방법 논문

미토콘드리아 호흡 슈퍼복합체의 기능적 재구성

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DOI:

10.3791/72243

⸱

2026년 8월 21일

 ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of California, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Biomedicine Discovery Institute, Monash University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

우리는 상관관계가 있는 구조적 및 기능적 특성 분석을 위해, 기능적인 미토콘드리아 호흡 슈퍼컴플렉스를 잘 정의된 프로테오리포좀으로 재구성하는 간단한 프로토콜을 제시합니다.

초록

미토콘드리아는 생체 에너지 대사의 중심 허브이며 ATP의 주된 공급원입니다. 미토콘드리아 내막에는 전자 전달계 복합체(CI, CII, CIII)를 포함하는 산화적 인산화 시스템이 위치합니다.2, 그리고 CIV) 및 ATP 합성효소(CV). 포유류의 경우, CI, CIII2, 그리고 CIV는 SC I+III와 같은 슈퍼복합체(supercomplexes, SCs)라고 불리는 고차 구조를 형성합니다.2+IV, SC I+III2, 및 SC III2+IV. 슈퍼복합체(SC) 형성을 촉진하는 생리학적 요인은 여전히 불분명하지만, SC 형성이 복합체 간의 전자 전달 속도를 높이거나, 활성 산소종 생성을 줄이거나, 혹은 밀집된 미토콘드리아 내막 내에서 비특이적 단백질 응집을 방지할 수 있다는 가설이 제기되어 왔다. 호흡 SC의 구조 및 기능 연구는 주로 계면활성제로 추출한 복합체에 의존해 왔다. 이러한 연구들을 통해 전자 전달계에 대한 이해가 깊어졌으나, 밀폐된 막 이중층의 부재로 인해 슈퍼복합체 조립의 기능적 이점을 탐구하는 데 한계가 있었다. 그러나 최근의 발전으로 막 단백질을 재구성된 천연 유사 막 환경에서 구조적으로 특성화할 수 있게 되었으며, 이는 이러한 연구에 더욱 생리학적인 맥락을 제공한다. 본 연구에서는 호흡 SC를 리포좀으로 재구성하는 간단하고 빠르며 재현 가능한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 다양한 지질 조성, 단백질 농도 및 막 전위가 호흡 SC의 기능에 미치는 영향을 테스트할 수 있게 하여, 향후 기전 연구를 위한 가치 있는 도구를 제공한다.

서론

미토콘드리아는 진핵생물의 호흡에 있어 핵심적인 역할을 합니다. 미토콘드리아 내막(IMM)에는 전자 전달계 복합체(CI–CIV)와 ATP 합성효소(CV)로 구성된 산화적 인산화 시스템이 존재합니다1. CI와 CII는 환원된 기질로부터 유비퀴논(CoQ)으로 전자를 전달하여 유비퀴놀(CoQH2)을 생성하며, 이는 CIII2와 시토크롬 c를 거쳐 전자를 CIV로 전달하고, 여기서 산소는 물로 환원됩니다. CI, CIII2, CIV에 의한 양성자 펌핑은 양성자 구동력(PMF)을 형성하며, 이는 CV에 의해 ADP와 무기 인산(P)으로부터 ATP를 합성하는 데 이용됩니다1.

CI, CIII2, CIV는 독립적으로 기능할 뿐만 아니라, SC I+III2+IV(respirasome으로도 알려짐), SC I+III2, SC III2+IV와 같이 정의된 화학량론을 가진 고차 슈퍼복합체(supercomplex, SC) 구조로 조립될 수 있다2,3,4,5. 이러한 조립체의 기능적 이점은 아직 명확하지 않다6. 이들의 기능에 대한 가설은 조립 및 기질 채널링에서의 역할부터 미토콘드리아 내막(IMM)의 높은 단백질 밀도로 인한 부산물이라는 견해까지 다양하다3,7,8,9,10,11,12,13,14,15. 최근 연구들에 따르면 소수성 불일치로 유도된 막 변형, 단백질-단백질 상호작용 및 단백질-지질 상호작용을 포함한 막 특성이 SC의 형성과 안정성에 기여하는 것으로 나타났다16.

막 단백질의 구조 및 기능 연구는 전통적으로 계면활성제로 가용화된 복합체에 의존해 왔으나, 이는 천연 막 환경을 파괴하고 막 전위 및 이온 구배에 의존하는 과정의 조사를 제한합니다. 이와 대조적으로, 최근의 연구 결과들은 막 단백질이 재구성된17,18,19 또는 천연 막20,21,22,23 상태에서 구조적으로 특성화될 수 있음을 보여주며, 이는 막 전위와 이온 구배에 의존하는 막 단백질의 기능적 메커니즘을 조사하는 능력을 크게 향상시켰습니다.

본 프로토콜은 미토콘드리아 호흡 슈퍼복합체(SCs)를 정의된 프로테오리포좀으로 재구성하는 간단하고 재현 가능한 방법을 설명합니다. 이렇게 구축된 시스템은 제어된 천연 유사 막 환경에서 호흡 SC의 형성, 안정성 및 기능과 관련된 근본적인 질문을 조사할 수 있는 강력한 플랫폼을 제공합니다. 재구성 과정에서 CoQ10과 cytochrome c를 포함함으로써, 프로테오리포좀으로 재구성된 SC가 NADH 구동 산소 소비를 지원함을 입증하였으며, 이는 복합체가 지질 이중층 내에서 기능적으로 유효하게 유지됨을 나타냅니다. 또한, 극저온 전자 현미경(cryo-EM)을 사용하여 프로테오리포좀 내의 SC를 쉽게 시각화할 수 있음을 보여주었으며, 이를 통해 구조적 조직과 생화학적 활성 사이의 직접적인 상관관계를 규명할 수 있게 하였습니다.

이 방법은 견고하며 쉽게 재현할 수 있지만, 성공적인 재구성은 슈퍼컴플렉스의 안정성과 활성을 유지하기 위해 지질 조성, 계면활성제 농도, 단백질 대 지질 비율의 세심한 최적화와 효율적인 막 밀봉 작업에 달려 있습니다.

이 방법의 전반적인 목표는 정의된 막 조건 하에서 호흡 연쇄 복합체(SCs)의 통합적인 구조 및 기능 분석을 가능하게 하는 것입니다. 이러한 접근 방식은 SCs를 밀폐된 지질 이중층으로 복원함으로써 막 전위의 형성과 생리학적으로 유의미한 단백질-지질 상호작용을 지원하며, 이를 통해 계면활성제 기반 시스템의 주요 한계점을 해결합니다. 또한, 이 시스템은 지질 조성, 보조 인자 및 단백질 함량을 정밀하게 제어할 수 있어, 막 특성이 SC의 안정성과 활성에 미치는 영향을 체계적으로 테스트하는 데 매우 적합합니다. 계면활성제로 가용화된 제제나 in situ 접근 방식과 비교하여, 이 방법은 NADH 구동 산소 소비와 같은 기능 분석을 cryo-EM 기반의 구조 분석과 결합할 수 있다는 뚜렷한 장점이 있으며, 이를 통해 다른 시스템으로는 달성하기 어려운 구조-기능 상관관계를 규명할 수 있습니다.

프로토콜

식용 목적으로 도축된 동물로부터 얻은 상업용 심장 조직에서 돼지 심장 미토콘드리아 막을 분리하였습니다. 본 프로토콜을 위해 살아있는 동물을 특별히 사용하지 않았습니다. 해당 조직은 식용 목적으로 도축된 동물로부터 부산물로 얻은 것이므로, 이 재료의 사용은 동물 윤리 승인 대상에서 제외되는 것으로 결정되었습니다.

1. 돼지 심장 미토콘드리아의 세척된 막으로부터 미토콘드리아 슈퍼복합체 SC I+III2/SC I+III2+IV 정제

  1. 세척된 미토콘드리아 막 40 mg (4 mL)을 10 mg/mL씩 분주하여 해동한다(세척된 막은 이전에 보고된 방법24,25에 따라 준비한다).
  2. 막을 4 mL의 Buffer MX (30 mM HEPES, pH 7.7, 150 mM potassium acetate, 10% glycerol, 1 mM EDTA, 0.002% (w/v) phenylmethylsulfonyl fluoride, 0.1% (w/v) CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate), 1 mM potassium ferricyanide)에 희석한다. Buffer MX에 2% (w/v) digitonin 8 mL(8 mL에 digitonin 160 mg; 최종 비율 4:1, (mg digitonin: mg 총 막 단백질))를 첨가한다. 최종 부피는 16 mL이다.
  3. Dounce 균질기를 사용하여 기포가 생기지 않도록 주의하며 수동으로 균질화(50회 스트로크)한다. 4 °C에서 1시간 동안 배양(tumble)한다.
  4. 균질물을 16,000 × g, 4 °C에서 30분 동안 원심분리한다. 상층액을 수집한다.
  5. 100 kDa 컷오프 원심분리 필터 농축기를 사용하여 상층액을 3000 × g, 4 °C에서 1 mL로 농축한다. 원하는 부피에 도달할 때까지 10분 주기 단위로 농축하며, 주기 사이에 충분히 혼합한다(원심분리 주기 사이에 재현탁하지 않으면 필터 근처의 계면활성제 국소 농도가 증가하여 샘플이 응집되는 경향이 있다).
  6. 농축된 샘플을 250 µL씩 4개의 분주액으로 나눈다. 
  7. 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(컬럼 부피: 24 mL)을 크기 배제 크로마토그래피 버퍼(SEC 버퍼; 30 mM HEPES pH 7.8, 150 mM potassium acetate, 1 mM EDTA, 0.005% glycocide detergent) 48 mL(2컬럼 부피)로 평형화한다.
  8. 용출 부피 6 mL부터 시작하여 24 mL까지 1 mL씩 분획을 수집하도록 크로마토그래피 프로그램을 설정한다. 24 mL 크기 배제 크로마토그래피 레진에 250 µL 분주액(단계 1.6에서 준비)을 주입한다. 크기 배제 크로마토그래피 버퍼로 사전 평형화된 컬럼(단계 1.7에서 준비)을 사용한다. 다음 가동을 시작하기 전에 분획 수집기에서 분획을 수집한다.
  9. 단계 1.6에서 준비한 나머지 농축 분주액에 대해 단계 1.7 및 1.8을 반복한다.
  10. SEC 가동으로 얻은 각 분획 10 µL를 blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) 로딩 다이 5 µL와 혼합하여 3%–12% acrylamide gradient 젤에서 전기영동하고, NADH/Nitro tetrazolium blue chloride CI in-gel 활성 분석26 을 수행하여 분획의 CI 활성을 확인한다. 
    참고: 호흡 SC는 24 mL 가교 아가로스 젤 여과 매질에서 약 11.5 mL의 용출 부피에서 용출된다.
  11. CI in-gel 활성 분석에서 최대 고분자량(high MW) CI 활성을 보이는 분획들을 모은다. 샘플은 위의 단계 1.5에 설명된 방법으로 농축한다.
    참고: 글리코사이드 계면활성제 glyco-diosgenin GDN 내의 농축된 SC는 30% (v/v) glycerol과 함께 최종 농도 약 10 mg/mL로 Liquid N2에 보관할 수 있다. BCA 분석 결과, 세척된 미토콘드리아 복합체 40 mg에서 총 단백질 3.4 mg이 얻어졌다.

2. 지질 혼합물 준비

참고: 이전에 보고된 프로토콜27,28을 수정하여 작성되었습니다. 클로로폼은 독성과 휘발성이 있으며 발암 가능 물질입니다. 적절한 개인 보호 장구(PPE)를 착용하고 인증된 화학 흄 후드 내에서만 취급하십시오. 펜탄은 인화성이 매우 높습니다. 점화원 근처에 두지 마십시오. 적절한 개인 보호 장구(PPE)를 착용하고 인증된 화학 흄 후드 내에서만 취급하십시오. 유기 용매 폐기물은 기관의 환경 보건 및 안전(EH&S) 정책에 따라 승인된 할로겐화/비할로겐화 용매 폐기물 용기에 폐기하십시오.

  1. 흄 후드 내에서 POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 그리고 CL (cardiolipin: 1,3-bis(sn-3’-phosphatidyl)-sn-glycerol; 소 심장 조직 유래)의 25 mg/mL 스톡 용액을 각각 클로로포름으로 준비한다. 
  2. 클로로포름으로 10 mM CoQ10을 준비한다. 총 지질 혼합물 25 mg을 위해, 13 mL 유리 시험관에 스톡 용액으로부터 POPC 0.4 mL (10 mg), POPE 0.4 mL (10 mg), CL 0.2 mL (5 mg), 그리고 10 mM CoQ10 50 µL (최종 500 nmol CoQ10 (20 nmol CoQ10/mg lipid))를 첨가한다. POPC:POPE:CL의 최종 중량비는 2:2:1이다.
  3. 불활성 가스 흐름(아르곤 또는 질소) 하에서 혼합물을 건조시켜 클로로포름을 제거하며, 이때 시험관을 천천히 회전시켜 시험관 벽면을 따라 지질 혼합물이 얇은 층을 형성하도록 한다. 불활성 가스를 지속적으로 흘려주며 10분 동안 건조한다.
  4. 건조된 지질 층을 1 mL의 펜탄으로 다시 용해하고 단계 2.3을 반복하여 잔류 클로로포름의 제거를 촉진한다.
  5. 용매를 완전히 제거하기 위해 건조된 지질 시험관을 진공 데시케이터에 넣고 실온에서 하룻밤 동안 배양한다. 
  6. 지질 혼합물을 재수화하기 위해 Proteoliposome Buffer (PLB; 10 mM MOPS pH 7.4, 150 mM KCl) 5 mL를 첨가하고, 누출을 방지하기 위해 시험관을 단단히 밀봉한 뒤, 지질이 완전히 가용화될 때까지(시험관 표면에 건조된 지질이 더 이상 보이지 않을 때까지) 부드럽게 볼텍싱한다.
  7. 밀봉을 제거하고 시험관을 불활성 가스(아르곤 또는 질소)로 채운 뒤 다시 밀봉하고, 실온에서 1시간 동안 배양한다. 1시간 배양 후, 지질 혼합물을 300 µL씩 분주하여 −20 °C에서 보관한다. 
    참고: POPC:POPE:cardiolipin (2:2:1) 혼합물은 경험적 최적화와 PE 및 cardiolipin이 미토콘드리아 내막의 주요 구성 성분이라는 점을 근거로 선택되었으나, 본 프로토콜은 다른 지질 조성의 테스트를 위해 쉽게 조정될 수 있다.

3. 리포좀 내 미토콘드리아 SC의 재구성

  1. 액체 N 2  (단계 1.12)에 보관된 SC 분주액을 얼음 위에서 해동한다. 샘플을 SEC 버퍼에 재현탁하여 버퍼 교환을 수행함으로써 샘플에서 글리세롤을 제거한다. 4 °C, 3000 × g에서 100 kDa cut-off 원심분리 필터를 사용하여 샘플을 농축한다. 농축 회전 사이(~매 5분마다)에 샘플을 SEC 버퍼에 재현탁하여 버퍼 교환을 계속 수행한다.
  2. BCA 분석(bicinchoninic acid 단백질 분석 키트)을 사용하여 SC의 최종 농도를 확인한다.
  3. 단계 2.7에서 준비한 지질 혼합물 분주액 300 µL를 해동하고, 100 nm 폴리카보네이트 막이 장착된 압출기로 실온에서 6회 사이클 동안 압출한다(1회 사이클은 지질 혼합물을 왼쪽 주사기에서 오른쪽으로, 다시 왼쪽으로 통과시키는 것으로 구성됨). 압출 사이클이 완료되면 시작 측의 반대편 주사기에서 생성된 100 nm 리포좀을 수집한다. 또는 초음파 처리를 통해 리포좀을 생성할 수도 있다. 
  4. 별도의 튜브에 압출된 지질 혼합물 250 µL를 넣고 20% (w/v) 계면활성제 9 µL(최종 농도 0.6% w/v)를 첨가한다.
    참고: 다양한 계면활성제를 시도할 수 있다. 본 실험에서는 음이온성 담즙염 계면활성제인 Sodium cholate가 가장 효과적이었다.
  5. 도립 혼합(inversion)하여 섞고 4 °C에서 30분 동안 배양한다. 
  6. 혼합물에 미토콘드리아 SC 120 µg(또는 그 이상)과 10 mM cytochrome c 3 µL(최종 농도 100 µM)를 첨가한다. PLB를 사용하여 최종 부피를 300 µL로 맞춘다. 최종 지질:단백질 비율은 약 10:1 (w:w)이다. 추가 대조군으로서, 미토콘드리아 SC와 cytochrome c 대신 SEC 버퍼(30 mM HEPES, pH 7.8, 150 mM potassium acetate, 1 mM EDTA, 0.005% glycoside 계면활성제)를 지질-계면활성제 혼합물에 첨가하여 빈 리포좀을 병행 생성한다. 
  7. 도립 혼합하여 섞고 4 °C에서 30분 동안 배양한다. 
  8. G-25 수지가 충전된 프리팩 탈염 스핀 컬럼을 PLB 버퍼로 중력 흐름 방식을 통해 4회 세척한다. 그 후, 컬럼을 1,000 × g에서 2분 동안 원심 세척한다.
  9. 세척된 프리팩 G-25 수지 탈염 스핀 컬럼에 프로테오리포좀 샘플을 넣고 4 °C, 1,000 × g에서 2분 동안 원심분리하여 계면활성제를 제거한다. 용출액을 수집한다.
    참고: 압출법으로 준비한 리포좀이 초음파 처리로 생성한 리포좀보다 더 균일한 크기 분포를 보였다. 샘플의 계면활성제 오염을 방지하기 위해 프리팩 탈염 스핀 컬럼을 제조사 권장 시간보다 더 오래 원심분리하지 마시오. 프로테오리포좀은 4 °C에 보관하였으며, 활성 손실을 최소화하고 슈퍼컴플렉스의 무결성을 유지하기 위해 일반적으로 36시간 이내에 사용하였다.

4. 지질 부유 분석(Lipid flotation assay)29

  1. PLB에 27% 및 7% (w/v) sucrose 용액을 조제한다. 3.5 mL 원심분리관에 27% sucrose 1.5 mL와 7% sucrose 0.9 mL를 층별로 쌓아 단계 구배(step gradient)를 형성한다.
  2. SC가 포함된 proteoliposomes(단계 3.9에서 준비) 300 µL를 sucrose 구배 위에 조심스럽게 층을 이뤄 올린다. 고정각 로터(fixed-angle rotor)를 사용하여 4 °C에서 100,000 × g로 2시간 동안 원심분리한다.
  3. 위에서부터 아래 방향으로 300 µL씩 9개 분획(또는 270 µL씩 10개 분획)을 혼합되지 않도록 주의하여 조심스럽게 수집한다. 펠릿이 있는 경우 마지막 분획에 재현탁하여 분획 9 또는 10으로 수집한다. 재구성되지 않은 SC는 분획 9 또는 10에 축적되어야 한다.
    참고: 부유 분석(flotation assay)은 재구성된 proteoliposomes를 빈 리포좀 및 재구성되지 않은 단백질 복합체로부터 분리하는 데 도움이 된다. 이는 재구성 과정을 최적화하는 데 사용된다.

5. CI 분광학적 페리시안화물 활성 측정 및 CI 인겔 활성 측정

  1. 필요한 양의 ferricyanide 반응 버퍼(FRB; 20 mM Tris HCl, pH 7.4, 50 mM NaCl, 0.1% w/v 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS), 1 mM potassium ferricyanide)를 준비한다.
  2. 1 mL 큐벳에 반응 버퍼 990 µL를 분주한다. 각 구배 분획의 시료 5 µL를 큐벳에 넣은 후, 20 mM NADH(최종 농도 100 µM) 5 µL를 반응액에 추가한다. 큐벳을 투명 필름으로 밀봉하고 뒤집어서 섞어준다.
  3. 분광광도계에서 25 °C의 온도로 340 nm에서의 흡광도 감소율을 모니터링한다. 340 nm에서의 흡광도 감소는 NADH 산화를 나타낸다. 모든 분획에 대해 3회 반복 실시한다. 시료 대신 PLB 5 µL를 사용하여 공시료(blank) 값을 기록한다.
  4. 공시료 값을 뺀 후 NADH 산화율을 계산하고, 각 분획의 총 활성도를 그래프로 그린다.
    참고: 또는, 이 실험을 96-well 플레이트에서 수행할 수도 있다.
  5. 총 활성이 최대인 분획들을 모은다(튜브 바닥에 활성이 있는 분획은 재구성되지 않은 단백질에 해당하므로 제외한다). sucrose를 희석하기 위해 PLB를 사용하여 모은 분획의 총 부피를 20 mL로 맞춘다.
  6. 고정각 로터(fixed-angle rotor)를 사용하여 150,000 × g, 4 °C에서 1시간 동안 시료를 원심분리한다. 상층액은 버리고 펠릿을 200 µL의 PLB에 재현탁한다.
  7. 위 단계에서 재현탁한 펠릿 25 µL를 PLB에 포함된 2% w/v digitonin 25 µL와 섞고 4 °C에서 1시간 동안 배양(tumble)한다.
  8. 추출되지 않은 단백질을 16,000 × g에서 20분 동안 원심분리한다. 상층액을 수집한다.
  9. 상층액 30 µL에 BN-PAGE 로딩 다이 10 µL를 추가하고 3%–12% 구배 BN-PAGE에 로딩한다. CI 및 CIV in-gel 활성 분석26을 수행하기 위해 젤 두 개를 실행한다.
  10. 다크 BN-PAGE 버퍼(25 mM Tris, 0.192 g Glycine, 200 mg Coomassie blue)를 사용하여 150 V에서 30분 동안 젤을 전기영동한다. 다크 블루 버퍼를 라이트 블루 버퍼(25 mM Tris, pH 8.3, 0.192 g Glycine, 20 mg Coomassie blue)로 교체하고 200 V에서 2시간 동안 추가로 전기영동한다.
  11. 전기영동 후, 젤을 적절한 용기에 옮겨 CI 및 CIV in-gel 활성 분석26을 수행한다.
    참고: 리포좀에 재구성된 복합체의 구조 및 기능 연구를 위해서는 5.6단계에서 남은 재현탁 프로테오리포좀을 사용한다. 재구성이 완전히 최적화되면, 4단계와 5단계를 생략하고 3단계에서 얻은 재구성 프로테오리포좀을 직접 사용할 수 있다.

6. 재구성된 프로테오리포좀의 막 무결성을 측정하기 위한 ACMA 형광 소광 분석29

  1. 필요한 양의 ACMA (9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine) 반응 완충액 (10 mM MOPS pH 7.4, 15 mM KCl, 4 µM ACMA, 0.5 mg/mL bovine serum albumin (BSA), 2 mM 2-Mercaptoethanol)을 준비합니다. 
  2. 1 mL 큐벳에 반응 완충액 930 µL를 분주합니다. 여기에 재구성된 프로테오리포좀 50 µL를 첨가하고, 큐벳을 밀봉한 뒤 뒤집어서 섞어줍니다. 빛이 차단된 곳에서 8분 동안 배양합니다.
  3. 분광광도계의 매개변수를 다음과 같이 설정합니다: 들뜸 파장 410 nm, 방출 파장 490 nm. 
  4. 배양 후, 큐벳을 다시 뒤집어 섞어준 다음 실온에서 분광광도계를 사용하여 8분 동안 형광을 측정합니다.
  5. 큐벳에 20 µM valinomycin 4 µL (최종 농도 80 nM)를 첨가하고, 뒤집어서 섞어준 뒤 8분 동안 측정합니다.
  6. 큐벳에 1 mM CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone) 6 µL (최종 농도 6 µM)를 첨가하고, 뒤집어서 섞어준 뒤 8분 동안 측정합니다.
  7. 빈 소포 대조군을 설정하려면, 단계 6.2–6.6을 반복하되 재구성된 프로테오리포좀 대신 "빈 리포좀"을 사용합니다. 빈 리포좀은 재구성된 프로테오리포좀과 동일한 단계로 생성하지만, 재구성 과정(단계 3.6)에서 SCs를 첨가하는 대신 SEC 완충액을 사용합니다.
  8. 재구성된 프로테오리포좀과 빈 리포좀 모두에 대해 측정을 3회 반복하고, 시간에 따른 상대적 형광 값을 그래프로 그립니다.
    참고: 재구성된 프로테오리포좀 또는 빈 리포좀의 데이터는 (Fi − Fmin)/(Fmax−Fmin)으로 스케일링하며, 여기서 Fmax는 해당 샘플의 초기 기선 형광 값이고 Fmin은 CCCP 첨가 후 해당 샘플의 최저 기선 값입니다.
    경고: CCCP는 독성 미토콘드리아 짝풀림제이므로 반드시 흄 후드 내에서 장갑을 착용하고 취급해야 합니다.

7. 재구성된 SC의 기능을 평가하기 위한 산소 소비량의 호흡 측정법 측정30.

참고: 산소 소비율은 Clark-type 산소 전극 시스템을 사용하여 측정합니다. 재구성된 SC의 기능 분석은 탈염 컬럼(단계 3.9)에서 얻은 용출액을 사용하여 직접 수행합니다.

  1. 제조사의 지침에 따라 산소 전극 시스템 장치를 설치하고 장치 제어 소프트웨어를 엽니다. 측정 챔버에 초순수 2 mL를 추가합니다.
  2. 교반 속도를 높여도 산소 농도 그래프가 변하지 않을 때까지 교반 속도를 설정합니다(10에서 시작하여 10씩 증가시킵니다). MQ water를 제거하고 산소포화수(병에 담긴 MQ water를 격렬하게 흔든 것)를 추가합니다.
  3. Calibrate > Liquid-phase calibration > Air-saturated water를 클릭하고 보정값이 안정화될 때까지(속도 0 nmol per min) 기다립니다. 소형 스패튤라를 사용하여 반응 용기에 디티오나이트나트륨(sodium dithionite) 결정 몇 개(4–6개)를 추가하여 챔버 내 산소 농도를 0으로 설정합니다.
  4. 신호가 평탄해질 때까지 기다린 후 계속 진행합니다. 보정값을 저장하고 반응 챔버를 70% 에탄올 5 × 1 mL, 0.1 mM EDTA 5 × 1 mL, MQ water 5 × 1 mL, 그리고 oxygraph 반응 버퍼(ORB; 150 mM KCl, 50 mM MOPS pH 7.4, 5 mM MgCl2, 5 mM KH2PO4, 0.02 mM EGTA, 0.5 mg/mL BSA) 5 × 1 mL로 세척합니다.
  5. ORB 2 mL를 추가하고 소프트웨어의 “start read” 버튼을 클릭한 후 그래프가 안정화될 때까지 기다립니다. 반응 챔버에 프로테오리포좀(시료)을 추가하는 동안, 소프트웨어 그래프에 시료 추가 지점을 표시합니다.
    참고: 프로테오리포좀 시료의 단백질 농도는 리포좀에 추가된 총 단백질 양으로 추정합니다. 단백질:지질 비율 1:12 및 산소 전극 시스템 챔버(2 mL) 내 최종 단백질 농도 50 µg/mL가 가장 적절했습니다. 정확한 프로테오리포좀 수율은 측정하지 않았습니다.
  6. 산소 전극 시스템의 읽기 값이 안정화되면 반응 챔버에 NADH를 추가하고, 동시에 소프트웨어 그래프에 NADH 추가 지점을 표시합니다. 5분 동안 계속 측정합니다.
  7. CCCP를 추가하고 소프트웨어에 추가 지점을 표시한 뒤 5분 동안 계속 측정합니다.
  8. 억제제(예: CI 억제제 (Piericidin A) 또는 CIII2 억제제 (Myxothiazol) 또는 CIV 억제제 (NaN3))를 추가하고 소프트웨어 그래프에 표시한 뒤 2분 동안 측정하고 측정을 중단합니다. 
  9. 그래프를 저장하고, 다음 측정을 수행하기 전에 반응 챔버를 70% 에탄올 5 × 1 mL, 0.1 mM EDTA 5 × 1 mL, MQ water 7 × 1 mL, 그리고 ORB 5 × 1 mL로 세척합니다.
  10. 백그라운드 속도에 대해 데이터를 보정하려면, NADH 추가 전 측정값의 기울기인 백그라운드 속도를 계산하고, 이 속도를 측정 시간 경과에 따라 선형적으로 외삽하여 각 시간 지점의 예상 백그라운드 [O2]를 계산합니다. 그런 다음 각 시간 지점에서 측정된 [O2] 값에서 외삽된 백그라운드 [O2] 를 뺍니다.
  11. 각 시약 추가 후의 백그라운드 보정 [O2] 농도 측정값의 기울기로 산소 소비율(OCR)을 계산합니다.
  12. NADH 추가 후의 OCR에 대한 상대적 속도를 계산하려면, 각 개별 트레이스에 대해 측정된 각 OCR(예: 각각 NADH, CCCP, 억제제 추가 후의 OCR)을 NADH 추가 후 측정된 OCR로 나눕니다.     
    참고: 주의: 디티오나이트나트륨은 강력한 환원제로 산화제나 수분과 격렬하게 반응할 수 있습니다. 장갑을 착용하고 취급하십시오. 억제제가 포함된 폐기물은 기관 지침에 따라 유해 화학 폐기물로 처리하십시오.

8. 동적 광산란법을 이용한 재구성 리포좀의 크기 측정

  1. 동적 광산란(DLS) 장비의 전원을 켜고 레이저가 안정화될 때까지 약 30분간 대기합니다.
  2. 기기 획득 소프트웨어를 실행하고 이전에 열려 있던 모든 파일을 닫으십시오.
  3. 프로테오리포좀을 여과하십시오(0.2 μm) 모든 입자성 물질을 제거합니다.
  4. 70 옮기기 µ프로테오리포좀 L을 지문이나 얼룩이 남지 않도록 주의하며 깨끗한 큐벳에 넣습니다.
  5. 큐벳을 기기에 장착하고 덮개를 단단히 닫으십시오.
  6. 새 파일을 생성하고 수동 측정(Manual Measurement)을 선택하십시오. > 크기
  7. 온도를 25로 설정하십시오. °C로 설정하고 감쇠 지수(attenuation index)를 자동(auto)으로 유지하십시오.
  8. 분산제 특성(점도 및 굴절률; 예: 물/완충액의 경우 RI = 1.330)을 정의하십시오.
  9. 획득 파라미터를 설정하십시오(자동 지속 시간, 약 3회 측정, 일반 목적 처리).
  10. 측정을 시작하고 크기, 다분산 지수(PDI) 및 계수율(목표치 ~100–500 kcps)을 모니터링하십시오.
  11. 결과 분석: 크기 분포(강도/부피) 및 PDI(분산 지수) 확인<(0.3 이내면 허용 가능), 그리고 자기상관 품질(매끄러운 감쇄, 안정적인 기선)을 확인한 후 데이터를 저장하십시오.

9. 저온 전자 현미경 그리드 제작 및 스크리닝

  1. 단계 5.11(단계 4와 5를 건너뛴 경우 단계 3.9)의 프로테오리포좀 샘플을 사용하여 EM 그리드를 준비한다. 필요한 경우 단계 5.6을 반복하고 더 적은 부피의 PLB로 재부유시켜 프로테오리포좀을 농축한다.
  2. 글로우 방전 세척 시스템을 사용하여 공기 중에서 20 mA, 90초 동안 홀리 카본 코팅된 300-mesh 구리 그리드를 글로우 방전 처리한다.
  3. 자동 플런지 급속 동결 시스템을 습도 95%, 온도 15 °C에서 플런지 동결이 가능하도록 다음과 같은 파라미터로 설정한다: blot time 10 s, blot force −8, wait time 10 s, drain time 0.
  4. 글로우 방전 처리된 그리드가 달린 핀셋을 플런지 급속 동결 시스템에 부착한다.
  5. 자동 플런저 상의 글로우 방전 처리된 그리드에 프로테오리포좀 샘플 4.0 µL를 첨가한다.
  6. 그리드를 10초 동안 인큐베이션한 후, 10초 동안 블로팅하고 액체 에탄에 플런지 급속 동결시킨다. 그리드를 액체 N2 챔버 내의 그리드 박스로 조심스럽게 옮긴 후, 나중에 액체 N2 보관 듀어(dewar)로 옮긴다.
  7. 동결된 그리드를 로딩하고 극저온 샘플 로더가 장착된 투과 전자 현미경으로 스크리닝한다. 본 실험에서는 직접 전자 검출기가 장착된 투과 전자 현미경을 사용하였다.
  8. 제조사의 지침에 따라 현미경을 설정하고 재구성된 프로테오리포좀에 대해 그리드를 스크리닝한다. 이미지를 저장한다.
    참고: 주의: 액체 에탄은 인화성이 매우 높고 극저온 물질이므로, 화재 및 저온 화상을 방지하기 위해 적절한 개인 보호구(PPE)를 착용하고 점화원으로부터 떨어진 곳에서 취급해야 한다. 액체 질소는 극저온 물질로 심한 저온 화상을 일으키거나 산소 결핍을 유발할 수 있다. 적절한 극저온 PPE를 착용하고 환기가 잘 되는 곳에서만 사용한다.

결과

본 프로토콜을 사용하여 돼지 심장 미토콘드리아에서 분리한 미토콘드리아 슈퍼컴플렉스(SC)의 최적 재구성 조건을 확인하였습니다(그림 1A,B). 자당 단계 구배(sucrose step-gradient) 프로토콜은 재구성된 프로테오리포좀을 빈 소포 및 통합되지 않은 단백질로부터 효과적으로 분리하여, 신속한 테스트와 조건 최적화를 가능하게 합니다. 그림 2의 대표적인 결과는 원심분리 전후에 시료가 적용된 구배를 보여줍니다. 또한, 호흡 SC를 리포좀으로 재구성하는 데 사용되는 계면활성제를 최적화하였습니다. 음이온성 담즙산염 계면활성제, CHAPS, digitonin, glycoside 계면활성제의 네 가지 서로 다른 계면활성제를 사용하여 SC를 각각 재구성하였습니다. 테스트한 각 계면활성제에 대해 분획 내 총 CI 활성을 NADH-ferricyanide 산화환원 분석법으로 측정하였습니다(그림 3A–D). 성공적인 재구성의 경우, 두 자당 농도(27% w/v sucrose 및 7% w/v sucrose)의 계면 분획에서 CI의 최대 활성이 관찰되었습니다. 특히, 음이온성 담즙산염 계면활성제와 CHAPS의 경우 분획 #10에서 최소 활성이 검출된 반면, digitonin과 glycoside 계면활성제 모두 분획 #10에서 상당한 활성을 보여 digitonin과 glycoside 계면활성제는 슈퍼컴플렉스를 리포좀으로 효과적으로 재구성하지 못한다는 것을 나타냅니다. 이후 모든 재구성 과정에는 음이온성 담즙산염 계면활성제가 사용되었습니다.

digitonin으로 추출한 POPC:POPE:CL (2:2:1) 프로테오리포좀의 blue-native polyacrylamide electrophoresis 젤에서 수행한 CI 및 CIV in-gel 활성 분석은 재구성 후의 SC 및 개별 ETC 복합체의 상대적 양을 보여준다(그림 4). 결과는 digitonin을 이용한 재추출과 BN-PAGE 이후에도 프로테오리포좀 내에서 CI와 CIII2 사이의 상호작용이 상당 부분 유지되었음을 나타낸다. 일부 CIV 활성이 supercomplex 밴드에서 나타나지만, CIV 단독 상태와 일치하는 낮은 분자량에서도 강한 신호가 관찰되어 해리가 일어났음을 보여준다. 재구성된 리포좀의 막 누출도는 ACMA 형광 소광 분석을 통해 측정되었으며, 프로테오리포좀이 양성자에 대해 유의미하게 누출되지 않음을 나타냈다(그림 5A,B). 재구성된 리포좀의 크기는 DLS를 사용하여 추정하였으며, 재구성 전 압출 공정을 통해 빈 소포의 최종 프로테오리포좀 크기 분포는 직경 82.9 ± 0.8 nm, 재구성된 supercomplex 프로테오리포좀 RSPs는 110.6 ± 0.4 nm임을 보여주었다(그림 6). 프로테오리포좀의 산소 소비량을 통해 SC 기능을 평가하였으며, 억제제에 민감한 명확한 NADH 구동 산소 소비가 확인되었다(그림 7A). NADH 첨가 후의 OCR 대비 상대적인 OCR을 그래프로 나타내면 RSPs 내의 커플링 정도를 직접적으로 알 수 있는데, 즉 CCCP 첨가 후 OCR은 NADH 단독 첨가 시보다 약 1.5배 증가하였다(그림 7B). 스크리닝된 Cryo-EM 그리드를 통해 프로테오리포좀 막 내의 SC를 시각화함으로써 성공적인 재구성을 확인하였다(그림 8A–I).

figure-results-1
그림 1: 돼지 심장 미토콘드리아로부터 계면활성제로 가용화된 초복합체의 분리 및 특성 분석. (A) digitonin으로 추출한 돼지 미토콘드리아 막 복합체의 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 정제 대표 크로마토그램. (B)  CI 인겔 활성 염색(in-gel activity staining)으로 시각화한 A의 분획들에 대한 Blue-native PAGE (BN-PAGE). 여기에서 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.

figure-results-2
그림 2: 프로테오리포좀을 이용한 수크로스 단계 구배. 초원심분리기에서 100,000 × g로 2시간 동안 원심분리하기 전(왼쪽)과 후(오른쪽)의 모습. 구배에 로딩된 프로테오리포좀 샘플은 빈 소포, 프로테오리포좀, 그리고 바닥의 응집된 단백질로 분리된다. 이후 이 구배는 기술된 바와 같이 추가 특성 분석을 위해 분획된다. 각 분획의 대략적인 범위가 표시되고 라벨링되어 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: 다양한 세제에서의 재구성 효율을 평가하기 위한 부유 분석. (A) 음이온성 담즙산 세제, (B) 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS) (0.6% (w/v)), (C) digitonin (0.6% w/v), (D) glycoside detergent (GDN) (0.6% (w/v))로 재구성한 후 sucrose 단계 구배의 분획들에 대한 CI NADH-ferricyanide 활성. 분획 #10은 마지막 분획의 펠렛을 재현탁하여 얻은 것이다. 분획 #10에서의 활성은 단백질이 재구성되지 않았음을 나타낸다. n = 3이며 오차 막대는 SD = 표준 편차를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 4: 3%–12% BN-PAGE로 분석한 digitonin 추출 proteoliposomes의 겔 내 활성 분석(in-gel activity assay). CI (왼쪽) 및 CIV (오른쪽) 겔 내 활성 분석. R = respirasome (SC I+III2+IV), SC1,3 (SC I+III2), IGA CI = (CI 겔 내 활성 분석); IGA = 겔 내 활성 분석, CIV = (CIV 겔 내 활성 분석). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-5
그림 5: 재구성된 프로테오리포좀의 양성자 누출을 감지하기 위한 ACMA 형광 소광 분석. pH 민감성 염료(ACMA)를 사용하여, Valinomycin과 CCCP를 순차적으로 첨가한 후 재구성된 프로테오리포좀(청록색)의 내부 pH를 빈 리포좀(주황색)과 비교하였다. 비교를 위해 서로 다른 프로테오리포좀 표본에서 얻은 대표적인 ACMA 형광 추적 곡선을 나타내었다. (A) 막이 손상된 재구성 리포좀(누출성). (B) 막이 온전한 재구성 리포좀. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 6: 공립소(empty liposome) 및 재구성된 SC 프로테오리포솜의 동적 광산란 측정 결과.압출된 공립소(주황색)와 SC가 재구성된 프로테오리포솜(청록색)의 평균 부피 가중 크기 분포가 나타나 있다. 측정은 세 번의 기술적 반복으로 수행되었다. 공립소의 평균 수력학적 직경은 82.9 ± 0.8 nm이며, RSPs의 평균 수력학적 직경은 110.6 ± 0.4 nm이다. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-7
그림 7: 리포좀 내에 재구성된 초등복합체(SCs)의 커플링 평가를 위한 산소 소비 분석. 압출법으로 생성된 리포좀에 재구성한 후, 전자전달계(ETC) 복합체의 호흡 활성과 커플링을 평가하기 위해 산소 소비량을 측정하였다. (A) 배경값을 보정한 대표적인 산소 전극 추적 곡선으로, CI 구동 호흡을 개시하기 위한 NADH, 양성자 기울기를 소산시켜 최대 비결합 산소 소비율(OCR)을 측정하기 위한 CCCP, CI 억제제인 piericidin A, CIII2 억제제인 Antimycin A, 또는 CIV 억제제인 NaN3 (Azide)를 순차적으로 첨가한 후의 산소 농도 변화를 보여준다. (B)지정된 조건 하에서의 OCR 정량 결과이며, 단계 7.10에 따라 보정되었다. 각 추적 곡선에 대해 NADH 첨가 후의 OCR에 대한 상대적 데이터 포인트와 평균 ± 표준편차(SD, 오차 막대)를 함께 표시하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 8: 프로테오리포좀 막에 재구성된 SC의 Cryo-EM 시각화. (A–C) 프로테오리포좀 막과 결합된 재구성된 SC를 보여주는 스크리닝 그리드의 대표 전자현미경 사진. 재구성된 SC는 노란색 화살표로 표시됨. 스케일 바 = 50 nm. (D–I) 프로테오리포좀 막에서 더 높은 배율로 관찰한 대표적인 SC 입자. 스케일 바 = 10 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

미토콘드리아 호흡 SC를 정의된 프로테오리포좀으로 재구성하여 그 구조와 기능을 제어하며 조사할 수 있는 간단하고 재현 가능한 방법을 제시합니다. 본 프로토콜의 여러 단계는 성공적인 재구성을 위해 매우 중요합니다. 실험 결과, 압출(extrusion) 방식으로 생성된 리포좀이 초음파 처리(sonication) 방식으로 생성된 리포좀보다 더 균일한 크기 분포(동적 광산란법으로 측정)를 보였습니다. 막 밀봉과 지질 이중층으로의 SC의 적절한 통합을 촉진하기 위해서는 사전 충전된 탈염 스핀 컬럼(pre-packed desalting spin column)을 사용하여 계면활성제를 효율적으로 제거하는 것이 필수적이며, 불완전한 제거는 누출이 있거나 불안정한 프로테오리포좀을 초래할 수 있습니다. 지질 조성, 단백질-지질 비율 및 계면활성제 선택의 최적화 또한 동일하게 중요한데, 이러한 매개변수들이 재구성 효율과 SC 안정성에 강력한 영향을 미치기 때문입니다. 자당 농도 구배 부상 분석(sucrose gradient flotation assay)은 초기 최적화에 유용하지만, 조건이 설정된 후에는 시료 손실과 구배 분획 중의 파손을 피하기 위해 사전 충전된 탈염 스핀 컬럼 단계 직후의 프로테오리포좀을 하위 구조 및 기능 분석에 직접 사용하는 것이 바람직합니다. 활성을 관찰하는 데 필요한 분획의 부피는 조제물마다 다릅니다. 서로 다른 조제물에 대해 반응 혼합물에 추가할 부피를 조정하십시오. 프로테오리포좀 막 내에서 호흡 SC의 방향은 호흡 측정치에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 본 재구성 절차는 단일 토폴로지를 강제하도록 최적화되지 않았으므로, 혼합된 방향의 집단이 예상되지만, CI ferricyanide 접근성 분석 결과 CI 주변 팔(peripheral arms)이 외부를 향하는 경향이 강한 것으로 나타났습니다.

재구성된 슈퍼컴플렉스의 배향을 실험적으로 평가하였으며, 계면활성제 존재 및 부재 하에서 CI ferricyanide 활성을 측정하였다. 온전한 RSP에서는 외부에서 첨가된 NADH가 주변부 암(peripheral arm)이 외부 매질로 노출된 CI 분자에만 접근할 수 있는 반면, 계면활성제를 통한 투과화는 모든 컴플렉스에 대한 NADH의 접근을 가능하게 한다. 따라서 이 분석법은 프로테오리포좀 토폴로지의 완전한 구조적 결정보다는 외부 매질을 향해 있어 기능적으로 접근 가능한 CI 주변부 암의 분율을 추정한다. 이러한 조건 하에서 측정된 활성을 비교한 결과, respirasome(SC)의 83.1% ± 0.04%가 CI 주변부 암이 바깥쪽을 향하도록 배향되어 있었으며, 이는 재구성 과정 중 상당한 배향 편향이 있음을 나타낸다.

재현성과 안정성을 높이기 위해 몇 가지 수정 사항과 문제 해결 전략을 적용할 수 있다. sucrose 기울기 원심분리로 추출된 digitonin 추출 통합 분획을 대상으로 CI 및 CIV의 겔 내 활성 분석(In-gel activity assay)을 수행하면 SC 밴드가 나타나는데, 이는 재구성 과정 중에 SC가 완전히 해리되지 않음을 나타낸다. 그러나 SC 밴드는 CIV 활성 겔보다 CI 활성 겔에서 더 강하게 나타나며, 이는 재구성 후 CIV가 CI 및 CIII2로부터 부분적으로 해리될 수 있음을 시사한다(그림 4). 지질 조성을 조정함으로써 SC의 안정성을 높일 수 있다. CIV의 부분적 해리는 계면활성제의 선택이나 재구성 중 급격한 계면활성제 제거로 인해 발생할 수도 있으며, 이는 슈퍼콤플렉스 내의 약한 단백질-단백질 상호작용을 불안정하게 만들 수 있다. 계면활성제 교환 조건을 추가적으로 최적화하면 CIV 유지력을 향상시킬 수 있다. 또한, 기계적 스트레스를 최소화하고 불필요한 정제 단계를 피하며 샘플을 주의 깊게 다루면 프로테오리포좀의 무결성을 유지하는 데 도움이 된다. 기능 분석의 경우, 막의 누출은 막관통 양성자 기울기와의 결합을 방해하므로 프로테오리포좀이 완전히 밀봉되었는지 확인하는 것이 매우 중요하다. cryo-EM 그리드 제작 시에는 연속 탄소 코팅 그리드를 사용하는 것이 중요한데, 이는 그리드 홀 내의 입자 분포를 개선하는 것으로 나타났기 때문이다19.

이러한 장점에도 불구하고, 이 접근 방식에는 한계가 있습니다. 프로테오리포좀은 천연 미토콘드리아 내막의 조성적 및 동적 복잡성을 완전히 재현하지 못하며, 특히 CIV를 포함한 SC 구성 성분의 부분적 해리가 여전히 과제로 남아 있습니다. 또한, 불완전한 결합이나 재구성 효율의 불균일성으로 인해 기능적 측정 결과에 영향을 받을 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 계면활성제로 가용화된 시스템과 비교하여 이 방법은 지질-단백질 상호작용을 보존하고 천연과 유사한 막 환경을 지원하며, in situ 접근 방식보다 더 뛰어난 실험적 제어 능력을 제공합니다. 따라서 이 방법은 지질 조성과 막 특성이 SC의 안정성과 활성을 어떻게 조절하는지 체계적으로 조사할 수 있는 가치 있는 플랫폼을 제공합니다.

호흡 초복합체(respiratory supercomplex) 조직의 붕괴가 광범위한 미토콘드리아 및 대사 질환과 관련이 있기 때문에 이러한 관계를 이해하는 것이 특히 중요합니다31,32,33,34,35,36,37,38,39,40. Leigh 증후군41,42,43,44,45,46,47, Barth 증후군48,49,50,51,52,53,54, Sengers 증후군48과 같은 질환에서 관찰되는 ETC 복합체 조립, 카디오리핀(cardiolipin) 합성 또는 지질 리모델링의 결함은 초복합체를 불안정하게 만들고, 전자 전달을 저해하며, ATP 생산을 감소시키고, 활성 산소종(ROS) 생성을 증가시킬 수 있습니다. 이러한 생체 에너지학적 결함은 심장, 골격근, 뇌와 같이 에너지 요구량이 높은 조직에 불균형적으로 영향을 미쳐 심근병증, 운동 불내성, 신경 퇴행을 포함한 표현형을 유발합니다36,37,38. 반대로, 최근의 증거들은 초복합체 형성이 ETC 복합체를 안정화하고 병리적인 ROS 생성을 제한함으로써 스트레스 상황에서 보완 및 보호 역할을 할 수 있음을 시사합니다55,56. 본 논문에서 설명하는 재구성된 프로테오리포좀(proteoliposome) 플랫폼은 질환 관련 지질 리모델링, 돌연변이 또는 약물적 개입이 초복합체의 조립과 기능에 어떻게 영향을 미치는지 직접 테스트할 수 있는 제어된 시스템을 제공하며, 이를 통해 미토콘드리아 기능 장애에 대한 기전 연구를 가능하게 하고 향후 치료 전략 수립에 정보를 제공합니다.

낮은 산소 소비율은 슈퍼복합체(supercomplex)의 불충분한 통합, CIV의 부분적 해리, 잔류 세제, CoQ10 또는 cytochrome c의 부족, NADH의 분해, 또는 oxygraph 챔버 내의 낮은 단백질 농도로 인해 발생할 수 있습니다. 부상 분석(flotation assay) 또는 BN-PAGE를 통해 재구성을 확인하고, ACMA quenching으로 막 무결성을 검증하며, 신선한 NADH를 준비하고, 단백질 대 지질 비율, 보조인자 농도, 세제 제거 및 시료 농도를 최적화하십시오. 누출이 있는 프로테오리포좀(proteoliposomes)은 불완전한 세제 제거, 과도한 세제 농도, 거친 취급, 반복적인 동결-해동 주기 또는 지질 손상으로 인해 발생할 수 있습니다. ACMA 분석에서 양성자 누출이 관찰되면, 새로 평형을 맞춘 탈염 컬럼을 사용하여 세제 제거를 반복하고, 컬럼을 과하게 원심분리하지 않으며, 리포좀을 새로 준비하고, 기계적 스트레스를 최소화하며, 재구성 직후에 프로테오리포좀을 사용하십시오. 농축 단계 중의 응집은 농축기 막에서의 높은 국소 단백질 또는 세제 농도로 인해 발생할 수 있습니다. 짧은 (10 min) 원심분리 주기로 시료를 농축하고, 회전 사이에 시료를 부드럽게 재현탁하며, 과도한 농축을 피하고, 시료를 4 °C로 유지하며, 후속 단계 사용 전 저속 원심분리를 통해 가시적인 응집물을 제거하십시오. 불일치한 부상 거동은 가변적인 리포좀 크기, 불완전한 세제 제거, 응집, 잘못된 수크로스 층 형성, 또는 시료 로딩이나 분획 수집 중의 구배 파괴를 반영할 수 있습니다. 신선한 수크로스 용액을 준비하고, 계면이 섞이지 않도록 구배를 천천히 쌓으며, 균일하게 압출된 리포좀을 사용하고, 원심분리 조건을 일정하게 유지하며, 분획을 위에서 아래로 부드럽게 수집하십시오. cryo-EM 입자 분포가 좋지 않은 것은 낮은 프로테오리포좀 농도, 응집, 탄소로의 우선적 흡착, 불충분한 그리드 젖음, 두꺼운 얼음 또는 과도한 블로팅(blotting)으로 인해 발생할 수 있습니다. 프로테오리포좀 농도를 최적화하고, 그리드 준비 전에 응집물을 제거하며, glow-discharge 조건을 조정하고, 블롯 시간과 블롯 힘을 테스트하며, 다양한 그리드 유형이나 탄소 지지체를 스크리닝하고, 가능한 한 새로 준비한 시료를 사용하십시오.

공개 사항

저자들은 이해관계의 충돌이 없음을 선언합니다.

감사의 글

그리드 스크리닝은 UC Davis BioEM Core 시설에서 수행되었습니다. 스크리닝을 도와주신 Fei Guo 박사님께 감사드립니다. 본 연구는 NIH의 NIGMS 지원금 R35GM137929 (JAL)에 의해 수행되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)Avanti Research860320
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (POPE)Avanti Research850757
1,3-bis(sn-3’-phosphatidyl)-sn-glycerol (cardiolipin, 소 심장 조직 유래)Avanti Research840012
2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid --- HEPESSigma-AldrichH23830
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS)Sigma-AldrichM12545
3,3′-Diaminobenzidine ---- DABBSigma-AldrichD4293
Carbonyl Cyanide m-Chlorophenylhydrazone ---- CCCPSigma-AldrichC2759
CHAPSSigma-Aldrich220201
클로로포름 (Chloroform)Sigma-Aldrich650948
코엔자임 Q10 (Coenzyme Q10)Sigma-AldrichC9538
말 심장 유래 Cytochrome cSigma-AldrichC2506
디지토닌 (Digitonin)Sigma-Aldrich300410
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid --- EGTASigma-AldrichE3889
Ethylenediaminetetraacetic acid -- EDTASigma-AldrichE6758
글리세롤 (Glycerol)Sigma-AldrichG7893
Glyco-diosgeninAnatraceGDN101계면활성제
Lauryl Maltose Neopentyl Glycol ---- LMNGSigma-AldrichNG310
염화 마그네슘 (Magnesium chloride)Sigma-AldrichM8266
믹소티아졸 (Myxothiazol)Sigma-AldrichT5580
NADH, Disodium SaltSigma-Aldrich481913
Nitrotetrazolium blue chlorideSigma-AldrichN6876
Piericidin ASigma-Aldrich96861
아세트산 칼륨 (Potassium acetate)Sigma-AldrichP5708
염화 칼륨 (Potassium chloride)Sigma-AldrichP3911
페리시안화 칼륨 (Potassium Ferricyanide)Sigma-Aldrich702587
Potassium phosphate monobasic ---- KH2PO4Sigma-AldrichP0662
아지드화 나트륨 (Sodium azide)Sigma-AldrichS2002
Sodium cholate hydrateSigma-AldrichC1254
염화 나트륨 (Sodium chloride)Sigma-AldrichS9888
디티오나이트 나트륨 (Sodium dithionite)Sigma-Aldrich71699
수크로스 (Sucrose)Sigma-AldrichS9378
TRISSigma-AldrichT1503
ACMA (9-amino-6chloro-2-methoxyacridine)Sigma-AldrichSML4162
장비 및 키트
Amicon® Ultra 원심분리 필터, 100 kDa MWCO 0.5 mLMilliporeUFC5100
Amicon® Ultra 원심분리 필터, 100 kDa MWCO 15 mLMilliporeUFC9100
Beckman Optima TLX 초원심분리기Beckman Coulter
BN-PAGE 겔Blue-Native 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 겔
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