본 연구는 3x3 요인 설계를 사용하여 난소 절제 쥐의 폐경 후 골다공증에 대한 좌귀환의 효과를 평가합니다. 결과는 Yin 및 Yang 성분이 골 대사와 관련 EphB4/ephrinB2 경로 마커에 시너지 효과를 준다는 점을 뒷받침하지만, 기전적 증거는 인과적이라기보다는 연관적인 수준으로 남아 있습니다.
연구 논문
난소절제 쥐 모델에서 좌귀환의 조골세포-파골세포 결합 조절 효과: 3x3 요인 설계 연구
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2026년 9월 11일
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요약
초록
폐경 후 골다공증은 에스트로겐 결핍과 관련된 골 형성 및 골 흡수의 불균형으로 인해 발생합니다. 본 연구에서는 난소 절제 쥐 모델을 사용하여 좌귀환(Zuogui Pill) 음양 보익 하위 처방의 독립적 및 상호작용적 효과를 정량화하고, EphB4/ephrinB2/RhoA/alkaline phosphatase 경로와의 연관성을 조사하였습니다. ARRIVE 2.0 가이드라인에 따라, 3x3 요인 설계의 9개 그룹을 포함한 총 13개 그룹(그룹당 n=10)으로 130마리의 특정 병원체 제거(SPF) 암컷 Sprague-Dawley 쥐를 무작위 배정하였습니다. 평가 지표로는 P1NP, CTX-1, 이중 에너지 X선 흡수 계측법(DXA)으로 측정한 대퇴골 골밀도(BMD), 해면골 조직학, 그리고 역전사 정량 PCR 및 Western blotting으로 측정한 messenger ribonucleic acid 및 단백질 발현을 포함하였습니다. 전체 처방(I2A2)은 모델 그룹보다 높은 P1NP, 낮은 CTX-1, 그리고 높은 BMD와 연관이 있었습니다. 요인 분석 결과, P1NP와 BMD 사이에서 음양 상호작용이 확인되어 약리학적 시너지 효과가 뒷받침되었습니다. 분자적 변화는 EphB4/ephrinB2/ALP 발현의 증가 및 RhoA 발현의 감소와 연관이 있었습니다. 이러한 결과는 좌귀환 치료, 골 표현형 개선 및 경로 마커 조절 사이의 연관성을 뒷받침하며, 인과적인 경로 의존성은 억제, 넉다운 및 공배양 검증이 필요합니다.
서론
폐경 후 골다공증(PMOP)은 수많은 여성에게 영향을 미치며, 에스트로겐 결핍과 관련된 골 형성 및 골 흡수 균형의 붕괴가 특징입니다1,2. EphB4/ephrinB2 수용체-리간드 시스템은 조골세포와 파골세포 간의 소통을 매개합니다. EphB4 신호 전달은 조골세포 분화와 알칼리성 인산분해효소(ALP) 활성을 지원하는 반면, ephrinB2 역신호 전달은 RhoA 관련 기전을 통해 파골세포 형성을 억제할 수 있습니다3,4. 에스트로겐이 결핍된 뼈에서 이러한 결합의 감소는 골 재형성의 두 세포 경로 모두에 영향을 주는 중재법을 평가하기 위한 기전적 근거를 제공합니다.
골흡수 억제 및 골형성 촉진제를 포함한 현재의 골다공증 치료법은 골절 위험을 낮추지만, 장기 사용 시 복약 순응도, 비용, 금기 사항, 반동 효과 또는 부작용으로 인해 제한될 수 있습니다5. 따라서 과도한 골흡수를 제한하는 동시에 골형성을 개선하는 후보 치료법은 과학적으로 여전히 유효한 연구 대상입니다.
좌귀환(ZGP; Zuo Gui Wan)은 전통 중의학에서 뼈의 약화와 연관된 이론적 패턴인 신정부족(kidney-essence deficiency)에 사용되는 고전적인 다성분 처방입니다. 음을 보하는 성분으로는 Rehmannia glutinosa(숙지황, 조제된 뿌리, 24 g), Dioscorea opposita(산약, 근경, 12 g), Cornus officinalis(산수유, 열매, 12 g), Lycium barbarum(구기자, 열매, 12 g), Chinemys reevesii 복갑교(귀판 유래 젤라틴, 12 g) 및 Cyathula officinalis(우슬, 뿌리, 9 g)가 포함됩니다. 양을 보하는 성분으로는 Cuscuta australis(토사자, 씨앗, 12 g)와 Cervus elaphus 녹각교(녹각 유래 젤라틴, 12 g)가 포함됩니다. 고전 이론에서 음 중에서 양을 찾는다는 원리는 양을 보하는 약재가 단순히 독립적인 첨가제로 작용하기보다 음을 보하는 기초 성분을 강화할 수 있음을 시사합니다. 임상 근거와 전임상 연구에서는 골밀도(BMD), 골 형성 및 약동학적 거동에 미치는 영향을 포함하여 ZGP 또는 ZGP 함유 중재법의 항골다공증 활성이 보고된 바 있습니다6,7,8,9,10.
본 연구의 독창성은 난소절제(OVX) 쥐 모델에서 음(Yin)을 보하고 양(Yang)을 강화하는 성분들을 3x3 요인 설계(factorial separation)로 공식적으로 분리하여, 골 표현형과 EphB4/ephrinB2/RhoA/ALP 경로 마커를 동시에 평가했다는 점에 있습니다. 이러한 설계는 전체 처방이나 단일 비교군만을 사용한 연구보다 처방의 배합 이론을 더 직접적으로 검증하며, 동시에 경로 마커의 변화는 기전적으로 차단되거나 억제되지 않는 한 상관관계에 머문다는 점을 인식하고 수행되었습니다1.
프로토콜
본 연구의 모든 절차는 내몽고 의과대학교의 기관동물실험윤리위원회(승인 번호 YKD202404105)의 승인을 받았으며, ARRIVE 2.012 지침에 따라 수행되었습니다.
연구 설계
본 연구는 내몽고 의과대학교의 동물 실험 플랫폼에서 수행되었습니다. 두 가지 요인 보음 기본 처방(I; 세 가지 용량 수준: 0, 27, 54 g 생약 등가량)과 보양 처방(A; 세 가지 용량 수준: 0, 8, 16 g 생약 등가량)을 적용하여 3x3 완전 요인 설계를 실시하였으며, 이를 통해 9개의 요인 셀과 4개의 대조군을 설정하였습니다. 요인 설계 내용은 표 1에 제시되어 있습니다. I2A2는 임상 등가 용량의 완전한 ZGP 처방을 나타냅니다. 용량 환산은 체표면적 방법(랫드: 인간 계수 = 6.25)을 사용하였습니다13.
동물, 무작위 배정 및 눈가림법
특정 병원체 무균(SPF) 상태의 암컷 Sprague-Dawley 랫드 130마리(6개월령, 220–250 g)를 컴퓨터 생성 난수표를 이용해 배정하였습니다. 배정 코드는 결과 평가에 참여하지 않는 연구자가 순차적으로 밀봉된 봉투에 넣어 보관하였습니다. 랫드는 2 ± 2 oC의 온도와 50–60% 습도, 12시간 명/암 주기 조건의 환기 케이지에 3–4마리씩 수용되었으며, 물과 칼슘 및 인 함량이 기록된 표준 설치류 사료를 자유롭게 섭취하게 하고 케이지 활동 및 환경 풍부화를 제공하였습니다. 분자 분석, 조직학적 점수 산정, 이미지 정량화 및 밀도 측정은 배정 상태를 알지 못하는 연구자들이 수행하였습니다. 표본 크기는 사전 검정력 분석을 통해 결정되었으며, 그룹당 n = 10으로 산출되었습니다.
OVX 모델 및 약물 처리
정밀 기화기로 투여되는 흡입성 isoflurane 하에 양측 난소절제술(OVX)을 수행하였다. 산소 내 3–4% 농도로 마취를 유도하였으며, 노즈콘을 통해 1.5–2.5% 농도로 유지하였다. 발Withdrawal 반사와 안검 반사의 소실 및 안정적인 호흡을 통해 적절한 마취 깊이를 확인하였다. OVX 성공 여부는 수술 후 5일째에 질 발정 주기의 소실과 12주 후 BMD 감소를 통해 평가하였다. 모델 검증 후, 8주 동안 경구 투여(gavage) 처리(1 mL/10 g/day)를 실시하였다. 탕제는 끓는 물(10 °C, reflux)을 이용한 순차적 수성 추출법으로 제조하였으며, 10배 부피로 2시간, 이어서 8배 부피로 1.5시간 동안 추출한 뒤, 4겹의 의료용 거즈로 여과하고 감압 농축하여 0.968 g crude drug/mL로 만들었다. 농축 추출물은 4 °C에서 보관하였으며 제조 후 7일 이내에 사용하였다. 양성 대조군은 구수강 과립(1.8 g/kg/day)과 diethylstilbestrol(0.04 mg/kg/day)을 사용하였다. 실험 종료 시, 쥐를 5% isoflurane로 깊게 마취하여 발 및 각막 반사가 소실될 때까지 유지한 후, 방혈 및 경추 탈구를 실시하였다. 심박 및 호흡 정지로 사망을 확인하였다. 사체와 조직은 생물학적 폐기물로 처리하였고, 화학 잔류물은 유해 폐기물로 처리하였으며, 바늘이나 칼날은 승인된 손상성 폐기물 전용 용기에 폐기하였다.
결과 측정 지표
혈청 P1NP 및 CTX-1은 샌드위치 ELISA(Jiyinmei)로 측정하였다.14대퇴골 골밀도(BMD)는 이중 에너지 X선 흡수법(DXA)으로 정량화하였다. 해면골 조직학적 분석은 20배 배율에서 헤마톡실린 및 에오신 염색을 통해 평가하였다. 유전자 발현은 2--ΔΔ임계 사이클 (Ct) 방법, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)로 정규화하였다. 단백질 발현은 Western blot과 ImageJ 정량 분석으로 평가하였다(참조 재료 목록). 관찰된 분자량 및 항체 카탈로그 정보는 다음에서 제공됩니다. 부록 표 1프라이머 서열은 다음과 같다: EphB4 정방향/역방향, 5'-CTAGACTCTTTCCTGCGGCT/GGGAACTTGTGTAGGTGGGA-3'; ephrinB2, 5'-CGGACAAGGCCTGGTACTAT/ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT-3'; RhoA, 5'-GTTTATGTGCCCACGGTGTT/ACTATCAGGGCTGTCGATGG-3'; ALP, 5'-CGGACACAAGCATTCCCAGA/TGGTGGAGCTGAACAGGCTT-3'; GAPDH, 5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC/TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'.
통계 분석
모수 분석 전, Shapiro-Wilk 검정을 통해 정규성을 평가하였으며, Levene 검정을 통해 분산의 균질성을 평가하였다. 데이터는 평균 ± SD로 표시하였으며, 모든 정량적 그림의 오차 막대는 SD를 나타낸다. 주효과와 I 및 A의 상호작용을 추정하기 위해 9개의 요인 셀에 이원 분산 분석(Two-way factorial ANOVA)을 적용하였으며, 효과 크기로는 부분 에타 제곱(ηp2)을 사용하였다. 총 13개 그룹 간의 쌍별 비교는 Bonferroni 보정을 적용한 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용하여 수행하였다. 통계 분석은 GraphPad Prism으로 수행하였다. 유의성 기호는 다음과 같이 일관되게 정의하였다: *, **, ***, ****는 model 대비 p <0.05, p <0.01, p <0.01, p <0.01를 나타내며; #, ##, ###, ####는 full-formula ZGP 대비 동일한 임계값을 나타낸다.
결과
질 세포학 검사를 통한 모델 검증
수술 후 5일 이내에 발정 주기가 소실된 것을 통해 모든 난소절제 동물에서 OVX 성공이 확인되었으며(그림 1A), 반면 가짜 수술(sham-operated) 동물들은 4일 주기를 유지하였습니다(그림 1B). 12주 차에 DXA 분석 결과, OVX 모델군의 대퇴골 BMD가 가짜 대조군보다 낮게 나타나(0.214 ± 0.020 vs. 0.281 ± 0.019 mg/cm3; Bonferroni-adjusted p < 0.01), 처치 전 OVX로 유도된 골손실 모델이 성공적으로 구축되었음을 뒷받침하였습니다.
골밀도
전체 ZGP 처방(I2A2)은 요인 설계 하위 처방들 중 가장 높은 BMD 회복률을 보였으며, 두 양성 대조군 모두와 통계적으로 유사하였다(표 2, 그림 2). 모든 요인 설계 하위 처방은 모델군에 비해 BMD를 증가시켰다. 고함량 보음 단독(I3A1: 0.253 mg/cm3) 및 고함량 보양 단독(I1A3: 0.243 mg/cm3)은 전체 ZGP(I2A2: 0.307 mg/cm3)보다 낮은 수치를 유지하였으며, 이는 단순한 용량 효과보다는 상호작용이 있음을 뒷받침한다.
혈청 골교체 표지자
모델 그룹과 비교했을 때, 전체 공식 ZGP는 P1NP의 증가(+51%; 95% CI: 210.3–327.5 pg/mL; p <0.01) 및 CTX-1의 감소(-16%; p <0.01)와 관련이 있었으며, 이는 개선된 형성-흡수 균형과 일치한다(그림 3A,B). 고용량 단일 요법 군은 일부 비교에서 더 높은 절대 P1NP 값을 나타냈으나, 요인 패턴은 최대 단일 군 용량 반응보다는 최적화된 복합 활성을 뒷받침했다. 전체 그룹 수준 데이터는 표 3에 제시되어 있다.
요인 분산 분석 및 시너지 상호작용
9개 요인 셀에 대한 이원 배치 분산 분석(Two-way factorial ANOVA) 결과, 일차 평가 변수 전반에 걸쳐 보음(Yin-nourishing) 및 보양(Yang-enhancing) 요인의 유의미한 주효과와 I 및 A의 유의미한 상호작용 항이 확인되었습니다(표 4). P1NP에 대한 상호작용 효과(ηp2 = 0.74)는 본 실험 조건 하에서 보양 성분이 보음 성분의 활성을 증폭시켰음을 시사합니다.
골밀도 (모델 검증)
그림 4에 나타난 바와 같이, 처리 전 Model (OVX) 군의 대퇴골 밀도가 Blank 군 및 Sham 수술 군보다 낮게 나타나 OVX 골손실 표현형이 성공적으로 유도되었음을 확인하였다.
EphB4/ephrinB2/RhoA/ALP 발현
RT-qPCR 분석에는 각 그룹의 생물학적 샘플을 사용하여 기술적 3반복 반응을 수행하였으며, Western blot 밀도 측정은 독립적인 생물학적 용해물에 대해 수행되었습니다(Figure 5 및 Figure 6). 모델 그룹과 비교했을 때, 전체 포뮬러 ZGP는 더 높은 EphB4 (0.498 ± 0.09 vs. 0.048 ± 0.02; p < 0.001), ephrinB2 (0.41 ± 0.036 vs. 0.048 ± 0.03; p < 0.01), ALP (0.842 ± 0.019 vs. 0.090 ± 0.03; p < 0.01) 수치와 더 낮은 RhoA (1.658 ± 0.028 vs. 7.32 ± 0.430; p < 0.01) 수치와 연관이 있었습니다. 이러한 분자적 발견은 인과적 매개의 증거라기보다 경로 마커 간의 연관성으로 해석됩니다.
데이터 가용성
본 연구 결과를 생성하는 데 사용된 원본 데이터 파일은 이 논문에 첨부된 보충 코딩 파일로 제공됩니다
그림 1. 난소 절제술 후 발정 주기성을 확인하는 데 사용된 대표적인 질 세포학 이미지 (헤마톡실린 및 에오신 염색, 20배 확대). (A) 지속적인 비주기성 세포상을 보이는 난소제거 쥐의 대표적인 질 도말 표본. (B) 정상적인 발정 주기성을 보여주는 가짜 수술(sham-operated) 쥐의 대표적인 질 도말 표본. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2모든 그룹의 대퇴골 골밀도(BMD). 오차 막대는 표준편차(SD)를 나타냅니다. 통계 기호는 '통계 분석' 섹션에 정의된 모델 또는 전체 공식 ZGP와의 Bonferroni 보정 비교를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3혈청 골 교체 표지자. (A) 골 형성 표지자인 P1NP. (B) 골 흡수 표지자인 CTX-1. 오차 막대는 표준편차(SD)를 나타냄. 통계 기호는 모델 또는 전 성분 함유 ZGP 대비 Bonferroni 보정 비교 결과를 나타냄. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4치료 전, OVX로 유도된 골 손실을 확인하기 위한 대퇴골 골밀도 측정. 대퇴골 골밀도(mg/cm³)를 비교한 막대 그래프3전처치 전 모델 검증 시점에서 공백군(난소절제술을 하지 않은 미처리군), 위수술군, 모델군(OVX) 간의 차이. 막대는 평균을 나타냄 ± SD (그룹당 n = 10). *** = p < 0.01 vs. Blank 및 vs. Sham (Bonferroni 교정을 적용한 일원 분산 분석). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5상대적 mRNA 유전자 발현. (의 발현 수준A) EphB4 (B) ephrinB2 (C) RhoA (D) 2^-$\Delta\Delta$Ct 방법을 이용한 ALP 분석ΔΔGAPDH로 표준화한 Ct 방법. qPCR은 각 생물학적 시료에 대해 3회 반복의 기술적 반복 실험을 수행하였다. 오차 막대는 표준편차(SD)를 나타낸다. 통계 기호는 본페로니(Bonferroni) 교정 비교 분석 결과를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6웨스턴 블롯 단백질 발현. 패널은 독립적인 생물학적 샘플에서 선택한 EphB4, ephrinB2, RhoA, ALP 및 로딩 컨트롤인 GAPDH의 대표적인 면역블롯 결과를 보여줍니다. 밀도 분석은 ImageJ를 사용하여 GAPDH를 기준으로 정규화되었습니다. 관찰된 분자량은 다음과 같습니다: EphB4, 10 kDa; ephrinB2, 36 kDa; RhoA, 22 kDa; ALP, 39 kDa; GAPDH, 37 kDa (참조 부록 표 1). 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
| 보음 인자 (I) | ||||
| I₁ (0 g) | I₂ (27 g) | I₃ (54 g) | ||
| 보양 인자 (A) | A₁ (0 g) | I₁A₁ (모델) | I₂A₁ (음) | I₃A₁ (고음) |
| A₂ (8 g) | I₁A₂ (양) | I₂A₂ (ZGP†) | I₃A₂ (고음+양) | |
| A₃ (16 g) | I₁A₃ (고양) | I₂A₃ (음+고양) | I₃A₃ (전체 고농도) | |
표 1: 3x3 요인 설계 및 실험군. 본 표는 음을 보하는(I) 및 양을 보하는(A) 용량 수준의 3x3 요인 설계로 배치된 13개의 실험군과 4개의 대조군을 나타냅니다. †I₂A₂ = 임상 동등 용량의 Zuogui Pill 전체 처방. 체표면적법(rat : human = 6.25)을 이용한 용량 환산.
| 그룹 | 요인 설계 세포 (Factorial Cell) | BMD (mg/cm²)`³, x̄ ± 표준편차(SD) | 대조 모델 |
| 공시료 대조군 | — | 0.279 ± 0.030 | **** |
| 가짜 수술을 시행한 | — | 0.281 ± 0.019 | **** |
| 모델 (OVX) | I₁A₁ | 0.214 ± 0.020 | — |
| 양기 증진 | I₁A₂ | 0.258 ± 0.011 | ** |
| 강양(高陽) 증진 | I₁A₃ | 0.243 ± 0.021 | * |
| 음혈 보충 | I₂A₁ | 0.262 ± 0.015 | *** |
| 고보음(高補陰) | I₃A₁ | 0.253 ± 0.017 | ** |
| 음 + 희양 | I₂A₃ | 0.240 ± 0.014 | * |
| Hi-음 + 양 | I₃A₂ | 0.248 ± 0.014 | * |
| 전고(全高) | I₃A₃ | 0.257 ± 0.017 | ** |
| ZGP 전체 공식 | I₂A₂ | 0.307 ± 0.010 | **** |
| TCM 양성 대조군 | — | 0.307 ± 0.029 | **** |
| 양방 대조군 | — | 0.307 ± 0.009 | **** |
표 2: 모든 군의 대퇴골 BMD (군당 n=10, 평균 ± SD). * = p <0.05, ** = p <0.01, *** = p<0.01, **** = p<0.01 vs. 모델군 (Bonferroni 보정).
| 그룹 | 세포 | P1NP (pg/mL, x̄ ± SD) | CTX-1 (ng/mL, x̄ ± SD) |
| 공백 대조군 | — | 138.8 ± 29.7****#### | 3.4 ± 6.8****#### |
| 위수술군 | — | 1268.7 ± 124.1****#### | 45.0 ± 6.7****#### |
| 모델군 (OVX) | I₁A₁ | 526.4 ± 78.7 | 105.5 ± 9.9 |
| 양보군 | I₁A₂ | 845.1 ± 76.7**** | 84.2 ± 6.6**** |
| 고용량 양보군 | I₁A₃ | 1013.0 ± 73.7 ****## | 65.5 ± 6.6****#### |
| 음보군 | I₂A₁ | 870.7 ± 63.6**** | 8.2 ± 7.6** |
| 고용량 음보군 | I₃A₁ | 1068.0 ± 48.7****#### | 64.5 ± 4.0****#### |
| 음보 + 고용량 양보군 | I₂A₃ | 951.5 ± 146.5****# | 63.1 ± 6.0****#### |
| 고용량 음보 + 양보군 | I₃A₂ | 90.2 ± 16.8****## | 62.6 ± 4.4****#### |
| 전체 고용량군 | I₃A₃ | 739.5 ± 93.5** | 97.1 ± 8.9 |
| ZGP 전체 처방군 | I₂A₂ | 794.8 ± 6.0**** | 8.2 ± 6.0**** |
| 한약 양성 대조군 | — | 967.7 ± 49.9****# | 6.3 ± 6.1****#### |
| 양약 대조군 | — | 1026.6 ± 65.1****### | 68.8 ± 7.3****### |
표 3: 모든 그룹의 혈청 P1NP 및 CTX-1 (그룹당 n=10, 평균 ± SD). ** = p <0.01, **** = p <0.01 vs. model; # = p <0.05, ## = p <0.01, ### = p <0.01, #### = p <0.01 vs. ZGP (Bonferroni). ZGP P1NP vs. model에 대한 95% CI: 210.3–327.5 pg/mL.
| 결과 | 인자 | df | F | p-값 | 부분적 η² |
| P1NP (pg/mL) | 음 (I) | 2, 81 | 17.84 | <0.001 | 0.31 |
| 양 (A) | 2, 81 | 6.22 | 0.003 | 0.13 | |
| I × A | 4, 81 | 57.21 | <0.001 | 0.74 | |
| BMD (mg/cm²)³) | 음 (I) | 2, 81 | 31.90 | <0.0001 | 0.44 |
| 양 (A) | 2, 81 | 28.70 | <0.0001 | 0.41 | |
| I × A | 4, 81 | 24.60 | <0.0001 | 0.55 | |
| CTX-1 (ng/mL) | 음 (I) | 2, 81 | 14.22 | <0.001 | 0.26 |
| 양 (A) | 2, 81 | 5.88 | 0.004 | 0.13 | |
| I × A | 4, 81 | 19.43 | <0.001 | 0.49 |
표 4: Bonferroni 교정 사후 비교를 포함한 3x3 요인 ANOVA의 주효과 및 상호작용 항. 효과 크기는 부분 에타 제곱(Partial eta-squared)으로 보고되었습니다. df는 자유도를 나타냅니다.
부록 표 1. 웨스턴 블롯 항체 정보. 본 표에는 본 연구에 사용된 1차 및 2차 항체의 표적 단백질, 관찰된 분자량, 공급처, 카탈로그 번호, 숙주 종 및 작동 희석 배율이 나열되어 있습니다.이 파일을 다운로드하시려면 여기를 클릭하십시오.
보충 코딩 파일 1. 연구를 뒷받침하는 가공되지 않은 실험 데이터. 이 아카이브에는 개별 BMD 측정값, ELISA 로우 데이터, 증폭 및 융해 곡선 출력값이 포함된 RT-qPCR Ct 값, 원본 웨스턴 블롯 이미지 및 밀도 분석 파일, 대표적인 조직학적 현미경 이미지, 그리고 이러한 실험과 관련된 기기 생성 출력 파일을 포함하여 논문에 제시된 결과를 도출하는 데 사용된 원본 데이터 파일이 포함되어 있습니다.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
토론
요인 상호작용 항은 ZGP의 보음(Yin-nourishing) 성분과 보양(Yang-enhancing) 성분 사이의 비가산적 관계를 뒷받침합니다. 이 결과는 양을 보강하는 성분이 음을 보하는 기초를 활성화하거나 증강시킨다고 보는 '음중구양(seeking Yang within Yin)'이라는 전통적 원리와 일치합니다15. 이러한 발견은 처방 수준의 약리학적 시너지 효과로 해석되어야 하며, 해당 효과를 일으키는 개별 활성 성분을 식별하는 것은 아닙니다.
EphB4와 ephrinB2는 생물학적으로 타당한 조골세포-파골세포 결합 매개체이나3,4, 현재의 증거는 상관관계에 기반하고 있습니다. RhoA 감소에 따른 EphB4, ephrinB2 및 ALP의 증가 관찰 결과는 결합 개선과 부합하지만, 이것만으로는 이 경로가 ZGP 작용에 필수적이거나 충분하다는 것을 입증하지 않습니다. 인과적 의존성을 검증하기 위해서는 경로 억제, anti-EphB4 또는 ephrinB2 차단 접근법, RhoA/ROCK 조절16, 유전자 녹다운 및 조골세포-파골세포 공배양 실험이 필요합니다.
임상 적용에는 주의가 필요합니다. 쥐의 인간 등가 용량 변환은 초기 규모 설정의 근거가 되지만, 인간 투여를 위해서는 약동학, 약력학 및 장기 안전성 연구가 추가로 필요합니다. 표준화된 ZGP 제품은 HPLC 또는 LC-MS 화학적 프로파일링, 지표 성분 한도 설정, 배치 간 비교 가능성, 오염 물질 검사, 그리고 약재의 기원, 추출, 농축 및 제조 공정에 대한 문서화가 필요할 것입니다17. 규제적 적용 시에는 구성 성분 간의 상호작용, 기존 골다공증 치료제와의 적합성, 그리고 BMD 단독 지표보다는 골절 감소와 같은 비교 임상 결과도 반드시 고려해야 합니다.
본 연구에는 몇 가지 한계점이 있습니다. OVX 쥐 모델은 갑작스러운 에스트로겐 결핍을 유도하므로 인간의 폐경, 노화, 면역 조절, 수명, 동반 질환 또는 장기적인 골 리모델링 역학을 완전히 재현할 수 없습니다18,19. 전신 내분비 효과가 관찰된 결과에 기여했을 수 있으므로, 직접적인 골세포 신호 전달로 단정해서는 안 됩니다. 경로 억제나 유전자 넉다운이 수행되지 않아 인과적인 기전 주장을 하기 어렵습니다. HPLC 또는 LC-MS 프로파일링의 부재로 인해 재현성이 제한되며, 특정 성분에 따른 효과를 규명하는 데 한계가 있습니다. 해면골 미세구조에 대한 정량적 평가가 이루어지지 않았습니다. 향후 연구에서는 골 구조 변화에 대한 보다 종합적인 평가를 제공하기 위해 BV/TV, Tb.N, Tb.Th 및 Tb.Sp를 포함한 micro-CT 또는 정량적 조직 형태 분석을 도입해야 합니다20. 한약재 배치의 가변성, 추출 절차 및 품질 관리 요구 사항은 여전히 중요한 중개 연구의 장벽으로 남아 있습니다.
OVX로 유도된 PMOP 쥐 모델에서, 전처방 좌귀환(Zuogui Pill)은 골밀도(BMD) 개선, 유리한 혈청 골교체 마커 및 EphB4/ephrinB2/RhoA/ALP 경로 마커의 조화로운 변화와 관련이 있었습니다. 3x3 요인 분석 결과는 보음(Yin-nourishing) 및 보양(Yang-enhancing) 성분 사이의 시너지 상호작용을 뒷받침하며, 이는 전통적인 방제 배합 이론과 일치합니다. 이러한 데이터는 PMOP의 다중 표적 후보 물질로서 ZGP에 대한 추가 연구의 근거가 되지만, 기전적 또는 중개적 주장을 확정하기 위해서는 억제 연구, 유전자 침묵 실험, 조골세포-파골세포 공배양, 화학적 프로파일링, 정량적 골 미세구조 분석, 약동학, 장기 안전성 테스트 및 임상 시험이 필요합니다.
공개 사항
저자들은 선언할 이해상충 관계가 없습니다.
감사의 글
본 연구는 내몽고 자연과학재단(Grant No. 2025LHMS08047), 내몽고 의과대학교 일반 프로젝트(Grant No. YKD2025MS015) 및 내몽고 의과대학교 박사 시작 펀드(Grant No. YKD2023BSQD07)의 지원을 받았습니다. 지원 기관은 연구 설계, 데이터 수집, 분석, 출판 결정 또는 원고 작성에 관여하지 않았습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1% 암모니아수 | 해당 사항 없음 | 해당 사항 없음 | 헤마톡실린 분별 후 청색화 용액. |
| 1% 염산 알코올 | 해당 사항 없음 | 해당 사항 없음 | 헤마톡실린 염색을 위한 분별 용액. |
| 2x qPCR 믹스 | 해당 없음 | 해당 사항 없음 | 정량 PCR 마스터 믹스. 소스 반응 부피: 반응당 12.5 uL. |
| 4% 파라포름알데히드 용액 | 해당 없음 | 해당 없음 | 조직학적 분석을 위한 왼쪽 대퇴골 및 경골 시료의 고정. |
| 5x 로딩 버퍼 | 해당 없음 | 해당 사항 없음 | 전기영동 전 시료 변성. |
| ALP 1차 항체 | Affinity Biosciences | 해당 사항 없음 | 웨스턴 블롯 항체. 원액 희석 배수: 1:200. JoVE 제출을 위해 RRID 및 로트 번호가 필요함. |
| ALP 프라이머 쌍 | 해당 없음 | 해당 없음 | qRT-PCR로 ALP mRNA를 측정하였으나, 모프라이머 표에 ALP 프라이머 서열이 제공되지 않았습니다. 저자의 확인이 필요합니다. |
| 비오틴 항체 시약 | ELISA 키트에 제공됨, Jiyinmei | 키트 구성품 | ELISA 수행 중 샘플 웰에 첨가됨. |
| Cervus elaphus 뿔 젤라틴, 녹각교 | 북경동인당 | 해당 사항 없음 | 양기 보강 성분. 원처방의 전체 배합 용량: 12g, 비율 4. 젤라틴을 탕제에 녹였다. |
| 남생이 복갑 젤라틴, 귀반교 | Beijing Tongrentang | 해당 사항 없음 | 음양 보익 성분. 원물 내 전체 처방 용량: 12g, 비율 4. 젤라틴을 전탕액에 녹였다. |
| 클로포름 | 해당 없음 | 해당 없음 | RNA 추출 중의 상분리. |
| 냉각 스테이지 | Leica | 1150 | 절편 제작 워크플로를 위한 냉동 또는 냉각 지원. |
| 산수유, 산수유 | Beijing Tongrentang | 해당 없음 | 음양 보익 성분. 원처방의 전체 용량: 12 g, 비율 4. |
| Cuscuta australis, 토시자 | 베이징 통런탕 | 해당 없음 | 양강 성분. 원료 내 전체 처방 용량: 12g, 배수 4. |
| Cyathula officinalis, 천우시 | 베이징 통런탕 | 해당 사항 없음 | 음양보익 성분. 원 처방의 전체 복용량: 9 g, 비율 3. |
| DEPC 처리된 PBS | 해당 사항 없음 | 해당 사항 없음 | 액체 질소 동결 전 L4 내지 L5 요추의 세척. |
| 디에틸스틸베스트롤 | 해당 사항 없음 | 해당 사항 없음 | 웨스턴 의학 양성 대조군. 투여량: 0.04 mg/kg/일, 1 mL/10 g/일. diethylstilbestrol. |
| Dioscorea opposita, 산약 | 북경동仁堂 | 해당 사항 없음 | 음양을 보하는 성분. 원천 처방의 전체 복용량: 12 g, 비율 4. |
| dNTP 혼합물 | 해당 사항 없음 | 해당 없음 | 역전사 반응에 포함됨. |
| ECL 화학발광 시약 | 해당 없음 | 해당 사항 없음 | 웨스턴 블롯 검출 시약. |
| ELISA 발색 시약 A | ELISA 키트에 포함됨, Jiyinmei | 키트 구성품 | ELISA용 발색 시약. |
| ELISA 발색 시약 B | ELISA 키트에 포함됨, Jiyinmei | 키트 구성 요소 | ELISA용 발색 시약. |
| ELISA 정지액 | ELISA 키트에 제공됨, Jiyinmei | 키트 구성 요소 | ELISA 발색 반응을 정지시키는 데 사용됨. |
| 효소 표지 ELISA 시약 | ELISA 키트에 포함됨, Jiyinmei | 키트 구성품 | ELISA의 공백이 아닌 웰에 추가함. |
| EphB4 1차 항체 | Proteintech | 해당 사항 없음 | 웨스턴 블롯 항체. 원액 희석 배수: 1:200. JoVE 제출을 위해 RRID 및 로트 번호가 필요함. |
| EphB4 프라이머 쌍 | 해당 사항 없음 | PCR 생성물 232 bp | 정방향 CTAGACTCTTTCCTGCGGCT; 역방향 GGGAACTTGTGTAGGTGGGA. 상위 표의 오타 Rat RphB4는 Rat EphB4로 수정되어야 합니다. |
| ephrinB2 1차 항체 | Affinity Biosciences | 해당 없음 | 웨스턴 블롯 항체. 원액 희석 배수: 1:20. JoVE에 RRID 및 로트 번호 필수. |
| ephrinB2 프라이머 쌍 | 해당 없음 | PCR 생성물 172 bp | 정방향 CGGACAAGGCCTGGTACTAT; 역방향 ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT. |
| 에탄올, 절대 에탄올 및 단계별 95%, 85%, 75% 농도 | 해당 사항 없음 | 해당 사항 없음 | 헤마톡실린 및 에오신 염색 과정 중의 단계적 탈수 및 재수화. |
| 암컷 Sprague-Dawley 랫드 | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | 원본 논문에 동물 실험 인증서 및 허가 번호가 제공되지 않음 | 특정 병원체 부재(SPF), 6개월령의 건강한 비임신 암컷. 중국어 원문에는 230~270g으로 기재되어 있으나, 이전 영어 초안에는 20~250g으로 기재됨. 제출 전 최종 범위를 확인하십시오. |
| GAPDH 1차 항체 | Servicebio | 해당 없음 | 로딩 컨트롤 항체. 원액 희석 배수: 1:200. JoVE 제출을 위해 RRID 및 로트 번호가 필요함. |
| GAPDH 프라이머 쌍 | 해당 없음 | PCR 생성물 253 bp | 정방향 ACAGCAACAGGGTGGTGGAC; 역방향 TTTGAGGGTGCAGCGAACTT. |
| GraphPad Prism 소프트웨어 | GraphPad 소프트웨어 | 버전 9.4.1; RRID:SCR_02798 | 통계 분석 및 그래프 작성. 정규성, 분산 균질성, ANOVA, Bonferroni 보정 및 효과 크기는 출력 파일에 유지해야 한다. |
| 구수강 과립 | Liaoning Wohua Kangchen Pharmaceutical Co., Ltd. | 해당 사항 없음 | 전통 중의학 양성 대조군. 투여량: 1.8 g/kg/일 또는 0.5 mL/100 g/일. |
| 헤마톡실린 염색액 | Zhuhai Beisuo Biotechnology Co., Ltd. | 해당 사항 없음 | 조직학적 염색. 소스 절차에서는 5분간의 헤마톡실린 염색을 사용함. |
| 고속 마이크로원심분리기 | 해당 없음 | TG16W | 혈청 및 핵산 절차를 위한 원심분리. |
| Hologic 이중 에너지 X선 흡수 계측기 | Hologic | 해당 없음 | 골밀도 분석. 소스는 생체 내 및 생체 외 대퇴골 스캔을 보고함. |
| ImageJ 소프트웨어 | 미국 국립보건원 | RRID:SCR_03070 | 웨스턴 블롯 밴드의 밀도 측정 정량 분석. 소스 기사에는 버전이 제공되지 않음. |
| 인덕션 레인지 | Midea | 해당 사항 없음 | 중국어 상위 기기 표에 기재됨. |
| 이소플루레인 | 해당 없음 | 해당 사항 없음 | 양측 난소절제술을 위한 마취 및 DXA 포지셔닝. 개정된 프로토콜에는 도입, 유지, 투여 경로 및 마취 깊이 판정 기준이 명시되어야 한다. |
| 이소프로판올 | 해당 사항 없음 | 해당 없음 | 추출 과정 중의 RNA 침전. |
| 액체 질소 | 해당 사항 없음 | 해당 없음 | 요추 시료의 급속 냉동. |
| 구기자, 구기자 | 북경동인당 | 해당 없음 | 음양을 보하는 성분. 원전의 전체 처방 용량: 12g, 비율 4. |
| 마이크로플레이트 리더 | 해당 없음 | AMR-10 | 450 nm에서의 ELISA 흡광도 측정. |
| 마이크로플레이트 세척기 | 해당 사항 없음 | APW-20 | ELISA 플레이트 세척 단계. |
| MMLV 역전사 효소 | 해당 없음 | 해당 없음 | 역전사 효소 |
| 중성 마운팅 검 | Sinopharm Group | 해당 없음 | 헤마토실린 및 에오신 염색 슬라이드용 봉입제. |
| 생리식염수 | 해당 없음 | 해당 없음 | 공백 대조군, 가짜 수술군 및 모델군에 대한 용매 경구 투여. |
| Oligo(dT)18 프라이머 | 해당 없음 | 해당 사항 없음 | 역전사 과정에 사용됨. |
| 페니실린 | 해당 사항 없음 | 해당 없음 | 수술 후 감염 예방. 투여량: 3일 동안 20,0 U/kg를 근육 내 투여. |
| 압력솥 | 신페이 | 해당 사항 없음 | 중국어 모기 표에 기재됨. |
| 단백질 분해 효소 억제 | 해당 사항 없음 | 해당 사항 없음 | 단백질 추출 과정 중 추가됨. |
| 단백질 용해 완충액 | 해당 없음 | 해당 사항 없음 | 웨스턴 블롯팅을 위한 골 조직 단백질 추출. |
| PVDF 막 | 해당 없음 | 해당 없음 | 메탄올로 활성화된 웨스턴 블롯 전사 막. |
| qRT-PCR 기기 | 해당 사항 없음 | 해당 없음 | EphB4, ephrinB2, RhoA, ALP 및 GAPDH를 위한 정량적 역전사 PCR. |
| Rat CTX-1 ELISA 키트 | Jiyinmei | JYM026Ra | 제1형 콜라겐의 혈청 C-말단 텔로펩타이드 측정을 위한 샌드위치 ELISA. 450 nm에서 검출. |
| Rat P1NP ELISA 키트 | Jiyinmei | JYM030Ra | 혈청 1형 프로콜라겐 N-말단 프로펩타이드 측정을 위한 샌드위치 ELISA. 450 nm에서 검출. |
| 지황, 숙지황 | Beijing Tongrentang | 해당 사항 없음 | 음양 보익 성분. 원천 자료의 전체 처방 용량: 24 g, 비율 8. |
| RhoA 1차 항체 | Proteintech | 해당 사항 없음 | 웨스턴 블롯 항체. 원액 희석 배수: 1:20. JoVE 제출을 위해 RRID 및 로트 번호가 필요함. |
| RhoA 프라이머 쌍 | 해당 없음 | PCR 산물 17 bp | 정방향 GTTTATGTGCCCACGGTGTT; 역방향 ACTATCAGGGCTGTCGATGG. 용어를 RHoA에서 RhoA로 통일함. |
| RNase 억제 | 해당 사항 없음 | 해당 없음 | 역전사 반응에 포함됨. |
| RNase-free water | 해당 사항 없음 | 해당 없음 | 건조 후 RNA 용해. |
| 회전식 마이크로톰 | Leica | 2245 | 조직학적 절편 제작. |
| 웨스턴 블로팅용 2차 항체 | 해당 없음 | 해당 없음 | 원액 희석 배수: 1:150. JoVE를 위해 숙주 반응성 및 RRID가 필요함. |
| 탈지분유, 5% | 해당 없음 | 해당 사항 없음 | 웨스턴 블롯팅용 블로킹 시약, 실온에서 2시간 동안 처리. |
| 슬라이드 도말 및 건조기 | 금화 이디 | 해당 없음 | 조직학을 위한 슬라이드 제작. |
| 펜토바르비탈나트륨, 3% | 해당 없음 | 해당 사항 없음 | 중국어 원본 문서의 복부 대동맥 채혈 전 말기 마취. 최종 안락사 절차 및 확인 방법이 검증되어야 함. |
| 표준 시료 희석액 | ELISA 키트에 포함됨, Jiyinmei | 키트 구성품 | ELISA 절차에서 표준 시료의 연속 희석에 사용됩니다. |
| TBST 완충액 | 해당 사항 없음 | 해당 없음 | 웨스턴 블로팅용 세척 완충액. |
| 항온 진탕 배양기 | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | 해당 사항 없음 | 실험실 배양 및 진탕. |
| TRIzol 시약 | 해당 사항 없음 | 해당 사항 없음 | 10mg 골 조직에서의 RNA 추출. |
| 정립 현미경 | Leica | DM100 | 20배 배율의 헤마톡실린 및 에오신 조직학 영상. |
| 워터재킷 항온 배양기 | 해당 없음 | GNP-9080 | 분석 절차를 위한 배양. |
| 수용성 에오신 염색액 | Zhuhai Beisuo Biotechnology Co., Ltd. | 해당 사항 없음 | 조직학적 대조염색. 원본 절차에서는 3분간 에오신 염색을 수행하였다. |
| 웨스턴 블롯 전기영동 시스템 | 해당 사항 없음 | 해당 없음 | 단백질 분리. 전원 전기영동: 초기 80 V, 이후 120 V. |
| 웨스턴 블롯 이미지 분석 시스템 | 해당 사항 없음 | 해당 없음 | 화학발광 막 이미지 분석. 제출 시 편집되지 않은 전체 막 이미지가 필요함. |
| 웨스턴 블롯 전이 시스템 | 해당 사항 없음 | 해당 사항 없음 | PVDF 막으로의 단백질 전이. 전이 조건: 40 mA, 90분, 얼음욕. |
| 자일렌 | 해당 없음 | 해당 사항 없음 | 조직학 과정 중의 탈파라핀 및 조직 투명화. |
| 좌귀환 구성 약재 | 베이징 동인당 | 해당 사항 없음 | 8가지 약재 처방: 지황, 산약, 산수유, 구기자, 남사삼(자라 갑), 가시삼, 토금은화, 녹용 것. |
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