방법 논문

외상 유발 출혈성 응고장애, 염증 및 생존율의 정량화를 단순화한 마우스 간 열상 모델

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DOI:

10.3791/72215

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2026년 9월 25일

 ,  ,  , 
1Division of Hematology and Cellular Therapy, Department of Medicine, University of California San Diego

이 논문에서

요약

본 연구에서는 혈액 손실, 외상 유발 응고장애 및 생존 결과를 통합한 심각한 출혈의 재현 가능한 마우스 간 열상 모델을 제시합니다. 이 모델은 응고, 섬유소 용해 및 사망률 평가와 더불어 recombinant factor VIIa 및 tranexamic acid를 포함한 지혈 중재법의 평가를 가능하게 하여, 출혈의 기전 및 중개 연구를 위한 비용 효율적이고 확장 가능한 플랫폼을 제공합니다.

초록

조절되지 않는 출혈은 외상 환자에게서 예방 가능한 사망의 주요 원인으로 남아 있으며, 외상 유도 응고병증(TIC)은 초기 사망률을 결정하는 중요한 요인입니다. 출혈 및 그와 관련된 응고병증 반응을 안정적으로 재현하는 실험 모델은 기전 연구와 표적 중재법의 평가에 필수적입니다. 본 논문에서는 정밀한 정량이 가능하고 전신 응고병증, 염증 마커 및 사망률을 동시에 추적할 수 있는, 재현 가능한 간 열상(LL) 유발 출혈을 이용한 표준화된 마우스 중증 출혈 모델을 설명합니다.

마우스에 표준화된 정중선 개복술을 시행한 후 LL을 유도하며, 혈액 흡수 스펀지를 통해 출혈량을 정량화합니다. 응고, 섬유소 용해 및 염증의 전신 마커는 시술 전과 시술 후 미리 지정된 일정한 간격으로 안와하 정맥 채혈을 통해 수집합니다. 출혈을 동반한 LL은 TIC(활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 연장, 트롬빈-안티트롬빈(TAT) 복합체 증가, 응고 인자(F) V 및 VIII의 선택적 고갈 및 섬유소 용해 활성화를 특징으로 함)를 안정적으로 유발합니다. 이와 동시에, 인터루킨-6 (IL-6)의 증가를 통해 염증 활성화가 입증됩니다. 또한, 이 모델은 정중선 절개 부위 봉합 후의 생존 분석을 가능하게 합니다.

중개적 응용으로서, rhFVIIa와 TXA는 응고 및 섬유소 용해 파라미터의 약리학적 조절을 통한 출혈 구조에 대해 모델이 민감하게 반응함을 입증하는 데 사용됩니다. 대동물 모델과 비교하여, 이 마우스 시스템은 외상성 출혈에 대한 혁신적이고 표적화된 중재 방안을 연구할 수 있는 경제적이고 다재다능하며 확장이 용이한 기회를 제공합니다.

서론

외상은 청년층(연령 < 45세)1,2, 조절되지 않는 출혈이 초기 사망의 주요 원인으로 작용하며3중증 외상 환자에게서 좋지 않은 결과가 나타나는 결정적인 요인은 외상 유발 응고병증(trauma-induced coagulopathy, TIC)의 발생입니다.4,5TIC는 응고 인자 V 및 VIII의 고갈을 특징으로 하는 복합적이고 다요인적인 지혈 조절 장애입니다.6,7, 조절 장애성 피브린 용해7,8,9, 그리고 전신 염증 활성화10TIC는 지속적인 출혈의 원인이 되며 수혈 요구량 증가와 관련이 있습니다.11, 장기 부전5및 손상 통제 소생술과 치료적 개입의 발전에도 불구하고 사망률이 발생하며5.

따라서 응고병증성 변화를 동반한 출혈성 쇼크를 안정적으로 재현하는 실험 모델은 기전 연구 및 표적 지혈 중재술의 평가에 필수적입니다. 조절된 출혈 모델은 표준화된 채혈 방식을 사용하는데, 이는 조직 손상을 유발하지 않을 수 있어 임상적 외상에서 관찰되는 전신적 응고병증 반응을 구현하는 데 한계가 있을 수 있습니다12. 그러므로 지속적인 출혈과 전신 반응을 정량적으로 평가할 수 있다면, 고형 장기 손상을 포함하는 출혈 모델이 더 높은 임상적 연관성을 제공할 것입니다13,14,15,16. 더 복잡한 TIC 모델은 중증 외상의 여러 구성 요소를 재현하기 위해 외상성 뇌 손상, 장골 또는 사지 골절, 연조직 손상, 개복술 및 조절된 출혈성 쇼크를 조합하여 통합합니다17,18. 이러한 접근 방식은 다발성 외상을 더 종합적으로 나타낼 수 있지만, 여러 번의 손상 유발 절차와 생리학적 조작으로 인해 기술적 복잡성과 실험적 변동성이 증가할 수 있습니다.

수십 년간의 연구에도 불구하고, 임상적으로 유의미하고 재현 가능한 TIC 실험 모델은 여전히 제한적이며 이질적입니다. 여러 리뷰 논문에서는 조직 손상과 출혈성 쇼크의 임상적 순서를 보다 정확하게 재현하고 치료적 개입의 평가를 지원할 수 있는 견고한 모델의 필요성을 강조해 왔습니다17,19. 심장 카테터 삽입 및 지속적인 혈역학적 모니터링을 포함하여 광범위한 기구 장착이 필요한 복잡한 모델은 상세한 생리학적 정보를 제공할 수 있지만, 특수 장비와 추가적인 시술 조작이 필요합니다. 외상 연구의 장벽을 제거하기 위해서는 TIC의 핵심 특징을 유지하면서 실험적 접근 방식을 단순화하는 것이 매우 중요해 보입니다. 본 논문에서 우리는 심한 출혈을 유도하고 TIC의 핵심 특징을 재현하는 재현 가능한 LL을 사용하여 조절되지 않는 출혈성 쇼크14를 일으키는 표준화된 마우스 모델을 설명합니다. 이 모델을 통해 일반적인 응고 측정(aPTT 및 트롬빈 생성), TIC의 특징인 응고 인자(FV 및 FVIII)의 선택적 고갈, 섬유소 용해 마커 및 사이토카인 프로파일링을 포함한 응고 및 염증 반응의 평가가 가능합니다. 이 모델이 인간 외상에 대해 가지는 민감성과 관련성을 입증하기 위해, 우리는 외상 소생술에 사용되는 rhFVIIa(지혈제)와 TXA(항섬유소 용해제)가 출혈의 중증도, 응고 장애의 진행 및 생존 결과에 미치는 영향을 평가합니다.

본 모델은 추가적으로 연속 및 최종 혈액 샘플링을 지원하여, 부상 심각도 및 치료적 개입과 관련하여 응고 및 염증 궤적의 종단적 평가를 가능하게 합니다. 종합적으로, 이 모델은 심각한 출혈 상황에서 TIC를 연구하고, 혈액 손실, 응고장애, 섬유소 용해, 염증 및 생존율을 포함한 임상적으로 유의미한 종말점을 사용하여 지혈 및 표적 약물 개입을 평가할 수 있는 재현 가능하고 확장 가능한 마우스 시스템을 제공합니다.

Dyer 등이 기술한 프로토콜13을 포함하여 이전에 발표된 마우스 간 열상 모델과 비교했을 때, 본 방법은 몇 가지 핵심적인 방법론적 진보를 도입하였습니다. 여기에는 혈액 손실의 정량적 중량 측정, 체중에 따른 열상 간 질량의 표준화를 통한 손상 중증도의 규격화, 그리고 TIC, 섬유소 용해 및 염증에 대한 포괄적인 프로파일링이 포함됩니다. 또한, 본 모델은 연속 샘플링, 약리학적 조절 및 복벽 폐쇄 기술을 상세히 다룬 생존 분석을 가능하게 하여, 안락사가 아닌 신체적 회복을 도모할 수 있게 합니다. 모든 절차는 단일 실험 접근 방식 내에서 수행될 수 있으며, 이를 통해 출혈 및 표적 지혈 중재 연구를 위한 확장 가능하고 중개 가능한 플랫폼을 제공합니다.

프로토콜

University of California San Diego (UCSD)의 기관동물관리심의위원회(IACUC)에서 모든 동물 실험 프로토콜을 승인하였습니다. C57BL/6J 마우스는 UCSD 내부 번식 시설에서 번식 및 유지되었습니다. 실험에는 8~10주령의 암수 마우스가 모두 사용되었습니다. 실험 워크플로우와 타임라인의 도식적 개요는 부록 그림 1에 제공되어 있습니다.

참고: 표본 크기는 예비 실험, 개별 종점의 예상 변동성 및 마우스 간 파열 모델에 대한 이전 경험을 바탕으로 결정되었습니다. 개별 실험 종점 및 실험 그룹에 대한 최종 표본 크기는 해당 그림 범례에 제공되어 있습니다. 간 무게 측정의 경우, 실험 코호트 간의 일관성을 평가하기 위해 여러 독립적인 실험의 데이터를 통합하였습니다. 별도의 실험 런(run)으로 수행된 응고 분석의 경우, 분석 간 일관성과 재현성을 모니터링하기 위해 이전에 분석된 샘플을 각 런에 포함시켰습니다.

1. 실험 전 준비 단계

  1. 기초선 샘플 수집 (Day -1)
    1. 기초선 파라미터를 설정하기 위해 실험 24시간 전, 각 마우스(8–10주령)의 안와하 정맥을 통해 혈액 ~200 µL를 수집합니다.
    2. 혈액 수집 후 멸균 주사용 식염수 ~200 µL를 피하 투여합니다.
    3. 실험 당일까지 온도 20–24 °C, 상대 습도 30%–70%, 12시간 명기/12시간 암기 주기의 표준 실험실 조건 하에 깨끗한 케이지에서 마우스를 사육하며, 먹이와 물을 자유롭게 섭취하게 합니다.
  2. 케이지 준비 (Day 0)
    1. 실험 당일, 마우스를 새 페이퍼 타월이 깔린 깨끗한 케이지로 옮깁니다.
    2. 실험 15분 전에 먹이와 물을 제거하고, 수술 후 흡수 스펀지를 제거할 때까지 공급하지 않습니다.

2. 기구 및 수술 부위 준비

  1. 기구 멸균
    1. 수술 기구, 솜, 어플리케이터 및 여과지를 오토클레이브로 멸균합니다.
    2. 70% 에탄올을 사용하여 수술 표면을 소독합니다.
  2. 수술대 설정
    1. 멸균 드레이프 위에 멸균된 기구들을 배치합니다.
    2. 기구의 중간 세척을 위해 70% 에탄올과 멸균 솜이 담긴 스테인리스강 용기를 준비합니다.
    3. 마이크로비드 멸균기를 작동시켜 동물 간 멸균을 위해 150 °C에 도달하도록 합니다.

3. 온도 유지 준비

  1. 등온 패드 준비
    1. 제조사의 지침에 따라 수술 직전에 등온 가열 패드를 활성화하십시오.
    2. 마취 및 수술 전 과정 동안 마우스의 체온이 36–37 °C의 목표 범위 내로 유지되도록 등온 가열 패드를 설정하십시오.
    3. 패드 표면 전체에 열이 균일하게 분포되는지 확인하십시오.
    4. 패드를 수술 플랫폼 위에 놓고 멸균 드레이프로 덮으십시오.
    5. 수술 보드를 이소플루란 마취 시스템에 연결하십시오.

4. 마취 및 수술 전 처치

  1. 마취 유도
    1. 2 L/min 산소에 2% isoflurane이 포함된 유도 챔버에 마우스를 넣어 마취를 유도합니다.
    2. 발가락 꼬집기 반사(toe pinch reflex)를 통해 적절한 마취 상태를 확인합니다.
    3. 수술 전 체중을 기록합니다.
  2. 진통제 및 치료제 투여
    1. 진통을 위해 buprenorphine (3.25 mg/kg, 피하 주사)을 투여합니다.
    2. 필요에 따라 지혈제를 준비합니다.
    3. 치료군의 경우, 손상 5분 전에 recombinant human activated factor VII (rhFVIIa; 3 mg/kg) 또는 tranexamic acid (10 mg/kg)를 안와하 정맥 주사로 투여합니다.
    4. 대조군 동물에게는 동일한 부피(~100 µL)의 주사용 멸균 식염수를 투여합니다.

5. 수술 준비

  1. 수술 부위 준비
    1. 마취된 마우스를 등온 패드 위에 놓인 수술대 위로 옮깁니다.
    2. 수술 과정 전반에 걸쳐 2 L/min 산소 내 1.5%–2% isoflurane을 사용하는 노즈 콘을 통해 마취 상태를 유지합니다.
    3. 마우스를仰臥位(supine)로 배치하고 테이프로 네 다리를 모두 고정합니다.
    4. 복부 부위를 제모합니다.
    5. 포비돈-요오드와 70% 에탄올을 교대로 사용하여 무균 준비를 수행합니다(3회 반복).

6. 간 열상 유발 절차

  1. 재료 사전 무게 측정
    1. 0.5 mL 식염수가 들어 있는 튜브 하나와 빈 튜브 하나를 포함하여 1.5 mL 튜브 두 개의 무게를 미리 측정한다.
    2. 동물마다 1차 흡수 삼각형 3개와 2차 흡수 삼각형 2개의 무게를 미리 측정하고 그 합산 질량을 기록한다.
    3. 추후 적출된 간 조직의 무게를 측정하기 위해 동물마다 weigh boat 하나를 준비하여 무게를 미리 측정한다.
  2. 간 손상 유도
    1. 간을 노출시키기 위해 약 0.5 inch (12.7 mm) 길이의 정중선 개복술을 시행한다.
    2. 간과 접촉하지 않도록 주의하며 복벽의 좌우를 따라 흡수 삼각형 두 개를 배치한다.
    3. 좌측 간 엽을 외측으로 노출시키고, 조직 제거 범위를 표준화하기 위해 엽의 경계를 확인한다. 이때 의도치 않은 조직 손상이 발생하지 않도록 주의한다.
    4. 동물 간의 일관성을 확보하기 위해 날카로운 가위로 제어된 단일 동작을 통해 엽의 약 75%를 절개한다.
    5. 손상 정도를 추후 정량화하기 위해 절개하여 적출한 조직을 미리 무게를 측정한 빈 튜브로 옮긴다.
    6. 출혈 단계 동안 균일한 혈액 수집을 용이하게 하기 위해 세 번째 흡수 삼각형을 복강 내에 삽입한다.
  3. 내부 출혈 유지를 위한 신속한 복벽 폐쇄 (중요 단계)
    1. 두 개의 외과용 오토클립을 사용하여 약 10–15 s 이내에 복벽을 즉시 폐쇄한다.
    2. 틈새 없이 완전히 폐쇄되도록 절개면의 가장자리를 정확하게 맞춘다. 폐쇄가 불완전하면 혈액이 외부로 누출되어 혈액 손실량이 과소평가될 수 있다.
    3. 폐쇄 시 일정한 강도로 부드럽게 당기되, 출혈 역학을 변화시킬 수 있는 복강 내 장기의 압박은 피한다.
    4. 복강 구획이 완전히 밀폐되도록 조직 접착제(2–3 drops)를 사용하여 폐쇄 부위를 보강한다.
  4. 손상 후 모니터링
    1. 적출한 간 조직의 무게를 측정하고 이를 체중으로 정규화하여 간 손상의 정도를 정량화하고 확인한다.
    2. 마우스를 등온 패드 위에 놓인 케이지로 돌려보낸다.
    3. 종점 및 생존 코호트의 경우, 출혈이 60 min 동안 진행되도록 둔다.

7. 혈액 수집 및 출혈량 정량화

  1. 혈액 샘플 수집 및 처리
    1. 종점 코호트의 경우, 간 열상 후 60분에 이소플루란으로 마우스를 다시 마취합니다.
    2. 생존 코호트의 경우, 혈액 수집을 위해 간 열상 후 6시간 및 7일에 이소플루란으로 마우스를 다시 마취합니다.
    3. 혈장 준비를 위해 안와하 정맥 천자를 통해 구연산나트륨 용액(혈액 대 항응고제 비율: 9:1)이 담긴 튜브에 혈액을 수집합니다.
    4. 샘플을 2,000 × g에서 10분간 원심분리한 후, 다시 12,000 × g에서 5분간 원심분리하여 후속 응고 및 섬유소 용해 분석에 사용할 혈소판 결핍 혈장을 얻습니다.
  2. 출혈량 측정
    1. 종점 및 생존 코호트 모두 간 열상 후 60분에 복부를 다시 절개하고 혈액이 포함된 흡수 스펀지를 제거합니다.
    2. 혈액이 흡수된 모든 스펀지를 멸균 식염수가 들어 있는 미리 무게를 잰 튜브로 옮깁니다.
    3. 미리 무게를 잰 추가 흡수 스펀지를 사용하여 복강 내 잔류 혈액을 수집합니다.
    4. 혈액 수집 후 수집 튜브의 무게를 측정하여 최종 튜브 무게를 구합니다.
    5. 다음의 중량법 방정식을 사용하여 출혈량을 계산합니다:
      출혈량 (µL/g) = [(최종 튜브 무게 − 초기 튜브 무게 – 흡수 스펀지 무게) / 마우스 체중] × 1000.
      참고: 모든 무게는 그램(g)으로 표시됩니다. 1,000이라는 계수는 혈액 밀도를 약 1 g/mL로 가정하여 혈액의 그램 단위를 마이크로리터로 변환합니다.
  3. 생존 및 종단적 결과 코호트
    1. 60분 시점의 출혈량 측정 후, 외과용 스테이플러와 조직 접착제를 사용하여 절개 부위를 즉시 봉합하여 복강이 완전히 밀폐되도록 합니다.
    2. 회복 전 멸균 식염수 400 µL를 피하 투여합니다.
    3. 마우스를 표준 사육 환경으로 돌려보내고 마취 회복 기간 동안 지속적으로 모니터링하며, 수술 후 2시간, 6시간, 24시간에 평가하고 이후 7일까지 매일 모니터링합니다.

8. 수술 후 관리

  1. 수술 후 모니터링
    1. 마취에서 회복하는 초기 단계 동안 동물의 고통이나 질환 징후가 있는지 지속적으로 모니터링합니다.
    2. 정해진 각 평가 시점에 생존 상태와 임상 관찰 내용을 기록합니다.
  2. 지지 요법
    1. 멸균 생리식염수 400 µL를 3일 동안 매일 피하 투여합니다.
    2. 승인된 동물 관리 프로토콜에 따라 72시간마다 진통제(buprenorphine, 3.25 mg/kg, 피하 투여)를 투여합니다.
    3. 마우스가 사료와 물을 자유롭게 섭취할 수 있도록 표준 사육 환경에서 유지합니다.
  3. 인도적 종료점
    1. 심각하거나 지속적인 무기력증, 보행 불능 또는 음식 및 물 섭취 불능, 심각한 호흡 곤란, 무반응, 또는 승인된 기관 동물 관리 프로토콜에 명시된 기타 심각한 고통의 징후를 포함하여 미리 정의된 인도적 종료점이 나타나는지 모니터링합니다.
    2. 미리 정의된 인도적 종료점에 도달한 동물은 기관 지침에 따라 안락사시킵니다.
    3. 7일째까지 또는 인도적 종료점에 도달할 때까지 생존 모니터링을 계속합니다.

9. 종료 절차 및 조직 수집

  1. 미리 정해진 실험 종료 시점에 마우스를 마취하고 안와하 정맥 채혈을 통해 혈액을 수집합니다.
  2. 기관 지침에 따라 CO₂ 흡입법으로 안락사시킵니다.
  3. 장기를 적출하고 지정된 후속 절차에 따라 조직학적 분석을 위해 조직을 처리합니다.

10. 응고, 섬유소 용해 및 사이토카인 분석

참고: 본 절차에 사용된 시약, 분석 키트 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

  1. aPTT 측정
    1. 재료 표에 기재된 응고측정기를 사용하여 모든 응고 시간을 기록한다.
    2. 마우스 혈장 25 µL와 aPTT 시약 25 µL를 혼합하고 37 °C에서 3분 동안 배양한다. HBS(20 mM HEPES, 147 mM NaCl, 3 mM KCl, pH 7.4)로 제조한 CaCl₂ (25 mM) 25 µL를 첨가하여 응고를 개시하고, 응고 시간을 기록한다.
  2. FV, FII 및 FX 활성 측정
    1. 마우스 혈장 5 µL를 해당 인자 결핍 혈장 20 µL 및 0.5% bovine serum albumin이 포함된 HBS 25 µL와 혼합한다.
    2. 37 °C에서 1분 동안 배양한 후, 재료 표에 기재된 Innovin 시약을 첨가하여 응고를 개시한다.
    3. 해당 보정/표준 시스템을 기준으로 인자 활성을 결정한다.
  3. FVIII 측정
    1. 제조사의 지침에 따라 발색 FVIII 분석법을 사용하여 FVIII을 결정한다.
  4. 피브리노겐 측정
    1. Clauss 방법을 사용하여 피브리노겐 농도를 결정한다. 마우스 혈장 10 µL를 0.01% bovine serum albumin이 포함된 HEPES 완충 식염수 40 µL에 첨가하고 37 °C에서 3분 동안 배양한다.
    2. thrombin (25 U/mL) 25 µL를 첨가하여 혈전 형성을 개시하고, 분석 보정 곡선을 사용하여 피브리노겐 농도를 결정한다.
  5. 혈장 바이오마커 측정
    1. 재료 표에 기재된 시판 분석 키트를 사용하여 혈장 TAT 복합체, PAP 복합체 및 D-dimer를 측정한다. 각 분석은 제조사의 지침에 따라 수행한다.
    2. 제조사에서 지정한 분석 특이적 표준물질, 보정물질 및 대조군을 사용하고, 해당 표준 곡선으로부터 분석 대상 물질의 농도를 계산한다.
  6. 혈장 IL-6 측정
    1. 재료 표에 기재된 멀티플렉스 사이토카인 분석법을 사용하여 간 열상 전 기저 상태와 열상 후 60분 및 6시간 시점의 혈장 IL-6 농도를 측정한다.
    2. 제조사의 지침에 따라 분석을 수행하고, 제조사의 Q-View 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석한다.

결과

LL 모델은 생쥐에서 재현 가능하고 표준화된 손상 심도를 구현합니다. 그림 1A는 체중 대비 비율(%BW)로 정규화했을 때 파열된 간 무게의 일관성을 보여주며, 실험군 전반에 걸쳐 손상 중앙값은 1.4% BW로 나타났습니다. 이러한 일관성은 신뢰할 수 있는 외과적 유도를 확인시켜 주며, 개체 간 및 실험 조건 간의 재현성을 가능하게 합니다. 손상 심도를 표준화하는 능력은 조직 손상의 가변성과 무관하게 하위 생리학적 반응을 평가하는 데 매우 중요합니다.

모델 내 출혈 반응의 검증 및 치료적 조절 효과는 그림 1B에 나타나 있습니다. 마우스에 식염수, 지혈 전 단계 약제인 rhFVIIa 또는 항섬유소 용해제인 TXA를 전처치한 후, 혈액 손실량을 측정하여 체중 대비 값(µL/g)으로 정규화했습니다. 식염수 처리군은 LL 이후 상당한 출혈을 보인 반면, rhFVIIa 또는 TXA 처리군은 혈액 손실이 감소한 것으로 나타났습니다. 이러한 결과는 본 모델이 출혈의 약리학적 조절을 감지하고, 조절되지 않는 출혈 조건에서 지혈 중재술을 평가할 수 있음을 보여줍니다.

이 모델은 외상 유발 응고병증의 주요 특징 또한 재현합니다. 그림 1C에서 보듯이, LL은 aPTT의 연장을 초래했으며, 이는 손상 후 응고 기능이 저하되었음을 나타냅니다. rhFVIIa 또는 TXA 치료는 이러한 연장을 완화시켰으며, 이는 응고 기능이 회복되었음을 시사합니다. 마찬가지로 TAT 복합체로 평가한 트롬빈 생성이 LL 이후 증가했다가 TXA 치료로 감소한 반면, rhFVIIa는 TAT 수준을 감소시키지 않았으며(그림 1D), 이는 응고 활성화의 조절이 이루어졌음을 시사합니다.

응고병증에 대한 추가적인 특성 분석 결과는 그림 2에 제시되어 있습니다. LL은 TIC와 일치하게 응고 인자 V와 VIII의 선택적 고갈을 초래했으며, 이러한 변화는 rhFVIIa 또는 TXA 처리에 의해 회복되었습니다 (그림 2A,B). 이와 대조적으로, 인자 II와 X는 유의미하게 변화하지 않았으며 (그림 2C,D), 이는 인자 II와 X가 보존된 상태에서 이러한 변화가 일어남을 나타내어, 범발성 혈관 내 응고(DIC) 유사 표현형보다는 TIC 우세 표현형임을 뒷받침합니다.

LL 이후의 섬유소 용해 발달 과정은 그림 3에 나타나 있습니다. 손상 후 피브리노겐 수치가 감소하여 소모가 일어났음을 보여주었으며, rhFVIIa 또는 TXA 투여 후에도 완전히 회복되지 않았습니다(그림 3A). 이와 대조적으로, plasmin-antiplasmin (PAP) 복합체와 D-dimer를 포함한 섬유소 용해 마커들은 LL 이후 상승했습니다. rhFVIIa는 PAP 복합체 수치를 감소시켰으나 D-dimer 수치에는 유의미한 변화를 주지 않았습니다. TXA는 LL 이후 PAP 복합체와 D-dimer 수치를 모두 감소시켰습니다(그림 3B,C).

마지막으로, 전신 염증 반응과 생존 결과를 그림 4에서 평가합니다. 모든 치료군에서 LL 후 60분 및 6시간 시점에 혈장 interleukin-6 (IL-6) 수치를 측정합니다. 모든 군에서 초기 시점에 IL-6 수치가 상승합니다 (그림 4A). 7일간의 생존율은 Kaplan-Meier 분석을 사용하여 평가합니다. 7일 생존율은 생리식염수 투여군에서 75%, rhFVIIa 투여군에서 55%, TXA 치료군에서 80%입니다. 생리식염수 군과 TXA 군 사이에는 유의미한 차이가 관찰되지 않은 반면, rhFVIIa 군의 생존율은 생리식염수 및 TXA 군에 비해 유의하게 감소하였습니다 (그림 4B).

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그림 1: 간 파열(LL) 모델의 검증: 손상 중증도의 재현성, 정량적 혈액 손실 및 응고병증 유도. 정중선 개복술 후 표준화된 LL을 통해 심각한 내부 출혈을 유도합니다. 출혈 및 응고병증의 약리학적 조절을 평가하기 위해 손상 전 마우스에 생리식염수(~100 µL), 재조합 인간 활성화 제7인자(rhFVIIa; 3 mg/kg) 또는 트라넥삼산(TXA; 10 mg/kg)을 전처치합니다. (A) 손상 중증도는 체중 대비 파열된 간의 무게(%BW)로 정량화하며, 이는 동물 간에 표준화된 손상이 재현 가능하게 유도되었음을 보여줍니다. (B) 혈액 손실은 중량법을 사용하여 정량화하고 체중으로 표준화(µL/g)하며, TXA 처치로 감소하는 측정 가능한 출혈을 보여줍니다. (C) 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT)과 (D) 트롬빈-안티트롬빈(TAT) 복합체는 LL 이후 응고병증이 재현 가능하게 유도되었음을 보여주며, rhFVIIa 또는 TXA 처치 후 조절되는 양상이 관찰됩니다. 데이터는 중앙값 및 사분위 범위와 함께 개별 값으로 표시되었으며, 비교는 비모수적 Mann–Whitney U 검정을 사용하여 수행되었습니다(n = 5–21). ****P ≤ 0.0001. Joseph 외 연구자의 허가를 받아 수정됨16. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 간 열상(LL) 후 외상성 응고장애(TIC)의 검증: 응고 인자의 선택적 고갈. 정중선 개복술 후 표준화된 LL을 통해 심각한 내부 출혈을 유도한다. 응고장애의 약물학적 조절을 평가하기 위해, 손상 전 마우스에 식염수(~100 µL), 재조합 인간 활성 제7인자(rhFVIIa; 3 mg/kg) 또는 트라넥삼산(TXA; 10 mg/kg)을 전처치한다. LL 후 60분에 응고 파라미터를 평가한다. (A) Factor V 및 (B) Factor VIII 수치는 LL 후 재현 가능한 고갈을 보여주며, 이는 TIC와 일치한다. (C) Factor II 및 (D) Factor X는 상대적으로 보존되어, 전신적 소모보다는 선택적인 응고 인자 고갈이 일어났음을 나타낸다. 데이터는 중앙값 및 사분위 범위와 함께 개별 값으로 표시되었다(n = 7–10). 통계적 비교는 비모수적 Mann-Whitney U 검정을 사용하여 수행되었다. ***P ≤ 0.001; ****P ≤ 0.0001. Joseph et al.16의 허가를 받아 수정됨. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3간 파열(LL) 후 섬유소 용해 활성화의 검증. 정중선 개복술 후 표준화된 간엽절제술(LL)을 통해 심각한 내부 출혈을 유도합니다. 마우스에 식염수를 전처치합니다(~100 µL), 또는 섬유소 용해의 약리학적 조절을 평가하기 위해 손상 전 재조합 인간 활성 제7인자(rhFVIIa; 3 mg/kg) 또는 트라넥삼산(TXA; 10 mg/kg)을 투여하였다. 섬유소 용해 파라미터는 LL 후 60분에 평가한다. (A피브리노겐 수치는 부상 후 소모되는 양상을 보이며, 이는 섬유소 용해 활성화 및 응고 인자 고갈과 일치합니다.B) 플라스민-안티플라스민(PAP) 복합체 및 (C) LL 이후 D-dimer 수치가 증가했으며, 이는 활발한 피브린 분해와 전신적 피브린 용해 활성화를 나타낸다. 데이터는 중앙값 및 사분위 범위와 함께 개별 값으로 표시되었다 (n = 8–13). 통계적 비교는 비모수적 Mann-Whitney U 검정을 사용하여 수행되었다. **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001; ****P ≤ 0.0001. Joseph 등의 문헌에서 허가를 받아 수정함.16. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 4: 간 열상(LL) 후 전신 염증 반응 검증 및 생존율 평가.정중선 개복술 후 표준화된 LL을 통해 심각한 내부 출혈을 유도한다. 마우스에 손상 전 생리식염수(100 µL), 재조합 인간 활성화 제7인자(rhFVIIa; 3 mg/kg) 또는 트라넥삼산(TXA; 10 mg/kg)을 전처치한다. 손상 후 복부 절개 부위를 상처 클립과 조직 접착제로 봉합하고 동물을 원래의 케이지로 돌려보낸다. 보조 요양으로는 손상 후 처음 3일 동안 매일 생리식염수(400 µL)를 피하 투여한다. 전신 염증 활성화를 평가하기 위해 LL 후 60분과 6시간에 혈장 샘플을 수집한다. (A) 인터루킨-6(IL-6) 수치는 손상 후 지속적인 전신 염증 반응을 보여준다. 데이터는 중앙값 및 사분위 범위와 함께 개별 값으로 표시되었다. 통계적 비교는 비모수적 Mann–Whitney U 테스트를 사용하여 수행되었다(n = 9–13). (B) 7일 생존율은 Kaplan-Meier 분석을 사용하여 평가하며, 이는 종단적 결과 기반 종말점을 지원하는 모델의 능력을 보여준다(n = 20). ****P ≤ 0.0001. Joseph 등에 의해 허가 하에 수정됨16. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: 간 열상 모델 및 실험 타임라인의 도식적 개요. 이 그림은 조절되지 않는 출혈의 표준화된 마우스 간 열상(LL) 모델에 대한 실험 워크플로우를 요약한 것입니다. 마우스는 정중선 개복술을 거친 후, 왼쪽 간 엽의 약 75%에 대해 재현 가능한 LL을 유도합니다. 손상 전, 마우스에게 식염수(~100 µL, 용매 대조군) 또는 재조합 인간 활성 제7인자(rhFVIIa; 3 mg/kg), 또는 트라네사믹산(TXA; 10 mg/kg)을 LL 5분 전에 후안구 주사를 통해 정맥 투여합니다. 혈액 손실의 정량화는 손상 시 복강 내에 배치하고 LL 60분 후 회수하여 총 출혈량을 측정하도록 미리 무게를 잰 복부 스펀지를 사용하여 수행됩니다. 그 후 복부는 조직 접착제가 포함된 상처 클립을 사용하여 폐쇄합니다. 혈액 샘플은 종점 코호트의 경우 60분에, 생존 코호트의 경우 6시간 및 7일에 후안구 경로를 통해 수집합니다. 혈장은 aPTT(활성화 부분 트롬보플라스틴 시간), 응고 인자 활성, 트롬빈-안티트롬빈(TAT) 복합체, 플라스민-α2-안티플라스민(PAP) 복합체 및 60분 시점의 D-dimer를 포함한 응고 파라미터를 분석합니다. 사이토카인 프로파일링은 60분 및 6시간에 수행됩니다. 생존 여부는 7일 동안 모니터링합니다. Joseph 등의 허가를 받아 수정됨16. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

본 연구에서는 정량적 혈액 손실 평가, 외상성 염증성 응고증(TIC) 및 염증 특성 분석, 그리고 생존 분석을 단일 실험 내에 통합한 표준화된 간 열상(LL) 기반의 재현 가능한 중증 출혈 마우스 모델을 제시합니다. 이 모델은 체중 대비 표준화된 간 열상 무게가 유사하게 나타나는 것에서 알 수 있듯이 일관된 부상 심각도를 생성하며, 이를 통해 실험군 전반에 걸쳐 출혈 및 전신 지혈 반응을 재현성 있게 평가할 수 있습니다. 표준화된 부상 및 정량적 결과 측정 지표를 갖춘 소형 설치류 모델을 사용함으로써, 기술적으로 복잡한 절차 없이도 단일 실험 체계 내에서 여러 실험적 종점(endpoint)을 효율적으로 평가할 수 있으며, 이는 TIC에 대한 재현 가능하고 확장 가능한 연구를 가능하게 합니다.

중요한 점은, 이 모델이 일반 응고 파라미터(aPTT)의 연장, TAT 복합체로 반영되는 트롬빈 생성 증가, 응고 인자 V 및 VIII의 선택적 고갈, 그리고 PAP 복합체 상승 및 D-dimer 형성으로 입증되는 섬유소 용해 활성화 등 TIC의 주요 특징을 재현한다는 것입니다. 이러한 변화는 인자 II와 X가 보존된 상태에서 발생하며, 이는 범발성 혈관 내 응고(DIC)보다는 TIC 우세의 표현형을 뒷받침합니다. 이러한 파라미터들을 동시에 정량화할 수 있는 능력은 외상성 손상 후의 지혈 조절 장애를 평가하기 위한 중개 연구적으로 유의미한 프레임워크를 제공합니다.

이 모델의 핵심 강점은 외상성 출혈 상황에서 생존을 결과 엔드포인트로 포함했다는 점입니다. 임상적으로 유의미한 구조 전략을 테스트하기 위해, 인간의 외상 소생술에 사용되거나 연구 중인 두 가지 약제인 rhFVIIa와 TXA를 모두 평가했습니다. TXA는 혈액 손실 감소, 응고 장애 및 섬유소 용해 활성화의 정상화에 일관된 효과를 보였으며, 이는 생존 구조로 이어졌습니다. 반대로, rhFVIIa는 지혈 파라미터의 과도한 교정과 불완전한 섬유소 용해 조절과 관련된 현저한 사망률을 초래했습니다16.

이러한 결과는 본 모델의 중요한 측면을 강조합니다. 즉, 생존은 개별 지혈 경로의 단편적인 교정보다는 출혈의 심각도, 응고병증 및 전신 반응의 복잡한 상호작용에 의해 결정된다는 점입니다. 이 출혈 모델은 임상 실무에서 결정적인 결과 판정 요소인 생존율과 생화학적 지혈 파라미터의 통합적 연관성에 민감한 것으로 보입니다. 본 시스템에서 모델링한 일차적 손상은 중증 외상성 출혈이지만, 이차적인 장기 손상 또한 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 모델을 이용한 이전 연구에서 rhFVIIa 투여 쥐에게서 폐 미세혈전과 피브린 침착이 관찰되었으며, 이는 사망률 증가와 연관되어 있어 혈전 염증성 장기 손상이 결과에 기여했을 가능성을 시사합니다16.

본 연구에서는 동시성 가짜 수술(sham-operated) 그룹을 포함하지 않았으나, 이전에 우리는 LL 없는 개복술만으로는 TIC가 발생하지 않음을 입증하였으며, 이는 TIC에서 관찰되는 특징적인 응고 이상을 유발하기 위해서는 추가적인 급속 혈액 손실(쇼크)이 필요함을 보여줍니다14.

이 모델의 재현성을 위해서는 몇 가지 기술적 고려 사항이 중요합니다. 간 제거량의 차이가 출혈의 심각도와 그에 따른 응고장애 반응에 상당한 영향을 미칠 수 있으므로, LL의 범위와 위치를 표준화해야 합니다. 본 프로토콜에서는 왼쪽 간 엽의 약 75%를 제거하며, 파열된 간의 무게를 체중으로 표준화하여 손상 일관성에 대한 객관적인 측정 기준을 제공합니다. 또한, 관찰 기간 동안 외부 혈액 손실을 방지하고 복강 내 출혈 환경을 유지하기 위해 신속하고 확실하게 복부를 폐쇄하는 것이 매우 중요합니다. 정확한 혈액 손실 측정을 위해, 모든 실험군에서 동일한 수집 절차와 타이밍을 사용하여 미리 무게를 잰 스폰지를 일관되게 회수해야 합니다. 이러한 단계들은 작업자에 따른 변동성을 최소화하며, 특히 초기 혈액 손실의 차이가 이후의 응고장애 및 생존율에 영향을 줄 수 있기 때문에 매우 중요합니다. 폐쇄 전 과도한 출혈이 발생하거나 외부로 혈액이 유실된 경우, 해당 동물은 분석에서 제외해야 합니다.

이 모델의 한계는 장기 손상에 집중되어 있어, 장골 골절, 연부 조직 압착 손상 및 기타 복합적인 쇼크 상태를 포함할 수 있는 다발성 외상의 이질성을 반영하지 못한다는 점입니다. 그러나 이러한 집중적인 손상은 의도적인 모델의 특징이기도 하며, 이를 통해 여러 손상 양상으로 인해 발생하는 추가적인 절차적 복잡성과 변수 없이 심각한 출혈 및 TIC의 효과를 연구할 수 있습니다. 결론적으로, 이 마우스 LL 모델은 외상 관련 출혈 TIC 및 사망률을 연구하기 위해 대동물 연구와 비교하여 비용 효율적이고 강력하며 확장 가능한 접근 방식을 제공합니다. 단순한 소형 설치류 실험 플랫폼을 표준화된 손상, 정량적 혈액 손실 측정, 종합적인 지혈 프로파일링 및 생존 평가와 결합함으로써, 이 모델은 더 광범위한 기구가 장착된 외상 모델에 대한 실용적인 대안을 제공합니다. 또한 임상적으로 유의미한 맥락에서 혈액량 손실, 응고(aPTT, FII, FV, FVIII, FX, TAT), 섬유소 용해(Fibrinogen, PAP, D-dimer) 및 생존 종말점을 통합적으로 평가할 수 있게 하여, 항섬유소 용해제 및 표적 지혈 중재법을 평가하는 데 매우 적합합니다.

공개 사항

A.v.D.는 BioMarin, Regeneron, Pfizer, Bioverativ/Sanofi, CSL Behring, Novo Nordisk, Spark Therapeutics, Genentech 및 uniQure로부터 과학 자문 위원회 참여, 컨설팅 및 강연 활동에 대한 사례비를 받았습니다. A.v.D.는 출혈 합병증을 위한 superFVa 치료제를 개발하는 바이오테크 기업인 Hematherix LLC의 공동 설립자입니다. B.C.J., M.L.C. 및 R.M.은 공개할 사항이 없습니다.

감사의 글

기술적 자문을 제공해주신 Laurent Mosnier 박사님께 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
25 G 바늘BD Diagnostics305124
30 G 바늘BD Diagnostics305106
마취 시스템Patterson Scientific78915712
aPTT 시약 - STA-C.K. Prest. 5Stago597
AutoclipFine Science Tools12022-19
Autoclip 어플리케이터Fine Science Tools12020-09
Autoclip 제거기Fine Science Tools12023-00
소 혈청 알부민Sigma Aldrich10735078001
염화 칼슘Fisher scientificC79-500
모세관 – 일반형Fisher Scientific22-260943
면봉Medique19-090-701
탈지면Fisher Scientific22-456-103
D-dimer ELISA 키트InvitrogenEEL094
Delta Phase 등온 패드Braintree Scientific50-195-4663
에탄올Fisher scientificBP28184
EthiqaFidelisSKU 072117
Factor II 결핍 혈장Affinity BiologicalsFII-DP
Factor V 결핍 혈장Affinity BiologicalsFV-DP
Factor VIII 결핍 혈장Affinity BiologicalsFVIII-DP
Factor X 결핍 혈장Affinity BiologicalsFX-DP
거름종이, 초두껍게, 7 cm × 8.4 cmFisher ScientificPI88605
Graefe 핀셋Fine Science Tools11049-10
유도 챔버Patterson Scientific78933385
주사용 식염수Hospira0409-4888-02
InnovinSiemens Healthineers23-044-778
이소플루란Med Vet International50-304-2993
K824086 Chromogenix Coatest SP Factor VIIIDiapharma K822585
Liqui Vet Rapid 조직 접착제World Precision Instrument50-253-9340
마이크로비드 멸균기Fisher scientific14-955-342
마이크로 원심분리 튜브 – 1.5 mLFisher ScientificAM12400
마우스 사이토카인 멀티플렉스 키트Quansys Biosciences 111049MS-13P
PAP 복합체 분석 키트BiotechneNBP3-06903
포비돈-요오드Med Vet International50-283-2277
재조합 인간 활성 인자 VIINovo Nordisk0169-7001
시트르산 나트륨Fisher ScientificS279-500
수술용 드레이프Stoelting10-000-695
Surgical platform equaflow mouse 5 마취 매니폴드Patterson Scientific78919268
수술용 가위Fine Science Tools91405-11
테이프Fisher scientific15-901-5R
TAT 복합체 분석 키트Siemens Healthineers23-044-704
트롬빈InvitrogenPIRP43100
트라넥삼산Auromedics55150-0188-10
트리머Stoelting10-000-792
WAG 활성탄 여과 시스템Patterson Scientific78909457
weigh boatFisher Scientific01-549-752

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