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방법 논문

기질 기반 면역조직화학법을 이용한 면역능이 있는 교모세포종 줄기세포 유사 모델 내 종양 내 면역세포 항원 검출

71 조회수

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DOI:

10.3791/72193

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2026년 8월 21일

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1Department of Biology, North Carolina Agricultural and Technical State University, 2Brain Tumor Research Center, Department of Neurosurgery, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

이 논문에서

요약

본 연구는 포르말린 고정 파라핀 임베딩(FFPE) 처리된 교모세포종 줄기세포 유래 종양 조직 절편에서 단일 및 이중 항원을 일관되게 검출하기 위한 상세하고 재현 가능한 기질 기반 면역조직화학 워크플로를 제공합니다. 이 프로토콜은 기술적 문제를 해결하면서 다양한 면역 및 종양 마커의 식별을 지원하며, 다른 종양 모델에서도 활용될 가능성이 있습니다.

초록

교모세포종(GBM)은 가장 흔하고 치명적인 원발성 뇌악성종양으로, 아직 효과적인 치료법이 부족합니다. 이는 부분적으로 치료제 저항성을 가진 교모세포종 줄기세포 유사세포(GSCs)에 의해 유도되는 강력한 면역 억제성 종양 미세환경이 특징입니다. 본 논문에서는 포르말린 고정 파라핀 임베딩(FFPE) 뇌종양 절편에서 종양 침윤 면역세포 관련 표면 및 세포 내 항원을 검출하기 위한 재현 가능한 기질 기반의 단색 및 이색 면역조직화학(IHC) 프로토콜을 설명합니다. 뇌종양은 면역 능력이 있는 마우스의 정위적으로 이식된 마우스 GSCs로부터 유도되었습니다. 단색 IHC 워크플로우는 개별 면역세포 항원의 시각화를 위해 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 기반의 발색 검출 시스템을 사용하며, 이색 IHC 워크플로우는 동일한 숙주 유래 일차 항체를 사용하는 워크플로우를 포함하여 동일한 조직 절편 내에서 두 가지 면역세포 항원을 동시에 검출하기 위한 순차적 알칼리성 포스파타아제(AP) 기반 염색 전략을 채택합니다. 이러한 방법들은 GBM 조직 내 종양 침윤 면역세포 관련 항원의 발색 분석을 위한 실용적이고 재현 가능한 프레임워크를 제공하며, 다른 전임상 종양 모델 및 잠재적으로 인간 FFPE 표본에도 적용 가능합니다.

서론

교모세포종(GBM)은 공격적이고 침습성이 높으며 이질적인 일차성 악성 뇌종양으로, 현재의 표준 치료법에도 불구하고 환자의 생존율이 낮습니다1. GBM의 결정적인 특징은 매우 강력한 면역 억제성 종양 미세환경(TME)을 가진다는 것이며, 이는 면역 치료 전략에 대한 내성에 기여합니다2,3. 작동 T 세포의 침윤 감소와 T 세포의 기능 부전 및 소진 유도를 포함한 여러 메커니즘이 GBM의 면역 억제를 유도합니다4. 또한, GBM 세포의 하위 집단인 GBM 줄기 유사 세포(GSCs)는 세포 독성 면역 활성이 제한된 면역학적 "냉성(cold)" TME를 유지함으로써 면역 회피를 더욱 촉진합니다5. 이러한 특징들은 GBM TME 내에서 종양 침윤 면역 세포 집단과 그들의 기능적 상태를 정확하게 특성화하는 것이 중요함을 강조합니다.

면역조직화학(IHC)은 조직 구조를 유지하면서 세포 마커를 in situ에서 시각화하고 위치를 파악하며 반정량적으로 평가할 수 있게 해주기 때문에, 종양 조직 내 면역 세포 침윤을 평가하는 데 가장 널리 사용되는 방법 중 하나로 남아 있습니다6,7,8,9,10,11,12. 이전의 면역조직화학 및 면역 프로파일링 연구들은 GBM 면역 환경에 대한 이해를 상당히 진전시켰으며, 종양 진행 및 치료 반응과 관련된 면역 세포군을 확인하였습니다12,13,14,15,16. 단일 색상 발색 IHC는 특히 포르말린 고정 파라핀 매립(FFPE) 조직 절편에서 개별 면역 마커를 검출하는 데 유용합니다12,13,15,17,18,19,20. 반면, 이중 색상 발색 IHC는 동일한 조직 절편 내에서 두 가지 마커를 동시에 시각화할 수 있어 세포 표현형, 증식 또는 활성화 상태의 평가를 용이하게 합니다12,19,21.

이러한 발전에도 불구하고, 면역 기능이 유지되는 GSC 유래 GBM 모델에 적용 가능한 실용적이고 표준화된 기질 기반 발색 IHC 프로토콜은 여전히 제한적입니다. 또한, 희소하고 불균일한 면역 세포 침윤, 광범위한 종양 내 이질성, 그리고 매우 강력한 면역 억제성 및 복잡한 TME로 인해, 동일한 조직 절편 내의 여러 세포군을 정확하게 시각화하고 해석하는 것이 어려워 GBM의 발색 IHC는 다른 많은 고형암보다 더 까다롭습니다2,3,4. 이중 발색 IHC는 특히 두 일차 항체가 동일한 숙주 종에서 생성된 경우 추가적인 기술적 과제가 발생하며, 이는 항체 호환성의 세심한 최적화, 동일 조직 절편 내 두 항원의 동시 검출을 위한 순차적 염색 전략, 그리고 광학 현미경 하에서 명확한 마커 구별을 보장하기 위한 발색 기질의 선택을 필요로 합니다.

본 연구에서는 면역 기능이 유지된 정위성 005 GSC 유래 GBM 모델22,23,24에서 대표적인 종양 침윤 면역 세포 관련 표면 및 세포 내 항원을 성공적으로 검출하는 재현 가능한 기질 기반의 단색 및 이색 IHC 프로토콜을 설명합니다. 이러한 기질 기반 발색 IHC 프로토콜은 다른 전임상 종양 모델 및 잠재적으로 인간 FFPE 종양 시료에도 적용할 수 있습니다. 수확한 마우스 뇌 조직은 이전에 설명한 바와 같이19 일상적인 조직 처리 및 파라핀 임베딩 전, 10% 중성 완충 포르말린에서 하룻밤(~12 h) 동안 고정되었습니다. FFPE 블록은 양전하 처리된 현미경 유리 슬라이드 위에 섹션(두께 5 µm19)하여 사용 전까지 상온에서 보관하였습니다. 단색 IHC는 3,3′-diaminobenzidine (DAB)를 기질로 사용하는 horseradish peroxidase (HRP) 기반 발색 검출 시스템을 사용하여, 광학 현미경으로 개별 항원을 시각화하기 위해 갈색 신호를 생성합니다. 이 워크플로우는 FFPE 조직 섹션 내의 막 관련 항원과 세포 내 항원을 모두 검출하는 데 적합합니다.

이중 색상 IHC를 통해 동일한 조직 절편 내에서 두 가지 항원을 동시에 검출할 수 있으나, 항체 간의 호환성을 확보하고 명확한 발색 신호 분리를 보장하기 위한 추가적인 최적화가 필요합니다. 일차 항체가 서로 다른 숙주 종에서 생성된 경우, 종 특이적 이차 항체를 사용할 수 있어 이중 색상 IHC 염색이 비교적 간단합니다. 하지만 두 일차 항체가 동일한 숙주 종에서 유래한 경우, 동시 검출은 기술적으로 더 까다로워집니다. 이러한 과제를 해결하기 위해, 본 지침에서 설명하는 이중 색상 IHC 워크플로우는 서로 다른 기질을 이용한 순차적 알칼리성 인산분해효소(AP) 기반 발색 염색 전략을 채택하여, 광학 현미경 하에서 두 항원 신호를 시각적으로 명확하게 구별할 수 있도록 합니다.

두 워크플로우 모두 조직 탈파라핀화, 재수화, 항원 회복, 블로킹, 염색, 탈수, 투명화 및 봉입 단계를 포함합니다. 시약의 준비는 염색 품질과 재현성에 매우 중요합니다(보충 파일 1 참조). 마찬가지로, 일차 항체(primary antibodies)의 적절한 희석 또한 성공적인 염색 프로토콜을 위해 필수적이며, 이는 해당 이차 항체의 숙주 종에 따라 2.5% normal horse 또는 goat serum을 사용하여 사용 직전에 수행합니다(표 1 참조). 단색 및 이중색 염색에 사용된 종 특이적 이차 항체의 목록은 표 2에 제시되어 있습니다. 단색 IHC는 자일렌 기반의 투명화 및 봉입 시약을 사용하지만, 이중색 IHC의 경우 기질이 자일렌에 부분적으로 용해되므로 자일렌이 없는 대체제(예: Histo-Clear)가 필요합니다(표 3의 기질 목록 참조).

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프로토콜

본 프로토콜은 기관 동물 보호 및 사용 위원회(IACUC)(IACUC 프로토콜 번호: 2004N000067 및 LA24-0045)를 포함하여 모든 관련 규제 및 기관 지침에 따라 수행되었습니다.

참고: 단색 및 이중색 IHC 프로토콜의 여러 단계에서는 에탄올 및 조직 투명화제를 포함한 가연성 시약을 사용합니다. 따라서 탈파라핀화, 재수화, 탈수, 투명화 및 마운팅을 포함하여 가연성 화학 물질이 사용되는 절차는 적절한 실험실 안전 수칙을 준수하며 인증된 화학 흄 후드 내에서 수행해야 합니다. 가연성 시약은 기관의 안전 지침에 따라 적절하게 라벨이 부착되고 나사 캡이 있는 유리 용기에 담아 지정된 가연성 물질 보관함에 보관하고 준비해야 합니다. 재료 및 시약 부피는 최대 48개의 현미경 슬라이드(슬라이드 랙 2개, 랙당 24개 슬라이드)의 배치 처리에 맞게 구성되어 있으나, 실험 필요에 따라 워크플로우를 쉽게 조정할 수 있습니다.

1. FFPE 뇌종양 절편의 단일 염색 IHC

참고: 다음 프로토콜은 정위 005 GSC 모델에서 유래한 FFPE 뇌종양 절편 내의 대표적인 표면 및 세포 내 항원을 검출하기 위한 기질 기반 단색 IHC 방법을 설명합니다.

  1. 탈파라핀화 (20분):
    1. 슬라이드를 폴리옥시메틸렌(POM) 슬라이드 랙에 넣고, 흄 후드 내에서 먼저 Xylene I에 10분간, 이어서 Xylene II에 10분간 슬라이드 랙을 침전시킵니다. 탈파라핀 과정 동안 조직 절편이 자일렌에 완전히 잠겨 있도록 하십시오.
      주의: 이 단계는 실험복, 보호 안경, 안면 마스크 및 핸드 글로브를 포함한 적절한 개인 보호 장구(PPE)를 착용하고 화학 흄 후드 내에서 수행하십시오. 이 단계 및 이후의 모든 단계에서 절편이 마르지 않도록 주의하십시오. 절편이 마르면 조직 손상 및 절편 손실이 발생할 수 있습니다. 자일렌 용액은 밀폐된 유리 용기에 보관하고, 깨끗해 보일 경우 재사용하십시오.
  2. 단계적 재수화(15분):
    1. 절편을 100%, 90%, 70% 에탄올 순으로 각각 5분씩 처리하여 순차적으로 재수화합니다. 이를 위해 슬라이드를 염색 용기에 담아 100% 에탄올에 5분 동안 침전시킨 후(그 후 100% 에탄올은 재사용을 위해 유리병에 다시 담습니다), 이어서 90% 에탄올에 5분 동안 침전시키고(그 후 병에 다시 담습니다), 마지막으로 70% 에탄올에 5분 동안 침전시킵니다(그 후 병에 다시 담습니다).
      주의: 이 단계는 화학 흄 후드 내에서 수행하고, 1.1단계와 동일한 개인 보호 장구(PPE)를 착용하십시오. 이 에탄올 용액들은 밀폐된 유리 용기에 보관하고 깨끗해 보인다면 여러 실험에 걸쳐 재사용할 수 있습니다.
  3. 물 세척 (5분):
    1. 슬라이드를 증류수에 5분 동안 담가두면 재수화 과정이 완료됩니다.
      참고: 이 단계를 수행하는 동안, 1X PBS 600 mL(슬라이드 랙 1개 기준)에서 800 mL(슬라이드 랙 2개 기준)를 준비하십시오.× 명시된 지침에 따라 2 L 전자레인지용 유리 비커에 항원 회복 완충액(10 mM 시트르산 나트륨 완충액)을 준비합니다. 보충 파일 1에서.
  4. 항원 복원 (~20분):
    1. 갓 제조한 10 mM 시트르산나트륨 항원 회복 완충액이 담긴 2 L 비커를 플라스틱 랩으로 덮어, 예열 및 장시간의 전자레인지 가열 중 과도한 증발을 방지하십시오.
    2. 조직 절편을 가열하는 동안 발생하는 과도한 압력으로 인해 완충액이 튀어나가는 것을 방지하기 위해, 플라스틱 랩에 구멍을 몇 개 뚫어줍니다.
      참고: 단계 1.1과 같이 개인 보호 장구(PPE)를 착용하십시오.
    3. 갓 조제한 10 mM 시트르산 나트륨 항원 회복 완충 용액을 3분 동안 예열하십시오. 재수화된 조직 절편이 담긴 슬라이드 랙을 예열된 항원 회복 용액에 넣으십시오.
    4. 그 다음으로 최고 출력(예: P10)의 전자레인지에서 조직 절편을 15분 동안 가열하며, 이때 비커를 세심히 관찰하여 절편이 계속 잠겨 있는지 확인하고 증발로 인해 마르지 않도록 주의하십시오.
      참고: 또는, 스팀 쿠커 내부에 배치한 플라스틱 염색 트로프에서 약 15분 동안 항원 회복을 수행할 수 있으며, 이는 모니터링이 덜 필요한 더 완만한 가열 방법입니다. 소듐 시트레이트 완충액(10 mM, pH 6.0)이 다음 목록에 기재된 모든 1차 항체에 대해 항원 회복 완충액으로서 성공적으로 검증되어 사용되었습니다. 표 1. 사용된 1차 항체 및 제조사의 권장 사항에 따라, 본 연구에서 평가되지 않은 항체의 경우 EDTA 또는 Tris-EDTA와 같은 다른 완충액이 필요할 수 있습니다. 
  5. 냉각 (10–20분):
    1. 비커를 전자레인지에서 꺼내 작업대에 놓고 20분 동안 상온에서 식힙니다. 냉각 속도를 높이려면 비커를 얼음처럼 차가운 수돗물에 약 10분 동안 담가 둡니다.
      주의: 매우 뜨거우므로 취급 시 적절한 내열 장갑이나 비커 집게를 사용하십시오. 단계 1.1에 명시된 개인 보호 장구(PPE)를 착용하십시오.
  6. Dulbecco 인산염 완충 식염수(DPBS) 세척 (~10분):
    1. 비커에서 슬라이드 랙을 꺼내 슬라이드를 1에 담급니다.× 염색 용기 내의 DPBS 용액.
    2. 절편을 1에서 두 번 헹굽니다.× 조직 박리를 방지하기 위해 부드럽고 정적인 세척 방식으로 DPBS를 사용하여 각각 5분 동안 세척한다.
  7. 소수성 장벽 (<1분/슬라이드):
    1. DPBS 세척 단계(단계 1.6) 동안 각 슬라이드를 개별적으로 조심스럽게 꺼내어, 조직 자체에 닿지 않도록 주의하며 보풀 없는 와이퍼(예: Kim Wipes)로 조직 절편 주변을 부드럽게 닦아냅니다.
    2. PAP(peroxidase-anti-peroxidase) 펜과 같은 소수성 장벽을 사용하여 각 조직 절편 주변에 액체 배제 장벽을 그린 다음, 슬라이드를 염색 용기 내의 DPBS 세척액으로 되돌립니다. 모든 슬라이드에 대해 이 단계를 반복하십시오.
      참고: 조직 주변에 소수성 장벽을 형성하면 섹션 간의 시약 유출을 방지하고 항체가 조직에 잘 유지되도록 돕습니다.
  8. 내인성 과산화효소 차단 (5분):
    1. 폐기 1× 염색 용기에서 DPBS를 제거한 후, 3% H₂O₂ 용액에 슬라이드나 조직 절편이 완전히 잠기도록 하여 5분 동안 처리합니다.
      참고: 3% H₂O₂에서 장시간 배양 시₂O₂ 조직을 손상시킬 수 있습니다. 내성 과산화효소 활성을 차단하는 것은 발색 과정 중 내성 과산화효소로 인해 발생하는 배경 염색을 방지하기 위한 필수 단계입니다. 단계 1.1과 동일하게 개인 보호 장구(PPE)를 착용하십시오.
  9. DPBS 세척 (~12분):
    1. 3% H₂O₂를 제거합니다.₂O₂ 용액, 그리고 슬라이드를 다시 1회 헹굽니다.× DPBS로 5분씩 2회 세척한다.
    2. 2차 세척 후 슬라이드 랙에서 슬라이드를 꺼내 습윤 챔버에 평평하게 놓은 다음, 습윤 챔버의 가장자리에 증류수를 추가하십시오.
    3. 섹션이 마르지 않도록 1.10단계의 블로킹 과정을 즉시 진행하십시오.
      참고: 다음에 나열된 각 가습 챔버는 재료 목록 30개의 슬라이드를 수용할 수 있는 공간이 있습니다.
  10. 혈청 블로킹 (~70분):
    1. 50을 추가하십시오. µ섹션당 5% bovine serum albumin (BSA) 용액 L를 넣고, 조직 섹션에서 블로킹 버퍼가 증발하는 것을 방지하기 위해 습윤 챔버의 뚜껑을 닫은 상태로 상온에서 30분 동안 배양합니다.
    2. 30분 후, 워크벤치 위에 놓인 보풀 없는 와이프(lint-free wipe)에 슬라이드를 가볍게 두드려 BSA를 제거합니다.
    3. 그런 다음, 2차 항체의 숙주 종과 일치하는 2.5% 정상 말 또는 염소 혈청을 추가하고(절편당 한 방울), 습윤 챔버의 뚜껑을 닫은 상태로 실온에서 30분 동안 추가로 배양합니다. 흡수성 종이나 보풀 없는 와이퍼 위에 슬라이드를 가볍게 두드려 혈청을 제거한 후, 즉시 단계 1.11로 진행하십시오.
      참고: 섹션이 마르지 않도록 주의하십시오. 적절한 블로킹 버퍼(blocking buffer)에 희석한 1차 항체를 준비하십시오(참조 표 1블로킹 단계가 끝나갈 무렵에 준비하여, 블로킹이 완료된 후 단계 1.11에서 즉시 사용할 수 있도록 합니다.
  11. 1차 항체 반응(~16시간):
    1. 약 50을 적용하십시오. µ적절한 블로킹 버퍼(blocking buffer)에 최적으로 희석한 1차 항체 L (참조 표 1), 조직 절편에 처리하고 4°C에서 하룻밤(~16시간) 동안 반응시킨다. °습윤 챔버 내의 C.
      참고: 챔버 내의 습도를 밤새 유지하기 위해 습윤 챔버의 지정된 구역에 증류수를 채우십시오. 또한, 조직 슬라이드용 지정 구역/챔버에 증류수가 채워지지 않도록 주의하십시오. 증류수가 채워질 경우 조직 절편이 침수될 수 있습니다.
  12. DPBS (0.1% Tween 20) 세척 (~18-20분):
    1. 슬라이드 랙을 염색 용기에 넣고 세척 완충액(1× DPBS, 0.1% Tween 20).
    2. 하룻밤 동안 배양한 후, 습윤 챔버에서 슬라이드를 꺼내고 흡수지 위에 슬라이드를 가볍게 두드려 1차 항체를 제거한 다음, 세척 버퍼(1× 염색 용기에 DPBS(0.1% Tween 20 포함)를 넣고, 세척 버퍼를 버립니다.
    3. 그 후, 절편을 1에 세척합니다.× DPBS(0.1% Tween 20)로 5분씩 3회 세척한 다음, 슬라이드 랙에서 슬라이드를 꺼내 습윤 챔버에 평평하게 놓은 후 즉시 1.13단계로 진행하십시오.
      참고: 1.15단계의 발색 후 배경 염색이 심하게 나타나는 경우, 각 세척 시간을 10~15분으로 연장할 수 있습니다. 조직이 슬라이드에서 탈락하는 것을 방지하기 위해 세척은 부드럽게 수행해야 하며, 정적인 상태(흔들거나 흔들지 않음)를 유지해야 합니다.
  13. 2차 항체 배양 (~32-35분):
    1. 적절한 HRP-접합 2차 항체(상황에 따라 anti-rabbit 또는 anti-rat IgG; 참조)를 한 방울/섹션 추가합니다. 표 2) 후 가습 챔버 뚜껑을 닫은 상태로 조직 절편을 실온에서 30분 동안 배양합니다.
      참고: 1.15단계에서 배경 신호를 줄이기 위해 2차 항체를 PBS에 1:1로 희석하여 사용할 수 있습니다.
  14. DPBS (0.1% Tween 20) 세척 (~18–20분):
    1. 2차 항체와 함께 배양한 후, 습윤 챔버에서 슬라이드를 꺼내고 흡수지로 슬라이드를 가볍게 두드려 2차 항체를 제거하십시오.
    2. 그 후, 슬라이드를 세척 버퍼(1)에 담근 슬라이드 랙에 넣습니다.× 염색 용기 내부의 시료를 0.1% Tween 20이 포함된 DPBS로 짧게 세척한 후, 세척 버퍼를 제거합니다.
    3. 그 후, 조직 절편을 1로 3회 세척하십시오.× DPBS (0.1% Tween 20)로 각각 5분 동안 세척한다.
      1. 발색제 발색 단계(즉, 단계 1.15)를 시작하기 전, 발색 반응을 중지시키기 위한 단계 1.16의 준비 과정으로 별도의 슬라이드 랙을 증류수가 채워진 염색 용기에 넣어 두십시오.
      2. 마지막 세척 단계 동안, DAB 작동 용액(기질 1mL당 발색제 1방울; 참조)을 즉시 준비하십시오. 보충 파일 1).
  15. 발색제 발색 (30초~5분):
    1. 단계 1.14의 세 번째 세척 후, 슬라이드 랙에서 슬라이드를 꺼내 흰색 배경의 작업대 위에 평평하게 놓습니다.
    2. 50을 적용하십시오. µ각 절편에 DAB 작업 용액 L을 첨가하고, 흰색 배경 또는 광학 현미경 하에서 갈색으로 발색되는 것을 시각적으로 관찰하십시오.
      참고: 단계 1.1과 동일하게 개인 보호 장구(PPE)를 착용하십시오. 흰색 흡수지를 사용하면 DAB 발색 단계에서 갈색으로 발색되는 과정을 시각적으로 확인하는 데 도움이 됩니다. 발색 시간은 마커에 따라 일부는 20~60초, 다른 일부는 2~5분 정도 소요될 수 있습니다(단계 1.16의 상세 내용 참조).
  16. 반응 정지 (1~2분):
    1. 1.15단계에서 원하는 갈색 색신호가 나타나는 즉시, 1.14.3.1단계에서 준비한 증류수 용기에 슬라이드를 담가 반응을 중단시키십시오.
    2. 슬라이드를 증류수로 1분 동안 세척하십시오. 증류수를 버린 후, 1.17단계(대조염색)로 진행하십시오.
      참고: 슬라이드는 염색에 영향을 주지 않고 최대 1시간까지 증류수에 보관할 수 있습니다. 발색에 소요되는 시간은 정지 반응 단계를 언제 시작할지를 결정합니다. 또한, 본 연구의 경우와 같이 동일한 슬라이드에 2~3개의 마커(CD3, CD4, CD8 등)가 있는 경우 반응 시간이 달라질 수 있습니다. 예를 들어, 여기에서 설명하는 시스템에서는 CD8의 발색에 일반적으로 약 30초가 소요됩니다.+ 세포, CD3의 경우 1~3분 동안+ 또는 CD4+ 세포, 또는 Granzyme B의 경우 더 길게(3~5분) 처리하십시오.+ 및 Ki67+ 세포. 발색 시점의 차이로 인해 반응을 중단시키기 위해 슬라이드 전체를 증류수에 담글 수는 없습니다. 대신, 각 구역에 200~300$\mu$L를 추가하여 각 반응을 개별적으로 중단시킵니다. µ각 섹션에 증류수 L을 직접 분사합니다.
  17. 대조염색 (<1분):
    1. 갈색 염색과의 대비를 높이기 위해 희석된 헤마톡실린(증류수에 1:3 비율로 희석)을 염색 용기에 넣고, 슬라이드가 희석된 헤마톡실린에 약 10~20초 동안 침지되도록 합니다.
      참고: DAB 배경 염색이 강한 경우, 대조 염색 시간을 늘리거나(최대 1분) 희석하지 않은 헤마톡실린을 짧게 사용하십시오.
  18. 수돗물 세척 (6분):
    1. 염색 용기에서 헤마톡실린을 버리고, 재사용을 위해 유리병에 다시 담으십시오.
    2. 슬라이드를 수돗물로 1분간 헹군 다음, 조직 절편 면이 물줄기에 직접 닿지 않도록 주의하며 천천히 흐르는 수돗물에 5분간 헹굽니다. 수돗물을 버리고 단계 1.19로 진행하십시오.
      참고: 마운팅 전까지의 나머지 단계들은 흄 후드 내에서 수행합니다.
  19. 단계적 탈수 (15–17분):
    1. 슬라이드를 염색 용기에 담아 70% 에탄올에 5분 동안 침전시킨 후(사용 후 70% 에탄올은 재사용을 위해 유리병에 다시 담음), 90% 에탄올에 5분 동안 침전시키고(다시 병에 담음), 마지막으로 100% 에탄올에 5분 동안 침전시킨다(다시 병에 담음).
    2. 1.20단계로 진행하십시오.
      참고: 이 단계는 화학 흄후드 내에서 수행하십시오. 탈수 단계에서는 1.2단계에서 사용한 것과 동일한 에탄올 용액을 사용하며, 용액이 깨끗해 보인다면 여러 번 재사용할 수 있습니다.
  20. 투명화:
    1. 탈파라핀화(단계 1.1)에 사용한 것과 동일한 Xylene I 및 II 용액을 사용하여 조직 절편/슬라이드를 세척하십시오.
    2. 먼저, 염색 용기에 담긴 Xylene I 용액에 슬라이드를 10분 동안 담근 후(사용 후 Xylene I은 재사용을 위해 유리병에 다시 넣으십시오), 이어서 Xylene II 용액에 10분 동안 추가로 담급니다.
    3. 마운팅(즉, 1.21단계)이 완료될 때까지 슬라이드를 Xylene II에 보관하십시오.
      참고: 이 단계에서 절편이 마르지 않도록 하십시오. 절편이 마르면 부서지기 쉬워지므로, 필요한 경우 봉입을 위해 Xylene II에 더 오래 둘 수 있습니다.
  21. 마운팅:
    1. Xylene II에서 슬라이드를 하나씩 꺼내어 화학 흄후드 내에 평평하게 놓습니다. 적절한 크기의 커버슬립 위에 Xylene 기반 봉입제를 한 방울 떨어뜨린 후, 봉입제 면이 조직 절편을 향하도록 커버슬립을 슬라이드 위에 덮습니다.
    2. 엄지손가락으로 커버슬립을 가볍게 눌러 봉입제가 세 개의 절편 모두에 고르게 퍼지게 하고 기포를 제거합니다.
      참고: 24 × 슬라이드 위의 3개 절편을 덮기 위해 50mm 커버슬립이 필요합니다; 24 × 두 개의 절편을 위한 40 mm 커버슬립; 그리고 24 × 한 섹션당 24 mm 커버슬립을 사용합니다. 흄 후드 내의 지속적인 공기 흐름으로 인해 봉입제가 빠르게 건조되어 슬라이드에서 Xylene II가 빠르게 증발하고 섹션이 부서지기 쉬워질 수 있으므로, 슬라이드당 30초 이내에 봉입을 완료하는 것이 중요합니다.
  22. 풍건 및 광학 현미경 관찰:
    1. 평가 및 광학 현미경을 이용한 이미징 전, 흄 후드 내에서 슬라이드를 최소 2시간 동안 공기 건조한다. 건조가 완료되면, 마운팅된 슬라이드를 슬라이드 박스에 넣어 실온에서 수년간 보관할 수 있다.

2. FFPE 뇌종양 절편을 위한 이중 염색 IHC

참고: 다음 프로토콜은 동일한 FFPE 뇌종양 절편 내에서 두 가지 항원을 동시에 검출하기 위한 기질 기반의 이중 색상 발색 면역조직화학(IHC) 워크플로우를 설명합니다. 단일 색상 IHC와 비교하여, 이중 색상 워크플로우는 각 염색 단계마다 하룻밤 동안의 배양 단계를 포함하여 독립적인 1차 항체 배양과 순차적인 염색 사이클이 필요하기 때문에 시간이 더 많이 소요됩니다. 하지만 이러한 확장된 워크플로우를 통해 조직의 형태를 보존하면서 동일한 조직 절편 내에서 신뢰할 수 있는 동시 항원 검출이 가능하며, 광학 현미경 하에서 명확한 발색 신호 분리를 유지할 수 있습니다.

  1. 탈파라핀화 (20분):
    1. 화학 흄 후드 내에서 단계 1.1의 단일 색상 IHC에 기술된 것과 동일한 탈파라핀 과정을 따르되, 자일렌 대신 비-자일렌 기반 투명제(예: Histo-Clear I 및 Histo-Clear II)를 사용하십시오.
      주의: 1.1단계와 동일한 개인 보호 장구(PPE)를 착용하고, 이 단계는 화학 흄 후드 내에서 수행하십시오. 발색제가 자일렌에 일부 용해되므로 Histo-Clear 사용을 권장하며, 자일렌 프리(xylene-free) 공정은 이중 염색 면역조직화학(IHC) 중 염색 강도를 유지하는 데 도움이 됩니다. 절편이 마르지 않도록 하십시오. 투명화 용액은 밀폐된 유리 용기에 보관하고 깨끗해 보일 경우 재사용할 수 있습니다.
  2. 점진적 재수화(15분):
    1. 단계 1.2에 기술된 단일 염색 IHC와 동일하게 진행합니다. 에탄올 농도를 점진적으로 낮추며(100%, 90%, 70%) 각 단계당 5분씩 순차적으로 절편을 재수화합니다.
      ​참고: 1.2단계의 단일 염색 IHC에 사용된 단계별 에탄올은 Xylene II에 오염되었을 가능성이 높으므로, 여기서는 별도의 자일렌-프리 단계별 에탄올 세트를 사용합니다.
  3. 물 세척 (5분):
    1. 단계 1.3의 단일 염색 면역조직화학염색(IHC)과 동일하게 진행합니다. 슬라이드를 증류수에 5분간 넣어 재수화 과정을 완료합니다.
      ​참고: 1.3단계와 동일함; 이 5분 동안 항원 회복 용액을 준비하십시오.
  4. 항원 회복(~20분): 단계 1.4의 단색 IHC에 설명된 것과 동일한 항원 회복 절차를 따릅니다.
  5. 냉각(10-20분): 단계 1.5에서 설명한 단일 염색 IHC의 냉각 과정을 동일하게 수행하십시오.
  6. DPBS 세척 (10분): 단계 1.6의 단일 염색 IHC에 설명된 항원 회복 용액 세척 과정을 따릅니다.
  7. 소수성 장벽 (<슬라이드당 1분):
    1. 단계 2.6의 DPBS 세척 과정 중에 단계 1.7의 과정/프로토콜과 동일하게 조직 절편 주변에 소수성 장벽을 형성하십시오.
    2. 소수성 배리어 펜을 사용하여 각 조직 절편 주위에 액체 반발 배리어를 그린 후, 슬라이드를 염색 용기 내의 DPBS 세척 용액에 다시 넣으십시오. 모든 슬라이드에 대해 이 단계를 반복하십시오.
  8. 알칼리성 인산분해효소 차단 (5분):
    1. 모든 조직 절편의 소수성 장벽(hydrophobic barrier) 형성을 완료한 후, 염색 용기에서 슬라이드를 꺼내 가습 챔버에 평평하게 놓습니다. 절편당 한 방울의 내인성 알칼라인 포스파타아제 차단 용액(예: BLOXALL)을 첨가하고 5분 동안 배양합니다. 즉시 단계 2.9로 진행하십시오.
      ​참고: 이중 염색 IHC 프로토콜에서는 AP 접합 2차 항체를 사용하므로, 적색 또는 청색 발색 과정 중 배경 신호를 줄이기 위해 내인성 알칼리성 포스파타아제 활성을 차단하는 것이 필수적입니다. 여기서는 내인성 알칼리성 포스파타아제를 억제하기 위해 BLOXALL 차단 용액을 사용합니다. 이 용액은 내인성 퍼옥시다아제 또한 억제하므로, 단일 염색 IHC 프로토콜에서 3% H2O2 대신 내인성 퍼옥시다아제 활성을 차단하는 용도로 사용할 수 있습니다.₂O₂ 용액
  9. DPBS 세척 (10분):
    1. 슬라이드를 1에서 헹굽니다.× 염색 용기 내에서 DPBS 용액으로 5분씩 2회 세척합니다.
    2. 2차 세척 후, 염색 용기에서 슬라이드를 꺼내 습윤 챔버(humidified chamber)에 평평하게 놓고, 습윤 챔버의 가장자리에 증류수를 추가하십시오.
      주의: 섹션이 마르지 않도록 하여 2.10단계의 비특이적 항원-항체 결합 차단 과정으로 즉시 진행하십시오.
  10. 혈청 블로킹 (~70분):
    1. 단계 1.10에 기술된 단색 면역조직화학염색(IHC) 프로토콜과 동일한 혈청 블로킹 과정을 수행하십시오.
      1. 먼저, 범용 블로킹 완충액(5% BSA; 50 µ실온에서 30분 동안 처리한 후, 2차 AP-접합 항-토끼 IgG 항체의 숙주 종과 일치하는 2.5% 정상 말 혈청(절편당 한 방울)을 넣고 습윤 챔버 덮개를 닫은 상태로 실온에서 다시 30분 동안 처리합니다.
      2. 이 시간이 지난 후, 슬라이드를 흡수지에 가볍게 두드려 혈청을 제거하고 2.11단계를 진행하십시오.
        참고: 1차 항체 I을 준비하십시오(보십시오. 표 1단계 1.10에 기술된 대로, 블로킹 단계의 마지막 1분 동안 수행합니다.
  11. 1차 항체 I 배양 (~16시간):
    1. 단계 1.11에서와 동일한 과정으로 1차 항체를 배양하십시오. 예를 들어, 약 50 µ2.5% 정상 말 혈청에 1:100으로 희석한 rabbit anti-CD3 항체 L (참조 표 1), 각 조직 절편에.
    2. 4°C에서 하룻밤(~16시간) 동안 배양하십시오. °가습 챔버 내의 C.
  12. DPBS (0.1% Tween 20) 세척 (~18–20분):
    1. 단계 1.12의 단일 색조 IHC 프로토콜에 기술된 것과 동일한 세척 절차(5분씩 3회 세척)를 따르십시오.
    2. 세 번째 세척 후, 슬라이드를 습윤 챔버 내에 평평하게 놓으십시오. 즉시 2.13단계로 진행하십시오.
      참고: 단계 1.12와 동일한 주의 사항을 적용하십시오. 예를 들어, 각 세척 시간을 10~15분으로 연장할 수 있으며, 세척은 부드럽고 정적으로 수행해야 합니다. 절편이 마르지 않도록 하십시오.
  13. 2차 항체 1차 반응 (~32–35분):
    1. 각 구획당 AP-결합 항토끼 IgG 2차 항체를 한 방울씩 첨가하십시오(참조 표 2) 후, 가습 챔버 뚜껑을 닫은 상태로 조직 절편을 실온에서 30분 동안 배양합니다.
      참고: 2.15단계에서 배경 신호를 줄이기 위해 2차 항체를 PBS로 1:1 희석하여 사용할 수 있습니다.
  14. DPBS (0.1% Tween 20) 세척 (~18-20분):
    1. 1번과 동일한 세척 절차를 따르십시오.× 단계 1.14에 명시된 DPBS/0.1% Tween 20.
    2. 참고: 마지막 세척 단계 동안, 권장 사항에 따라 기질 작업 용액(5 mL)을 새로 준비하십시오(다음 참조) 표 3) 제조사의 지침에 따라 (시약 준비 섹션 참조) 보충 파일 1).
  15. 적색 발색 (12~15분):
    1. 단계 2.14를 완료한 후, 단계 1.15에서 설명한 바와 같이 흰색 흡수지 등 흰색 배경의 작업대 위에 슬라이드를 평평하게 놓으십시오.
    2. 갓 조제한 적색 기질 작업 용액을 충분히 혼합한 다음, 50$\mu\text{L}$를 첨가하십시오. µ각 조직 절편에 L(남은 용액은 폐기하십시오).
    3. 흰색 배경에서 또는 광학 현미경 하에서 2~3분마다 주기적으로 확인하며, 붉은색이 나타날 때까지 조직 절편을 상온에서 배양하십시오.
      참고: 적색 발색에 소요되는 시간은 마커마다 다르며 20~30분 정도 걸릴 수 있습니다. 하지만 CD3 염색의 경우+ AP 검출 시스템을 사용하여 005 뇌종양 절편 내의 세포를 염색할 때, 일반적으로 12~15분 이내에 적색 발색이 나타납니다.
  16. 완충액 세척 (5분):
    1. 2.15단계에서 원하는 적색 신호가 나타나는 즉시, 절편을 1분 동안 세척하십시오.× 염색 용기에서 DPBS/0.1% Tween 20로 5분 동안 세척합니다.
    2. 이 세척 시간 동안, 적절한 블로킹 버퍼(예: 2.5% normal horse serum에 1:100으로 희석한 rabbit anti-Ki67 항체; 참조)를 사용하여 2차 1차 항체를 새로 준비하십시오. 표 1).
      참고: 단일 염색 IHC(단계 1.16)에서 사용한 증류수 세척과 달리, 여기서는 반응을 중단시킬 뿐만 아니라 과잉 발색제를 철저히 세척하여 두 번째 염색 주기를 준비하기 위해 DPBS/0.1% Tween 20을 사용합니다.
  17. 1차 항체 II 배양 (~16시간):
    1. 슬라이드를 가습 챔버로 옮기고 ~50$\mu$L를 첨가합니다. µ각 조직 절편에 갓 조제한 rabbit anti-Ki67 항체 L을 첨가합니다. 4°C에서 하룻밤(~16시간) 동안 배양합니다. °C.
  18. DPBS (0.1% Tween 20) 세척 (~18–20분):
    1. 단계 1.12와 동일한 절차를 따르십시오.
    2. 3차 세척 후, 염색 용기에서 슬라이드를 꺼내 가습 챔버에 평평하게 놓습니다. 즉시 2.19단계로 진행하십시오.
  19. 2차 항체 II 배양 (~32–35분):
    1. 2.13단계와 동일한 절차를 따릅니다. 구역당 한 방울씩 AP-접합 항-토끼 IgG를 첨가합니다(참조 표 2) 후 가습 챔버 뚜껑을 닫은 상태로 조직 절편을 상온에서 30분 동안 배양합니다.
  20. DPBS (0.1% Tween 20) 세척 (~18–20분):
    1. 1번과 동일한 세척 절차를 따르십시오.× 단계 1.14에 명시된 DPBS/0.1% Tween 20.
      참고: 마지막 세척 단계 동안, 권장 사항에 따라 기질 작동 용액(5 mL)을 새로 준비하십시오(다음 내용을 참조하십시오. 표 3) 제조사의 지침에 따라 (시약 준비 섹션 참조) 보충 파일 1).
  21. 청색 발색 (10~12분):
    1. 2.20 단계를 완료한 후, 슬라이드를 흰색 배경의 작업대 위에 평평하게 놓으십시오.
    2. 갓 조제한 청색 기질 작업 용액을 충분히 섞은 후, 50µL를 첨가하십시오. µ각 조직 절편에 L만큼 첨가하십시오(남은 용액은 폐기하십시오).
    3. 흰색 배경에서 또는 광학 현미경 하에 2~3분마다 주기적으로 확인하며, 청색이 나타날 때까지 조직 절편을 상온에서 배양하십시오.
      참고: 단계 2.15의 적색 발색과 마찬가지로, 청색 발색에 필요한 시간은 20~30분이 소요될 수 있습니다. 하지만 Ki67 염색의 경우+ AP 검출 시스템을 이용한 005 뇌종양 절편 내 세포의 염색 시, 10~12분 이내에 청색으로 발색됩니다.
  22. 완충액 세척 (5분):
    1. 2.21단계에서 원하는 청색 색상 신호가 나타나는 즉시, 절편을 1에 담급니다.× 염색 용기에 담아 0.1% Tween 20이 포함된 DPBS로 5분 동안 세척합니다. 세척액은 버립니다.
  23. 수세(1분): 절편을 증류수로 1분 동안 헹굽니다. 헹군 후 증류수를 버립니다.
  24. 단계적 탈수 (15~17분):
    1. 슬라이드를 염색 용기에 담아 70% 에탄올에 5분 동안 침전시킨 후(사용 후 70% 에탄올은 재사용을 위해 유리병에 다시 담음), 90% 에탄올에 5분 동안 침전시키고(이후 병에 다시 담음), 마지막으로 100% 에탄올에 5분 동안 침전시키십시오(이후 병에 다시 담음).
    2. 각 단계를 흄 후드 내에서 반복하십시오. 2.25단계로 진행하십시오.
      참고: 본 탈수 단계에서는 2.2단계에서 사용한 것과 동일한 (자일렌-프리) 에탄올 용액을 사용하며, 용액이 깨끗해 보인다면 여러 번 재사용할 수 있습니다.
  25. 비자일렌 기반 투명화:
    1. 단계 2.1에서 사용한 것과 동일한 자일렌 프리 용액(예: Histo-Clear)을 사용하여 조직 절편/슬라이드를 세척하십시오.
      1. 먼저, 염색 용기에 담긴 슬라이드를 xylene-free solution I에 10분간 담가 둔 다음(이후 xylene-free solution I은 재사용을 위해 유리병에 다시 넣음), 이어서 xylene-free solution II에 10분 동안 더 담가 둡니다.
      2. 마운팅(즉, 단계 2.26)이 완료될 때까지 슬라이드를 xylene-free solution II에 보관하십시오.
        참고: 필요에 따라 마운팅을 위해 섹션을 xylene-free solution II에 더 오래 보관할 수 있습니다.
        주의: 단계 1.1과 동일한 개인 보호 장구(PPE)를 착용하고, 이 단계는 화학 흄 후드 내에서 수행하십시오.
  26. 비자일렌 기반 봉입:
    1. xylene-free solution II에서 슬라이드를 하나씩 꺼내 흄 후드 위에 평평하게 놓습니다. 적절한 크기의 커버슬립 위에 비자일렌 계열의 봉입제를 한 방울 떨어뜨린 후, 봉입제가 조직 절편 쪽을 향하도록 하여 슬라이드 위에 커버슬립을 덮습니다.
    2. 엄지손가락으로 커버슬립을 가볍게 눌러 봉입제가 세 개의 절편 전체에 고르게 퍼지게 하고 기포를 제거합니다.
      참고: 마운팅 용액이 빠르게 마를 수 있으므로, 슬라이드당 30초 이내에 마운팅을 완료하십시오. 1.1단계와 같이 개인 보호 장구(PPE)를 착용하고, 이 단계는 화학 흄 후드 내에서 수행하십시오.
  27. 공기 건조 및 광학 현미경 관찰: 광학 현미경을 이용한 평가 및 이미징 전, 흄 후드 내에서 슬라이드를 최소 2시간 동안 공기 건조한다. 건조가 완료된 마운팅 슬라이드는 슬라이드 보관함에 넣어 실온에서 수년간 보관할 수 있다.

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결과

HRP 기반의 발색 검출 시스템을 이용한 단일 색상 IHC를 통해 FFPE 05 뇌종양 절편에서 명확하고 재현 가능한 염색 결과를 얻었습니다. 표면 항원 염색의 대표 이미지는 그림 1에 제시되어 있으며, T 세포 마커(CD3, CD4, CD8), 종양 관련 대식세포(TAM) 마커(CD68, F4/80) 및 면역 체크포인트 분자인 programmed death ligand 1(PD-L1)이 성공적으로 검출되었음을 보여줍니다. 모든 경우에서 DAB를 발색제로 사용하여 양성 염색이 뚜렷한 갈색 발색 신호로 시각화되었으며, 조직 형태가 보존되고 배경 염색이 최소화되어 단일 색상 IHC 프로토콜이 다양한 막 결합 항원에 적용 가능함을 나타냅니다.

세포 내 항원 검출을 위한 단일 염색 IHC 프로토콜의 적용 가능성은 그림 2에 제시되어 있습니다. 대표적인 염색 이미지는 T-bet, F...

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토론

본 연구는 정위 GSC 모델에서 유래한 FFPE 뇌종양 조직 내 표면 및 세포 내 항원의 단일 및 이중 색상 검출을 위한 상세하고 재현 가능한 기질 기반 발색 IHC 워크플로우를 설명합니다. 본 연구의 주요 목적은 면역 기능이 유지된 GBM 조직에서 신뢰할 수 있는 발색 항원 검출을 위한 실용적인 단계별 프로토콜을 수립하는 방법론적 연구에 있습니다.

발색 면역조직화학(Chromogenic IHC)은 조직 구조를 보존하면서 종양 미세환경(TME) 내 항원의 공간적 위치 파악이 가능하므로, FFPE 조직의 세포 마커를 평가하는 데 널리 사용되는 방법으로 남아 있습니다15,16. 재현성 있는 발색 염색을 위해서는 항원 회복, 블로킹 조건, 항체 농도, 발색제 현상 시간, 염색 및 마운팅 중 조직 처리 등 여러 기술적 파라미터의 세심한 최적화가 필요합니다. 이러한 단계에서의 작은 편...

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공개 사항

S.D.R.은 Georgetown University와 Massachusetts General Hospital이 소유 및 관리하며 Amgen과 Acti\Vec Inc.로부터 로열티를 받은 항암 헤르페스 심플렉스 바이러스 관련 특허의 공동 발명자이며, Replimune, Cellinta, Greenfire Bio의 컨설턴트로 활동하여 사례비를 받았으며, EG 427로부터 사례비와 지분을 받았습니다. 나머지 저자들은 잠재적인 이해 상충으로 해석될 수 있는 상업적 또는 재정적 관계 없이 본 원고가 작성되었음을 밝힙니다.

감사의 글

D.S.는 North Carolina Agricultural and Technical State University (NCA&T) 과학기술대학의 기금, NCA&T의 교수 펠로우십 그랜트 (GRADS-4C) 및 NIH 그랜트 (1R16NS147983-01)의 지원을 일부 받았습니다. 마찬가지로 S.D.R.은 Thomas A. Pappas Chair in Neurosciences의 지원을 일부 받았으며, R.H.N.은 NIH 그랜트 (1R35GM153737)의 지원을 일부 받았습니다. 005 GSCs를 제공해주신 Inder Verma 박사님과 Yasushi Soda 박사님께 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2 L 유리병 CorningCORN1395-2L10의 준비 및 보관에 사용됨× DPBS, 1× DPBS, 증류수 및 시트르산 나트륨 완충액
2 L Pyrex 유리 비커 Corning1000-2L나트륨 시트레이트 완충액(600mM)을 이용한 마이크로웨이브 매개 항원 회복에 사용됨–(최종 부피 800 mL)
2.5% 정상 말 혈청 또는 정상 염소 혈청이 제품들은 Vector Laboratories의 2차 항체와 함께 준비되어 제공됩니다. 비특이적 결합과 배경 염색을 최소화하기 위해, 2차 항체의 숙주 종(anti-rabbit 또는 anti-rat IgG)에 따라 종 특이적 블로킹 및 항체 희석에 사용합니다.
30% 과산화수소 (H2O2)Fisher ScientificBP2633500
500 mL 유리병VWR InternationalVWRU10754-818단일 염색 면역조직화학(IHC)용 가연성 시약 및 이중 염색 면역조직화학(IHC)용 자일렌 프리 시약의 조제 및 보관에 사용됨
Kimwipes가 포함된 흡수성 벤치 페이퍼염색 과정 중 다음 배양 단계 이전에 조직 절편에서 과잉 항체나 세척액을 제거하는 데 사용하며, 이를 통해 시약의 잔류 및 교차 오염을 최소화합니다.
항-CD3eAbcamab5690
항-CD4 eBioscience14-9766-80
항-CD68Abcamab125212
항-CD8a eBioscience14-0808-80
항-절단된 caspase-3CST9661
Anti-F4/80Abcamab111101
Anti-FoxP3Abcamab54501
항-GFPAbcamab183734
항-그랜자임 BAbcamab4059
Anti-Ki67Abcamab16667
Anti-NeuNCST24307
항-PD-L1Abcamab205921
항-pSTAT1CST9167
Anti-T-betAbcamab91109
AP 항-토끼 IgGVector LaboratoriesMP-5401
AP 항-쥐 IgGVector LaboratoriesMP-5404-15
BLOXALL 블로킹 솔루션Vector LaboratoriesSP-6000-100주로 2색 면역조직화학염색(IHC)에서 내인성 peroxidase 및 alkaline phosphatase 활성을 억제하는 데 사용됨
소 혈청 알부민 (BSA)Bioworld22070007-2비특이적 결합을 줄이기 위한 5% 범용 블로킹 버퍼(universal blocking buffer) 제조에 사용됨
Cytoseal 60 영구 봉입제 전자현미경 과학18006단색 면역조직화학(IHC)적으로 사용되는 자일렌 호환 봉입제
DAB 기질 및 발색제DAKOK346811-2HRP 기반의 단색 발색 검출에 사용됩니다. 제조사의 지침에 따라 1mL의 DAB 기질에 발색제를 1방울 첨가하여 사용 직전에 준비하십시오.’지침에 따르십시오. 조제 후 사용하지 않은 작업 용액은 폐기해야 합니다. DAB는 잠재적 발암 물질이므로 기관의 생물 안전 및 화학 안전 가이드라인에 따라 취급해야 합니다.
증류수시약 조제, 세척 및 완충액 조제에 사용됩니다. 초순수 또는 Milli-Q water를 사용할 수도 있습니다.
DPBS (Dulbecco’인산 완충 식염수(phosphate-buffered saline) Corning55-031-PC
에탄올, 200 proof Decon Labs2701
Fisherbrand Superfrost Plus 현미경 슬라이드Fisher Scientific12-550-15조직 절편용 양전하 처리 현미경 유리 슬라이드
유리 커버스립Corning 또는 MilliporeSigma슬라이드당 조직 절편 수에 따라 적절한 크기를 선택해야 합니다. 일반적인 크기는 다음과 같습니다: 24 mm × 24 mm (단일 조직 절편), 24 mm × 40 mm (조직 절편 2개), 24 mm × 50 mm (조직 절편 3개)
헤마톡실린Fisher Scientific220-102
Histo-Clear (1 L)전자현미경학64111-01이중 염색 면역조직화학염색(dual-color IHC)에 사용되는 자일렌 프리 투명화제. Histo-Clear I 및 Histo-Clear II라고 표시한 500 mL 병 두 개를 준비한다.
HRP 표지 항-마우스 IgGVector LaboratoriesMP-7402-15
HRP 항-토끼 IgGVector LaboratoriesMP-7401
HRP 항-쥐 IgGVector LaboratoriesMP-7444-15
가습 챔버 Stellar ScientificHS-120879조직 절편의 1차 및 2차 항체 배양을 위해
소수성 배리어 펜 (PAP 펜)Vector LaboratoriesH-4000배양 과정 동안 항체와 시약을 유지하고, 동일한 슬라이드 상의 여러 조직 절편 간의 교차 오염을 방지하기 위해 조직 절편 주변에 발수성 차단벽을 만드는 데 사용됨
KimwipesKimtech Science34155조직 절편에서 잔류 시약 및 세척 버퍼를 부드럽게 제거하는 데 사용됨
자기 교반기 IKAI-10001529소듐 시트레이트 및 DPBS 스톡 용액 조제를 위하여
전자레인지Panasonic (모델: NN-L931BF)SN: 6H610500362.2 큐빅피트 용량. 2 L 유리 비커를 이용한 열 유도 항원 회복에 필요함
Nikon 광학 현미경 NikonSN: 707798Nikon Eclipse Ci-L 일련번호: 707798, Sola light engine 5M5-LCR-VA 일련번호: 11787, 소프트웨어: NIS Elements BR 4.60.00 &NIS Elements BR Analysis 4.60.00, 카메라: Nikon DS-Fi3 sn: 110865 (컬러) &Photometrics CoolSNAP DYNO snA17A608015 (B/W)
pH 미터 VWR International77619-152항원 회수 버퍼의 pH 조절을 위해
플라스틱 랩Fisher Scientific01810마이크로파 가열 중 증발을 최소화하고 조직의 건조를 방지하기 위해 항원 회수 완충액을 느슨하게 덮는 데 사용됨
폴리옥시메틸렌(POM) 슬라이드 랙 MopecSP234상기 염색 용기와 호환되며, 각 랙에는 최대 24개의 현미경 슬라이드를 거치할 수 있습니다.
정밀 저울 Mettler Toledo30697420시트르산 나트륨 및 DPBS 분말의 무게 측정 시
냉장고Thermo ScientificTSG3005CA온도 민감성 시약 및 항체 보관용
슬라이드 보관함Fisher Scientific22-267294
염색 용기/디쉬 MopecSP233각 용기에는 24슬라이드 염색 랙 1개가 들어갑니다.
마그네틱 바 Fisher Scientific14-512-128소듐 시트레이트 및 DPBS 스톡 용액 준비를 위해
시트르산 삼나트륨 이수화물 Thermo Scientific ChemicalsAA3643936
Tween 20 Thermo ScientificAAJ20605AP
VectaMount PT 영구 봉입제 Vector LaboratoriesH-5600-60이중 염색 면역조직화학(IHC)에 사용되는 자일렌 프리(Xylene-free) 영구 봉입제
Vector Blue 알칼라인 포스파타아제 기질 키트 Vector LaboratoriesSK-5300이중 색상 AP 기반 IHC 과정 중 청색 발색 신호 발현에 사용됩니다. Vector Blue는 자일렌에 부분적으로 용해되므로, 이중 색상 염색 워크플로우에서는 자일렌 프리 투명제 및 봉입제를 사용해야 합니다.
Vector Red 알칼라인 포스파타아제 기질 키트Vector LaboratoriesSK-5100이중 색상 AP 기반 IHC 과정 중 적색 발색 신호 현상에 사용됨
자일렌 (1 L) StatLab8400-1단일 염색 면역조직화학염색(IHC)의 탈파라핀 및 투명화제로 사용됩니다. Xylene I 및 Xylene II라고 라벨을 부착한 500mL 병 두 개를 준비하십시오.

참고문헌

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