µL/min)가 CSF 생성 속도(~1.6 µL/min)23,24와 비슷하여, 주입 중에 뇌실압의 일시적인 증가가 예상됩니다. 주입 부피나 속도를 줄이면 이 문제를 부분적으로 완화할 수 있으나, 추적자 부피가 작아지면 검출 민감도가 떨어질 수 있고, 주입 속도를 늦추면 압력 증가를 완전히 억제하지 못한 채 전체 주입 시간만 연장됩니다. 따라서 주입 기간 동안의 추적자 이동 역학을 해석할 때는 주의가 필요하지만, 이러한 제한 사항이 이후의 분포 및 제거 단계에 대한 신뢰할 수 있는 특성 분석을 방해하지는 않습니다. 종합적으로, 이 MRI 호환 ICV 주입 프로토콜은 in vivo에서 CSF 추적자 이동의 전체 시간 경과를 포착할 수 있는 실용적이고 유연한 플랫폼을 제공하며, CSF 역학, 용질 제거 및 질병으로 인한 이러한 기능의 손상을 연구하는 새로운 길을 열어줍니다.
공개 사항
저자들은 공개할 이해관계 충돌이 없습니다.
감사의 글
본 연구는 보조금 번호 R01NS124206 및 RF1AG094791에 의거하여 미국 국립보건원(NIH)의 지원을 받았습니다. 본 콘텐츠의 내용은 전적으로 저자들의 책임이며, 반드시 국립보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 그림 4는 BioRender.com을 통해 제작되었습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 플라스틱 허브가 포함된 30 G x 1인치 피하 주사 바늘 | 엑셀 | 26439 | |
| 50 µL, 가스 기밀 시린지, 루어 팁 (LT) | 해밀턴 | 80901 | |
| 해부학적 협폭 포셉 | Fine Science Tools | 11003-12 | |
| 인공 뇌척수액 | TOCRIS | 3525 | |
| Attane Isofluran 1000 mg/g | ScanVet | 55226 | |
| 구리 모세관 튜브 0.32 mm 외경 × 0.16 mm 내경(ID) | Nippon Tokushukan Mfg. Co., Ltd. | C1220-11-109 | |
| 구리 클립 | IEUYO | FEBA 1801 | |
| 면봉 | 퓨리턴 | 868-WCS | |
| Dotarem (gadoterate meglumine) 주사제, 0.5 mmol/mL | Guerbet | NDC 67684-2001-1 | |
| 드릴 | 앞단추 (또는 서두/도입부) | 모델 SR | |
| 드릴 비트 | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| 드릴 홀더 | Stoelting | 51630 | |
| Dumont 의료용 포셉 | Fine Science Tools | 11252-00, 11253-20 | |
| 안연고 | 럭비 | NDC 0536 | |
| E-Z Anesthesia EZ-7000 Classic System | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| 그레페 포셉 (Graefe Forceps) | Fine Science Tools | 11052-10,11152-10 | |
| 가열 패드 | Braintree Scientific | 5381 | |
| 고온 소작 키트 | Fine Science Tools | 18010-00 | |
| Ketaminol Vet 100 mg/mL (케타민) | Intervet International BV | 511519 | |
| KWIK-SIL 실리콘 접착제, 저독성, 키트 | World Precision Instruments | KWIK-SIL | |
| 바늘 5/8인치 일회용, 멸균, 26 G | BD | 305115 | |
| 폴리에틸렌 튜브 외경 0.61 mm × 0.28 mm 내경(ID) | Scandidact | SKU252 | |
| Rompin Vet 20 mg/mL (xylazine) | KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH | 148999 | |
| 메스 날 | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| 가위 | Fine Science Tools | 91460-11, 14007-14 | |
| 스패튤라 | Fine Science Tools | 10090-13 | |
| 정위 고정 장치 | Stoelting | 51600U | |
| 수술용 지침기 | AgnTho’s | 12502-12 | |
| 주사기 펌프 | New Era 펌프 시스템 | NE-4000 | |
| Xylocain 20 mg/mL (리도카인) | AstraZeneca | 158543 |
참고문헌
- Balasubramanian V. Brain power. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021;118:e2107022118.
- Mattson MP, Arumugam TV. Hallmarks of brain aging: adaptive and pathological modification by metabolic states. Cell Metab. 2018;27:1176-1199.
- Iliff JJ, Wang M, Liao Y, Plogg BA, Peng W, Gundersen GA, et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid β. Sci Transl Med. 2012;4. doi:10.1126/scitranslmed.3003748.
- Nedergaard M. Garbage truck of the brain. Science. 2013;340:1529-1530.
- Benveniste H, Lee H, Volkow ND. The glymphatic pathway: waste removal from the CNS via. cerebrospinal fluid transport. Neuroscientist. 2017;23:454-465.
- Mestre H, Hablitz LM, Xavier AL, Feng W, Zou W, Pu T, et al. Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain. eLife. 2018;7:e40070.
- Iliff JJ, Lee H, Yu M, Feng T, Logan J, Nedergaard M, et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. J Clin Invest. 2013;123:1299-1309.
- Benveniste H, Lee H, Ozturk B, Chen X, Koundal S, Vaska P, et al. Glymphatic cerebrospinal fluid and solute transport quantified by MRI and PET imaging. Neuroscience. 2021;474:63-79.
- Eide PK, Ringstad G. MRI with intrathecal MRI gadolinium contrast medium administration: a possible method to assess glymphatic function in human brain. Acta Radiol Open. 2015;4:2058460115609635.
- Ringstad G, Valnes LM, Dale AM, Pripp AH, Vatnehol SAS, Emblem KE, et al. Brain-wide glymphatic enhancement and clearance in humans assessed with MRI. JCI Insight. 2018;3:e121537.
- Eide PK, Ringstad G. Functional analysis of the human perivascular subarachnoid space. Nat Commun. 2024;15:2001.
- Xavier ALR, Hauglund NL, von Holstein-Rathlou S, Li Q, Sanggaard S, Lou N, et al. Cannula implantation into the cisterna magna of rodents. J Vis Exp. 2018;(135):57378.
- Gahn-Martinez D, Giannetto MJ, Chang E, Beam N, Tobin P, Plá V, et al. Chronic intraventricular cannulation for the study of glymphatic transport. eNeuro. 2025;12:ENEURO.0537-24.2025.
- Decker Y, Müller A, Proulx ST. Contrast agent clearance dynamics and diffusion in the mouse brain after ventricular administration. Adv Sci (Weinh). 2025;12:2501502.
- Zhu Y, Zhu J, Ni C, Chen A, Li L, Gao Y, et al. Impact of infusion conditions and anesthesia on CSF tracer dynamics in mouse brain. Fluids Barriers CNS. 2026;23:23.
- DeVos SL, Miller TM. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. J Vis Exp. 2013;(75):50326.
- Ding G, Chopp M, Li L, Zhang L, Davoodi-Bojd E, Li Q, et al. MRI investigation of glymphatic responses to Gd-DTPA infusion rates. J Neurosci Res. 2018;96:1876-1886.
- Stanton EH, Persson NDÅ, Gomolka RS, Lilius T, Sigurðsson B, Lee H, et al. Mapping of CSF transport using high spatiotemporal resolution dynamic contrast-enhanced MRI in mice: effect of anesthesia. Magn Reson Med. 2021;85:3326-3342.
- Berger ML, Reither H, Schmid RW, Lassmann H. Manufacture and use of fused silica cannulas for intracerebral injections in freely moving rats. J Neurosci Methods. 1989;27:225-234.
- Zhang J, Tian W, Chen J, Yu J, Zhang J, Chen J. The application of polyetheretherketone (PEEK) implants in cranioplasty. Brain Res Bull. 2019;153:143-149.
- Plá V, Bork P, Harnpramukkul A, Olveda G, Ladrón-de-Guevara A, Giannetto MJ, et al. A real-time in vivo. clearance assay for quantification of glymphatic efflux. Cell Rep. 2022;40:111320.
- Benveniste H, Lee H, Ding F, Sun Q, Al-Bizri E, Makaryus R, et al. Anesthesia with dexmedetomidine and low-dose isoflurane increases solute transport via. the glymphatic pathway in rat brain when compared with high-dose isoflurane. Anesthesiology. 2017;127:976-988.
- Chiu C, Miller MC, Caralopoulos IN, Worden MS, Brinker T, Gordon ZN, et al. Temporal course of cerebrospinal fluid dynamics and amyloid accumulation in the aging rat brain from three to thirty months. Fluids Barriers CNS. 2012;9:3.
- Karimy JK, Kahle KT, Kurland DB, Yu E, Gerzanich V, Simard JM. A novel method to study cerebrospinal fluid dynamics in rats. J Neurosci Methods. 2015;241:78-84.
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