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방법 논문

Langendorff 관류 마우스 심장의 심방 및 심실 역학 평가를 위한 광학 시스템

66 조회수

⸱

DOI:

10.3791/72264

⸱

2026년 8월 14일

 , 
1Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN, Unidad Monterrey

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 마우스 심장 적출 및 캐뉼라 삽입 절차와 랑겐도르프(Langendorff) 역행성 관류 시스템의 준비 및 구성 방법을 설명합니다. 실험 설정은 심방과 심실의 자연스러운 동역학을 유지하면서 기계적 반응을 평가하도록 설계된 고해상도 광학 시스템과 결합되어 있습니다.

초록

마우스 심장은 공학 기술의 발전에 힘입어 심혈관 연구에서 널리 사용되는 모델로 활용되고 있습니다. 하지만 마우스 심장의 크기가 매우 작기 때문에 심방과 심실의 수축력을 평가하는 것은 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다. 본 연구에서는 분리된 온전한 심장에서 수축력과 심박수를 평가하기 위한 새로운 방법론을 소개합니다. Langendorff 관류 마우스 심장과 고해상도 광학 시스템을 결합하여 사용함으로써 심방 및 심실의 수축력을 평가할 수 있습니다. 이러한 실험 설정은 고해상도 신호를 획득하는 동시에 작은 심장 크기와 빠른 수축 속도로 인해 발생하는 문제들을 해결합니다. 420에서 660 beats per minute (bpm) 범위 내에서 자극 빈도와 심장 수축 빈도 간의 동기화는 auxotonic법의 결과와 일치하였습니다. 또한, 심실 단축 및 심방 동적 신호 측정을 통해 심방심실 수축을 결정할 수 있습니다. 이 방법은 약리학적 또는 전신적 영향 없이 분리된 온전한 심장의 수축력과 심박수를 평가하는 데 적합합니다. 이러한 결과는 광학 시스템을 통해 심실 및 심방의 단축 반응을 측정할 수 있음을 보여줍니다.

서론

심장 생리학에는 발견해야 할 것이 많습니다. 심장 박동 조절 및 흥분-수축 결합과 같은 핵심 과정은 지속적으로 연구되고 있는 중심 원칙입니다1. 생물학적 노이즈가 심장 수축력2 및 박동 조절 활동에 미치는 영향은 여전히 충분히 이해되지 않았으나1, 새로운 광학 이미징 방법들을 통해 새로운 패러다임이 제시되었습니다3,4.

Langendorff 시스템을 이용한 두 가지 실험 방법론은 심장 기능 측정에 매우 귀중한 기여를 해왔습니다. 첫 번째는 좌심실에 삽입된 작은 풍선으로부터 신호를 얻는 등용적 수축법(isovolumic contraction method)입니다5,6,7. 두 번째는 실의 한쪽 끝을 심장 심첨부에, 다른 쪽 끝을 기계적 기록 장치에 봉합하여 심장 축을 따라 발생하는 보조장력 수축(auxotonic contractions)을 측정하는 보조장력 기록법(auxotonic recording method)입니다2,8. 그럼에도 불구하고, 생쥐 심장은 크기가 매우 작기 때문에 심방과 심실의 수축력을 평가하는 것은 매우 까다롭습니다. 또한, 심장은 손상되기 쉽기 때문에 표본 제작 시 상당한 주의와 세심함이 필요합니다9,10,11,12,13.

마우스 심장의 기계적 역학을 평가하기 위한 이 광학 시스템은 몇 가지 새로운 특징과 장점을 가지고 있습니다. 첫째, 이 방법은 약리학적 또는 전신적 영향이 없는 상태에서 분리된 온전한 심장의 수축력과 심박수를 평가하는 데 적합합니다. 또한, 이 프로토콜은 약물 치료, 세포 재생 또는 산소 요법 기반의 치료법을 조사하는 허혈-재관류 손상 평가 실험에도 효과적으로 활용될 수 있습니다.

본 논문에서는 고해상도 광학 시스템을 사용하여 마우스 심장 수축 기능의 생물물리학적 파라미터를 기록하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 분리된 온전한 심장의 수축력과 심박수를 평가하는 데 도움이 됩니다. 또한, 심방 및 심실의 수축력 평가가 가능합니다. Langendorff 마우스 심장 준비법은 근육 수축을 저해하지 않으면서 관류액 온도의 손실과 움직임으로 인한 아티팩트를 최소화하기 위한 약간의 수정을 포함한 개선된 방식을 제시합니다.

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프로토콜

모든 동물 실험 절차는 동물 실험 및 관리에 관한 연방 규정을 준수하여 수행되었으며, CINVESTAV 동물 케어 위원회(CINVESTAV Zacatenco, D.F., Mexico)의 승인을 받았습니다. 본 연구에서는 체중 28–34 g, 연령 8–14주의 C57BL/6J 수컷 마우스를 사용하였습니다. 프로토콜에 사용된 모든 재료와 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다. 보충 파일 1–1에는 프로토콜을 위한 지원 도표, 소프트웨어 가이드, 분석 프로그램, 페이싱 데이터 및 애플리케이션 파일이 제공됩니다.

1. 스톡 준비

  1. 다음 두 가지 스톡 용액을 미리 준비하여 4 °C 냉장고에 보관하십시오: (1) 스톡 I, 1 L (탈이온수 기반; g/L 단위: 76.13 NaCl, 4.02 KCl, 1 MgCl2(6H2O), 0.4 NaH2PO4) 및 (2) 스톡 II, 0.1 L (탈이온수 기반; g/L 단위: 73.5 CaCl2(2H2O)).
    참고: 해당 용액들은 준비 후 최대 30일까지 사용할 수 있습니다. 4 °C에서 보관하십시오.

2. 랑겐도르프(Langendorff) 시스템 연결 및 세척

  1. 그림에 표시된 바와 같이 저장조(1), 저장조 항온조(2), 관류 펌프(3), 서펜타인(4), 서펜타인 재순환기(5), 모니터링 시스템(6) 및 배수 시스템(8)을 연결하십시오. 그림 1A.
    참고: 모니터링 시스템과 배수 시스템 간의 연결 관계는 다음에서 더 자세히 설명됩니다. 보충 파일 1.
  2. Langendorff 시스템을 1L의 탈이온수로 채웁니다. 50 °C그 후 관류 및 배수 펌프를 가동하십시오. (보충 파일 1, 배수 시스템)약 20~30분 후, 시스템에서 액체를 제거한 다음 단계로 진행하십시오.
    참고: 시스템에 누출이나 압력 강하가 없는지 확인하십시오. 이러한 현상이 발생할 경우 실험을 진행하지 마십시오.
  3. 시스템에 1% 아세트산(탈이온수에 용해) 1L를 채운 다음, 관류 및 배수 펌프를 끄고 60분 동안 기다린 후, 펌프를 다시 켜서 액체를 제거하십시오.
  4. 단계 2.2를 두 번 반복하십시오.
  5. 용액 성분의 흡착을 방지하기 위해 시스템을 70% 에탄올(탈이온수에 용해)로 채웁니다.
    참고: Langendorff 관류 시스템은 실험 10회마다 또는 매월 세척해야 합니다. 실험 전 세척 프로토콜은 다음에서 설명합니다. 제4절실험 후 세척 프로토콜에 대한 자세한 내용은 다음에서 확인할 수 있습니다. 섹션 8.

3. 실험 중 Tyrode 용액의 준비

  1. 다음 농도(mM)의 용액 1 L를 준비한다: 130.25 NaCl, 5.4 KCl, 0.53 MgCl2(6H2O), 0.3 NaH2PO4, 1.8 CaCl2(2H2O), 10 D-glucose, 10 HEPES, 그리고 NaOH를 사용하여 pH 7.35 ± 0.05로 조정한다.
    1. Stock I 10 mL를 탈이온수 700 mL와 함께 지속적으로 교반하며 혼합한 후, 용액의 온도를 37 °C로 올린다. 그림 1A (1)에 표시된 것과 같이 O2 탱크를 에어스톤에 연결하여 용액의 산소 공급 상태를 유지한다.
    2. Stock II 3.6 mL와 탈이온수 96.4 mL를 추가하여 1.8 mM CaCl2(2H2O) 농도를 맞춘 후, NaOH를 첨가하여 pH를 7.35 ± 0.05로 조정한다.
    3. 탈이온수를 채워 Tyrode 용액 1 L를 완성한다.
      참고: 용액 10 mL를 4 °C 냉장고에 보관하는 것을 권장하며, 이 분량은 나중에 6단계에서 사용된다.

4. 랑겐도르프(Langendorff) 시스템 준비

참고: 실험 당일에 Langendorff 시스템이 에탄올로 채워져 있지 않은 경우, 절차를 진행하지 말고 섹션 2를 반복하시기 바랍니다.

  1. 관류 및 배수 펌프를 켭니다. 관류 펌프 유량을 3 mL/min으로, 배수 펌프를 10 mL/min으로 설정합니다. 시스템을 배수합니다.
  2. 시스템에 37 °C의 탈이온수 1 L를 채운 후, 물을 배수합니다.
  3. 단계 3에서 준비한 Tyrode 용액을 시스템에 채우고, 용액을 생리학적 온도와 일정한 산소 농도로 유지합니다.
  4. 저장조 항온수조와 서펜타인 재순환기를 켭니다. 저장조 온도(그림 1A (2))를 38 °C로 설정하여 용액을 생리학적 조건으로 유지합니다. 서펜타인(그림 1A (5))의 온도를 40 °C로 설정합니다. 이는 Langendorff 시스템 용액의 온도 손실을 보완하기 위함입니다.
    참고: 시스템 배출구의 Tyrode 용액 온도가 생리학적 온도(37 ± 0.5 °C)가 아닐 경우, 서펜타인 재순환기 온도를 조정하십시오. 온도가 적절한 값으로 안정화될 때까지 단계 6으로 진행하는 것은 권장되지 않습니다.
  5. 압력 모니터(보충 파일 1, 모니터링 시스템)를 켜고 0–20 mmHg 범위에서 보정합니다. 시스템 보정을 돕기 위해 모니터링 및 페이싱 애플리케이션을 사용할 수 있습니다(보충 파일 3 및 보충 파일 1).
    참고: 시스템에 압력 손실이 없고 기포가 없는지 확인하는 것이 필수적입니다. 시스템에 기포가 있는 경우, 서펜타인의 하단 배출구를 일시적으로 막고 상단 밸브를 엽니다. 이렇게 하면 컬럼이 채워져 기포가 외부로 배출됩니다. 이 조건이 확인될 때까지 실험을 진행하는 것은 권장되지 않습니다.

5. 광학 시스템14

  1. CMOS 카메라를 조립하십시오 (그림 1A, 10), 조절 가능한 카메라 렌즈(LC) 및 조명 시스템.
    참고: 조명 시스템은 두 개의 LED로 구성됩니다.그림 1A, 9), 두 개의 평볼록 조명 렌즈(LI), 조명 제어 장치(그림 1A, 11), 데이터 수집 카드(보충 파일 1, 모니터링 시스템), 그리고 3D 설계 지지물(보충 파일 1).
  2. 부피가 약 1,0 mm³인 기준 객체를 배치하십시오.3 카메라 렌즈로부터 10–20 mm 거리에서(중심부의 그림 1A).
    참고: 대상물은 Langendorff 시스템의 심장 위치에 배치되어야 합니다. 이 위치는 다음에서 확인할 수 있습니다. 그림 1B, 특히 광선이 충돌하는 이미지의 중앙 부분에서.
  3. 카메라 획득 소프트웨어를 실행한 다음, 서브샘플링을 4배(4픽셀 = 1 서브픽셀)로 설정하십시오. 관심 영역(ROI)을 20 x 20 서브픽셀로 설정하십시오.보충 파일 2).
    참고: 이 구성을 통해 초당 750프레임(fps)의 시간 분해능을 구현할 수 있습니다.
  4. 조명 시스템을 켭니다 (보충 자료 1), 광선을 조정하여 기준 객체에 초점을 맞추고, 균일한 조명을 구현합니다 (그림 1B).
  5. 이미지가 과노출되는 것을 방지하기 위해 기준 물체의 빛 강도를 조절하십시오.
    참고: 이미지는 다음과 같이 보여야 합니다. 그림 2A (또는 그림 1C, 제어용 PC). 객체(심장) 표면의 반사는 외곽선의 선명도를 유지하는 범위 내에서 최대한 줄여야 합니다. 이는 조명 제어 전력을 조정하거나 카메라 설정에서 노출 시간을 줄임으로써 수행할 수 있습니다.
  6. 기준 객체의 선명한 이미지를 얻을 수 있도록 카메라 렌즈의 초점을 맞춥니다 (그림 1C, 제어 PC). 기준 객체가 시야의 80%를 차지하도록 하십시오(그림 2A) 약의 변환 척도를 얻기 위해 61 µm 서브픽셀당.
    참고: 카메라가 획득 모드로 설정되면 광학 시스템이 조명 시스템을 자동으로 활성화합니다.그림 1A 및 보충 파일 2). 과열을 방지하기 위해 카메라는 대기 모드로 유지하여 조명 시스템이 꺼져 있게 하고, 실험 데이터 수집 기간에만 활성화하는 것을 권장합니다.

6. 수술 및 캐뉼라 삽입 절차

  1. 헤파린 처리 및 마취
    1. tiletamine-zolazepam (마우스 체중 kg당 40 mg)과 xylazine (마우스 체중 kg당 10 mg)을 포함하는 마취 혼합액을 준비한 다음, 식염수로 20 µL가 되도록 희석합니다.
    2. 27 G 바늘을 사용하여 마취 혼합액을 복강 내로 주사합니다. 마우스가 깊은 마취 상태에 도달하도록 기다립니다.
      참고: 사지나 꼬리에 자극을 주어 반사 반응이 없는지 확인합니다(통상적으로 10분이면 충분합니다).
    3. 27 G 바늘을 사용하여 20 UI의 비분획 헤파린을 복강 내로 주사하고, 실험을 계속하기 위해 약 5분 동안 기다립니다.
  2. 적출 및 캐뉼라 삽입
    1. 마우스를仰臥(supine) 자세로 눕히고, 수술용 가위로 흉부 영역의 털과 피부를 제거합니다.
    2. 횡격막의 무결성을 유지하면서 횡격막 아래에 복부 절개를 실시합니다.
    3. 횡격막을 가로 절개하고 늑골을 통해 양측 상행 흉부 절개술을 신속히 수행한 후, 늑골 벽을 제거합니다.
      참고: 심장에 손상을 주지 않도록 주의하십시오. 절차 중 심장이 손상되거나 손상된 경우, 실험을 진행하지 않는 것을 권장합니다.
    4. 미세 핀셋을 사용하여 대동맥궁과 인접 혈관 등 심장의 상부 구조물을 부드럽게 잡습니다. 부드럽게 들어 올려 아래에서 위쪽으로 절개하고 심장과 폐를 함께 제거합니다.
    5. 심장을 4 °C의 Tyrode 용액 50 mL가 담긴 페트리 접시에 신속하게 옮겨 1차 세척을 실시합니다.
      참고: 횡격막을 절개하는 순간부터 동물은 호흡 곤란을 겪기 시작하며, 이 시점부터 단계 6.2.3~6.2.6을 수행하는 데 60초의 제한 시간이 있습니다. 이 시간 제한을 초과하면 허혈성 손상이 유발될 수 있습니다.
    6. 실체 현미경과 미세 가위를 사용하여 대동맥궁이 드러나도록 폐와 과잉 지방 조직을 제거합니다.
      참고: 조직을 정리할 때 대동맥궁이 손상되지 않도록 주의하십시오. 무두동맥(brachiocephalic artery) 아래에서 대동맥이 절단되면 캐뉼라 삽입이 어려워져 압력 누출이 발생할 가능성이 있습니다.
    7. 심장을 4 °C의 Tyrode 완충액 50 mL가 담긴 맞춤형 캐뉼라 삽입 베이스로 옮기고, 대동맥 끝부분을 20 G 바늘로 제작한 맞춤형 캐뉼라에 삽입합니다(Supplementary File 1).
      참고: 대동맥판막이 손상되지 않도록 주의하십시오. 판막이 손상되면 심장이 부풀어 오르고 관상동맥 순환이 제대로 이루어지지 않습니다.
    8. 4/0 실크 봉합사를 사용하여 두 개의 캐뉼라 매듭을 묶습니다. 첫 번째는 캐뉼라 팁 원위쪽의 움푹 들어간 곳에, 두 번째는 무두동맥(brachiocephalic trunk) 전단에 묶습니다(Supplementary File 1).
    9. 실온의 완충액을 채운 1 mL 주사기를 사용하여 Tyrode 용액을 천천히 주입합니다. 관상동맥 조직이 맑아지는 것을 확인하여 캐뉼라 삽입이 잘 되었는지 검증합니다.
    10. 심실과 심방에 접근할 수 있도록 지방 조직을 제거합니다.
      참고: 심장 생존력을 유지하기 위해 캐뉼라 삽입 시간을 5분 이내로 제한하십시오.
    11. 심장을 Langendorff 시스템으로 옮기고 30분 동안 안정화합니다.
      참고: 심장은 시스템의 중앙(Figure 1A,B)에 수직으로 매달아 배치합니다. 심장을 매달 때 기포가 형성되지 않도록 각별히 주의하십시오. 기포가 발생하면 압력이 140 mmHg 이상으로 상승하고 심장이 부풀기 시작하여 생존 능력을 상실합니다.
      참고: 심장이 기계적으로 안정적인 반응을 보이고, 약 360 beats per minute (BPM)의 자연 진동 주파수를 가지며, 관류압이 60에서 10 mmHg 사이일 때 Langendorff 장치 구성이 완료된 것입니다.

7. 페이싱 프로토콜 및 비디오 녹화

  1. 심장 생존능
    1. 3 mL/min 관류 펌프를 사용하여 관상동맥압이 60–10 mmHg 범위 내에 있는지 확인하십시오. 관상동맥 관류압이 60 mmHg 미만으로 떨어지면 관류 펌프의 유량을 약간 증가시키십시오(압력이 낮으면 심장이 창백해지고 흐물흐물해집니다). 반대로, 압력이 10 mmHg를 초과하면 펌프 유량을 약간 감소시키십시오(과도한 압력은 조직 부종을 유발하며, 심정지가 발생할 때까지 압력이 점진적으로 계속 상승하게 됩니다).
      참고: 앞서 언급한 최적 범위를 벗어난 관류압을 장기간 유지할 경우, 심장의 생존능이 가역 불가능하게 손상됩니다.
    2. 심장을 정면 위치에 놓아 카메라에 정면 전체 모습이 나오도록 합니다. 양쪽 심방이 모두 카메라에 보이도록 위치를 조정하십시오.그림 2A).
    3. 백금 전극을 우심방 상단 pacemaker node(심박조절결절) 부위에 표면적으로 조심스럽게 배치하십시오. 카메라 피드를 가이드 삼아 전극을 시야 내로 가져옵니다. 전극이 우심방을 가리지 않도록 위치를 잡으십시오. 카메라 라이브 뷰를 모니터링하면서 전극이 심방 조직에 닿을 때까지 천천히 전진시키되, 과도한 압력이 가해지지 않도록 주의하십시오(과도한 압력은 영상에서 우심방을 납작하게 만들 수 있습니다).
      참고: 올바르게 수행했다면, 카메라 화면은 다음과 같이 보일 것입니다. 그림 2A.
    4. 모니터링 및 페이싱 애플리케이션을 실행하십시오 (보충 파일 1) 및 데이터 수집 카드를 켭니다 (그림 1A (6)). 자극 파라미터 값을 다음과 같이 설정하십시오: 진폭은 2 V, 주파수는 분당 420, 540, 720 펄스(PPM)로 설정하며, 7 ms 듀티 사이클의 사각 펄스를 사용합니다(의 삽입도) 그림 2A).
    5. 가장 낮은 주파수부터 시작하여 생존율 자극을 가하며, 자극 지속 시간은 20초로 하고 각 자극 사이에는 20초의 회복 기간(휴식 시간)을 둡니다.
      참고: 카메라 모니터링을 통해 심장의 생존능력을 평가하십시오. 장기가 생리학적으로 기능을 하는 경우, 가해진 자극과 심장 반응 사이의 동기화가 관찰되며, 심방과 심실 간의 적절한 협응이 동반됩니다. 반대로, 생존능력이 없는 경우에는 심실 협응의 상실 또는 고립된 심방 수축만이 나타나는 것으로 확인됩니다.
    6. 실험이 실내 조명과 열 변동에 민감하므로 챔버 문을 닫으십시오(그림 1C).
      참고: 실험 시간 동안 챔버 문은 반드시 닫혀 있어야 합니다. 카메라와 관류압을 통해 심장의 생존 능력을 모니터링하십시오.
  2. 데이터 기록
    1. 30초 동안의 사각 펄스 열(square pulse train)과 이후 30초 동안의 무신호 구간으로 구성된 페이싱 프로토콜을 적용하십시오. 각 페이싱 열의 자극 파라미터 값은 진폭 2V, 듀티 사이클 7ms, 주파수 범위 360~720 PPM으로 설정하십시오.
      참고: 페이싱 프로토콜은 360 PPM에서 시작하여 각 시간 지점마다 60 PPM씩 증가합니다(~의 삽입도 그림 2A).
    2. 카메라 획득 소프트웨어를 사용하여 심장 전면부의 역동적인 모습을 .avi 형식의 동영상으로 연속 기록하십시오.보충 파일 2각 페이싱 트레인에 대해 20초 동안 비디오 녹화를 수행하십시오. 페이싱 시작 5초 후부터 20초 구간을 기록하십시오. 대표적인 원본 기록이 제공됩니다. 보충 영상 1.
      참고: 컴퓨터는 가해진 페이싱 트레인(pacing train)을 동시에 기록합니다(.xls, 보충 파일 9) 각각 모니터링 및 페이싱 애플리케이션과 카메라 획득 소프트웨어에 의해 생성된 각 녹화 영상(.avi)에)보충 파일 2 및 보충 파일 3).
    3. 자극 프로토콜 시작 전에 기록한 첫 번째 비디오와 프로토콜 적용 후에 기록한 두 번째 비디오를 비교하여 심장의 생존력을 확인합니다.그림 2B).

8. Langendorff 관류 시스템 실험 후 세척

  1. 자극기와 ECG 백금 전극을 제거합니다. 시스템에서 심장을 제거하고 남아있는 Tyrode 용액을 모두 배출합니다.
  2. 광학 시스템을 끄고 O2 밸브를 닫습니다.
  3. 37 °C의 탈이온수 1 L로 시스템을 헹구고, 시스템 내의 액체를 배출합니다.
  4. 단계 2.4와 2.5를 반복합니다.
  5. 모든 시스템과 장비의 전원을 끕니다.

9. 비디오 처리

  1. 각 비디오를 계산 소프트웨어로 가져온 후 비디오 정규화 기능을 적용하는 것으로 시작하십시오.15.
  2. 심장 영역을 포함하는 관심 영역(ROI)을 선택하십시오. 이미지 분할(image segmentation)을 수행하여 배경 노이즈, 전극 및 캐뉼라를 제거하십시오.보충 파일 4).
    참고제거할 이미지 영역을 정확하게 선택하려면 다음을 참조하십시오. 보충 파일 10.
  3. 전역 기계 역학 분석을 수행하십시오 (보충 파일 5). 보조 변동성 및 신호 예시는 다음에서 확인할 수 있습니다. 보충 그림 S1, 보충 그림 S2, 그리고 부수 도표 S3.
    1. 각 비디오 프레임에 형태학적 연산자를 적용하여 심장 외곽선을 검출한 다음, 프레임 채우기 알고리즘을 적용하여 마스크를 생성하십시오.15.
    2. 각 프레임의 분할된 영역 내 픽셀 수를 계산한 다음, 이 수치를 이미지의 총 픽셀 수로 정규화하여 동적 신호를 생성합니다(삽입 그림 그림 2B 및 부록 그림 S3).
    3. 고주파 노이즈와 관류 적하 아티팩트를 억제하기 위해, 획득한 신호에 3~10 Hz 범위의 5차 양방향 버터워스 필터를 적용하십시오.15.
    4. 기록된 최댓값과 최솟값을 사용하여 모든 비디오의 신호를 정규화하십시오.
    5. 각 동역학 신호와 자극 신호에 대해 두 최대 진폭 값 사이의 간격(IAA (s))을 계산하여 심박수를 측정하십시오.
    6. 다음 공식으로 BPM 단위의 주파수를 구합니다:
      심박수(BPM)가 60을 IAA로 나눈 값과 같음을 보여주는 빈도 계산 식.
    7. IAA 데이터로부터 푸앵카레 맵(Poincaré maps)을 생성하여 단기 및 장기 기간의 변동성을 시각화함16,17,18 (부수 도표 S1 및 보충 그림 S2).
      참고: 더 자세한 정보는 다음을 참조하십시오. 보충 파일 10.
  4. 심실 기계적 역학의 분절 분석을 수행하십시오.보충 파일 6).
    1. 이미지 이진화를 적용하십시오. 형태학적 연산자를 사용하여 심실 영역의 경계를 설정하고, 관심 영역(ROI)을 손상시키지 않는 범위 내에서 이를 타원형 기하 구조로 조정하십시오.15.
    2. 각 프레임의 심실 영역에 최소 타원을 맞춥니다. 프레임 내 일련의 원위점 좌표를 추출합니다. Y축의 각 양 끝단에 10~20개의 점 집합을 사용하십시오.그림 3A). 대표적인 타원 추정 결과물은 다음에서 제공됩니다. 보충 영상 2.
    3. 각 비디오에서 Y축을 따라 극점 간의 평균 거리로 심실 단축 정도를 계산하십시오.19.
    4. 고주파 노이즈와 관류 드립 아티팩트(perfusion dripping artifacts)를 억제하기 위해, 획득한 신호에 3~10 Hz 범위의 5차 양방향 버터워스 필터(bidirectional Butterworth filter)를 적용하십시오.15.
    5. 각 페이싱에 대해 획득한 모든 비디오를 기준으로 심실 단축 신호를 정규화하고, 단계 9.3.5~9.3.6과 같이 심박수와 지연 시간을 계산하십시오.
      참고: 심실 주기 지속 시간(DVE), 이완 지속 시간(DVW), 심실 간격(IVV) 및 심실 진폭(VA)과 같은 파라미터는 다음과 같이 얻습니다.그림 3A).
      참고: 더 자세한 정보는 다음을 참조하십시오. 보충 파일 10.
  5. 심방의 기계적 역동성에 대한 분절 분석을 수행합니다.보충 파일 7).
    1. 두 개의 관심 영역(ROI)을 사용하여 심방의 범위를 지정하십시오(그림 3C).
    2. 각 심방을 개별적으로 분석하십시오.
      1. ROI를 손상시키지 않고 조정하면서 형태학적 연산자를 사용하여 심방의 경계를 획정하십시오.15대조도 증가 알고리즘을 사용하여 각 심방의 경계를 정합니다.20,21.
      2. 이미지 이진화를 적용하고 프레임당 0이 아닌 픽셀 수를 정량화하여 심방 동적 신호를 얻습니다.
      3. 획득한 신호에 3~10 Hz 범위의 5차 양방향 버터워스 필터(Butterworth filter)를 적용하여 고주파 노이즈와 관류 낙하 아티팩트를 억제하십시오.15.
      4. 두 심방 신호의 평균을 계산하십시오.그림 3D).
    3. 각 페이싱에 대해 획득한 모든 비디오를 기준으로 심방 단축 신호를 정규화하고, 단계 9.3.5~9.3.6과 동일하게 심박수와 지연 시간을 계산하십시오.
      참고: 심방 주기 시간(DAE), 심방-심방 간격(IAT) 및 심방 진폭(AA)과 같은 파라미터는 다음과 같이 얻습니다(그림 3D). 더 자세한 정보는 보충 자료 10을 참조하십시오.
  6. 전기-기계적 분석을 수행하십시오13,22 (보충 파일 8).
    1. 페이싱 데이터를 심방 및 심실 신호와 비교하십시오 (그림 3D).
    2. 심장 전도 시스템 내의 전파 시간을 계산하여 심방과 심실 사건 사이의 지연 시간을 구합니다(AVD), 적용된 자극을 기준으로 합니다.

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결과

심장 기계적 기능 실험은 다음 그림에 표시된 Langendorff 장치를 사용하여 수행합니다. 그림 1A (상단)모니터링 및 광학 시스템은 조명 제어가 트리거될 때 비디오 녹화가 가능하며, 이는 다음에서 확인할 수 있습니다. 그림 1A (하단). 그림 1C 주변의 온도 변화와 빛으로부터 심장을 격리하여 유지하도록 설계된 온도 조절 캐비닛의 외관을 보여줍니다. 다음 그림에 묘사된 바와 같이 그림 1B분리된 심장은 Langendorff 장치, 광학 시스템 및 자극 시스템으로 구성된 실험 설정 내에서 기준 객체로 배치됩니다.

~에서 보여지는 바와 같이

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토론

마우스 심장은 온도 변화에 매우 민감합니다2,9,10,11,22. 본 실험에서는 관류 심장을 수직으로 배치하였습니다. 저희는 Langendorff 관류법에서 관류액의 온도 손실과 움직임에 의한 아티팩트를 최소화하기 위해 약간의 수정을 가했습니다. 관류액 온도를 37 ± 0.5 °C로 일정하게 유지하여 온도 손실을 최소화하기 위해 서펜타인(serpentine)에 재순환 펌프를 추가하였고, 움직임 아티팩트를 최소화하기 위해 배수 베이스를 추가하였습니다. 또한, 그림 1에 표시된 바와 같이, 광학 시스템과 심장 조직을 균일하게 조사하기 위해 양측에 배치된 두 개의 강도 조절 가능 LED 광원이...

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공개 사항

저자들은 선언할 이해상충 관계가 없습니다.

감사의 글

본 연구는 과학·인문학·기술 및 혁신 사무국(SECIHTI)의 지원금 No. LN-2025-C-23의 지원을 받아 수행되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1 mL 주사기BD Plastipak302485외과적 수술 절차
20 G 바늘NIPROAH-2032대동맥 캐뉼라
8x-100x 배율의 25 mm 조절식 렌즈GenericN/A광학 시스템 카메라 렌즈; 일반적으로 조절식 카메라 렌즈로 언급됨
27 G 바늘BD PrecisionGlide302358외과적 수술 절차
3D 설계 지지 부품CINVESTAVN/A맞춤형 3D 설계 지지 부품
4-0 실크 봉합사AMERICAN SUTURETGSN0901대동맥 캐뉼라
40-A 전원 공급 장치STERENPRL-25LED 전원 공급 장치
에어 스톤N/AN/ATyrode 용액 산소 공급
CaCl2 (2H2O)Sigma-AldrichC3306Tyrode 용액
D-GlucoseJ.T. Baker1916-01Tyrode 용액
배수 펌프CINVESTAVN/A맞춤형 배수 펌프; 일반적으로 배수 펌프로 언급됨
F = 25.4 mm, 평볼록 렌즈THORLABSLA1951-A광학 시스템 조명 렌즈; 일반적으로 평볼록 조명 렌즈로 언급됨
빙초산Sigma-Aldrich695092Langendorff 시스템 세척
헤파린PiSA060M91항응고제
HEPESSigma-AldrichH3375Tyrode 용액
고출력 LEDLuminiusCBT-90-G-L11-C12LED 광원
조명 시스템CINVESTAVN/A맞춤형 조명 시스템; 일반적으로 조명 시스템으로 언급됨
KClCTR SCIENTIFICCTR02196Tyrode 용액
LabVIEW 소프트웨어 버전 2018NATIONAL INSTRUMENTSN/A모니터링 및 페이싱 애플리케이션 실행에 사용되는 소프트웨어; 일반적으로 모니터링 및 페이싱 애플리케이션으로 언급됨
MATLAB 소프트웨어The MathWorksN/A비디오 정규화, 세그멘테이션 및 분석 프로그램을 위한 계산 소프트웨어; 일반적으로 계산 소프트웨어로 언급됨
의료용 산소GRUPO INFRAN/ATyrode 용액 산소 공급
MgCl2 (6H2O)CTR SCIENTIFICCTR02104Tyrode 용액
가변 유량 미니 펌프CONTROL COMPANY3385관류 펌프
마우스 수술 키트Kent ScientificINSMOUSEKIT외과적 수술 절차
NaClSigma-AldrichS5886Tyrode 용액
NaH2PO4DEQDEQF290400250Tyrode 용액
NaOHCTR SCIENTIFICCTR03108pH 조절
NI USB-6009NATIONAL INSTRUMENTS779026-01데이터 수집 카드
백금 전극, 직경 0.25 mmSigma-Aldrich349402전기 자극 전극
전원 공급 장치 (12 V, 30 A)KarnickPTA-12V30A재순환기 전원 공급 장치
압력 모니터CINVESTAVN/A맞춤형 압력 모니터; 일반적으로 압력 모니터로 언급됨
압력 트랜스듀서LA BOUVETB17295Langendorff 시스템 압력 모니터
순수 에틸 알코올Sigma-Aldrich493511시스템 세척용 에탄올
재순환 항온 수조 (LXC)PolyScienceL113A0412저장조 재순환기
식염수PiSA1118480.9% 염화나트륨 (NaCl) 용액
서펜타인 항온 수조CINVESTAVN/A맞춤형 서펜타인 재순환기/항온 수조
실체 현미경N/AN/A외과적 수술 절차
실체 현미경 조명N/AN/A외과적 수술 절차
uEye Cockpit 소프트웨어IDS Imaging Development System GmBHN/A카메라 수집 소프트웨어; 일반적으로 카메라 수집 소프트웨어로 언급됨
UI-3360CP-NIR-GL Rev.2IDSAB00624고속 CMOS 카메라; 일반적으로 CMOS 카메라로 언급됨
자일라진PiSA4001211마취제
Zoletil 100Virbac83048907틸레타민-졸레마존 마취제; 일반적으로 마취제 혼합물로 언급됨

참고문헌

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