본 연구는 표준화된 기관지폐포 세척액 수집 및 처리, 7가지 마커의 유세포 분석 패널, 13가지 분석 물질의 멀티플렉스 사이토카인 분석, 그리고 통합 분석 파이프라인을 결합한 통합 시각화 워크플로우를 제시합니다.
이 논문에서
요약
초록
기관지폐포 세척액(BALF)은 하기도 염증을 연구하는 데 가장 직접적으로 접근 가능한 샘플링 매트릭스이지만, 기존의 분석 방식은 단일 마커 유세포 분석과 분석물별 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)의 조합에 의존하며, 이러한 접근 방식은 정보 밀도를 제한하고 세포-인자 간의 결합 관계를 모호하게 합니다. 본 연구에서는 표준화된 수집 및 전처리 과정과 7가지 마커의 호중구 및 단핵구 유세포 분석 패널, 13가지 분석물의 다중 사이토카인 분석, 그리고 uniform manifold approximation and projection(UMAP), FlowSOM 메타클러스터링, 계층적 클러스터링, Spearman 상관관계 네트워크 및 주성분 분석(PCA)을 기반으로 하는 통합 분석 파이프라인을 결합한 통합 시각화 워크플로우를 제시합니다.
이 워크플로우는 기관지 내시경 검사를 받는 성인 112명을 대상으로 한 단일 센터 전향적 코호트에 적용되었으며, 여기에는 미생물학적으로 확인된 폐 감염 환자 64명과 비감염 대조군 48명이 포함되었습니다. 세포학 및 유세포 분석 결과, 감염 동안 폐포 프로필이 대식세포 우세에서 호중구 우세로 뚜렷하게 전환되었으며, 호중구 비율은 중앙값 3.2%에서 68.4%로 상승했고 절대 호중구 농도는 약 50배 증가했습니다. 멀티플렉스 프로파일링을 통해 케모카인, 전염증 및 조절 모듈이 모두 상향 조절된 조율된 3개 모듈 사이토카인 반응이 확인되었으며, 연구 코호트 내에서 CXCL8/IL-8, IL-1β, IL-6, CXCL1/GRO-α 및 G-CSF가 가장 강력한 단일 마커 판별력을 보였습니다(곡선 아래 면적 [AUC] 0.89~0.94). PCA, 상관 행렬 및 네트워크 그래프를 이용한 통합 시각화 결과, 참여자 수준에서 호중구-케모카인 축이 밀접하게 결합되어 있음이 밝혀졌으며, BALF 호중구 수가 중심 네트워크 허브로 나타났습니다.
본 워크플로우는 임상적으로 지시된 BAL을 통해 일상적으로 얻는 시료만을 사용하며, 추가적인 시료 부피를 필요로 하지 않습니다. 또한, 다매개변수 유세포 분석기 및 멀티플렉스 비드 어레이 플랫폼을 갖춘 3차 의료기관 실험실에서 실행 가능하며, 종단적 연구, 단일 세포 연구 및 치료 평가 연구로 확장될 수 있는 호흡기 감염 시 기도 염증 해결을 위한 정보 밀도가 높은 프레임워크를 제공합니다. 개별 분석물을 바이오마커로 광범위하게 임상 적용하기 위해서는 독립적인 다기관 코호트에서의 전향적 검증이 필요할 것입니다.
서론
백신 전략과 치료 방식의 발전에도 불구하고 하기도 감염으로 인한 감염성 사망은 여전히 전 세계적인 사망률의 주요 원인이며, 특히 소아 및 노인 인구에서 이러한 경향이 두드러집니다1. 호중구는 감염된 호흡기 계통의 초기 선천 면역 반응에서 보고되는 주요 세포이며, 이는 침입한 병원균을 제거하는 데 필수적인 과정입니다. 그러나 조절되지 않은 호중구성 염증은 폐포 모세혈관 장벽의 파괴, 조직의 산화적 손상 및 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)의 발생을 초래합니다2,3. 폐 기도로 유입된 호중구는 다른 조직과는 다른 모집 역학, 유지 패턴 및 작동 세포 행동을 보이며, 이러한 차이는 감염이 해소될지 아니면 중증 폐렴으로 진행될지에 영향을 미칩니다4.
기관지폐포 세척액(BALF)은 폐포 미세환경에 대한 중요한 정보원이며, 해당 부위의 임상적 면역 상태를 가장 가깝게 나타냅니다5. 케모카인 CXCL8은 CXCL1, CXCL2, CXCL5를 포함한 다른 케모카인들과 함께 수용체인 CXCR1 및 CXCR2를 통해 호중구를 폐로 유인하는 데 필수적인 역할을 합니다6. 사이토카인 IL-1β, IL-6, TNF-α는 이 과정을 더욱 촉진하는 반면, IL-10은 이를 억제하는 사이토카인으로 작용합니다. BALF 내 이들 수치는 폐 감염의 중증도 및 세균성, 바이러스성, 비정형 폐렴으로 인한 폐 합병증의 발생과 상관관계가 있음이 밝혀졌으며7, 하기도 감염의 조기 진단 및 병원체 식별을 위해 다중 BALF 바이오마커 프로파일이 도입되고 있습니다8.
통상적인 BALF 검사는 일반적으로 해당 검사의 기저에 깔린 생물학적 특성을 완전히 포괄하지 못합니다. 세포 수는 사이토스핀(cytospin) 시료의 세포를 수동으로 구분하여 추정할 수 있는 반면, 수용성 매개체는 개별 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)을 사용하여 측정하고 막대그래프로 표시합니다. 케모카인, 사이토카인 및 각 세포 유형은 개별적으로 평가되며, 특정 케모카인 농도 기울기와 해당 케모카인이 시료 내에서 영향을 미치는 세포 집단 간의 상관관계는 설정되지 않습니다. 다변량 분석이 수행되지 않을 경우, 사이토카인 모듈의 조합, 케모카인-중성구의 용량-반응 관계, 그리고 고유한 염증 시그니처를 가진 환자 하위 집단들의 특성이 간과되는 경우가 많습니다9.
계산 능력의 발전으로 이러한 총체적인 접근 방식이 점차 현실화되고 있습니다. 다매개변수 유세포 분석(multiparameter flow cytometry) 및 스펙트럼 유세포 분석(spectral flow cytometry)을 t-분포 확률적 이웃 투영(t-SNE) 또는 균일 매니폴드 근사 및 투영(UMAP)과 같은 차원 축소 기법과 결합하면, 고차원의 면역 표현형을 2차원 공간으로 매핑할 수 있으며, 특히 UMAP은 유세포 분석 데이터에 적용했을 때 전체적인 위상 유지력과 재현성이 더 우수한 것으로 입증되었습니다10. 사이토카인의 다중 분석 패널을 사용하고 이어서 계층적 군집 분석(hierarchical clustering) 및 상관관계 네트워크를 적용하면, 단일 사이토카인 분석법으로는 식별할 수 없는 중증도 관련 시그니처를 확인하는 데 도움이 됩니다11. 이러한 분야의 진전에도 불구하고, 호흡기 감염 시 동일한 기관지 세척액(BALF) 검체에서 호중구 모집과 사이토카인 시그니처를 함께 연구하기 위해 이러한 방법들을 통합한 워크플로우는 아직 없는 실정입니다. 본 연구에서는 세포학 및 다매개변수 유세포 분석을 이용한 호중구 모집 조사와, 이어서 멀티플렉스 면역 분석을 통한 UMAP 및 사이토카인 시그니처 분석, 그리고 계층적 군집 분석, 상관 행렬 및 주성분 분석(principal component analysis)을 포함하는 통합 시각화 워크플로우를 설명합니다. 이 워크플로우는 하기도 감염 시 임상적으로 필요한 기관지경 검사 중에 통상적으로 채취하는 BALF 샘플을 사용하여, 기도의 세포성 및 수용성 면역 판독값을 단일 그래프에 담아내는 통합 시각화 결과를 제공합니다.
프로토콜
연구 대상 및 윤리
본 연구는 2026년 1월부터 2026년 4월까지 3차 교육 병원에서 수행된 단일 센터 전향적 관찰 연구였습니다. 연구 프로토콜은 승인 번호 2026HL-038로 승인되었으며, 모든 연구 절차 이전에 모든 참여자로부터 서면 동의서를 얻었습니다.
정기적인 임상 진료의 일환으로 기관지폐포 세척술(BAL)을 포함한 진단적 쇄굴성 기관지경 검사를 받는 18세에서 75세 사이의 성인을 연속적으로 모집하였으며, 최종 임상 및 미생물학적 진단 결과에 따라 감염군 또는 비감염 대조군으로 배정하였습니다. 환자 모집부터 통합 시각적 출력물까지의 통합 시각화 워크플로우 개요는 그림 1에 나타나 있습니다.
그림 1BALF 기반의 호중구 모집 및 염증성 사이토카인 반응 프로파일링을 위한 통합 시각화 워크플로우 개요. 다섯 단계는 왼쪽에서 오른쪽 순으로 각각 기관지경 검사와 기관지폐포 세척술(BAL)을 통한 감염군 및 대조군의 전향적 모집, BALF의 세포 펠렛(cell pellet) 및 상층액 분획으로의 전처리, 세포 측정(Wright–Giemsa 세포학 및 다중 파라미터 유세포 분석)과 수용성 측정(13-플렉스 비드 기반 면역 분석)의 병행, 통합 시각화 파이프라인(FlowSOM 메타 클러스터링을 이용한 UMAP, 계층적 히트맵, 주성분 분석 및 Spearman 상관관계 네트워크), 그리고 통합 시각적 출력물을 요약하여 보여줍니다. 약어: BAL = 기관지폐포 세척술; BALF = BAL 액; UMAP = 균일 매니폴드 근사 및 투영. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
감염군 포함 기준은 다음과 같습니다: (1) 미국 감염학회(IDSA) 및 미국 흉부학회(ATS) 가이드라인에 따라 지역사회 획득성 폐렴(CAP), 병원 획득성 폐렴(HAP) 또는 인공호흡기 관련 폐렴(VAP)으로 진단된 환자; (2) BALF 배양 결과 104 CFU/mL 이상의 병원균 검출, 호흡기 다중 중합효소 연쇄 반응(PCR), BALF의 메타게놈 차세대 염기서열 분석, 또는 쌍을 이룬 호흡기/혈청 검체로부터의 특정 항원/항체 검사 중 하나 이상의 방법으로 병원균이 검출된 경우.
대조군 선정 기준은 다음과 같았습니다: (1) 불확정 폐결절의 평가, 감염이 의심되지 않는 비정상적 방사선 결과, 또는 만성 기침 검사와 같이 기관지 내시경 검사가 필요한 비감염성 사유가 있는 경우; (2) 미생물 검사 결과가 음성이고 기관지 내시경 검사 당시 염증이나 전신 감염 징후가 없어 급성 폐감염이 없는 경우; (3) 참여 전 30일 동안 항생제를 사용하지 않은 경우. 대조군은 건강한 자원봉사자가 아니라 임상적으로 지시된 다른 폐 질환으로 기관지 내시경 검사를 받는 환자들 중에서 모집하였으며, 이는 해당 연구 센터에서 임상적으로 BAL이 일상적으로 수행되는 환자군을 반영한 것입니다.
제외 기준은 다음과 같습니다: (1) 최근 6개월 이내의 악성 종양 및/또는 세포독성 화학요법, (2) HIV 혈청 양성, (3) 고형 장기 또는 조혈모세포 이식, (4) 일일 등가 용량의 프레드니손을 포함한 지속적인 면역억제 치료 > 3주 이상 0.3 mg/kg 투여; (5) 임신 또는 수유 중인 여성; (6) 출혈성 소인 병력 또는 쇄엽 기관지 내시경 검사의 금기 사항; (7) 기존의 중증 만성 호흡기 질환(만성 폐쇄성 폐질환[COPD] GOLD stage III/IV, 특발성 폐섬유증, 중증 지속성 천식 또는 임상적으로 유의한 기관지 확장증); (8) 활동성 결핵; (9) 최근 30일 이내에 다른 중재 연구에 참여한 경우. 기관지 세척액(BAL) 채취는 첫 번째 기관지 내시경 검사 시, 감염으로 인한 입원 후 72시간 이내, 그리고 기계 환기가 필요한 감염 환자의 경우 기관 삽관 후 48시간 이내에 수행되었다.
표본 크기 계산은 주요 세포 결과인 군별 기관지 폐포 세척액(BALF) 내 호중구 수에 중점을 두었습니다. 감염된 기도와 감염되지 않은 기도 사이의 예상 효과 크기를 0.6 SD로 설정하고 15%의 중도 탈락 허용치를 고려했을 때, 양측 검정에서 군당 최소 45명의 피험자가 필요했습니다. α 통계적 검정력 80%에서 p = 0.05로 설정하였다. 적격 후보자 156명 중 27명이 선정 기준을 충족하지 못하였다(18명은 주로 정해진 기간 내에 질병의 원인이 되는 병원체를 식별하지 못했거나 시술 자체에 동의하지 않아 선정 기준을 충족하지 못했으며, 9명은 주로 활동성 악성 종양 또는 화학요법 투여 이력, 만성 코르티코스테로이드 사용, 중증의 기존 만성 폐질환 또는 출혈성 소인으로 인해 제외 기준에 해당하였다). 나머지 129명의 대상자는 기관지 내시경 검사를 받았다. 이후 17명의 대상자가 연구에서 제외되었다(7명은 BALF 회수량 부족으로 인해). < 40%; 입원 중 동의 철회로 인해 4명; 최종 미생물학적 평가 후 피험자 재분류로 인해 6명(배양 결과에 따라 잠재 감염으로 진단된 대조군 후보 4명, 배양 분석 후 감염 증거가 없는 것으로 나타난 감염 후보 2명)이 제외되었습니다. 최종 연구 대상자 군은 감염자 64명과 비감염자 48명을 포함하여 총 112명으로 구성되었습니다.
BALF 수집 및 전처리
기관지 내시경 검사는 숙련된 작업자가 기관지폐포 세척술에 대해 발표된 기술적 권장 사항과 일치하는 표준 기관 프로토콜을 사용하여 수행하였습니다.12리도카인을 국소적으로 도포하였으며, 환자에게는 중등도의 정맥 진정 요법을 시행하는 동시에 산소 포화도(SpO2)를 유지하기 위해 보조 산소를 공급하였다.₂) >92%. 굴곡성 기관지경을 삽입하여 방사선학적 이상 소견이 있는 기관지폐구역에 위치시켰다. 방사선학적 이상 소견이 미만성이거나 국소화할 수 없는 경우에는 우중엽 또는 좌폐설구역을 선택하였다. 각 주입 후에는 음압을 이용한 부드러운 수동 흡인을 수행하였다. < 100 mmHg에서 수행되었습니다. 멸균 식염수를 총 3~5회 주입하였습니다. 37 °C각각 20~40 mL씩, 총 부피 100~150 mL를 투여하였다. 회수율은 투여 부피 대비 회수된 부피로 추정하였으며, 회수율이 40% 이상인 샘플만 분석 대상으로 고려하였다.
기관지 오염을 줄이고 폐포 성분이 풍부한 샘플을 얻기 위해, 두 번째 이후 세척에서 수집한 샘플들을 하나로 모았습니다. 인간 BALF 샘플을 장기간 보관하거나 가온했을 때 세포 구성 및 차등 계산에 변화가 생긴다는 최근의 연구 결과13를 고려하여, 기관지폐포세척액(BALF) 풀을 얼음 위에 유지하고 수집 후 2시간 이내에 처리했습니다. 점액을 걸러내기 위해 공극 크기가 70 microns인 멸균 나일론 메쉬를 사용하여 여과를 수행하였으며, 이때 디티오트레이톨(dithiothreitol)과 같은 점액 용해제나 응집 방지제 없이 기계적 통과만으로 진행했습니다. 이는 사전 테스트 결과, 하위 표면 에피토프의 무결성 손실 없이 점액 덩어리를 제거하기에 충분함이 확인되었기 때문입니다. 여과된 액체는 4 °C에서 400 × g로 10분 동안 원심분리했습니다. 상층액은 데칸테이션 후 사이토카인 분석을 위해 저단백질 결합 크라이오바이알에 분주하였으며, 세포는 0.5% 소혈청 알부민과 2 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)이 포함된 인산완충생리식염수(PBS)에 현탁시킨 후 일부는 세포학적 검사와 유세포 분석을 위해 보관했습니다. 사이토카인 샘플은 액체 질소에 급속 냉동하여 –80 °C에 보관하였으며, 사용 전 동결-해동 주기가 1회를 초과하지 않도록 했습니다.
호중구 세포학 및 유세포 분석 정량화
세포병리학적 분석을 위해, BALF 세포 현탁액 100 µL를 사이토센트리퓨지(cytocentrifuge, 재료 표 참조)를 사용하여 300 × g 에서 5분 동안 유리 슬라이드에 도말한 후, 공기 중에서 건조시키고 Wright-Giemsa 염색을 수행하였습니다. 환자의 의학적 배경을 알지 못하는 혈액학 기술자가 슬라이드당 최소 400개의 세포를 계수하여 대식세포, 림프구, 호중구 및 호산구의 비율을 계산하는 분획 계수를 실시하였습니다. 폐 침윤이 있는 환자에서 감염성 폐 질환과 비감염성 폐 질환을 구분하는 데 유용하다는 현재의 증거를 바탕으로, BALF 내 호중구 비율을 세포병리학의 일차 결과 측정 지표로 설정하였습니다14.
유세포 분석 정량 프로토콜은 최근 검증된 4색 기관지폐포 세척액(BALF) 백혈구 분화 프로토콜을 기반으로 하였습니다.15 그리고 호중구를 식별하기 위해 추가 마커를 포함하였습니다. 구체적으로, 약 5 × 105 BALF에서 분리한 세포는 인간 Fc 수용체 차단 시약(참조 재료 목록)로 10분간 4 °C, 그런 다음 다음 조건에서 20분 동안 염색하였습니다. 4 °C CD45(클론 HI30), CD66b(클론 G10F5), CD15(클론 HI98), CD16(클론 3G8), CD11b(클론 ICRF44), CD14(클론 M5E2) 및 HLA-DR(클론 L243)에 대한 항체와 고정 가능 생존 염색약(참조: 재료 목록). 적혈구 용해를 위해서는 시판 적혈구 용해 용액(참조 재료 표)를 사용하여 실온에서 10분 동안 처리하였습니다. 적혈구 용혈 후, 2% fetal calf serum이 첨가된 PBS로 세포를 2회 세척하고 flow buffer에 재현탁한 다음, 다색 유세포 분석기로 분석하였습니다(참조 재료 목록). 보정은 단일 염색된 보정 비드(compensation beads)를 사용하여 수행하였습니다(참조 재료 목록), 그리고 각 패널마다 fluorescence-minus-one(FMO) 대조군 튜브와 비염색 튜브가 포함되었습니다.
최소 1 × 105 CD45⁺ 각 샘플에 대해 이벤트를 획득하였다. 먼저 FSC-A/FSC-H 도표에서 싱글렛(singlet)을 게이팅한 다음, 생존 세포(생존 염색약)를 게이팅하였다.⁻) CD45⁺ 백혈구, 이후 CD14 제외⁺HLA-DR⁺ 단구-대식세포 분석을 통해 side scatter가 높은 CD66b 양성 세포를 선택하였다.⁺ 과립구. 이후 과립구 군집 내에서 CD15 양성 세포를 호중구로 정의하였다.⁺CD16⁺CD11b⁺ 사건들. 이 일차 CD66b⁺ 과립구 게이트는 CD15로 제한하기보다 모든 높은 측방 산란 이벤트 주변으로 넓게 설정되었습니다.⁺CD16⁺CD11b⁺ 경계선을 설정하여, CD16-dim, CD11b-high 활성 중성구 및 기타 덜 성숙한 과립구 형태들이 전체 자동 중성구 수치 내에 유지되도록 하였으며, 더 엄격한 CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ 정의는 후속 클러스터링 분석에서 별도로 보고된 성숙 호중구 서브셋을 특징짓는 데에만 적용되었습니다. BALF 내 호중구 수(cells/µL)는 자동 혈액 분석기를 사용하여 측정한 호중구 백분율과 총 유핵 세포 수를 기반으로 추정되었습니다 (참조 재료 목록보정 매트릭스, 게이팅 전략 및 개별 샘플 품질 관리 보고서를 보관하였으며, 분석자는 데이터 획득 및 분석 전 과정에서 참가자 그룹 배정 정보를 알 수 없는 맹검 상태를 유지하였다.
다중 염증성 사이토카인 프로파일링
BALF 상청액을 젖은 얼음 위에서 한 번 해동한 후, 짧게 볼텍싱하고 10,000에서 원심분리하여 투명하게 정제하였다. × g 5분 동안 다음 온도에서 4 °C 분석 직전에 준비합니다. 맞춤형 자기 비드 패널이 포함된 멀티플렉스 비드 기반 면역 분석 플랫폼을 사용하여 세 가지 기능적 범주에 속하는 13가지 분석물을 측정하였습니다(참조 재료 목록). 염증 유발 군은 IL-1로 구성되었습니다.β, IL-6, IL-17A 및 TNF-α; 케모카인 그룹은 CXCL8/IL-8, CXCL1/GRO-로 구성되었습니다.α, CXCL10/IP-10, CCL2/MCP-1 및 CCL3/MIP-1α; 그리고 조절 그룹은 IL-10, IFN-으로 구성되었습니다.γ, IL-1RA 및 G-CSF. 분석 대상 물질의 선택은 폐렴/중증 호흡기 감염 연구의 기관지 세척액(BALF) 또는 혈청 사이토카인 다중 분석(multiplex analysis)에서 유용한 정보로 가장 흔히 보고된 항목들을 기반으로 하였다.7,11희석 배수(분석 버퍼 내 1:2)는 감염 샘플과 대조군 샘플 모두의 대표 서브셋을 대상으로 수행한 예비 실험을 통해 결정되었으며, 이는 다음을 보장하기 위함입니다. >측정값의 90%가 표준 곡선 범위 내에 있었습니다.
표준 곡선은 제조사의 재조합 표준품을 7단계로 연속 희석하여 결정하였으며, 배경값을 빼기 위해 블랭크 웰 하나를 포함하여 모든 플레이트에 중복으로 준비하였습니다. 곡선 적합은 해당 기기의 전용 데이터 수집 및 분석 소프트웨어를 통해 5-매개변수 로지스틱(5PL) 회귀 분석으로 수행하였습니다(참조 재료 목록). 정량 하한(LLOQ)은 역추산 회수율(back-fit recovery)이 80%에서 120% 사이이고 분석 내 변동 계수(CV)가 20% 이하인 표준품의 최소량으로 산출하였다. LLOQ 미만인 값은 LLOQ/로 대체하였다.√2. 장기적인 성능을 추적하기 위해, 대표적인 감염 환자와 비감염 피험자로부터 각각 얻은 두 개의 혼합 기관지폐포세척액(BALF) 품질 관리 샘플을 분주하여 각 플레이트에 추가하였다. 품질 보증 표준은 12년간의 다기관 멀티플렉스 비드 기반 분석 숙련도 프로그램에서 도출된 최적 실무 권장 사항을 기반으로 하였다.16중복 웰의 분석 내 변동 계수(CV) ≤ 10%, 품질 관리를 위한 플레이트 간 CV ≤ 20%, 웰당 분석물별 최소 비드 수 ≥ 50개의 요구 사항이 포함되었다. 상기 기준을 충족하지 못한 플레이트는 재시험하였다. 분석은 단일 키트 로트를 사용하여 4주 이내에 단일 배치로 수행되었으며, 감염 샘플과 대조 샘플을 무작위로 교차 배치하였다.
시각화 분석 파이프라인
Flow Cytometry Standard (FCS) 파일은 먼저 상용 유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 분석되었습니다 (참조 재료 목록) 보정하고 살아있는 CD45 세포를 게이팅합니다.⁺ 싱글렛(singlets)을 선별한 후, R v4.4에서 편향 없는 분석을 위해 데이터를 내보냈습니다. 각 샘플당 10,000개의 CD45⁺ 이벤트는 다운샘플링 후 연결되었으며, 신호 강도는 보정 계수(cofactor) 150의 arcsinh 함수를 사용하여 변환되었습니다. 차원 축소 및 UMAP 투영은 uwot 패키지를 사용하여 최근접 이웃(nearest neighbors) 15개 및 최소 거리 0.1로 수행되었으며, perplexity 30의 Rtsne 패키지를 사용한 병렬 t-SNE 임베딩이 함께 수행되었습니다.10100개의 자기조직화지도(self-organizing map) 노드를 갖춘 FlowSOM을 사용하여 표현형 클러스터를 식별하였으며, 최근 고차원 사이토메트리 데이터에 대해 검증된 최적화 기반 접근 방식을 통한 메타 클러스터링을 통해 이를 12~15개의 클러스터로 추가 세분화하였다.17각 클러스터는 계통 및 활성화 마커의 중앙값 발현량을 기준으로 주석을 달았으며, 수동 게이트와 대조하여 검토하였습니다.
멀티플렉스 사이토카인 데이터 분석을 위해, 먼저 원시 값에 log₁₀ 변환을 수행한 후, 추가 분석 전 z-scoring을 통해 분석물 간의 표준화를 진행하였습니다. 분석물과 환자 모두 유클리드 거리(Euclidean distance)와 Ward.D2 연결법을 사용하여 계층적 군집 분석을 수행하였으며, 그 결과는 행과 열이 군집화된 히트맵으로 표시하였습니다. 이러한 접근 방식은 멀티플렉스 염증 코호트에서 공동 발현되는 사이토카인 모듈을 탐지하고 환자 하위 그룹을 분류하는 데 사용되었습니다9. 모든 세포성 및 수용성 바이오마커에 대해 쌍별 Spearman 순위 상관 분석을 사용하여 상관 행렬을 생성하였습니다. 상관 행렬의 히트맵을 노드가 바이오마커에 해당하고 엣지가 Benjamini–Hochberg (BH) 방법을 이용한 다중 검정 보정 후에도 유의미한 상관관계를 나타내는 네트워크와 함께 도식화하였습니다. 엣지의 너비는 상관 계수의 크기 |ρ|에 따라 조정되었으며, 보정 후 |ρ| ≥ 0.30 및 p < 0.05인 경우에만 엣지를 포함하였습니다. 단위 분산 스케일링이 적용된 prcomp() 함수를 사용하여 세포와 사이토카인을 포함하는 표준화된 행렬에 대해 주성분 분석(PCA)을 수행하였습니다. 감염군과 대조군을 중첩하여 첫 두 개의 주성분에 참여자들을 투영하였습니다. 모든 분석에서 일관된 다운샘플링과 표준화를 거쳐 모든 시각화 자료에서 세포성 및 수용성 바이오마커 판독값 간의 비교 가능성을 확보하였습니다.
통계 분석
연속형 변수는 Shapiro–Wilk 검정에 따라 정규 분포를 따르지 않는 경우 중앙값(사분위간 범위, IQR)으로, 그렇지 않은 경우 평균(표준 편차, SD)으로 기술하였습니다. 범주형 변수는 빈도와 비율로 기술하였습니다. 그룹 간 비교는 연속형 변수가 비정규 분포를 보일 때는 Mann–Whitney U 검사를, 정규 분포를 보일 때는 Welch t-검사를 사용하였으며, 범주형 변수의 경우 해당 시 카이제곱 검사 또는 Fisher의 정확 검사를 수행하였습니다. 연속형 변수 간의 연관성은 Spearman 순위 상관계수를 통해 평가하였습니다. 다중 사이토카인 및 상관관계 분석에서 허위 발견율(FDR)을 고려하기 위해 p-값은 Benjamini–Hochberg 방법을 사용하여 조정하였으며, 기준점은 q < 0.05로 설정하였습니다. 모든 1차 분석에서 양측 p < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였습니다. 가능한 경우, 개별 변수의 데이터가 누락된 사례는 유지하여 해당 변수에 대해 완전 사례 분석(complete-case analysis)을 수행하였으며, 민감도 분석을 위해 연쇄 방정식(m = 20)을 이용한 다중 대체법을 수행하였습니다. 전체 연구 코호트를 대상으로 pROC 패키지를 사용하여 개별 사이토카인에 대한 ROC 곡선 및 해당 곡선 아래 면적(AUC)을 생성하였으며, 별도의 외부 검증 코호트는 사용하지 않았습니다. 사전 지정된 민감도 분석에서는 기관지 내시경 검사 전 72시간 이내에 항생제를 투여받은 참가자를 제외한 후, 그리고 감염 그룹을 기계 환기 상태 및 폐렴 하위 유형(지역사회 획득성, 병원 획득성 또는 인공호흡기 관련)으로 층화한 후 1차 그룹 비교를 반복하였습니다. 분석은 R v4.4의 rstatix, FlowSOM, uwot, ComplexHeatmap, igraph, pROC 및 mice 패키지를 사용하여 수행되었습니다. 그림은 상용 과학 그래프 소프트웨어를 사용하여 생성하였습니다(재료 표 참조).
결과
연구 대상 및 샘플 특성
최종 분석 코호트는 총 112명의 피험자로 구성되었으며, 감염군 64명과 비감염 대조군 48명이 포함되었습니다. 표 1에 나타난 바와 같이, 기선 인구통계학적 특성은 두 그룹 간에 유사했으나, 감염 관련 실험실 파라미터는 감염군에서 더 높게 나타났습니다. 감염은 주로 그람 음성균에 의해 발생했으며, 주요 세균성 병원체는 Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa 및 Acinetobacter baumannii였습니다. 그 외 병원체로는 Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, 비정형 병원체, 바이러스 및 혼합 감염이 있었습니다.
BALF 회수율은 모든 보존된 샘플에서 ≥40%라는 사전 정의된 임계값을 충족하였으며, 감염군이 대조군에 비해 약간 낮은 회수율을 보였는데(중앙값 48.3% vs 53.3%, p = 0.03), 이는 감염된 기도의 기도 염증 및 점막 충혈 증가와 일치하는 결과입니다. 회수된 부피 또한 군 간에 차이가 있었으므로(58 mL vs 64 mL, p = 0.04), 보고된 모든 사이토카인 농도는 희석 인자의 군 간 약간의 차이에 영향을 받았을 수 있습니다. 회수율이 ≥50%인 샘플(감염군 n = 42, 대조군 n = 34)로 제한하여 수행한 사전 정의된 민감도 분석 결과, 모든 군 간 비교의 방향과 크기가 동일하게 재현되었으며(효과 크기의 최대 변화 < 8%), 이는 희석 편향이 관찰된 차이의 원인이 될 가능성이 낮음을 나타냅니다. 수집부터 처리까지 소요된 시간은 감염군 65분, 대조군 62분으로, 2시간 이내의 기준을 유지하였습니다. 샘플 수준의 품질 관리(QC) 기준은 결과의 품질이 높음을 나타냈습니다. 세포학적 분획 계산은 112/112개 샘플 전체(100%)에서 ≥400개의 세포 수를 기반으로 수행되었습니다. 유세포 분석 획득 결과는 112/112개 샘플 전체(100%)에서 ≥1 × 105 CD45⁺ 이벤트라는 사전 정의된 기준을 충족하였으며, 살아있는 세포의 생존율 중앙값은 89.4%(IQR 85.6–92.8%)였습니다. 모든 멀티플렉스 사이토카인 플레이트는 단 한 번의 재시험 후 QC 기준을 충족하였습니다. 13가지 분석물 모두에 대해 분석 내 변동 계수(CV)는 4.7%(2.1–9.3%, 모두 <10%)였고, 풀링된 QC 샘플의 플레이트 간 CV는 11.2%(6.8–18.4%, 모두 <20%)였으며, 비드의 중앙값은 웰당 분석물당 78 이벤트(53–142, 모두 ≥ 50)였습니다.
| 변수 | 감염군 (n = 64) | 대조군 (n = 48) | p 값 |
| 연령, years, 중앙값 [IQR] | 62 [54–71] | 60 [52–68] | 0.41 |
| 남성, n (%) | 38 (59.4) | 26 (54.2) | 0.59 |
| BMI, kg/m2, 중앙값 [IQR] | 23.8 [21.4–26.2] | 23.5 [21.6–25.7] | 0.66 |
| 흡연력, n (%) | 0.52 | ||
| 비흡연 | 28 (43.8) | 25 (52.1) | |
| 과거 흡연 | 22 (34.4) | 16 (33.3) | |
| 현재 흡연 | 14 (21.9) | 7 (14.6) | |
| 고혈압, n (%) | 27 (42.2) | 18 (37.5) | 0.62 |
| 당뇨병, n (%) | 17 (26.6) | 10 (20.8) | 0.49 |
| 관상동맥성 심장질환, n (%) | 11 (17.2) | 6 (12.5) | 0.51 |
| 만성 신장질환, n (%) | 5 (7.8) | 3 (6.3) | 0.76 |
| 기관지내시경 적응증, n (%) | — | ||
| 지역사회 획득성 폐렴 | 35 (54.7) | — | |
| 병원 획득성 폐렴 | 19 (29.7) | — | |
| 인공호흡기 관련 폐렴 | 10 (15.6) | — | |
| 미분류 폐결절 | — | 23 (47.9) | |
| 지속적인 방사선학적 이상 | — | 15 (31.3) | |
| 만성 기침 평가 | — | 10 (20.8) | |
| 원인 병원체, n (%) | — | ||
| 그람 음성균 | 28 (43.8) | ||
| 그람 양성균 | 16 (25.0) | ||
| 비정형 병원체 | 7 (10.9) | ||
| 호흡기 바이러스 | 8 (12.5) | ||
| 혼합 감염 | 5 (7.8) | ||
| BAL 시 인공호흡기 적용, n (%) | 14 (21.9) | 0 (0) | <0.001 |
| BAL 전 72시간 이내 항생제 노출, n (%) | 41 (64.1) | 0 (0) | <0.001 |
| 주입량, mL, 중앙값 [IQR] | 120 [120–140] | 120 [120–140] | 0.84 |
| 회수량, mL, 중앙값 [IQR] | 58 [49–68] | 64 [55–73] | 0.04 |
| BALF 회수율, %, 중앙값 [IQR] | 48.3 [42.5–55.6] | 53.3 [46.2–60.5] | 0.03 |
| 처리까지의 시간, min, 중앙값 [IQR] | 65 [50–85] | 62 [48–80] | 0.55 |
| 혈액 WBC, × 10⁹/L, 중앙값 [IQR] | 11.8 [8.6–14.5] | 6.4 [5.3–7.8] | <0.001 |
| 혈액 호중구, %, 중앙값 [IQR] | 78.5 [70.2–86.4] | 60.3 [54.6–66.8] | <0.001 |
| C-반응성 단백질, mg/L, 중앙값 [IQR] | 78.5 [42.6–128.4] | 4.2 [1.8–8.6] | <0.001 |
| 프로칼시토닌, ng/mL, 중앙값 [IQR] | 0.86 [0.32–2.45] | 0.05 [0.03–0.08] | <0.001 |
표 1: 연구 코호트의 인구통계학적, 임상적 및 BALF 처리 특성. 기초 인구통계학적 특성, 동반 질환, 기관지경 검사 적응증, 원인 병원체, 시술 파라미터 및 말초혈액 검사 수치를 감염군 64명과 비감염 대조군 48명 간에 비교하였습니다. 연속형 변수는 중앙값 [사분위수 범위]로 표시하고 Mann–Whitney U 검정으로 비교하였으며, 범주형 변수는 n (%)으로 표시하고 카이제곱 검정 또는 해당되는 경우 Fisher의 정확 검정을 사용하여 비교하였습니다. 약어: BAL = 기관지폐포 세척; BALF = 기관지폐포 세척액; BMI = 체질량 지수; IQR = 사분위수 범위; WBC = 백혈구 수.
BALF 중성구 모집의 시각화
그림 2에서 보여주는 바와 같이, 감염된 피험자들 사이에서 대식세포 중심의 군집에서 중성구 중심의 군집으로 비율이 뚜렷하게 전환되었음이 관찰되었습니다. 세포원심분리법(cytocentrifuge)으로 준비한 표본을 Wright–Giemsa 염색법으로 염색한 결과, 두 그룹 간의 명확한 구분이 나타났습니다. 대조군은 폐포 대식세포, 일부 림프구 및 소수의 중성구가 더 많았던 반면, 감염군은 세포 내 세균이 빈번하게 관찰되고 핵의 퇴행 및 독성 과립화를 동반한 중성구가 지배적이었습니다. 최소 400개의 세포를 계수한 차등 계산을 통해 이러한 차이를 검증하였으며, 중성구 비율은 대조군의 중앙값 3.2% (IQR: 1.8–5.6%)에서 감염군의 68.4% (IQR: 49.2–82.5%)로 증가하였고 (p < 0.001), 폐포 대식세포의 비율은 88.2% (IQR: 82.4–92.5%)에서 22.6% (IQR: 12.3–38.5%)로 감소하였습니다 (p < 0.001). 림프구 백분율은 두 그룹 간에 유사하게 나타났습니다 (7.4% [4.8–11.3%] vs 6.5% [3.4–11.2%], p = 0.42).
게이팅 및 차원 축소 분석을 통해 현미경으로 관찰된 세포 표현형이 확인되었으며 그 범위가 확장되었습니다. 데브리, 더블렛 및 사멸 세포를 제외한 후, 감염군의 CD45⁺CD66b⁺ 과립구는 CD45⁺ 백혈구의 중앙값 65.8% (IQR: 46.2–79.4%)를 차지한 반면, 대조군은 4.1% (IQR: 2.3–6.8%)를 차지했습니다 (p < 0.001). 과립구 집단 내에서, CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ 성숙 호중구는 감염군 전체 과립구의 92.4% (IQR: 87.5–95.8%), 대조군의 88.6% (IQR: 82.3–93.5%)를 차지하여, 모집된 호중구 풀이 초기 전구세포보다는 주로 성숙하고 완전히 분화된 세포로 구성되어 있음을 나타냈습니다. arcsinh 변환된 표면 단백질 행렬 기반의 UMAP 및 t-SNE 투영 결과 거의 동일한 위상 구조를 보였으며, 감염 사례는 대조군 샘플에서는 드물게 나타나는 CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ 성숙 호중구의 뚜렷한 아일랜드 영역을 차지한 반면, HLA-DR⁺CD14⁺ 폐포 대식세포 아일랜드는 대조군에서 밀집되고 감염군에서 희소하게 나타나는 상반된 패턴을 보였습니다. FlowSOM을 이용한 메타 클러스터링 결과 13개의 하위 집단이 확인되었으며, 그중 성숙 호중구 하위 집단 (38.4% [22.6–56.2%] vs 2.8% [1.5–4.6%], p < 0.001)과 활성화된 CD16-dim CD11b-high 호중구 클러스터 (22.6% [11.4–32.5%] vs 0.4% [0.1–1.2%], p < 0.001)가 그룹 간 가장 큰 확장세를 보였습니다.
절대 호중구 수의 경우, 감염군에서의 BALF 호중구 수는 대조군에 비해 약 50배 증가하였습니다. BALF µL당 총 유핵 세포 수는 대조군의 156 cells/µL (IQR 88–232)에서 감염군의 384 cells/µL (IQR 180–712)로 증가하였으며 (p < 0.001), 호중구 수는 대조군의 5 cells/µL (IQR 2–13)에서 감염군의 262 cells/µL (IQR 89–578)로 증가하였습니다 (p < 0.001). 군 간의 호중구 백분율 및 절대 수의 쌍별 차이는 Benjamini–Hochberg (BH) 보정 후에도 매우 유의미하게 유지되었습니다 (q < 0.001).
그림 2: BALF 호중구 모집의 시각화. 대조군 참가자와 감염군 참가자의 대표적인 Wright–Giemsa 염색 사이토스핀(cytospin) 영역은 대식세포 중심에서 호중구 중심으로 변화한 BALF 세포 프로필을 보여준다. 4단계 유세포 분석 게이팅 전략(FSC 단일 세포 → live CD45⁺ 백혈구 → CD14⁺HLA-DR⁺ 제외 후 CD66b⁺ 과립구 → CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ 성숙 호중구), 생물학적 주석으로 색상을 구분하고 FlowSOM 13-메타클러스터 오버레이를 적용한 arcsinh 변환 유세포 분석 데이터의 UMAP 임베딩, 그리고 BALF 호중구 백분율 및 절대 호중구 농도(cells/µL, 로그 스케일)의 박스 플롯이 나란히 표시되어 감염군과 대조군에서 확인된 세포 표현형을 직접 비교할 수 있다. 약어: BALF = 기관지폐포 세척액; FSC = 전방 산란광; UMAP = 균일 매니폴드 근사 및 투영. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
BALF 염증성 사이토카인 프로필의 시각화
그림 3에서 보는 바와 같이, 여러 사이토카인 축에 걸친 조정된 반응 패턴이 감염군과 대조군을 구분하였으며, 사이토카인들은 세 개의 일관된 기능적 모듈로 그룹화되었습니다. Ward.D2 방법을 사용하여 log₁₀ 변환 및 정규화된 사이토카인 농도를 클러스터링한 결과, 샘플들이 두 그룹으로 명확히 나뉘는 덴드로그램이 생성되었으며, 감염 샘플과 대조군은 덴드로그램의 양 끝단에 위치하였습니다. 오분류된 참가자는 단 7명에 불과했습니다(대조군 중 6명은 감염 샘플과 클러스터링되었으며 이들은 주로 경미한 호중구성 기도 염증을 동반한 만성 기침 사례였고, 감염 샘플 중 1명은 대조군과 클러스터링되었으며 초기 비정형 폐렴에 해당하였습니다). 분석 물질의 덴드로그램은 세 가지 사이토카인 클러스터를 정의했습니다. CXCL8, CXCL1, CXCL10, CCL2 및 CCL3로 구성된 케모카인 클러스터는 감염군과 대조군 사이에서 가장 큰 배수 변화(fold change)와 가장 높은 모듈 내 상관관계를 보였습니다. IL-1β, IL-6, IL-17A 및 TNF-α를 포함하는 전염증성 클러스터는 유사한 방향의 상승을 보였으나 그 정도는 다소 덜 뚜렷했습니다. IL-10, IL-1RA, IFN-γ 및 G-CSF를 포함하는 조절 클러스터 또한 감염 샘플에서 상승하였으며, 이는 반응이 단순히 전염증적인 것이 아니라 항조절 및 항바이러스 기전이 병행되었음을 나타냅니다.
모든 테스트 분석물의 중앙값(IQR)은 대조군에 비해 감염군에서 더 높았으며, BH 기반 허위 발견율(BH-FDR) 보정 후 13가지 모든 분석물에 대한 보정 p 값은 0.001 미만이었다. 분석물 중에서 CXCL8/IL-8이 가장 높은 농도와 가장 가파른 배수 변화를 보였다(대조군 68 [32–142] pg/mL에서 감염군 2,485 [842–6,520] pg/mL로 약 36배 증가). CXCL1/GRO-α에서도 약 21배 증가(78 [36–148] vs 1,672 [524–3,890] pg/mL)하며 유사한 패턴이 나타났다. IL-1β는 약 13배 증가(5.8 [2.6–11.4] vs 78 [29–184] pg/mL)를 보였다. IL-6, IL-1RA 및 G-CSF는 각각 13~16배 증가하였다(16.4 [7.8–30.5] vs 248 [82–612] pg/mL; 112 [48–258] vs 1,748 [658–3,964] pg/mL; 24 [10–52] vs 384 [125–912] pg/mL). 그 외 상대적으로 적게 증가한 항목으로는 TNF-α(~8배), CXCL10/IP-10(~9배), CCL2/MCP-1(~8배), CCL3/MIP-1α(~10배), IL-10(~10배), IFN-γ(~6배), IL-17A(~4배)가 있었다.
코호트 내 수신자 조작 특성(receiver operating characteristic) 분석 결과, 감염군과 대조군 사이에서 단일 마커로서 가장 강력한 판별력을 보인 분석물은 IL-8 (AUC 0.94), IL-1β (AUC 0.92), IL-6 (AUC 0.91), CXCL1 (AUC 0.91) 및 G-CSF (AUC 0.89)로 확인되었습니다. 이 AUC 값들은 별도의 외부 검증 세트가 없는 상태에서 분석 코호트 내의 판별력을 요약한 것입니다. 연쇄 방정식에 의한 다중 대체(multiple imputation by chained equations, m = 20)를 이용한 민감도 분석 결과, 모든 분석물에 대해 완전 사례(complete-case) 중앙값의 5% 이내에서 추정치가 산출되었으며, 효과 크기의 순위 순서에는 변화가 없었습니다.
이전의 항생제 노출 및 폐렴 하위 유형이 관찰된 사이토카인 차이에 미치는 영향을 평가하기 위해 사전 지정된 민감도 분석을 수행하였습니다. BAL 전 72시간 이내에 항생제를 투여받은 감염군 참여자 41명(64.1%)을 제외하고 기본 그룹 비교를 반복했을 때, BH-FDR 보정 후에도 13가지 분석물 모두 나머지 23명의 감염 사례에서 대조군보다 유의하게 높게 유지되었으며(상위 5개 판별 인자의 경우 보정 p < 0.001), 점 추정치는 전체 코호트 중앙값보다 약간 더 높게 나타났습니다(예: CXCL8/IL-8 2,860 [980–7,110] pg/mL 및 IL-1β 92 [34–210] pg/mL). 이는 BAL 전 항생제 노출로 인해 기도 사이토카인이 부분적으로 억제되었음을 시사합니다. 폐렴 하위 유형별로 감염군을 층화하여 분석한 결과, 지역사회 획득성 폐렴(n = 35), 병원 획득성 폐렴(n = 19) 및 인공호흡기 관련 폐렴(n = 10) 전반에서 케모카인과 염증성 사이토카인의 동일한 순위 서열이 확인되었으며, 인공호흡기 관련 폐렴 하위 그룹에서 CXCL8, CXCL1, IL-6 및 G-CSF의 중앙값이 가장 높게 나타났습니다. 또한, 기계적 환기 상태는 그룹 간 비교의 방향성을 변화시키지 않았습니다.
그림 3: BALF 염증성 사이토카인 프로파일의 시각화. 모든 112명의 대상자에 대해 측정된 13가지 분석물의 log₁₀ 변환 및 z-점수화된 농도를 나타낸 계층적 클러스터링 히트맵이며, 히트맵 상단의 색상 표시 막대는 그룹 할당(대조군, 감염군), 폐렴 하위 유형(CAP, HAP 또는 VAP 폐렴) 및 원인 병원체 범주(그람 음성, 그람 양성, 비정형, 바이러스 또는 혼합 감염)를 나타낸다. 주요 차등 발현 사이토카인(CXCL8/IL-8, IL-1β, IL-6, CXCL1/GRO-α, G-CSF 및 TNF-α; log₁₀ 스케일, pg/mL)의 박스 플롯을 통해 감염군과 대조군을 비교하였다. *** p < 0.001 (BH 허위 발견율 보정 후). 약어: BALF = 기관지폐포 세척액; BH = Benjamini–Hochberg; CAP = 지역사회 획득성 폐렴; HAP = 병원 획득성 폐렴; VAP = 인공호흡기 관련 폐렴. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
호중구 모집 및 사이토카인 프로필의 결합 시각화
그림 4에서 보듯, 세포 성분과 수용성 성분을 결합하여 분석한 결과 호중구 모집과 케모카인 시스템 사이에 강력한 생물학적 연관성이 있음이 밝혀졌습니다. 표준화된 세포 및 사이토카인 행렬의 주성분 분석(PCA)을 통해 2차원 묘사도를 도출하였으며, PC1은 전체 분산의 51.1%, PC2는 추가로 12.7%를 설명하여 누적 63.8%의 설명력을 보였습니다. PC1은 감염군과 대조군을 분리하였는데, BALF 호중구, CXCL8, CXCL1, IL-6, IL-1β 및 G-CSF에서는 높은 양의 로딩값을, 대식세포에서는 높은 음의 로딩값을 나타내는 것이 특징이었습니다. PC2는 케모카인이 풍부한 궤적(CXCL8 및 CXCL1에서 높은 양의 로딩값)과 조절 인자가 풍부한 궤적(IL-10, IL-1RA 및 IFN-γ에서 양의 로딩값)을 구분하였습니다. 이에 따라 감염군 내에서 참여자들은 중증도에 따라 분리되는 경향을 보였으며, 기계 환기 치료를 받은 인공호흡기 관련 폐렴 사례들은 고케모카인 사분면에 속했습니다.
17가지 세포 및 가용성 특성 간의 쌍별 Spearman 순위 상관관계 분석 결과, BALF 중성구 수와 전반적인 케모카인 축(CXCL8 ρ = 0.78; CXCL1 ρ = 0.74; CCL3 ρ = 0.69; CCL2 ρ = 0.61; CXCL10 ρ = 0.54; 모든 보정 p < 0.001) 사이에 강한 양의 상관관계가 있음이 밝혀졌습니다. 두 번째 수준의 유의미한 상관관계는 중성구 수와 전염증성 축(G-CSF ρ = 0.65; IL-1β ρ = 0.62; IL-6 ρ = 0.58; TNF-α ρ = 0.51) 사이에서 검출되었으며, 이어서 조절 축(IL-10 ρ = 0.45; IL-1RA ρ = 0.48)과 중간 정도의 양의 상관관계를 보였습니다. 대식세포의 비율은 케모카인 및 전염증성 축 모두와 유사한 강도로 거울상 음의 상관관계를 나타냈습니다. 축 내 상관관계는 축 간 상관관계보다 실질적으로 더 강했으며(축 내 중앙값 |ρ| = 0.68 vs. 축 간 중앙값 |ρ| = 0.33), 이는 케모카인, 전염증성 및 조절 축을 제어하는 공통 상위 조절 경로라는 개념을 뒷받침합니다.
상관관계 네트워크는 이러한 결합을 그래프로 매핑하였으며, 여기서 BALF 호중구(neutrophils)가 가장 중심적인 허브 노드로 나타났고, 사이토카인과 연결된 13개의 엣지(edge) 모두가 다중 검정에 대한 BH 보정을 거친 후에도 유효하게 유지되었다. 17개 특성 간에 가능한 136개의 쌍별 연결 중 |ρ| ≥ 0.30 및 BH 보정 p < 0.05라는 공동 기준을 충족한 99개가 유지되었다. 상관관계 네트워크 그래프는 계층적 군집 분석에서 얻은 클러스터와 일치하는 명확한 3개 블록의 모듈 구조를 보여주었다. 가장 조밀하고 강한 연결은 케모카인 모듈과 BALF 호중구 수 및 백분율 사이에 나타났으며, 중간 정도의 가중치 연결은 전염증성(pro-inflammatory) 모듈을 호중구 및 케모카인 모듈 모두와 연결했다. 조절(regulatory) 모듈에서 뻗어 나온 얇은 연결들은 케모카인 블록과 전염증성 블록을 연결했다. 대식세포(macrophage) 백분율 노드는 호중구-케모카인 블록의 반대편에 위치하며, 음의 가중치를 가진 엣지들의 부채꼴 형태로 연결되어 있었다. 종합적으로 PCA, 상관행렬 및 네트워크 그래프는 개별 참가자 수준에서 BALF 호중구 침윤과 케모카인 반응이 강하게 연관되어 있으며, 전염증성 및 조절 경로가 이 호중구-케모카인 축을 중심으로 잘 정의되어 있으면서도 상호 연결된 모듈 역할을 한다는 일관된 패턴을 보여주었다.
그림 4: 호중구 보충 및 염증성 사이토카인 프로파일의 결합 시각화. 그룹별로 색상이 지정된 참가자들의 표준화된 세포 및 사이토카인 매트릭스에 대한 주성분 분석 바이플롯, Spearman 상관관계 히트맵, 그리고 17가지의 모든 세포 및 가용성 특성에 대한 네트워크 그래프(노드 크기는 degree에 따라 지정, 엣지는 |ρ|에 따라 스케일링되었으며 BH 보정 p < 0.05 및 |ρ| ≥ 0.30으로 필터링됨)이며, 호중구-케모카인 허브를 강조함. 약어: BH = Benjamini–Hochberg; PC = 주성분. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
데이터 가용성:
본 연구에 사용된 비식별 처리된 참가자 수준 데이터 세트와 R 분석 코드는 보충 표 S1 및 보충 파일 1로 제공됩니다. 본 연구의 결과를 뒷받침하는 기타 데이터는 합리적인 요청이 있을 경우 교신 저자로부터 제공받을 수 있습니다.
보충 표 S1: BALF 데이터 세트. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 분석 코드가 포함된 ZIP 파일.이 파일을 다운로드하시려면 여기를 클릭하십시오.
토론
본 프로토콜의 견고함은 분석 전과 분석 중에 내린 몇 가지 결정에 달려 있습니다. 하한 회수율을 40%로 설정하고 두 번째 이후의 분주액(aliquot)들을 통합한 것은 의도적인 결정이었습니다. 이는 첫 번째 분주액에 기관지 기도 물질이 더 많이 농축되어 있으며, 회수율이 연령, 성별, 흡연력 및 대상 기관지에 따라 체계적으로 달라지기 때문입니다18. Fc 수용체를 차단하고 개별 클론에 대한 항체 역가를 조절하여 성숙한 CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ 호중구와 CD14⁺HLA-DR⁺ 폐포 대식세포(BALF 샘플에서 비특이적 염색과 자가형광 배경이 가장 높은 우세 세포군) 사이의 정확한 게이팅 경계를 확보하는 것은 두 그룹 간의 일관성을 유지하는 데 필수적입니다19,20. 동결-해동 횟수 제한과 멀티플렉스 분석을 위한 2시간의 시간 제한 또한 임의적인 것이 아닙니다. 인간 BALF 데이터에 따르면, 4 °C에서 보관하더라도 6시간에서 24시간 사이에 호중구 비율이 유의하게 감소한 반면, 대식세포와 림프구 비율은 일정하게 유지되었습니다13. t-SNE 및 UMAP 알고리즘의 파라미터와 FlowSOM 100-노드 그리드 및 12~15개 메타클러스터의 파라미터는 그룹 분석 전에 미리 결정되었습니다. 이는 사이토메트리 파이프라인의 재현성 결여 원인 중 하나로 알려진 사후 조정(post hoc tuning)을 방지하기 위함입니다16. 향후 대규모 분석에서 배치 보정(batch-correction) 방법을 적용할 수 있도록 세포 이벤트별로 작업자 및 플레이트/런 식별 정보를 유지할 수 있습니다21.
프로토콜 수정이 필요하지 않은 몇 가지 일반적인 실패 모드가 있습니다. 낮은 회수율 (<40%)은 일반적으로 불충분한 웨지 위치 선정이나 과도한 흡입으로 인해 발생합니다. 이 문제는 기관지경 위치를 조정하고 다른 분주액을 흡입하기 전에 흡입력을 <100 mmHg로 낮추어 해결해야 합니다. 폐 세포 유세포 분석의 주요 교란 요인인 폐포 대식세포의 과도한 자가형광은 매 배치마다 염색되지 않은 폐 세포 대조군을 포함하고, 생존 염색제에만 의존하기보다는 고측방 산란(high-side-scatter) 대식세포 게이트를 명확하게 정의함으로써 완화할 수 있습니다19. 멀티플렉스 패널은 일반적으로 낮은 비드 수와 이상치인 높은 값으로 인해 성능이 저하됩니다. 1:2 희석을 고정하기 전에 감염 및 대조군 샘플의 일부에 대해 예비 희석 곡선을 실행하면, BALF 샘플에서 이전에 발견된 매트릭스 효과로 인해 폐렴 샘플의 표준 곡선 최상단에 위치하는 CXCL8, CXCL1 및 G-CSF의 신호 포화를 방지할 수 있습니다22. 프로토콜은 코호트의 특성에 따라 추가로 조정될 수 있습니다. 샘플이 주로 단일 병원체 유형을 포함하는 경우, 핵심 패널을 케모카인과 전염증 매개체만 포함하도록 축소해도 충분한 통계적 검정력을 유지할 수 있습니다. 박테리아, 바이러스 및 비정형 병원체가 포함된 혼합 집단의 경우, 폐포 호중구와 대식세포에서 병원체 특이적 시그니처가 존재함이 최근에 입증되었으며23, 전염증성 및 조절성 BALF 사이토카인의 조합이 지역사회 획득성 폐렴의 질병 중증도를 반영하는 것으로 나타났으므로24, 조절 매개체까지 함께 측정하는 것이 여전히 유익합니다.
본 워크플로우의 기여점은 호흡기 감염 시의 호중구 유입이나 케모카인 및 전염증성 사이토카인의 상승이라는 개별적인 관찰—이 두 가지는 이미 광범위하게 입증된 사실임—에 있는 것이 아니라, 7가지 마커의 호중구-단핵구 유세포 분석 패널과 13가지 분석물 다중 면역 분석법을 동일한 BALF 검체에 적용되는 공통 시각화 파이프라인으로 결합했다는 점에 있습니다. 호중구와 단핵구를 표적으로 하는 7가지 마커 패널과 13가지 분석물 다중 면역 분석법을 구현함으로써 표현형과 사이토카인의 복잡성을 포착할 수 있으며, 이것이 없다면 일반적인 기관지 내시경 검체에서 얻을 수 있는 것보다 훨씬 더 많은 양의 BALF를 사용하여 여러 번의 독립적인 테스트를 수행해야 할 것입니다. 전자는 다색 유세포 분석이 BALF 샘플의 세포 유형 식별에 있어 수동 현미경 관찰만큼 신뢰할 수 있다는 이전 연구 결과15와 잘 일치하며, 후자의 수용 기준은 공인된 다기관 다중 비드 기반 분석 숙련도 프로그램의 모범 사례를 반영합니다16. 특히, 동일하게 표준화된 입력 데이터를 사용하여 구축된 통합 히트맵, 네트워크 플롯 및 PCA는 이전에는 독립적인 막대 그래프들을 합산하여 추론할 수밖에 없었던 세포 유형과 관련 인자들 사이의 관계를 명확히 드러냅니다. 이는 BALF 유래 케모카인인 CXCL8, CCL2, CCL3가 공동 순환계로부터 호중구와 단핵구를 모집하기 위해 함께 작용하며, 이들의 공동 구조는 독립적인 단일 분석물 판독값으로는 얻을 수 없는 정보를 담고 있기 때문에 중요합니다9,10. BALF는 이미 임상 목적으로 일상적으로 수집되며 추가적인 용량이 필요하지 않으므로, 이 워크플로우는 단독 진단 절차가 아닌 기존 기관지 내시경 서비스의 중개 연구적 부가 기능으로 배치될 수 있습니다.
시료 운송, 염색, 유세포 분석 데이터 획득, 멀티플렉스 분석 배양 및 판독, 그리고 다운스트림 계산 파이프라인으로 구성된 전체 워크플로의 실제 소요 시간은 연구 실험실 조건에서 약 24시간 정도입니다. 따라서 본 워크플로는 인공호흡기 관련 폐렴과 무균성 급성 호흡곤란 증후군을 즉각적으로 구분해야 하는 것과 같이 시간적으로 민감한 결정이 필요한 응급 침상 분류 분석보다는, 기전 특성 분석 및 치료 반응 모니터링을 위한 심층 표현형 분석 도구로 적합합니다. 전자의 경우, 더 빠른 미생물학적 분석 및 단일 마커 바이오마커 분석이 여전히 표준 치료법으로 사용되고 있습니다.
언급해야 할 몇 가지 제한 사항이 있습니다. BALF는 기도 공간에서 수집되어 기도 공간의 즉각적인 표면 상호작용을 나타내지만, 많은 활성화된 대식세포와 조직 상주 림프구가 위치하는 폐포벽 및 중격 내의 세포는 포함하지 않습니다. 따라서 기도 공간과 폐실질의 면역 상태 사이에는 일대일 대응 관계가 성립하지 않으며, 이는 이전에 발표된 데이터25와 일치합니다. 멀티플렉스 비드 기반 검출은 항체 교차 반응성과 매트릭스 효과의 영향을 받는데, 이는 혈청에 비해 뮤신과 계면활성제가 포함된 BALF 환경에서 특히 빈번하게 나타납니다. 또한, 최근 발표된 비판적 논문26과 마찬가지로, 생리식염수로 상피세포 lining fluid를 희석하는 과정은 urea와 같은 내인성 마커로도 해결할 수 없습니다. 회수된 세척액의 부피는 감염군이 대조군보다 평균 6 mL 적었으므로, 여기서 보고된 절대 농도는 그룹 간 희석 배수의 약간의 차이에 영향을 받을 수 있으며, 내인성 희석 마커는 적용되지 않았습니다. 감염군 참여자 64명 중 41명(64.1%)의 사전 항생제 노출은 기도 사이토카인 농도와 병원체 회수율을 감소시켰을 가능성이 있습니다. 중요한 점은, 본 프로토콜이 임상적으로 지시된 기관지 내시경 검사 중 단일 시점의 스냅샷만을 나타내므로, 개별 환자에서 호중구 모집의 역학, 최대 케모카인 분비 및 그 해소 과정을 분석하는 것이 불가능하다는 것입니다. 단일 분석물 AUC 값은 독립적인 검증 코호트 없이 바이오마커 식별에 사용된 동일한 코호트에서 도출되었으며, 이는 외부적으로 검증된 진단 성능이라기보다 코호트 내 판별 측정치로 해석되어야 합니다. 임상 현장에서 단일 마커 컷오프를 채택하려면 독립적인 다기관 코호트에서의 전향적 검증이 필요할 것입니다. 회수율이 높은 검체, 항생제 미투여 참여자로 제한하거나, 기계 환기 상태 및 폐렴 하위 유형(지역사회 획득, 병원 획득 또는 인공호흡기 관련)별로 층화하여 수행한 사전 지정 민감도 분석에서도 그룹 간 비교 방향은 변하지 않았습니다.
향후에는 단백질 및 세포 정량 분석에 사용된 것과 동일한 BALF 펠릿에 단일 세포 RNA 시퀀싱 또는 CITE-seq를 추가함으로써 이러한 한계점을 해결할 수 있으며, 이는 이미 박테리아성 폐렴 및 소아 Mycoplasma pneumoniae 폐렴의 대규모 코호트에서 성공적으로 적용되어 기존의 유세포 분석으로는 구분이 불가능했던 폐포 호중구 및 대식세포 하위 집단을 밝혀낸 바 있습니다27,28. 기도 분석을 통해 얻은 정보를 일치하는 생검 조직이나 부검 재료의 이미징 질량 세포 분석 또는 공간 전사체 분석 데이터와 결합하면 이러한 정보의 맥락을 파악할 수 있을 것입니다29. 중증 폐렴 및 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)에서 생존율 향상 또는 장기 보조 이점을 보인 CXCR1/CXCR2 길항제 및 IL-6 수용체 차단제 평가와 종단적 BALF 샘플링을 연계한다면, 본 워크플로에서 강조된 호중구-케모카인 축을 치료 결정 보조 수단으로 테스트하는 것도 가능할 것입니다30,31.
결론적으로, 본 연구는 표준화된 BALF 수집 및 준비 절차, 호중구-단핵구 구성을 정량화하는 7가지 마커의 유세포 분석 패널, 13가지 사이토카인을 측정하는 멀티플렉스 사이토카인 분석, 그리고 UMAP, 계층적 군집 분석, 상관 네트워크 및 PCA 분석으로 구성된 공통 시각화 플랫폼을 포함하는 통합 시각화 워크플로우를 설명합니다. 임상적으로 기관지경 검사가 필요한 성인 112명의 전향적 코호트에 이 워크플로우를 적용한 분석 결과, 감염 환자에서 폐포 면역 세포 구성이 대식세포에서 호중구로 급격히 전환됨을 확인하였고, 3가지 모듈의 사이토카인 반응 패턴을 검출하였으며, 단일 마커 측정으로는 관찰할 수 없는 강력하게 결합된 호중구-케모카인 축을 발견하였습니다. 이 절차는 오직 임상 진단 중에 수집된 재료에만 의존하며, 추가적인 샘플 부피가 필요하지 않으므로, 다변수 유세포 분석 및 멀티플렉스 비드 어레이 분석 장비를 갖춘 3차 의료기관 실험실에서 실행 가능할 것입니다. 더 폭넓은 도입과 개별 분석물을 진단 바이오마커로 사용하기 위해서는 독립적인 다기관 코호트에서의 전향적 검증이 필요합니다. 따라서 본 연구는 호흡기 감염 시 기도 염증을 특성화하기 위한 재현 가능하고 데이터가 풍부한 방법론을 제시하며, 이는 향후 종단적 연구, 단일 세포 및 공간 분석, 그리고 호중구-케모카인 축을 표적으로 하는 면역 조절의 치료적 평가로 발전시킬 수 있는 기초를 제공합니다.
공개 사항
저자들은 선언할 이해 상충 관계가 없습니다.
감사의 글
본 연구에 참여하여 귀중한 협조를 해주신 모든 환자와 자원봉사자분들께 진심으로 감사드립니다. 또한, 전체 연구 과정 동안 윤리적 승인(승인 번호 2026HL-038)과 규범적 지침을 제공해 준 윤리위원회에 깊은 감사를 표합니다.
임상 검체 수집, 기관지폐포 세척액 처리 및 미생물 검출에 도움을 주신 호흡기 내과, 기관지경 센터 및 임상 병리실 의료진분들께 감사드립니다. 또한 고차원 유세포 분석 및 다중 사이토카인 프로파일링 실험을 위해 기술적 플랫폼을 지원해 주신 병원 중앙 실험실에 감사드립니다.
본 연구는 공공, 상업 또는 비영리 부문의 지원 기관으로부터 어떠한 특정 연구비 지원도 받지 않았습니다.
환자 스크리닝, 시료 관리, 실험 수행 및 데이터 정리에 기여해주신 모든 연구원, 기술진 및 간호 인력의 노력에 감사드립니다.
재료
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