포도당 내성 장애가 있는 쥐의 침술 반응 모니터링을 위한 산화환원 반응성 표면 강화 라만 산란 미세바늘

요약

이 탐색적 쥐 모델 연구는 포도당 내성이 저하된 쥐에서 동시 침술 개입과 국소 산화 능력 및 산화환원 전위 관련 SERS 지수의 비율 추적을 위한 산화환원 감응성 표면 산란(SERS) 활성 마이크로바늘을 제시합니다.

초록

포도당 내성 저하(IGT)는 산화환원 항상성 장애와 산화 스트레스 증가와 관련이 있으나, 침술 중재 중 산화환원 관련 변화를 생 체 내에서 동적으로 추적하는 것은 기술적으로 여전히 어렵습니다. 이 연구는 IGT 환자 쥐에서 동시 침술 개입과 산화 능력(OC) 및 산화환원 전위(RP) 관련 SERS 지수의 상대 비율 추적을 위한 산화환원 표면 증강 라만 산란(SERS) 활성 마이크로바늘 시스템을 개발했습니다. 산화 및 산화환원 민감성 SERS 프로브는 금나노쉘(GNS)을 각각 OC 반응성을 위해 p-페닐렌디아민(p-PDA)과 함께 기능화하여 RP 반응성을 위해 안트라퀴논을 제조했습니다. 탐침은 침술 바늘에 새겨진 두 개의 홈에 삽입되어 SERS 활성 마이크로바늘을 만들었습니다. 이 탐색 연구에는 특정 병원체가 없는 수컷 Sprague–Dawley 쥐를 사용했습니다. 정상 대조군으로 3마리의 쥐가 사용되었고, 20마리의 쥐는 고지방 식이를 먹이고 IGT를 유도하기 위해 스트렙토조토신(STZ)을 투여했습니다. 선별 검사 후, 18마리의 적합한 IGT 쥐를 고지방 식이와 정상 식이군으로 나누었으며, 각 식이군에 9마리씩 배정되었습니다. 각 식이군은 침점 비틀기, 비침 부위 비틀기, 침 지점 직접 삽입 하위군으로 추가되었으며, 각 하위군마다 3마리의 쥐가 포함되었다. 바늘링은 7일 연속으로 하루 두 차례 시행되었으며, 공복 혈당(FPG), 식후 2시간 혈당(2hPG), 그리고 OC 및 RP 관련 SERS 지수가 기록되었습니다. 결과는 침술 지점에서 꼬임을 이용한 침술이 FPG 및 2hPG 수치를 낮추고, OC 및 RP 관련 SERS 지수에 변화를 보였음을 보여주었습니다. 외부 보정 곡선, 독립적인 생화학적 산화 스트레스 분석, 프로브 침출 시험, 생체적합성 분석법이 포함되지 않았기 때문에, SERS 비율은 절대 생화학적 농도나 절대 산화환원 전위 값이 아니라 상대적인 산화환원 관련 광학 지표로 해석되어야 합니다. 이러한 발견은 침술 중재와 국소 비율 SERS 추적을 결합하는 탐색적 전임상 플랫폼으로서 SERS 활성 마이크로바늘의 실현 가능성을 뒷받침합니다.

서론

포도당 내성 저하(IGT)는 신체가 포도당 내성 능력이 감소하는 현상으로, 정상 혈당과 당뇨병 혈당¹ 사이의 과도기를 나타냅니다. 따라서 IGT는 제2형 당뇨병 2형 발병의 주요 조기 경보 신호이자 가역적 단계^입니다. 임상 데이터에 따르면 IGT 환자 중 약 30%가 5년에서 10^{년 이내에} 제2형 당뇨병으로 진행됩니다. 하지만 적시에 개입하면 이 비율을 10% 미만으로 줄일 수 있습니다⁴.

IGT는 역동적이고 복잡한 과정이며, 지속적인 고포도당 환경은 산화 대사 장애의 주요 유발 요인입니다^. 신체가 장기간 고혈당 상태에 있을 때, 미토콘드리아 호흡 사슬이 비정상적으로 기능하고, 반응성 산소 종 생성 속도가 30–50% 증가^{하여 신체 내} 산화력을 직접적으로 증가시킵니다. 동시에, 높은 당도 수치는 글루타티온 환원효소와 같은 주요 효소의 활성을 억제하여 항산화 시스템이 과도한 활성 산소 종을 제때 제거하는 것을 막고 산화-환원 균형을 더욱 깨뜨립니다. 또한 IGT는 인슐린 저항성과 β세포 기능의 경미한 장애 등 병리학적 변화를 동반하여 다양한 생물학적 및 생화학적 반응을 초래합니다 ^7,8. 산화환원 상태의 진화와 함께 이러한 변화는 포도당 대사의 교란을 더욱 악화시키고, 망막병증, 신병증, 심혈관 질환 등 당뇨병 합병증의 잠재적 위험을 높입니다(^9,10). 따라서 IGT 환자 또는 동물 모델에서 산화 능력(OC)과 산화환원 전위(RP)를 모니터링하는 것은 IGT 발달 기전의 이해를 높이고 표적 치료 전략 설계에 지침을 제공할 것입니다.

침술은 3,000년이 넘는 역사를 가지고 있으며 많은 질병 치료에서 우수한 임상적 효능을 보여왔습니다¹¹. 더불어, 동물을 대상으로 한 수많은 실험 연구에서 침술이 항산화 효소 시스템을 강화하고 지질 과산화를 감소시켜 동물 모델에서 산화 스트레스 상태를 조절하는 데 유익한 효과를 발휘한다는 것이 입증되었습니다¹². 전통 중국 의학 관행으로서 침술은 당뇨병과 IGT 치료에도 상당한 이점을 보여주었습니다. 관원(CV4)과 산인자오 침술점(SP6)은 골격근에서 SIRT1/PGC-1α 경로를 활성화하여 비만-당뇨병 마우스의 인슐린 저항성을 완화하는 것으로 보고되었습니다¹³. 더불어, 천수의 침점(ST25)은 외측 시상하부 영역에 위치한 포도당 억제 신경세포의 활동을 조절하고 당지질 대사 조절에 기여합니다¹⁴. 그러나 혈관 내 침술의 기전에 관한 대부분의 연구는 주로 신경조절, 면역조절, 위장관 시스템에 초점을 맞추고 있으며, 침술은 자율신경 기능 조절을 통해 포도당 대사에 영향을 미치거나 장내 미생물군의 균형을 개선하여 혈당 수치를 간접적으로 조절할 수 있습니다^15,16. 침술이 IGT 치료에 미치는 구체적 기전과 산화 스트레스에 미치는 영향은 심층 연구와 실험적 데이터 지원이 부족했습니다.

표면 강화 라만 산란(SERS)은 뛰어난 감도와 특이도를 제공하여 다양한 분석 물질을 검출할 수 있게 합니다. 나노섬유 광학¹⁷, 키토산 막¹⁸ 및 이전 연구를 기반으로 한 SERS 나노 프로브는 침 침¹⁹가 생체 내 바이오마커, 신경전달물질 및 세포 생화학의 여러 측면 검출에 사용될 수 있음을 입증했습니다. 특히 침술 바늘은 심부 조직 검사에 유망한 도구로, 최소 침습 현장 모니터링과 체외 분석을 가능하게 합니다. 침술은 잘 확립된 치료 방법으로서 매우 광범위한 임상 응용을 가지고 있습니다. 최근 연구들은 SERS 기반 광섬유, 상처 드레싱, 마이크로니들 장치가 생물학적으로 관련 있는 환경에서 산화환원 관련 신호의 현장 또는 최소 침습 추적을 지원할 수 있음을 보여주었습니다^20,21. 동시에 SERS 활성 침술 침 및 관련 마이크로바늘 시스템은 조직 중재와 감지 기능을 통합하는 유망한 매개체로 부^상하여, 생체 내 반응과 시험관 내 SERS 검출 능력을 갖춘 SERS 활성 마이크로바늘을 탄생시켰습니다.

본 연구는 이전에 보고된 SERS 활성 마이크로바늘 전략을 기반으로 포도당 유발 스트레스 모델에서 산화 용량 및 산화환원 전위 관련 신호를 감지하는 데 기반을 두고 있습니다. 그러나 본 연구는 생물학적 맥락과 실험적 목적 면에서 이전 연구와 다릅니다. 구체적으로, 본 연구는 SERS 활성 마이크로바늘 플랫폼을 혈당 내성 저하 쥐 모델에 적용하고, 국소 비율 SERS 추적과 침술 중재를 통합하였습니다. 본 연구는 침술 지점과 인접한 비침술 부위를 추가로 비교하고, 다양한 침술 조작을 평가하며, 7일간의 개입 기간 동안 산화환원 관련 SERS 지수를 모니터링합니다. 이전에 보고된 SERS 기반 광섬유, 상처 드레싱, 그리고 주로 단일 부위 또는 단일 기능 생화학적 검출을 위해 설계된 SERS 활성 마이크로니들과 비교할 때, 본 플랫폼은 두 가지 진전을 제공합니다. 첫째, OC 및 RP 반응 탐침이 단일 침 바늘에 있는 두 개의 독립적인 부식 홈에 통합되어 보완적인 산화환원 지표를 동시에 모니터링할 수 있습니다. 둘째, 침침은 SERS 탐침 전달자뿐만 아니라 치료 장치로도 기능하여 침술 중재 중에 산화환원 모니터링을 수행할 수 있게 합니다. 그림 1에서 볼 수 있듯이, 마이크로바늘을 조직에 삽입한 후 미세한 상처가 형성되고, 두 홈의 프로브가 조직과 반응하여 생체 내에서 OC와 RP 수치를 감지할 수 있게 됩니다. 본 연구의 목적은 이 SERS 활성 마이크로바늘을 사용하여 IGT 환자 쥐에서 OC와 RP 변화를 조사하고, 이들 동물의 침술 지점과 침술의 효과를 규명하여 침술이 IGT 치료에 미치는 효과 기전과 산화환원과 비정상 고혈당 상태 간의 관계에 대한 귀중한 통찰을 얻는 것이었습니다.

프로토콜

IGT의 동물과 모델

모든 동물 시술은 동남대학교 쑤저우연구소 동물윤리위원회(승인 번호)의 승인을 받았습니다. SEU-IACUC-20250318007)에서 실험동물의 관리 및 사용에 관한 기관 지침에 따라 수행되었습니다. 쥐들은 25°C의 특정 병원체 무(SPF) 조건에서 12시간 빛, 12시간 암 주기로 보관되었습니다. 마취가 필요한 시술에서는 유도 챔버를 통해 산소로 투여된 이소플루란으로 쥐를 마취하고 코 콘으로 유지했습니다. 이소플루란은 유도 시 3%, 유지 시 1%로 사용되었으며, 농도는 호흡 심수와 시술 반응에 따라 조정되었습니다.

바늘 삽입이나 주사 전에 올바른 반사 상실과 발가락 집힘에 대한 반응 부재로 충분한 마취 깊이가 확인되었습니다. 마취 중에는 호흡 패턴, 신체 자세, 회복 상태를 모니터링했으며, 동물들은 체온을 유지하기 위해 온열 패드 위에 올려놓았습니다. 동물들은 우리당 2마리씩 수용되었으며, 혈당 검사를 위해 금식이 필요하지 않은 한 자유롭게 음식과 물을 사용할 수 있었습니다. 도착 후 쥐들은 모델 유도 전 1주일간 고대에 적응시켰습니다. 동물 복지는 매일 모니터링되었으며, 일반 활동, 미용, 음식 섭취, 체중, 주사 부위 상태, 마취 후 회복 등이 포함되었습니다. 연구가 끝난 후, 쥐들은 승인된 동물 프로토콜에 따라 안락사되었습니다. 안락사는 점진적으로 CO₂ 흡입을 통해 시행되었으며, 이후 자궁경부 탈구법으로 사망 확인이 이루어졌습니다. 심각한 체중 감소, 지속적인 움직임 정지, 비호흡, 식사 및 마실 수 없는, 심각한 고통 등 인도적 평가 기준을 충족하는 동물들은 예정된 종료점까지 유지하지 않고 즉시 안락사되었습니다. 이 연구에는 체중 200± 20g의 특정 병원체가 없는 수컷 Sprague–Dawley 쥐가 사용되었습니다. 1주일간의 적응 후, 쥐들은 무작위로 두 그룹으로 배정되었습니다: 정상군의 3마리는 정상적인 음식을 먹였고, 모델 그룹의 20마리는 3주간 고지방 차우(50% 기초 차우 + 10% 라드 + 25% 자당 + 15% 노른자 가루)를 먹였습니다. 모델 그룹의 동물들은 12시간 동안 수분 제한 없이 금식 후 12시간 동안 20mg/kg의 2% STZ 용액(0.1mol/L, pH 4.4 시트레이트 버퍼에 용해됨)을 복막 내 주사를 받았습니다. 정상군은 정상 음식을 먹은 후 해당 용량의 시트레이트 완충액 복강내 주사를 받았습니다. 1주 후 복강내 포도당 내성 검사(IPGTT)가 시행되었습니다. 이 연구에 사용된 시약과 장비 는 재료표에 나열되어 있습니다.

공복 혈당(FPG)은 각 그룹의 쥐 꼬리 끝에서 수분 제한 없이 12시간 금식 후 혈액 채취로 측정했으며, 복강내 주사 후 2시간 동안 20% 포도당 2g/kg 주사 후 2hPG가 기록되었습니다. 정상 그룹에서는 FPG 범위가 5.1–6.6 mmol/L, 2hPG 포도당 범위는 7.3–9.4 mmol/L였으며, 모델 그룹에서는 FPG가 ≤7.0 mmol/L, 2hPG 범위는 10–16 mmol/L이었습니다. IGT 모델 유도에 배정된 20마리 중 18마리가 IPGTT 후 사전 정의된 IGT 기준을 충족하여 후속 중재 실험에 포함되었습니다. 두 마리의 쥐는 FPG 또는 2hPG 값이 미리 정의된 IGT 범위를 벗어나 제외되었습니다. 18마리의 적격 쥐는 고지방 식단과 정상 식단에 무작위로 배정되었으며, 각 그룹에 9마리씩 배정되었습니다. 각 식이군은 추가로 세 개의 하위 그룹으로 나뉘었는데, 침 지점 비틀기, 비침 부위 비틀기, 침 지점 직접 삽입 그룹으로, 각 하위군마다 3마리의 쥐가 있었다. 이 연구는 침술 중재와 SERS 기반 비율 추적을 전임상 IGT 쥐 모델에서 결합하는 타당성을 평가하기 위해 고안된 탐색적 방법 개발 연구였습니다. 공식적인 통계적 검정력 계산은 수행되지 않았습니다. 세 마리의 쥐 하위 그룹은 타당성, 예비 SERS-마이크로바늘 연구, 동물 감소 원칙을 바탕으로 선정되었습니다. 쥐는 실험자가 무작위로 배정했으며; 공식적인 배분, 은폐, 눈 가리기는 시행되지 않았다.

침술 치료 프로토콜은 전통 중의학의 근거 기반 임상 실무 지침과 동물 실험의 타당성을 참고하여 선별되었다²². 선정된 경혈은 중완(RN12/CV12), 수이펀(RN9/CV9), 음교(RN7/CV7), 양측 천서(ST25), 양측 수이도(ST28), 양측 조산리(ST36)였습니다. RN12, RN9, RN7은 전측 정중선에 위치하며 단일 중앙선 점으로 처리되었고, ST25, ST28, ST36은 양측으로 치료되었습니다. 침술 지점 조합은 IGT²³ 임상 치료에 사용된 기준을 기반으로 하였습니다. 적응은^24,25 문헌에 기반하며, 이분법을 사용했다. 쥐의 경우, 경혈점은 해부학적 랜드마크와 표준 인간 경병점 위치와의 비례 변환에 따라 국소화되었습니다. 복부 RN/CV 지점은 첨골돌기, 배꼽, 치골 결합을 통해 해부학적 랜드마크로 확인되었습니다. ST25는 배꼽 부위에서 양측으로, ST28은 전방 정중앙선에서 같은 외측 거리의 하복부 부위에 양측적으로 표시되었습니다. ST36은 경골결절 외측의 전경골 전부 부위에서 확인되었다. 인접한 비침술 비교 부위는 해당 경보에서 5mm 떨어진 경경선 외곽에 표시되었으며, 눈에 보이는 혈관, 흉터, 이전 천자 부위는 피하였습니다. 바늘링 전에 승인된 동물 프로토콜에 따라 이소플루란으로 마취한 쥐를 보온용 패드 위에 엎드려 눕혔습니다. 각 표적 부위의 복부와 뒷다리 피부는 면도하고 75% 에탄올로 소독되었습니다. SERS 활성 마이크로바늘은 피부에 수직으로 약 10mm 깊이까지 삽입되었습니다. 침 점이 있는 비틀기 그룹에서는 SERS 활성 미세바늘을 선택한 경혈에 삽입하고 20분 동안 부드럽게 양방향으로 회전시켰습니다. 비침술 부위 그룹에 대해서도 5mm 인접한 비침술 비교 부위에서 동일한 시술이 시행되었습니다. 직접 삽입 그룹에서는 SERS 활성 마이크로바늘을 경보에 삽입하고 20분간 비틀지 않고 유지했습니다. 모든 니들링 절차는 동일한 훈련된 조작자가 수행하여 운영자 간 변동을 최소화했습니다.

니들링은 하루 2회, 10:00과 15:00에 7일 연속으로 시행되었습니다. 매일 시술 전, 수분 제한 없이 8시간 금식 후 FPG를 측정했습니다. 매일 바늘 시술 후에는 OC 및 RP 반응을 기록했습니다. 침술 치료 후 7일째에 IPGTT가 시행되었고, 2hPG 수치가 기록되었습니다.

주의사항

스트렙토조토신은 위험하므로 독성 화학물질로 취급해야 합니다. 실험실 코트, 니트릴 장갑, 보호 안경, 마스크를 착용한 상태에서 화학 연기함이나 인증된 생물안전 캐비닛에서 스트렙토조토신 용액을 준비하세요. 스트렙토조토신 오염된 주사기, 주사기, 물티슈, 침구, 케이지, 동물 관련 배설물은 기관의 유해 생물학적 및 화학적 폐기물 절차에 따라 처리되어야 합니다. 사용한 바늘과 주사기는 즉시 뚜껑을 닫지 않고 찌름에 강한 샤프 용기에 버려야 합니다.

OC 및 RP 검출을 위한 SERS 활성 마이크로니들 제작

침 바늘은 이전에 보고된 대로²⁶명을 준비했다. 연구 기간 내내 동일한 종류의 상업용 스테인리스 침술 침(0.25mm × 26mm)을 사용하여 SERS 활성 마이크로바늘을 제작하였습니다. 바늘은 피부에 대략 수직으로 깊이 10mm로 삽입되었습니다. 트위스티싱 그룹의 경우, 동일한 훈련된 조작자가 유지 기간 동안 20분 동안 부드럽고 일관되게 수동 양방향 회전을 적용했습니다. 조작은 기기 제어가 아니었으며; 따라서 정확한 회전 주파수와 진폭은 정량화되지 않았습니다. 이 한계는 토론에서 인정되었습니다.

초기에는 바늘을 MMA에 담갔다가 실온(25°C)에서 1일간 건조시켰습니다. 다음으로, PMMA 보호층에 크기와 모양, 깊이가 비슷한 두 개의 평행한 홈(5mm 간격)을 에탄올로 세척한 작은 공예용 칼날을 사용해 만들었습니다; 그 후 바늘을 0.5M 황산에 담가 전해질 역할을 하며 10초 동안 12V 전압에서 전기화학 식각을 거쳐 점수 부위에 거의 원형에 가까운 두 개의 홈을 형성했습니다. 셋째, 세 차례 세척 후 바늘을 0.1 mol L⁻¹ MPTES와 0.3 mol L⁻¹ APTES가 포함된 에탄올 용액에 실온에서 24시간 담가, 이로써 홈이 있는 표면에 설피드릴 기능을 부여했다. 넷째, 바늘을 MMA에 담가서 코팅을 벗겼습니다. 이전에 보고된 방법²⁷을 기반으로 산화환원 반응성 SERS 활성 마이크로바늘을 준비하였습니다. SERS 기판은 각 침술 바늘의 각각 홈 중 하나에 흡착되고, 생성된 SERS 활성 미세바늘은 1 × ^10-4 mol/L 농도로 37 °C에서 60분간 수용성 p-PDA 용액에 담근 후 산화 반응성 SERS 활성 미세바늘을 생성했습니다. 금 나노쉘을 기반으로 한 SERS 기질^{은 앞서} 설명한 대로 합성되었습니다. 본 연구에서는 이 미세바늘들을 각 침술 바늘의 다른 홈에 떨어뜨린 후 자연스럽게 건조시켰다. 이로 인해 OC 및 RP 반응을 가진 SERS 활성 마이크로바늘이 탄생했습니다.

SERS 활성 마이크로바늘에 대한 OC 및 RP 반응의 체외 평가

OC 및 RP 프로브의 반응은 SERS 활성 마이크로바늘을 체외 조직에 삽입하여 평가하였다. OC 프로브의 산화 반응성을 검증하기 위해 산화 전후로 p-PDA의 SERS 스펙트럼을 기록하였습니다. 산화환원 SERS 프로브의 스펙트럼도 강환원 NaBH₄ 용액과 강산화성 HAuCl₄ 용액에서 획득하였습니다. OC 프로브의 선택성은 ^10-4 M FeSO₄ 1×, ^10-4 M Na₂SO₄, 10-4 M ×× 10-4 M 아스코르브산 1× 등 환원제와 산화제(^10-4 M CuSO₄, ^10-4 M H₂O₂, 10-4 M ×× FeCl₃ 1 포함)를 사용하여 평가되었습니다. 그리고 ^10-4 M HAuCl₄× 1척. 모든 용액은 20 mM PBS(pH 7.4)에서 준비되었고, 각 용액과 함께 37 °C에서 20분간 배양되었습니다. SERS 활성 마이크로니들의 견고성은 1× ^10-4 mol/L FeCl₃로 반응 전후 OC 반응을 기록하여 평가하였다. 이러한 외부 체외 및 용액 기반 검사는 통제된 조건에서 탐침 반응성을 확인하는 데 사용되었습니다. 그러나 국소 pH 변화, 단백질 흡착, 세포외 기질 구성 요소 및 기타 생물학적 물질이 SERS 신호에 영향을 미칠 수 있는 생체 내 조직 미세환경의 복잡성을 완전히 재현하지는 못합니다. 따라서 생체 내 OC 및 RP 측정값은 기질 독립적인 생화학적 측정이 아닌 상대적으로 산화환원 관련 SERS 지수로 해석되었습니다.

침술 및 비침술 부위에서의 OC 및 RP 탐지

침술 지점과 비침술 지점에서 OC 및 RP 탐침의 성능을 평가하기 위해, SERS 활성 마이크로바늘을 건강한 쥐의 ST36 및 RN12 침술 지점에 각각 인접한 약 10mm 깊이에서 동일한 시간 삽입했습니다.

바늘 꼬임이 OC 및 RP 감지에 미치는 영향

다양한 침술 기법 하에서 OC 및 RP 탐침의 반응성을 평가하기 위해, 건강한 쥐의 ST36 및 RN12 침술 지점과 인접한 약 10mm 깊이에 SERS 활성 마이크로바늘을 삽입하였다. 각 침 지점마다 한 바늘이 비틀렸고, 인접한 침은 비틀리지 않았으며, 반대로 침 지점 인접 바늘은 비틀렸지만 침 지점에 있는 바늘은 비틀리지 않았습니다. 각 침에 대해 동일한 삽입 시간에 프로브에서 나오는 SERS 신호가 수집되었습니다.

IGT 환자 쥐에서 침 지점, 바늘 꼬기, 식이 조건에 따른 OC 및 RP 변화

침 치료, 바늘 꼬기 치료, 식이 상태가 IGT 쥐의 OC 및 RP에 미치는 영향을 평가하기 위해, 고지방 식이군 쥐는 무작위로 세 그룹(A1, A2, A3; 각 그룹에 3마리씩)으로 배정되었고, 정상 식이군(그룹: B1, B2, B3; 각 그룹에 3마리씩)도 포함되었다. A1 및 B1 그룹의 쥐에서는 진정 후 침술 지점에 SERS 활성 미세바늘을 삽입하고 20분간 비틀었으며; 동일한 절차가 A2 및 B2 그룹의 쥐에 대해서도 시행되었으나, 미세바늘은 침술 지점 인접 5mm 간격으로 삽입되었다. A3 및 B3 쥐의 경우, SERS 활성 미세바늘을 쥐 침술 지점에 비틀지 않고 삽입했습니다; 바늘은 20분 동안 그대로 두었습니다. 니들링은 7일 동안 하루 10시와 15시에 두 번 시행되었습니다. 매일 시술 전에는 혈당 측정기를 사용해 각 쥐 그룹의 FPG 값을 기록했습니다(단식 후 8시간 동안 물 제한은 없었습니다). 매일 침질 후 OC와 RP 반응을 측정하고 기록했습니다. 7일째 침술 후 각 쥐 그룹에 대해 IPGTT를 시행하고 2hPG 수치를 기록하였다.

특성화 및 측정

SERS 활성 마이크로니들의 형태는 주사 전자현미경(SEM)으로 조사되었습니다. SERS 스펙트럼은 25°C에서 50× 장거리 대물렌즈(NA: 0.5)와 785 nm 레이저를 장착한 라만 분광기를 사용해 획득했습니다. 모든 측정에서 획득 시간은 10초였으며, 라만 시스템은 동일한 광학 구성에서 명목상 레이저 출력 600 μW로 작동했습니다. 이 연구에서는 조직 표면에 전달된 실제 레이저 출력을 직접 측정하지 않았습니다. 따라서 동일한 획득 환경에서 그룹 간 상대 비교를 위해 SERS 스펙트럼을 사용했으며, 절대 조직 광열 안전성에 관한 결론은 도출되지 않았습니다. 두 SERS 프로브의 강도 비율은 다음과 같은 방법으로 계산되었습니다: 1450 cm⁻¹ 에서의 강도 값과 1500 cm⁻¹ 의 강도 값을 OC 지표로 지정했으며(I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹), 각 피크 각각에서 1700 cm⁻¹ (배경 값)에서 강도를 빼고 나서, 각각 이전 보고서와 마찬가지로 ^17명; 그리고 RP의 지표로 I₁₆₀₆ cm⁻¹ / I₁₆₆₆ cm⁻¹ 을 사용하여 각각 두 피크 각각에서 1700 cm⁻¹ (배경)에서의 강도를 차감했다. 계산된 I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹ 과 I₁₆₀₆ cm⁻¹/I₁₆₆₆ cm⁻¹ 값은 각각 상대적으로 SERS 유도 지수로 분석되었으며, 이는 OC 및 RP 관련 반응의 상대적 지수였습니다. 이 비율들은 동일한 획득 환경에서 그룹 및 시점 간 변화를 비교하는 데 사용되었습니다.

본 연구에서는 이러한 비율을 산화성 종의 절대 농도나 절대적인 전기화학 산화환원 전위값으로 변환하는 외부 보정 곡선이 설정되지 않았습니다. 각 스펙트럼은 SERS 탐사선의 다섯 개 지점에서 세 번의 복제 샘플에서 두 번 기록되었습니다. Origin은 데이터를 처리하고 차트를 만드는 데 사용되었습니다. 획득 관련 변동성을 최소화하기 위해 동일한 레이저 파장, 대물, 획득 시간, 레이저 출력 설정, 스펙트럼 처리 워크플로우가 모든 그룹에 적용되었습니다. 레이저 조사로 인한 잠재적 광열 또는 광화학 효과는 독립적으로 정량화되지 않았으며, 한계로 인정받고 있습니다. 통계 데이터는 평균± 표준오차(SEM)로 제시됩니다. 각 실험이나 도표 패널에 사용되는 표본 크기와 통계적 검정은 해당 도표 전례에 명시되어 있습니다. 체 외 탐침 검증 실험에서는 SERS 프로브 또는 독립적으로 준비된 마이크로니들(microneedle)을 분석 장치로 사용했습니다. 생 체 내 혈당 및 SERS 지수 분석에서는 쥐를 생물학적 분석 단위로 사용했습니다. 동일한 프로브의 여러 지점에서 수집된 스펙트럼은 기술적 측정으로 간주되어 그룹 수준 분석 전에 평균을 내었습니다. 통계 분석은 SPSS 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 그룹 간 비교는 해당 도표 판례에 표시된 통계 검정을 사용하여 수행되었습니다. 7일간의 중재 기간 동안 연속 공복 혈당 및 SERS 지수 측정은 소그룹 규모로 인해 탐색적 종단 추세로 해석되었으며, 공식적인 반복 측정이나 혼합 효과 모델은 적용되지 않았습니다. 통계적 유의성은 p < 0.05로 정의되었습니다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.

결과

OC 및 RP 검출을 위한 SERS 활성 마이크로니들 제작

OC와 RP 변화를 식별하기 위해 해당 프로브가 포함된 SERS 활성 마이크로니들(microneedle)을 제작하였습니다. 대표적인 SEM 이미지는 SERS 활성 마이크로바늘의 2홈 구조를 확인했습니다. 그림 2A는 두 개의 부식된 홈이 있는 침술 바늘 본체를, 그림 2B는 GNS가 적재된 홈을, 그림 2C는 홈 내에 분포된 GNS의 확대 모습을 보여줍니다. 이 이미지들은 각각 홈이 OC 및 RP 반응 SERS 탐사선의 국소 하중 부위로 활용될 수 있음을 확인시켜 주었습니다. 최대 강도 비 I₁₄₅₀ cm⁻¹ / I₁₅₀₀ cm⁻¹은 p-PDA가 산화된 정도를 나타내는 데 사용되었다. 그림 3A는 1× 10^⁻⁻ M FeCl₃과의 상호작용 전후 p-PDA의 SERS 스펙트럼을 보여주며, 그림 3B는 1× 10^⁻³ M NaBH4와 1× 10^⁴ M HAuCl₄ 수용액 중 산화환원 프로브의 스펙트럼을 보여줍니다. RP 프로브 반응은 최대 강도 비율(I₁₆₀₆ ^cm-1/I₁₆₆₆ ^cm-1)으로 표현되었으며, RP가 증가할수록 감소하였다.

산화 용량 반응성 프로브의 선택성을 평가하기 위해, 다양한 환원제 및 산화제에 노출된 후 I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹ 비율을 측정하였다. 독립적인 프로브 측정은 그룹당 n = 3개로 수행되었으며, 분석 단위로 SERS 프로브 또는 독립적으로 준비된 마이크로니들(마이크로니들)을 사용했습니다(그림 3C). CK 그룹(크루스칼-월리스 검사 후 던의 다중 비교 검사)과 비교할 때, 환원제 FeSO₄와 Na_2SO-4는 I₁₄₅₀ cm⁻¹ / I₁₅₀₀ cm⁻¹ 비율에 유의미한 변화를 주지 않았습니다(p > 0.05). 아스코르브산(AA, p < 0.001)도 환원제로 포함되었음에도 불구하고 현재 검사 조건에서 비율이 증가했다. 따라서 AA 반응은 이 용액 기반 분석에서 산화 행동의 증거보다는 프로브 특이적 스펙트럼 반응으로 신중하게 해석되었습니다. 반면, 산화 또는 산화 관련 시약은 비율을 다양하게 증가시켰습니다. CuSO₄(p < 0.0001), H₂O₂(p < 0.0001), FeCl₃(p < 0.0001), HAuCl₄(p < 0.0001) 노출 후 비율이 증가했습니다. 실온에서 OC 프로브의 안정성을 평가하기 위해, 1 × 10^⁻⁻ M FeCl₃와 반응하기 전 6시간 동안 시간마다 SERS 스펙트럼을 획득했습니다(그림 3D). 이에 대응하는 I₁₄₅₀ cm⁻¹/_{I 1500} cm⁻¹ 비율이 계산되었습니다. 프로브 흡착 후 초기 값은 약 0.20 ± 0.02로 안정적으로 유지되었으며,_FeCl3 반응 시 약 0.9 ± 0.10 수준으로 6시간 동안 안정적이었습니다. 이 결과들은 GNS의 p-PDA가 공기 중에서 안정적임을 시사합니다.

침술과 비침술 지점에서의 강박 및 RP 반응

이전^{연구들 29} 건은 OC 프로브가 삽입 후 10분 이내에 최대 반응을 보이는 것으로 나타났습니다. 그림 4A와 B는 건강한 쥐에서 ST36 및 RN12 침술 지점, 그리고 그 지점에 인접해 5mm 간격으로 놓은 침술 지점에 놓인 SERS 활성 미세바늘의 반응을 10분 동안 보여줍니다. 이 실험들에서는 그룹당 n=3마리의 쥐를 사용하고, 동일한 탐침의 여러 지점에서 수집한 스펙트럼을 기술적 복제로 간주하여 그룹 수준 분석 전에 평균화하였습니다. SERS 활성 마이크로바늘은 생체 내에서 침술 지점 그룹에서 OC와 RP 변화에 효과적으로 반응했으며, 침술 지점 그룹에서 비침술 지점 그룹과 비교해 OC와 RP에 유의미한 차이가 없었습니다(독립 표본 t-test, p > 0.05).

생 체 내 국소 OC와 RP에 대한 바늘 꼬임의 효과를 더 확인하기 위해, SERS 활성 미세바늘을 건강한 쥐의 ST36 및 RN12 침술 지점, 그리고 이 지점들보다 5mm 지점까지 10mm 깊이까지 삽입하였다. 각 침 지점에서 비틀기 동작을 할 때, 그 지점 인접한 바늘은 비틀리지 않았고, 그 반대도 마찬가지였으며, 구멍 부위의 OC와 RP 값 변화가 기록되었습니다(그림 4C–F). 건강한 쥐에서 침 치료 지점 또는 비침술 지점에서 비틀기를 시행했는지에 따라 OC와 RP에 유의미한 변화가 없었으며, 인접 지점에서 비틀어도 효과가 없었다(p > 0.05).

침술, 바늘 꼬기 및 식이 조건과 관련된 IGT 쥐의 OC 및 RP 변화

IGT 쥐 모델 성공적으로 확립되었음을 확인하기 위해, FPG와 2hPG 값을 각각 IPGTT 분석으로 모델 및 대조 쥐에서 기록하였습니다. 대조군에는 n = 3마리의 쥐가 포함되었고, 모델 그룹에는 사전에 정의된 포도당 내성 기준을 충족하는 n마리 = 18마리가 포함되었습니다. 모델 쥐들은 대조군보다 공복 혈당 수치가 더 높았다(6.92 mmol/L 대 5.54 mmol/L; Mann–Whitney U 검사, p < 0.01) 그리고 대조군보다 식후 2시간 혈당이 더 높았다(11.52 mmol/L 대 7.92 mmol/L; Mann–Whitney U 테스트, p < 0.001) (그림 5)는 모델 동물에서 IGT가 성공적으로 유도되었음을 나타냅니다.

침술 포인트, 바늘 꼬기, 식이 조건의 조합이 IGT 쥐에게 미치는 영향을 검증하기 위해 전형적인 침술 포인트 쌍을 선택하였다. 18마리의 적격 모델 쥐는 고지방 식이군과 정상 식이군으로 나뉘었으며, 각 식이군당 n = 9마리의 쥐가 배분되었습니다. 각 식이군은 추가로 세 가지 중재 하위 그룹으로 나뉘었는데, 침 지점 비틀기, 비침 부위 비틀기, 침 지점 직접 삽입 그룹으로, 각 하위군당 n = 3마리의 쥐가 포함되었습니다. FPG 값은 니들링 전 매일 기록되었고(그림 6A–C), 2hPG(그림 6D)는 각 그룹에서 7일 니들링 후 IPGTT 분석으로 측정되었습니다. 이 탐색적 데이터셋에서는 침술 후 고지방 식이와 정상 식이 모델 그룹 간에 FPG 또는 2hPG에 명확한 차이가 관찰되지 않았습니다. 침 점과 비침술 부위 침술 비교 결과, 침점 비틀림이 현재 실험 조건에서 혈당 수치가 낮음과 연관되어 있음을 시사했습니다(독립 표본 t-검정, p < 0.05). 하위 그룹 규모가 작고 식이, 경혈점 위치, 비틀림 조작을 완전히 통계적으로 분리할 수 없었기 때문에, 이 결과들은 예비 동물 모델 관찰로 해석되었습니다.

IGT 쥐에서 1주일간 침술 개입 기간 동안 산화 능력 관련 및 산화환원 전위 관련 SERS 지수 변화를 모니터링하였다. 이 분석에서는 각 하위 그룹별로 n=3마리의 쥐가 포함되었고, 각 쥐는 생물학적 분석 단위로 취급되었습니다. 고지방 식이 쥐에서 산화 능력 관련 SERS 지수는 침술 포인트 비틀기와 침술 직접 삽입군에서 시간이 지남에 따라 감소한 반면, 비침술 부위 비틀림군에서는 상대적으로 높은 수준을 유지했습니다(그림 7A). 침 지점 비틀기군과 침점 직접 삽입군에서 산화환원 관련 SERS 지수는 시간이 지남에 따라 증가한 반면, 비침술 부위 비틀림군은 상대적으로 약한 증가를 보였다(그림 7B). 정상적인 식이 IGT 쥐에서도 유사한 경향이 관찰되었습니다. 침 지점 비틀림군과 침점 직접 삽입군에서는 산화 용량 관련 SERS 지수가 시간이 지남에 따라 감소했으며, 비침술 부위 비틀림군에서는 변화가 더 작았다(그림 7C). 침 지점 비틀기군과 침술 직접 삽입군에서 산화환원 전위 관련 SERS 지수는 시간이 지남에 따라 증가한 반면, 비침술 부위 비틀기 그룹은 상대적으로 낮았습니다(그림 7D).

동일한 침술 조작 하에서 식이 상태를 추가로 비교하기 위해, 고지방 식단과 정상 식단의 침 점 비틀림 하위 그룹을 비교하였다. 이 비교에서 산화 능력 관련 SERS 지수는 두 식이 조건 모두에서 시간이 지남에 따라 감소했으며, 정상 식이 침술 점이 꼬이는 하위 그룹에서는 7일째에 더 큰 감소가 관찰되었습니다(그림 7E). 산화환원 전위 관련 SERS 지수는 두 식이 조건 모두에서 시간이 지남에 따라 증가했으며, 정상 식이 침술 포인트 비틀기 하위 그룹에서 7일차 수치가 더 높았습니다(그림 7F). 이 결과는 침 지점 비틀림과 식이 정상화가 IGT 쥐에서 국소 산화환원 관련 SERS 지수 변화와 연관되었음을 시사합니다. 각 하위 그룹에는 단 3마리의 쥐만 포함되었고 독립적인 생화학적 산화 스트레스 분석이 수행되지 않았기 때문에, 이 결과들은 산화 스트레스 개선에 대한 결정적인 생화학적 증거라기보다는 탐색적 동물 모델 관찰로 해석되어야 한다.

데이터 가용성:

혈당 측정, SERS 유도 비율 값, 정량적 도표 패널용 원본 데이터를 포함하여 도표 생성 및 통계 분석에 사용되는 모든 수치 원시 데이터는 보충 표 1로 정리되어 업로드되었습니다. 분석 기기가 직접 생성하는 연속 탐침 모니터링 실험의 경우, 프로브 성능 평가에 사용되는 내보내진 값과 대표적인 기기 생성 결과가 보충 파일 1에 포함되어 있습니다.

그림 1: 이중 홈 SERS 활성 마이크로바늘을 이용한 침술 중재 및 국소 비율 SERS 추적의 방법론적 워크플로우. 도식은 2홈 SERS 활성 마이크로바늘을 침술 지점이나 인접한 비침술 부위에 삽입한 후 라만 스펙트럼 획득을 보여줍니다. 저자들은 WPS 소프트웨어를 사용해 이 그림을 만들었으며, 저작권 라이선스는 필요하지 않습니다. 약어: SERS = 표면 강화 라만 산란. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: SERS 활성 마이크로바늘의 대표적인 SEM 이미지. (A) 두 개의 홈이 있는 침술 바늘 몸체; 스케일 바 = 200 μm; 배율 = 77×. (B) GNS와 통합된 홈; 스케일 바 = 20 μm; 배율 = 1,000×. (C) B 홈의 확대된 이미지; 스케일 바 = 2 μm; 배율 = 30,000×. 약어: SEM = 주사 전자현미경; GNS = 골드 나노쉘. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: OC 반응 및 RP 반응 SERS 프로브의 특성화. (A)_FeCl3와 상호작용 전후 p-PDA의 정규화 스펙트럼. (b) 각각 NaBH₄ 및 HAuCl₄ 용액 내 RP 프로브의 정규화된 SERS 스펙트럼. (C) 다양한 산화 및 환원 용액에서 OC 프로브에 대해₁₄₅₀ cm⁻¹ /_{I 1500} cm⁻¹ 비율을 사용한다. n=그룹당 3개의 독립적인 프로브 측정. 크루스칼-월리스 검정 뒤에 던의 다중 비교 검정이 CK 그룹에 대해 적용되었다. 데이터는 평균± 표준오차(SEM)로 제시됩니다. (D) FeCl₃과의 반응 전후 OC 반응 프로브의 6시간 안정성 평가. 약어: SERS = 표면 강화 라만 산란; CK = 컨트롤 체크; p-PDA = p-페닐렌디아민; AA = 아스코르브산. p < 0.001, ****p < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4: 건강한 쥐에서 침술 및 비침술 부위에서 다양한 침술 방법으로 측정한 OC 및 RP 관련 SERS 지수. (A) 침 지점 및 인접한 비침술 부위에 직접 삽입한 후 발생한 OC 관련 SERS 지수. (B) 침술 지점 및 인접한 비침술 부위에 직접 삽입한 후 RP 관련 SERS 지수. (C) 비침술 부위에서 직접 삽입 후 침술 지점에서 바늘을 꼬는 후 발생한 OC 관련 SERS 지수. (D) 비침술 부위에서 직접 삽입하고 침 지점에서 바늘을 비틀었을 때 RP 관련 SERS 지수. (E) 침 지점에 직접 삽입하고 인접한 비침술 부위에서 바늘을 꼬는 후 OC 관련 SERS 지수. (F) 침 지점에 직접 삽입하고 인접한 비침술 부위에서 바늘을 꼬는 후 RP 관련 SERS 지수. OC는 I₁₄₅₀ ^cm-1/I₁₅₀₀ ^cm-1로 계산되었고, RP는 I₁₆₀₆ ^cm-1/I₁₆₆₆ ^cm-1로 계산되었습니다. 각 그룹마다 n=3. 데이터는 SEM 평균± 제시됩니다. 쌍 비교 간 유의한 차이는 관찰되지 않았습니다. 약어: OC = 산화 능력; RP = 산화환원 전위. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 5: 모델 및 대조(CK) 쥐의 IPGTT 분석법에 따른 FPG 및 2hPG 값. FPG와 2hPG를 측정하여 포도당 내성 저하 쥐 모델의 확립을 검증하였습니다. n = 대조군 쥐 3마리, 모델 그룹 n = 18마리. 통계 분석은 Mann–Whitney U 검정으로 수행되었으며, 결과는 SEM 평균± **p < 0.01, ***p < 0.001로 제시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 6: 침술 중 IGT 쥐의 FPG 및 2hPG 값. (A) 침술 지점에서 바늘을 꼬고 침 지점에 직접 침을 삽입하는 그룹의 FPG 값(그룹당 n = 3개). (B) 침술 지점과 비침 지점에서 꼬임을 가진 침술을 받는 그룹의 FPG 값(그룹당 n = 3개). (C) 고지방 식단과 정상 식단군의 FPG 값(n=3명). (D) 침 지점 비틀림, 비침술 부위 비틀림, 침 지점 직접 삽입 조건 하에 고지방 및 정상 식이 쥐의 7일차 2hPG 값. (n = 그룹당 3개). 결과는 SEM 평균± 제시됩니다. 패널 D에서 계획된 쌍별 평가 평가 비교는 쌍 없는 양측 학생 t-검정을 사용해 분석하였습니다. *p < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 7: 각 그룹의 쥐 OC 및 RP 변화 1주일 침술 기간 동안. (A) 고지방 식이 IGT 쥐의 OC 변화. (B) 고지방 식이 IGT 쥐의 RP 변화. (C) 정상 식이 IGT 쥐에서 OC 변화. (D) 정상 식이 IGT 쥐의 RP 변화. (E) 침 지점 비틀기 하위 그룹 내 고지방 식단과 정상 식단 상태 간의 OC 관련 SERS 지수 비교; (F) 침 점 비틀기 하위 그룹 내 고지방 식단과 정상 식단 상태 간의 RP 관련 SERS 지수 비교. n = 하위 그룹당 3마리의 쥐. 데이터는 SEM 평균± 제시되며, 연속 측정은 탐색적 종단 추세로 해석되었습니다. 약어: OC = 산화 능력; RP = 산화환원 전위. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 파일 1: 프로브 응답 평가를 위한 대표적인 기기 생성 출력. 이 파일은 분석 기기에서 직접 생성된 대표적인 연속 모니터링 출력을 포함하며, 프로브 응답 성능을 평가하는 데 사용됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 표 1: 정량적 분석을 위한 원시 데이터 표. 이 파일에는 혈당 측정, SERS 유도 비율 값, 정량적 도표 패널 데이터를 포함한 수치 생성 및 통계 분석에 사용되는 자료가 포함되어 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

포도당 내성 장애는 제2형 당뇨병 이전에 가역적 전환 단계를 나타내며, 대사 불균형, 인슐린 저항성, 산화 스트레스 관련 조절 장애와 밀접한 관련이 있습니다. 생활습관 중재와 기타 초기 치료 전략은 포도당 내성 저하에서 당뇨병으로의 진행 위험을 줄일 수 있지만, 중재 중 국소 생화학적 반응을 동적으로 모니터링하는^{도구는 여전히 제한}적입니다. 침술은 실험 및 임상 연구에서 포도당 대사와 산화 스트레스 관련 경로에 영향을 미치는 것으로 보고되었습니다. 그러나 침술의 대부분 기전 연구는 종말 혈액 또는 조직 측정에 의존하며, 침 치료 중 국소 산화환원 관련 반응을 최소 침습적으로 추적할 수 있는 방법은 상대적으로 적습니다. 이전 IGT 치료에 대한 임상 시험들은 식이 조절, 체중 감소, 신체 활동 증가 등 생활습관 중재를 통해 당뇨병 위험을 크게 줄일 수 있음을 확인했습니다³¹. 침술은 혈당 대사율을 개선하고 공복 및 2hPG를 낮추는 데 효과가 있음이 입증되었습니다. 따라서 침술, 산화환원, IGT 간의 관계를 밝히는 것은 IGT를 되돌리거나 진행을 방해하는 접근법을 제공하여 당뇨병 발생률을 줄이고, IGT의 병리와 발달 기전에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.

본 연구는 침술 중재와 국소 비율 SERS 추적을 결합하여 포도당 내성 저하 쥐 모델에서 침술 중재와 국소 비율 SERS 추적을 결합하는 이중 홈 산화환원 감응 표면 강화 라만 산란 활성 마이크로바늘 플랫폼을 제안합니다. 이 시스템에서는 단일 침술 바늘에 두 개의 부식된 홈이 사용되어 산화 능력 반응성 및 산화환원 반응성 탐침을 운반했습니다. 이 설계 덕분에 침침은 단순한 개입 도구뿐만 아니라 상대적으로 국소 산화환원 관련 광학 판독을 감지하는 운반체 역할도 할 수 있게 되었습니다. 결과는 침술 부위에서 비틀림을 이용한 침술이 공복 혈당 및 2hPG 수치를 낮추고, 포도당 내성 저하 쥐에서 산화 용량 관련 및 산화환원 전위 관련 SERS 지수 변화와 관련이 있음을 보여주었습니다. 이러한 발견은 침술 중재 중 국소 산화환원 관련 반응을 탐색하기 위해 SERS 활성 마이크로바늘을 사용하는 것이 가능함을 뒷받침합니다. 전반적으로, 결과는 침술 지점에 비틀림을 이용한 침술이 IGT 쥐에서 FPG 및 2hPG 수치의 감소와 OC 및 RP 관련 SERS 지수 변화와 관련이 있음을 시사합니다. 이 발견들은 침술 중재 중 국소 산화환원 관련 광학 반응을 추적하기 위해 SERS 활성 마이크로바늘을 사용하는 것이 가능함을 지지합니다. 그러나 표준 생화학적 산화 스트레스 분석, 프로브 침출 분석, 조직 생적합성 검사가 수행되지 않았기 때문에, 관찰된 SERS 지수 변화를 산화 스트레스 개선의 결정적인 생화학적 증거로 해석해서는 안 됩니다.

같은 가설을 더 조사하기 위해 여러 대안적 접근법을 사용할 수 있습니다. 활성 산소종, 말론디알데히드, 슈퍼옥사이드 디뮤타제, 카탈라아제, 글루타티온 퍼옥시다아제, 글루타티온/글루타티온 디설파이드 비율 측정을 포함한 표준 생화학적 산화 스트레스 분석법을 사용하여 SERS 유래 지수 변화가 기존 산화 스트레스 생체지표와 일치하는지 검증할 수 있습니다^32,33. 전기화학 산화환원 탐침, 형광 기반 산화환원 센서, 화학발광 분석법, 미세투석 후 생화학적 분석, 조직 기반 면역조직화학 또는 조직학적 검증도 상호 보완적인 정보를 제공할 수 있습니다. SERS 활성 마이크로니들 센싱과 이러한 독립적인 접근법을 결합하면 관찰된 광학 변화가 특정 생화학적 산화환원 변화를 반영하는지, 아니면 니들링과 대사 상태에 대한 더 넓은 국소 조직 반응을 반영하는지 판단하는 데 도움이 될 것입니다³⁴.

이 방법의 잠재적 응용은 현재의 포도당 내성 저하 모델을 넘어 확장됩니다. 산화환원 불균형은 대사 질환, 조직 손상, 염증, 상처 복구에 관여하기 때문에, SERS 활성 마이크로니들(SERS active microneedles)은 당뇨병 관련 모델, 상처 치유 연구, 염증성 질환 모델 및 기타 최소 침습 개입 환경에서 국소 산화환원 관련 반응을 모니터링하는 데 유용한 전임상 도구를 제공할 수 있습니다³⁵. 침술 연구에서는 침 지점, 비침술 부위, 다양한 침술 조작법, 다양한 중재 일정을 비교하는 데 유용할 수 있습니다. 그러나 이러한 응용은 탐색 단계에 머물러 있으며, 추가적인 기술적·생물학적 검증이 필요합니다.

몇 가지 제한점이 있습니다. 첫째, OC 및 RP 측정값은 SERS 유도 비율 지표로 계산되었으며, 표준 산화성 농도나 절대 전기화학적 산화환원 전위 값에 맞춰 보정되지 않았습니다. 따라서 본 결과는 절대적인 생화학적 측정이 아니라 동일한 획득 조건에서의 상대적 산화환원 관련 광학 반응으로 해석되어야 합니다. 둘째, 생물학적 조직 미세환경은 국소 pH 변화, 단백질 흡착, 세포외 기질 구성 요소 및 기타 기질 효과 등 추가적인 신호 변이의 원천을 도입할 수 있습니다. 이러한 인자들은 혈청 함유 또는 조직 모방 배지에서 완전히 평가되지 않았습니다. 셋째, 조직 표면에 전달되는 실제 레이저 출력과 라만 획득 시 국소 온도 변화는 직접 측정되지 않았으며; 따라서 잠재적인 광열 또는 광화학 효과는 완전히 배제할 수 없습니다. 넷째, 홈 형상과 프로브 하중의 배치 수준 재현성은 다중 바늘 SEM 영상이나 하중 효율 분석으로 정량적으로 평가되지 않았습니다. 마지막으로, 독립적인 생화학적 검증, 프로브 침출 분석, 국소 생체적합성 시험은 수행되지 않았습니다. 향후 연구에서는 생물학적으로 관련된 행렬에서 보정 곡선을 설정하고, SERS 지수를 표준 산화 스트레스 및 산화환원 분석과 상관시키며, 프로브 침출을 정량화하고, 반복 삽입 후 국소 조직 적합성을 평가하며, 더 큰 동물 집단에서 장치를 검증해야 합니다. SERS 활성 마이크로바늘은 침술 중재와 국소 산화환원 관련 지수의 상대 비율 추적 SERS를 전임상 IGT 쥐 모델에서 결합하는 유용한 플랫폼을 제공할 수 있습니다. 추가 보정, 생화학적 검증, 프로브 침출 평가, 생체적합성 연구가 필요하며, 절대적인 정량적 모니터링이나 번역 적용을 주장할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES, 98%)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	A800524
(3-머캅토프로필)트리메톡시실란(MPTES, 95%)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	M742544
아스코르브산	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	CFAD310554
혈당 측정기	Cofoe Medical Technology Co., Ltd.	Cofoe A03
혈당 검사 스트립	Cofoe Medical Technology Co., Ltd.	Cofoe-A03-C
황산구리(CuSO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	PHR1477
에틸 알코올(≥99.7%)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	XW00641752
황산철(FeSO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	XW01772078701
포도당(Glu)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	D9434
과산화수소(H2O2)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	P-17-0500
염화철(FeCl3)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	CP81015228
메틸 메타크릴레이트(MMA)	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.	M109626
마이크로-라만 분광계	Renishaw	InVia 라만 현미경
p-페닐렌디아민(p-PDA)	Shanghai TCI Chemical Industry Development Co., Ltd.	P128784
폴리메틸 메타크릴레이트(PMMA)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	P742581
주사전자현미경	Zeiss	ULTRA Plus
붕소수소화나트륨(NaBH4)	Shanghai Adamas-beta Reagents Co., Ltd.	S432207
아황산나트륨(Na2SO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	S572396
스테인리스강 침술바늘	Suzhou Tianxie Acupuncture Instruments Co., Ltd.	X-20-03
통계 분석 소프트웨어	International Business Machines Corporation	버전 2021
스트레프토조토신(STZ)	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.	S408311
테트라클로로금산(HAuCl4)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	A124024
SPSS 소프트웨어	International Business Machines Corporation, Armonk, New York State, USA	버전 26.0
쥐	Jiangsu Qinglongshan Biotechnology Co., Ltd.	특정 병원체 자유 남성 Sprague-Dawley
기본 사료	Anuokang Biotech.	SY10001
라드	MCE	HY-W127601
수크로스	MCE	HY-B1779
계란 노른자 분말	MCE	HY-B2235B
시트르산 일수화물	Sigma-Aldrich	C1909
구연산나트륨 이수화물	Sigma-Aldrich	S4641
구연산완충액	beyotime	P0086
인산완충 식염수	beyotime	ST448-1L
아이소플루란	Bioss	D54468
소형 동물용 아이소플루란 마취 시스템	RWD Life Science	R500
유도 챔버 및 코 콘	RWD Life Science	R500 호환 액세서리
온열 패드	Shanghai Yuyan Life Science	Y69020
75% 에탄올	Boyu Bio.	YB60401
CO2 안락사 챔버	Lab Animal Tec. Co.	LAT-10-0090
WPS	Beijing Kingsoft Office Software	WPS365