본 연구는 표준화된 기관지폐포 세척액 수집 및 처리, 7가지 마커의 유세포 분석 패널, 13가지 분석 물질의 멀티플렉스 사이토카인 분석, 그리고 통합 분석 파이프라인을 결합한 통합 시각화 워크플로우를 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
기관지폐포 세척액(BALF)은 하기도 염증을 연구하는 데 가장 직접적으로 접근 가능한 샘플링 매트릭스이지만, 기존의 분석 방식은 단일 마커 유세포 분석과 분석물별 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)의 조합에 의존하며, 이러한 접근 방식은 정보 밀도를 제한하고 세포-인자 간의 결합 관계를 모호하게 합니다. 본 연구에서는 표준화된 수집 및 전처리 과정과 7가지 마커의 호중구 및 단핵구 유세포 분석 패널, 13가지 분석물의 다중 사이토카인 분석, 그리고 uniform manifold approximation and projection(UMAP), FlowSOM 메타클러스터링, 계층적 클러스터링, Spearman 상관관계 네트워크 및 주성분 분석(PCA)을 기반으로 하는 통합 분석 파이프라인을 결합한 통합 시각화 워크플로우를 제시합니다.
이 워크플로우는 기관지 내시경 검사를 받는 성인 112명을 대상으로 한 단일 센터 전향적 코호트에 적용되었으며, 여기에는 미생물학적으로 확인된 폐 감염 환자 64명과 비감염 대조군 48명이 포함되었습니다. 세포학 및 유세포 분석 결과, 감염 동안 폐포 프로필이 대식세포 우세에서 호중구 우세로 뚜렷하게 전환되었으며, 호중구 비율은 중앙값 3.2%에서 68.4%로 상승했고 절대 호중구 농도는 약 50배 증가했습니다. 멀티플렉스 프로파일링을 통해 케모카인, 전염증 및 조절 모듈이 모두 상향 조절된 조율된 3개 모듈 사이토카인 반응이 확인되었으며, 연구 코호트 내에서 CXCL8/IL-8, IL-1β, IL-6, CXCL1/GRO-α 및 G-CSF가 가장 강력한 단일 마커 판별력을 보였습니다(곡선 아래 면적 [AUC] 0.89~0.94). PCA, 상관 행렬 및 네트워크 그래프를 이용한 통합 시각화 결과, 참여자 수준에서 호중구-케모카인 축이 밀접하게 결합되어 있음이 밝혀졌으며, BALF 호중구 수가 중심 네트워크 허브로 나타났습니다.
본 워크플로우는 임상적으로 지시된 BAL을 통해 일상적으로 얻는 시료만을 사용하며, 추가적인 시료 부피를 필요로 하지 않습니다. 또한, 다매개변수 유세포 분석기 및 멀티플렉스 비드 어레이 플랫폼을 갖춘 3차 의료기관 실험실에서 실행 가능하며, 종단적 연구, 단일 세포 연구 및 치료 평가 연구로 확장될 수 있는 호흡기 감염 시 기도 염증 해결을 위한 정보 밀도가 높은 프레임워크를 제공합니다. 개별 분석물을 바이오마커로 광범위하게 임상 적용하기 위해서는 독립적인 다기관 코호트에서의 전향적 검증이 필요할 것입니다.
서론
백신 전략과 치료 방식의 발전에도 불구하고 하기도 감염으로 인한 감염성 사망은 여전히 전 세계적인 사망률의 주요 원인이며, 특히 소아 및 노인 인구에서 이러한 경향이 두드러집니다1. 호중구는 감염된 호흡기 계통의 초기 선천 면역 반응에서 보고되는 주요 세포이며, 이는 침입한 병원균을 제거하는 데 필수적인 과정입니다. 그러나 조절되지 않은 호중구성 염증은 폐포 모세혈관 장벽의 파괴, 조직의 산화적 손상 및 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)의 발생을 초래합니다2,3. 폐 기도로 유입된 호중구는 다른 조직과는 다른 모집 역학, 유지 패턴 및 작동 세포 행동을 보이며, 이러한 차이는 감염이 해소될지 아니면 중증 폐렴으로 진행될지에 영향을 미칩니다4.
기관지폐포 세척액(BALF)은 폐포 미세환경에 대한 중요한 정보원이며, 해당 부위의 임상적 면역 상태를 가장 가깝게 나타냅니다5. 케모카인 CXCL8은 CXCL1, CXCL2, CXCL5를 포함한 다른 케모카인들과 함께 수용체인 CXCR1 및 CXCR2를 통해 호중구를 폐로 유인하는 데 필수적인 역할을 합니다6. 사이토카인 IL-1β, IL-6, TNF-α는 이 과정을 더욱 촉진하는 반면, IL-10은 이를 억제하는 사이토카인으로 작용합니다. BALF 내 이들 수치는 폐 감염의 중증도 및 세균성, 바이러스성, 비정형 폐렴으로 인한 폐 합병증의 발생과 상관관계가 있음이 밝혀졌으며7, 하기도 감염의 조기 진단 및 병원체 식별을 위해 다중 BALF 바이오마커 프로파일이 도입되고 있습니다8.
통상적인 BALF 검사는 일반적으로 해당 검사의 기저에 깔린 생물학적 특성을 완전히 포괄하지 못합니다. 세포 수는 사이토스핀(cytospin) 시료의 세포를 수동으로 구분하여 추정할 수 있는 반면, 수용성 매개체는 개별 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)을 사용하여 측정하고 막대그래프로 표시합니다. 케모카인, 사이토카인 및 각 세포 유형은 개별적으로 평가되며, 특정 케모카인 농도 기울기와 해당 케모카인이 시료 내에서 영향을 미치는 세포 집단 간의 상관관계는 설정되지 않습니다. 다변량 분석이 수행되지 않을 경우, 사이토카인 모듈의 조합, 케모카인-중성구의 용량-반응 관계, 그리고 고유한 염증 시그니처를 가진 환자 하위 집단들의 특성이 간과되는 경우가 많습니다9.
계산 능력의 발전으로 이러한 총체적인 접근 방식이 점차 현실화되고 있습니다. 다매개변수 유세포 분석(multiparameter flow cytometry) 및 스펙트럼 유세포 분석(spectral flow cytometry)을 t-분포 확률적 이웃 투영(t-SNE) 또는 균일 매니폴드 근사 및 투영(UMAP)과 같은 차원 축소 기법과 결합하면, 고차원의 면역 표현형을 2차원 공간으로 매핑할 수 있으며, 특히 UMAP은 유세포 분석 데이터에 적용했을 때 전체적인 위상 유지력과 재현성이 더 우수한 것으로 입증되었습니다10. 사이토카인의 다중 분석 패널을 사용하고 이어서 계층적 군집 분석(hierarchical clustering) 및 상관관계 네트워크를 적용하면, 단일 사이토카인 분석법으로는 식별할 수 없는 중증도 관련 시그니처를 확인하는 데 도움이 됩니다11. 이러한 분야의 진전에도 불구하고, 호흡기 감염 시 동일한 기관지 세척액(BALF) 검체에서 호중구 모집과 사이토카인 시그니처를 함께 연구하기 위해 이러한 방법들을 통합한 워크플로우는 아직 없는 실정입니다. 본 연구에서는 세포학 및 다매개변수 유세포 분석을 이용한 호중구 모집 조사와, 이어서 멀티플렉스 면역 분석을 통한 UMAP 및 사이토카인 시그니처 분석, 그리고 계층적 군집 분석, 상관 행렬 및 주성분 분석(principal component analysis)을 포함하는 통합 시각화 워크플로우를 설명합니다. 이 워크플로우는 하기도 감염 시 임상적으로 필요한 기관지경 검사 중에 통상적으로 채취하는 BALF 샘플을 사용하여, 기도의 세포성 및 수용성 면역 판독값을 단일 그래프에 담아내는 통합 시각화 결과를 제공합니다.
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프로토콜
연구 대상 및 윤리
본 연구는 2026년 1월부터 2026년 4월까지 3차 교육 병원에서 수행된 단일 기관 전향적 관찰 연구였습니다. 연구 프로토콜은 승인 번호 2026HL-038로 승인되었으며, 모든 연구 절차를 시작하기 전 모든 참여자로부터 서면 동의서를 얻었습니다.
정기적인 임상 진료의 일환으로 기관지 세척술(BAL)을 포함한 진단적 쇄인성 기관지경 검사를 받는 18세에서 75세 사이의 성인을 연속적으로 모집하였으며, 최종 임상 및 미생물학적 진단 결과에 따라 감염군 또는 비감염 대조군으로 배정하였습니다. 환자 모집부터 통합 시각적 결과물에 이르는 통합 시각화 워크플로우의 개요는 그림 1에 나와 있습니다.
그림 1BALF 기반의 호중구 모집 및 염증성 사이토카인 반응 프로파일링을 위한 통합 시각화 워크플로 개요. 다섯 단계는 왼쪽에서 오른쪽 순으로, 기관지경 검사와 기관지폐포 세척술(BAL)을 통한 감염군 및 대조군의 전향적 모집, BALF의 세포 펠릿 및 상층액 분획으로의 전처리, 병행된 세포 측정(Wright–Giemsa 세포학 및 다변수 유세포 분석) 및 수용성 측정(13-plex 비드 기반 면역 분석), 통합 시각화 파이프라인(FlowSOM 메타 클러스터링을 적용한 UMAP, 계층적 히트맵, 주성분 분석 및 Spearman 상관 네트워크), 그리고 통합된 시각적 결과물을 요약하여 보여준다. 약어: BAL = 기관지폐포 세척술; BALF = BAL 액; UMAP = 균일 매니폴드 근사 및 투영. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
감염군 포함 기준은 다음과 같았다: (1) Infectious Diseases Society of America (IDSA) 및 American Thoracic Society (ATS) 가이드라인에 따라 지역사회 획득성 폐렴(CAP), 병원 획득성 폐렴(HAP) 또는 인공호흡기 관련 폐렴(VAP)으로 진단된 환자; (2) BALF 배양 시 104 CFU/mL 이상의 균락 형성 단위(CFU)/mL로 하나 이상의 병원균이 검출되었거나, 호흡기 다중 중합효소 연쇄 반응(PCR), BALF의 메타게놈 차세대 염기서열 분석, 또는 쌍을 이룬 호흡기/혈청 검체로부터의 특정 항원/항체 검사에서 병원균이 검출된 경우.
대조군 선정 기준은 다음과 같았다: (1) 비감염성 이유로 기관지 내시경 검사를 받는 경우로, 불확정 폐결절 평가, 감염을 시사하지 않는 비정상적 방사선 검사 결과 또는 만성 기침 검사가 이에 해당함; (2) 기관지 내시경 검사 당시 미생물 검사 결과가 음성이고 염증 또는 전신 감염 징후가 없어 급성 폐감염이 없음이 확인된 경우; (3) 참여 전 30일 동안 항생제를 사용하지 않은 경우. 대조군은 건강한 지원자가 아니라 다른 임상적 적응증으로 인해 기관지 내시경 검사를 받는 환자들 중에서 모집하였으며, 이는 해당 연구 센터에서 임상적으로 필요한 BAL이 통상적으로 수행되는 대상 집단을 반영한 것이다.
제외 기준은 다음과 같습니다: (1) 최근 6개월 이내의 악성 종양 및/또는 세포독성 화학요법 이력, (2) HIV 혈청 양성, (3) 고형 장기 또는 조혈모세포 이식, (4) 일일 등가 용량의 프레드니손을 포함한 지속적인 면역억제 요법. > 3주 이상 0.3 mg/kg 투여; (5) 임신 또는 수유 중인 여성; (6) 출혈성 소인 병력 또는 유연성 기관지경 검사의 금기 사항이 있는 경우; (7) 기존의 중증 만성 호흡기 질환(만성 폐쇄성 폐질환 [COPD] GOLD 단계 III/IV, 특발성 폐섬유화증, 중증 지속성 천식 또는 임상적으로 유의미한 기관지 확장증); (8) 활동성 결핵; (9) 최근 30일 이내에 다른 중재 연구에 참여한 경우. 기관지폐포 세척술(BAL)은 첫 번째 기관지경 검사 시, 감염으로 인한 입원 후 72시간 이내, 그리고 기계 환기를 받는 감염 환자의 경우 삽관 후 48시간 이내에 수행되었다.
표본 크기 계산은 주요 세포 결과인 그룹 간 BALF 내 호중구 수에 초점을 맞추어 수행되었습니다. 감염된 기도와 비감염된 기도 사이의 예상 효과 크기를 0.6 SD로 설정하고 15%의 탈락률을 고려했을 때, 양측 α = 0.05 및 80%의 통계적 검정력을 위해 그룹당 최소 45명의 피험자가 필요했습니다. 적격한 후보자 156명 중 27명은 적격성 요건을 충족하지 못했습니다(18명은 주로 정해진 기간 내에 질병의 원인이 되는 병원체를 식별하지 못했거나 시술 자체에 동의하지 않아 선정 기준을 충족하지 못했으며, 9명은 주로 활동성 악성 종양 또는 화학요법 투여 이력, 만성 코르티코스테로이드 사용, 심각한 기존 만성 폐질환 또는 출혈성 소인으로 인해 제외 기준에 해당되었습니다). 나머지 129명의 참여자는 기관지 내시경 검사를 받았습니다. 이후 17명의 피험자가 연구에서 제외되었습니다(7명은 BALF 회수율 < 40%로 불충분하여 제외, 4명은 입원 중 동의 철회, 6명은 최종 미생물학적 평가 후 피험자 재분류 — 배양 결과에 따라 잠재적 감염으로 진단된 대조군 후보자 4명 및 배양 분석 후 감염 증거가 부족한 감염 후보자 2명). 최종 연구 피험자 집단은 감염자 64명과 비감염자 48명을 포함하여 총 112명으로 구성되었습니다.
BALF 수집 및 전처리
기관지내시경 검사는 기관지폐포 세척술에 관한 기발표된 기술적 권고 사항과 일치하는 표준 기관 프로토콜에 따라 숙련된 운영자에 의해 수행되었습니다.12리도카인을 국소적으로 사용하였으며, 환자들은 산소 포화도(SpO₂)를 유지하기 위해 보충 산소를 공급받으며 중등도 정맥 진정법을 받았습니다. >92%. 굴곡성 기관지경을 삽입하여 방사선학적 이상 소견이 있는 기관지폐구역에 위치시켰다. 방사선학적 이상 소견이 미만성이거나 국소화할 수 없는 경우에는 우중엽 또는 좌폐설구역을 선택하였다. 매회 주입 후, 음압을 이용해 부드럽게 수동 흡인을 실시하였다. < 100 mmHg로 수행되었습니다. 멸균 식염수를 총 3~5회 투여하였습니다. 37 °C각각 20~40 mL씩, 총 부피 100~150 mL를 투여하였다. 회수율은 투여 부피 대비 회수된 부피로 산출하였으며, 회수율이 40% 이상인 샘플만 분석 대상으로 간주하였다.
기관지 오염을 줄이고 폐포 농축 시료를 얻기 위해 두 번째 세척부터 그 이후의 세척 단계에서 수집한 시료들을 하나로 합쳤다. 인간 BALF 시료를 장기간 보관하거나 가온했을 때 세포 구성 및 분획 계산 수치가 변한다는 최근의 연구 결과13를 고려하여, 수집된 기관지폐포세척액(BALF) 풀은 얼음 위에 유지했으며 수집 후 2 h 이내에 처리하였다. 점액을 제거하기 위해 70 microns 공극 크기의 멸균 나일론 메쉬로 여과하였으며, 이때 dithiothreitol과 같은 점액 용해제나 응집 방지제를 추가하지 않고 기계적 통과만으로 여과를 수행하였다. 이는 사전 테스트 결과, 이러한 방식만으로도 하위 단계의 표면 에피토프 무결성에 측정 가능한 손실 없이 점액 덩어리를 제거하기에 충분함을 확인했기 때문이다. 여과된 액체는 4 °C에서 10 min 동안 400 × g로 원심분리하였다. 상층액은 따라내어 사이토카인 분석을 위해 저단백 결합 크라이오바이알에 분주하였으며, 세포는 0.5% bovine serum albumin과 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)가 포함된 phosphate-buffered saline (PBS)에 현탁시킨 후 일부는 세포학적 검사와 유세포 분석을 위해 보관하였다. 사이토카인 시료는 액체 질소에 급속 냉동하여 –80 °C에 보관하였으며, 사용 전 동결-해동 주기를 1회 이하로 제한하였다.
호중구 세포학 및 유세포 분석 정량화
세포병리학적 분석을 위해, 세포 원심분리기( 재료 표 참조)를 사용하여 300 × g 에서 5분 동안 BALF 세포 현탁액 100 µL를 유리 슬라이드에 도포한 후, 공기 건조시키고 Wright-Giemsa 염색을 실시하였습니다. 환자의 의학적 배경을 알지 못하는 혈액학 기술자가 슬라이드당 최소 400개의 세포를 계수하여 대식세포, 림프구, 호중구 및 호산구의 백분율을 계산하는 감별 계수를 수행하였습니다. 폐 침윤이 있는 환자에서 감염성 폐질환과 비감염성 폐질환을 구분하는 데 호중구의 유용성을 시사하는 현재의 증거를 바탕으로, BALF 호중구 백분율을 세포병리학의 일차 결과 측정 지표로 간주하였습니다14.
유세포 분석 정량 프로토콜은 최근 검증된 4색 기관지폐포 세척액(BALF) 백혈구 분화 프로토콜15을 기반으로 하였으며, 호중구를 식별하기 위한 추가 마커를 포함하였습니다. 구체적으로, BALF에서 분리한 약 5 × 105개의 세포를 인간 Fc 수용체 차단 시약(재료 표 참조)으로 4 °C에서 10분 동안 차단한 후, 고정 가능 생존 염색약(재료 표 참조)과 더불어 CD45 (clone HI30), CD66b (clone G10F5), CD15 (clone HI98), CD16 (clone 3G8), CD11b (clone ICRF44), CD14 (clone M5E2) 및 HLA-DR (clone L243)에 대한 항체로 4 °C에서 20분 동안 염색하였습니다. 적혈구 용해를 위해 상용 적혈구 용해 용액(재료 표 참조)을 사용하여 실온에서 10분 동안 처리하였습니다. 적혈구 용해 후, 세포를 2% fetal calf serum이 첨가된 PBS로 2회 세척하고 유세포 분석 버퍼에 재현탁시킨 다음, 다색 유세포 분석기(재료 표 참조)로 분석하였습니다. 보정은 단일 염색 보정 비드(재료 표 참조)를 사용하여 수행하였으며, 각 패널에 대해 fluorescence-minus-one 및 미염색 튜브를 포함하였습니다.
각 샘플당 최소 1 × 105 CD45⁺ 이벤트가 수집되었습니다. 먼저 FSC-A/FSC-H 플롯에서 싱글렛(singlets)을 게이팅하고, 이어서 생존한(viability dye⁻) CD45⁺ 백혈구를 선택한 후, CD14⁺HLA-DR⁺ 단핵구-대식세포를 제외하여 high-side scatter CD66b⁺ 과립구(granulocytes)를 선택했습니다. 그 후, 과립구 집단 내에서 CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ 이벤트로 중성구(neutrophils)를 정의했습니다. 이 1차 CD66b⁺ 과립구 게이트는 CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ 경계로 제한하지 않고 모든 high-side-scatter 이벤트 주변에 넓게 설정하여, CD16-dim, CD11b-high 활성화 중성구 및 다른 덜 성숙한 과립구 형태들이 전체 자동화 중성구 수치에 포함되도록 하였으며, 더 엄격한 CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ 정의는 이후의 클러스터링 분석에서 별도로 보고되는 성숙 중성구 서브셋을 특성화하는 데에만 적용되었습니다. BALF 내 중성구 수(cells/µL)는 중성구 백분율과 자동 혈액 분석기를 통해 결정된 총 유핵 세포 수를 기반으로 추정되었습니다(재료 표 참조). 보정 행렬(compensation matrices), 게이팅 전략 및 개별 샘플 품질 관리 보고서를 보관하였으며, 분석가들은 수집 및 분석 전 과정 동안 참가자 그룹 배정 정보를 알지 못하는 맹검 상태를 유지했습니다.
다중 염증성 사이토카인 프로파일링
BALF 상청액을 젖은 얼음 위에서 한 번 해동한 후, 짧게 볼텍싱하고 10,000 × g에서 원심분리하여 투명하게 만들었다. g ~에서 5분 동안 4 °C 분석 직전에 준비합니다. 세 가지 기능적 범주에 속하는 13가지 분석물의 측정은 맞춤형 자성 비드 패널이 포함된 멀티플렉스 비드 기반 면역 분석 플랫폼을 사용하여 수행되었습니다(참조 재료 목록전염증성 그룹은 IL-1β, IL-6, IL-17A 및 TNF-α로 구성되었으며, 케모카인 그룹은 CXCL8/IL-8, CXCL1/GRO-α, CXCL10/IP-10, CCL2/MCP-1 및 CCL3/MIP-1α로 구성되었고, 조절 그룹은 IL-10, IFN-γ, IL-1RA 및 G-CSF로 구성되었다. 분석 대상 물질의 선정은 폐렴 및 중증 호흡기 감염 연구에서 기관지 세척액(BALF) 또는 혈청 사이토카인의 다중 분석 시 유용한 것으로 가장 흔히 보고된 항목들을 기반으로 하였다.7,11희석 배수(분석 버퍼 내 1:2)는 감염 샘플과 대조군 샘플 모두의 대표적인 일부 하위 집단을 대상으로 실시한 예비 실험을 통해 결정되었으며, 이는 다음을 보장하기 위한 것이었다. >측정값의 90%가 표준 곡선 범위 내에 있었습니다.
표준 곡선은 제조사의 재조합 표준 물질을 7점 연속 희석하여 결정하였으며, 배경값을 빼기 위한 공백 웰 하나를 포함하여 모든 플레이트에 2회 반복 준비하였습니다. 곡선 피팅은 기기의 전용 획득 및 분석 소프트웨어(재료 표 참조)를 사용하여 5-파라미터 로지스틱(5PL) 회귀 분석을 통해 수행되었습니다. 정량 하한(LLOQ)은 백-핏 회수율이 80%에서 120% 사이이고 런 내 변동 계수(CV)가 ≤ 20%인 표준 물질의 최소량으로 계산되었습니다. LLOQ 미만인 값은 LLOQ/√2로 대체되었습니다. 장기 성능을 추적하기 위해 대표적인 감염 환자와 비감염 대상자로부터 얻은 두 개의 혼합 기관지폐포 세척액(BALF) 품질 관리 샘플을 분주하여 각 플레이트에 추가하였습니다. 품질 보증 표준은 12년간의 다기관 멀티플렉스 비드 기반 분석 숙련도 프로그램16에서 도출된 최적 실습 권장 사항을 기준으로 하였으며, 여기에는 2회 반복 웰의 분석 내 CV ≤ 10%, 품질 관리를 위한 플레이트 간 CV ≤ 20%, 웰당 분석물당 최소 비드 수 ≥ 50개의 요건이 포함되었습니다. 위 기준을 충족하지 못한 플레이트는 재시험하였습니다. 분석은 단일 키트 로트를 사용하여 4주 이내에 단일 배치로 수행되었으며, 감염 샘플과 대조군 샘플을 무작위로 교차 배치하였습니다.
시각화 분석 파이프라인
유세포 분석 표준(FCS) 파일은 먼저 상용 유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 분석하였습니다(참조 재료 목록) 보정 및 생존 CD45⁺ 싱글렛(singlet) 게이팅을 수행한 후, R v4.4에서 편향 없는 분석을 위해 데이터를 내보냈다. 각 샘플에서 10,000개의 CD45⁺ 이벤트를 다운샘플링하여 결합하였으며, 신호 강도는 cofactor 150의 arcsinh 함수를 사용하여 변환하였다. 차원 축소 및 UMAP 투영은 uwot 패키지를 사용하여 최근접 이웃(nearest neighbors) 15 및 최소 거리(minimum distance) 0.1 조건으로 수행하였으며, 이와 더불어 Rtsne 패키지를 사용하여 perplexity 30으로 병렬 t-SNE 임베딩을 수행하였다.10표현형 클러스터는 100개의 자기 조직화 지도(self-organizing map) 노드를 이용한 FlowSOM으로 식별되었으며, 최근 고차원 사이토메트리 데이터에 대해 검증된 최적화 기반 접근 방식을 통해 메타 클러스터링을 거쳐 12~15개의 클러스터로 추가 세분화되었습니다.17각 클러스터는 계보 및 활성화 마커의 중앙값 발현량을 기준으로 주석 처리되었으며, 수동 게이트와 대조하여 검토되었습니다.
다중 사이토카인 데이터 분석을 위해, 먼저 원시 값을 log₁₀ 변환한 후 추가 분석 전 z-scoring을 통해 분석물 간의 표준화를 진행하였다. 분석물과 환자 모두 유클리드 거리와 Ward.D2 연결법을 이용한 계층적 군집화를 거쳤으며, 그 결과는 행 및 열 군집화된 히트맵으로 표시하였다. 이러한 접근 방식은 다중 염증 코호트에서 공통 발현되는 사이토카인 모듈을 탐지하고 환자 하위 집단을 분류하는 데 사용되었다9. 모든 세포성 및 수용성 바이오마커에 대해 쌍별 Spearman 순위 상관계수를 사용하여 상관 행렬을 생성하였다. 상관 행렬의 히트맵은 네트워크와 함께 도식화하였으며, 여기서 노드는 바이오마커에 해당하고 엣지는 Benjamini–Hochberg (BH) 방법을 이용한 다중 테스트 보정을 거친 후에도 유의미하게 남은 상관관계를 나타낸다. 엣지의 너비는 상관계수 크기 |ρ|에 따라 조정되었으며, 보정 후 |ρ| ≥ 0.30 및 p < 0.05인 경우에만 엣지를 포함하였다. 세포와 사이토카인을 포함하는 표준화된 행렬에 대해 unit variance scaling이 적용된 prcomp() 함수를 사용하여 주성분 분석(PCA)을 수행하였다. 감염군과 대조군을 중첩하여 참가자들을 처음 두 개의 주성분에 투영하였다. 모든 분석에서 일관된 다운샘플링과 표준화를 수행함으로써 모든 시각화 자료에서 세포성 및 수용성 바이오마커 판독값 간의 비교 가능성을 확보하였다.
통계 분석
연속형 변수는 Shapiro–Wilk 검정에 따라 정규 분포를 따르지 않는 경우 중앙값(사분위수 범위, IQR)으로, 그렇지 않은 경우 평균(표준 편차, SD)으로 기술하였습니다. 범주형 변수는 빈도와 비율로 기술하였습니다. 그룹 간 비교는 연속형 변수가 비정규 분포를 보일 때는 Mann–Whitney U 검정을, 정규 분포를 보일 때는 Welch t-검정을 사용하였으며, 범주형 변수에 대해서는 해당되는 경우 카이제곱 검정 또는 Fisher의 정확 검정을 수행하였습니다. 연속형 변수 간의 연관성은 Spearman의 서열 상관 계수를 통해 평가하였습니다. 다중 사이토카인 및 상관관계 분석에서 허위 발견율(FDR)을 고려하기 위해 p-값은 Benjamini–Hochberg 방법을 사용하여 조정하였으며, 기준점은 q < 0.05로 설정하였습니다. 모든 일차 분석에서 양측 p < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였습니다. 가능한 경우, 개별 변수의 데이터가 누락된 사례는 유지하여 해당 변수에 대해 완전 사례 분석(complete-case analysis)을 수행하였으며, 민감도 분석을 위해 연쇄 방정식(m = 20)을 이용한 다중 대체법을 수행하였습니다. 전체 연구 코호트를 대상으로 pROC 패키지를 사용하여 개별 사이토카인에 대한 수신자 작동 특성 곡선 및 이에 상응하는 곡선 아래 면적(AUC)을 생성하였으며, 별도의 외부 검증 코호트는 사용하지 않았습니다. 사전 정의된 민감도 분석에서는 기관지 내시경 검사 전 72시간 이내에 항생제를 투여받은 참여자를 제외한 후, 그리고 감염 그룹을 기계 환기 여부 및 폐렴 하위 유형(지역사회 획득성, 병원 획득성 또는 인공호흡기 관련 폐렴)별로 층화한 후 일차 그룹 비교를 반복하였습니다. 분석은 R v4.4의 rstatix, FlowSOM, uwot, ComplexHeatmap, igraph, pROC 및 mice 패키지를 사용하여 수행하였습니다. 수치는 상용 과학 그래프 소프트웨어를 사용하여 생성하였습니다(재료 표 참조).
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결과
연구 대상 및 표본 특성
최종 분석 코호트는 총 112명의 피험자로 구성되었으며, 감염군 64명과 비감염 대조군 48명이 포함되었습니다. 표 1에 나타난 바와 같이, 기저 인구통계학적 특성은 그룹 간에 유사했으나, 감염 관련 실험실 매개변수는 감염군에서 더 높게 나타났습니다. 감염은 주로 그람 음성균에 의해 발생했으며, 주요 세균성 병원체는 Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, 그리고 Acinetobacter baumannii였습니다. 기타 병원체로는 Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, 비정형 병원체, 바이러스 및 혼합 감염이 있었습니다.
BALF 회수율은 유지된 모든 샘플에서 사전 설정된 임계...
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토론
본 프로토콜의 견고함은 분석 전과 분석 중에 내린 몇 가지 결정에 달려 있습니다. 하한 회수율을 40%로 설정하고 두 번째 이후의 분주액(aliquot)들을 통합한 것은 의도적인 결정이었습니다. 이는 첫 번째 분주액에 기관지 기도 물질이 더 많이 농축되어 있으며, 회수율이 연령, 성별, 흡연력 및 대상 기관지에 따라 체계적으로 달라지기 때문입니다18. Fc 수용체를 차단하고 개별 클론에 대한 항체 역가를 조절하여 성숙한 CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ 호중구와 CD14⁺HLA-DR⁺ 폐포 대식세포(BALF 샘플에서 비특이적 염색과 자가형광 배경이 가장 높은 우세 세포군) 사이의 정확한 게이팅 경계를 확보하는 것은 두 그룹 간의 일관성을 유지하는 데 필수적입니다19,20. 동결-해동 횟수 제한과 멀티플렉스 분석을 위한 2시간의 시간 제한 또한 임의적인 것이 아닙니다. 인간 BALF 데이...
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공개 사항
저자들은 선언할 이해 상충 관계가 없습니다.
감사의 글
본 연구에 참여하여 귀중한 협조를 해주신 모든 환자와 자원봉사자분들께 진심으로 감사드립니다. 또한, 전체 연구 과정 동안 윤리적 승인(승인 번호 2026HL-038)과 규범적 지침을 제공해 준 윤리위원회에 깊은 감사를 표합니다.
임상 검체 수집, 기관지폐포 세척액 처리 및 미생물 검출에 도움을 주신 호흡기 내과, 기관지경 센터 및 임상 병리실 의료진분들께 감사드립니다. 또한 고차원 유세포 분석 및 다중 사이토카인 프로파일링 실험을 위해 기술적 플랫폼을 지원해 주신 병원 중앙 실험실에 감사드립니다.
본 연구는 공공, 상업 또는 비영리 부문의 지원 기관으로부터 어떠한 특정 연구비 지원도 받지 않았습니다.
환자 스크리닝, 시료 관리, 실험 수행 및 데이터 정리에 기여해주신 모든 연구원, 기술진 및 간호 인력의 노력에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Anti-human CD11b antibody, Brilliant Violet 421, clone ICRF44 | BioLegend | Cat. No. 301323 | 호중구 활성화 마커; 바이올렛 레이저 채널 URL: https://www.biolegend.com |
| Anti-human CD14 antibody, APC/Cyanine7, clone M5E2 | BioLegend | Cat. No. 301820 | 단핵구-대식세포 제외 마커; 레드 레이저 채널 URL: https://www.biolegend.com |
| Anti-human CD15 antibody, PE, clone HI98 | BioLegend | Cat. No. 301906 | 호중구 계통 마커; 블루 레이저 채널 URL: https://www.biolegend.com |
| Anti-human CD16 antibody, Brilliant Violet 510, clone 3G8 | BioLegend | Cat. No. 302048 | 호중구 성숙 및 NK 세포 마커; 바이올렛 레이저 채널 URL: https://www.biolegend.com |
| Anti-human CD45 antibody, PerCP, clone HI30 | BioLegend | Cat. No. 304026 / RRID: AB_893338 | 범백혈구 마커; 블루 레이저 채널 URL: https://antibodyregistry.org/AB_893338 |
| Anti-human CD66b antibody, FITC, clone G10F5 | BioLegend | Cat. No. 305103 | 과립구 마커; 블루 레이저 채널 URL: https://www.biolegend.com |
| Anti-human HLA-DR antibody, PerCP/Cyanine5.5, clone L243 | BioLegend | Cat. No. 307629 | 항원 제시 세포 마커; 블루 레이저 채널 URL: https://www.biolegend.com |
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| 유연 비디오 기관지경 | Olympus Corporation (BF-1TQ290) | Instrument (model BF-1TQ290) | 적절한 진정 상태 하의 BAL 시행에 사용 URL: https://www.olympus-global.com |
| 다색 유세포 분석기 (CytoFLEX LX) | Beckman Coulter Life Sciences | Instrument (model CytoFLEX LX, six-laser configuration) | 7가지 마커 호중구/단핵구 유세포 분석 패널 데이터 수집에 사용 URL: https://www.beckman.com |
| 유세포 분석 소프트웨어 (FlowJo) | BD Biosciences (FlowJo LLC) | v10.10 | FCS 파일의 보정 및 수동 게이팅에 사용 URL: https://www.flowjo.com |
| FlowSOM 패키지 (R/Bioconductor) | Bioconductor Project | v2.12 (open-source) | 유세포 분석 데이터의 자기 조직화 맵(SOM) 군집화 및 메타 군집화에 사용 URL: https://bioconductor.org/packages/FlowSOM |
| GraphPad Prism (통계 그래프 소프트웨어) | GraphPad Software (Dotmatics) | v10 | 최종 수치 데이터 그래프 생성에 사용 URL: https://www.graphpad.com |
| 인간 Fc 수용체 차단 시약 (Human TruStain FcX) | BioLegend | Cat. No. 422301 / RRID: AB_2818986 | 항체 염색 전 Fc 수용체 차단에 사용 URL: https://antibodyregistry.org/AB_2818986 |
| igraph 패키지 (R) | CRAN | v2.0 (open-source) | 상관관계 네트워크 그래프 구축 및 시각화에 사용 URL: https://cran.r-project.org/package=igraph |
| 저단백 결합 극저온 보관 튜브, 2.0 mL | Thermo Fisher Scientific (Nunc) | Cat. No. 375418 | 사이토카인 분석용 BALF 상층액 분주에 사용 URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/375418 |
| Luminex 멀티플렉스 비드 기반 면역 분석 플랫폼 (MAGPIX) | Luminex Corporation (DiaSorin) | Instrument (model MAGPIX) | 멀티플렉스 사이토카인 분석 데이터 수집에 사용 URL: https://www.luminexcorp.com |
| May-Grünwald-Giemsa 염색액 | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Cat. No. GS500 | 세포 원심분리 후 감별 세포 수 계산에 사용 URL: https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/gs500 |
| mice 패키지 (R) | CRAN | v3.16 (open-source) | 민감도 분석에서 연쇄 방정식에 의한 다중 대치법(MICE)에 사용 URL: https://cran.r-project.org/package=mice |
| 멀티플렉스 자기 비드 사이토카인/케모카인 패널 (13-plex, custom; MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine) | Merck / MilliporeSigma | Cat. No. HCYTOMAG-60K | 섹션 2.4에 기술된 13가지 분석 물질을 측정하는 맞춤형 패널 URL: https://www.merckmillipore.com |
| 나일론 메시 세포 스트레이너, 70 µm | Corning (Falcon) | Cat. No. 352350 | 점액 덩어리를 제거하기 위한 BALF의 기계적 여과에 사용 URL: https://www.corning.com |
| 인산완충생리식염수 (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | Cat. No. 10010023 | 세포 재현탁 및 염색을 위한 기본 버퍼 URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023 |
| pROC 패키지 (R) | CRAN | v1.18 (open-source) | ROC 곡선 및 AUC 값 생성에 사용 URL: https://cran.r-project.org/package=pROC |
| R (통계 계산 환경) | R Core Team | v4.4 (open-source) | 통계 분석 및 시각화 플랫폼 URL: https://www.r-project.org |
| rstatix 패키지 (R) | CRAN | v0.7 (open-source) | 그룹 간 비교 및 상관관계 통계 분석에 사용 URL: https://cran.r-project.org/package=rstatix |
| Rtsne 패키지 (R) | CRAN | v0.17 (open-source) | t-SNE 임베딩에 사용 URL: https://cran.r-project.org/package=Rtsne |
| 단일 염색 보정 비드 (UltraComp eBeads Compensation Beads) | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Cat. No. 01-2222-42 | 단일 색상 보정 컨트롤에 사용 URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/01-2222-42 |
| 주사용 염화나트륨 용액, 0.9% (멸균 식염수) | Baxter International | Cat. No. 2B1324 | BAL 주입에 사용 (100–150 mL, 37 °C에서 20–40 mL씩 분주) URL: https://www.baxter.com |
| uwot 패키지 (R) | CRAN | v0.2 (open-source) | UMAP 차원 축소에 사용 URL: https://cran.r-project.org/package=uwot |
| xPONENT (멀티플렉스 분석 데이터 수집 및 곡선 피팅 소프트웨어) | Luminex Corporation (DiaSorin) | v4.3 | 5PL 표준 곡선 피팅을 위한 기기 전용 소프트웨어 URL: https://www.luminexcorp.com |
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