연구 논문

생명정보학 접근법에 기반한 심부전에서 미토콘드리아 기능 장애 및 SUMOylation과 관련된 후보 바이오마커 식별

DOI:

10.3791/72265

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2026년 6월 26일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Hebei Medical University Third Hospital, 2Department of Clinical Pharmacy, Hebei Medical University Third Hospital

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

생물정보학, 머신러닝, qPCR 검증을 통해 본 연구는 심부전에서 SUMOylation과 미토콘드리아 기능 장애와 관련된 다섯 가지 후보 바이오마커를 확인하였습니다. 이러한 발견은 심부전 메커니즘에 대한 이해를 높이고 향후 진단 연구의 잠재적 방향을 제시합니다.

초록

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심부전(HF)은 지속적인 임상적 도전 과제를 제시합니다. SUMOylation과 미토콘드리아 기능은 심근세포 건강에 필수적이지만, 이들이 HF에 미치는 영향은 여전히 불확실합니다. HF 관련 데이터셋 2개가 GEO에서 다운로드되었습니다. 중복 유전자는 학습 세트 내 모든 유전자, SUMO 관련 유전자, 미토콘드리아 관련 유전자에서 얻어졌습니다. 진단 핵심 유전자를 식별하기 위해 세 가지 머신러닝 알고리즘이 적용되었습니다. 이후 이 유전자들을 기반으로 진단 모델이 구축되고 평가되었습니다. 또한 HF와 건강한 대조군의 면역 미세환경을 CIBERSORT, MCP-counter, ssGSEA를 사용해 평가하였습니다. HF와 건강한 대조군 간 면역 침윤 차이를 분석하였다. 약물 예측과 분자 도킹을 통해 이 유전자들을 표적으로 하는 잠재적 약물 후보를 식별하였습니다. 마지막으로, 임상 샘플에서 유전자 발현 수준을 검증하기 위해 qPCR을 사용하였습니다. 미토콘드리아 조절에 현저한 풍부도를 가진 총 113개의 공통 유전자가 확인되었습니다. NFKB1, MYEF2, NSUN2, SQSTM1, FKBP4 등 다섯 가지 주요 유전자가 세 가지 머신러닝 알고리즘으로 확인되었습니다. 기능 풍부화 분석은 이 유전자들이 면역 반응, RNA 처리, 세포 주기 조절과 연관되어 있음을 밝혀냈습니다. 더욱이 면역 침윤 프로파일링은 호중구 침윤이 HF에서 면역 반응 조절 이상에 기여한다는 사실을 밝혀냈습니다. 분자 결합 검사 결과, 소분자 약물 IMX-942가 SQSTM1과 유리한 결합 친화력을 보인다는 것이 밝혀졌습니다(-5.8 kcal/mol). qPCR 검증은 생물정보학 결과를 뒷받침했습니다. NFKB1, MYEF2, NSUN2, SQSTM1, FKBP4가 HF에서 SUMOylation과 미토콘드리아 기능을 연결하는 핵심 유전자로 확인되었습니다. 이 발견들은 HF 병태생리에 대한 새로운 통찰을 제공하며, 새로운 진단 및 치료 전략 개발에 기여할 수 있습니다.

서론

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심부전(HF)은 다양한 심혈관 질환의 말기 단계로, 신체의 대사 요구를 충족하지 못하는 심장 기능 저하가 특징입니다. 이 심각한 질환은 환자 건강에 심각한 위협을 가하며, 삶의 질 저하와 높은 사망률로 이어집니다2. 현재 HF의 진단 방법은 주로 생화학적 표지검출 3,4, 심초음파, 그리고 영상영상 5입니다. 사용 가능한 치료법에는 약물 치료제, 기기 기반 중재, 외과 절차가 포함되지만, 임상 결과는 여전히 만족스럽지 않습니다6. 부작용, 기기의 적용 범위 제한, 면역 거부 및 기타 합병증과 같은 제한 요인들이 치료 효능을 자주 저해합니다 7,8,9,10,11. 따라서 HF의 근본 메커니즘을 명확히 하고, 조기 정밀한 진단 바이오마커를 식별하며, 보다 효과적이고 안전한 치료 전략을 개발할 시급한 필요가 있습니다.

소형 유비퀴틴 유사 변형제(SUMO) 단백질은 기질 단백질의 라이신 잔기와 동적이고 가역적인 과정을 통해 공유 결합하여 기질 단백질의 구조와 기능을 조절합니다12. SUMOylation은 중요한 번역 후 변형으로, 다양한 세포 과정의 핵심 조절자 역할을 합니다13,14. 미토콘드리아는 세포의 에너지-대사 중심으로서 HF의 발병 기전에 결정적으로 관여합니다. HF의 병리학적 과정에서 ATP 생성 부족, 활성 산소종(ROS) 폭발, Ca2+ 항상성 불균형과 같은 미토콘드리아 기능 장애가 진행에 크게 기여합니다.15, 16, 17, 18. 특히, 새롭게 나오는 증거들은 SUMO화와 미토콘드리아 기능 간의 잠재적 상호작용을 시사합니다. 미토콘드리아 스트레스는 SUMOylation 관련 경로를 유발할 수 있으며, SUMO 단백질과 그 특이적 프로테아제는 미토콘드리아 항상성 유지에 필수적입니다 19,20,21. 최근 연구들은 심혈관 질환과 HF 진행에서 미토콘드리아 품질 관리와 미토콘드리아 역학의 중요성을 더욱 강조했습니다22,23. 그러나 SUMOylation과 미토콘드리아 조절이 HF 발달에 미치는 시너지 효과는 특히 유전자 수준에서 명확하지 않습니다.

본 연구에서는 HF에서 SUMOylation과 미토콘드리아 기능 장애가 교차하는 유전자를 체계적으로 조사하였는데, 이 두 가지 주요 생물학적 과정은 HF와 개별적으로 관련되어 있지만 아직 완전히 통합되지 않았습니다. 중복 유전자는 HF 관련 차별 발현 유전자, SUMOylation 관련 유전자, 미토콘드리아 관련 유전자가 교차하여 확인되었습니다. 주요 유전자들은 머신러닝 알고리즘을 사용해 선별되어 진단 모델을 구축했습니다. 기능적 풍부화 및 면역 침윤 분석도 추가로 수행하여 HF에서 이들의 생물학적 역할을 탐구하였습니다. 이러한 통합 접근법은 HF에서 SUMOylation과 미토콘드리아 기능 장애 간의 교차 반응을 탐구하는 체계적인 틀을 제공할 수 있습니다.

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프로토콜

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이 연구는 헬싱키 선언에 따라 수행되었으며, 프로토콜은 2024년 11월 허베이 의과대학 제3병원 윤리위원회(W2025-065-1)에서 승인되었습니다. 연구에 참여한 모든 피험자로부터 사전 동의를 받았습니다.

데이터 소스 및 전처리

HF와 관련된 RNA-seq 데이터가 확보되었으며, 여기에는 유전자 발현 옴니버스(Gene Expression Omnibus, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)의 두 개의 마이크로어레이 데이터셋이 포함되었습니다. 두 가지 말초 혈액 마이크로어레이 데이터셋이 선정되었습니다: GSE59867(34개의 HF 샘플과 30개의 대조군)가 훈련 데이터셋으로 사용되었고; 검증 데이터셋으로 GSE57338(177개의 HF 샘플과 136개의 대조군)이 사용되었습니다. 연령, 성별, 질병 상태 등 GSE57338 임상 정보는 GEO에서 수집되었으며, 보충 표 1에 요약되어 있습니다. 또한, dbPTM 데이터베이스에서 총 3,893개의 SUMOylation 관련 유전자(SRG)가 수집되었습니다(https://awi.cuhk.edu.cn/dbPTM/index.php)(보충표 2), 이전 연구를 기반으로 2,030개의 미토콘드리아 관련 유전자(MRG)가 수집되었습니다24 (보충표 3). 다음으로, R 패키지 GEOquery (v 2.72.0)25 를 사용하여 GEO 데이터베이스에서 데이터셋을 다운로드하고, 표현 행렬을 추출하며, 표본 표현형 정보를 얻었습니다. 주석 작성은 주석 파일을 매핑하고 유전자 ID를 매칭하는 방식으로 수행되었습니다. 유효하지 않은 유전자 ID는 제거하고, 가장 많이 발현된 프로브를 유지하였습니다.

머신러닝을 통한 핵심 유전자 선택

HF, SUMOylation, 미토콘드리아와 관련된 유전자를 선별하기 위해 다단계 접근법을 사용하였습니다. 먼저, 훈련 데이터셋, SRG, MRG 간의 공통 유전자를 교차 분석을 통해 확인했습니다. 일반 유전자의 잠재적 기능은 유전자 온톨로지(GO)와 교토 유전자 및 유전체 백과사전(KEGG)의 R 패키지 ClusterProfiler (v 4.12.6)를 사용한 풍부 분석을 통해 확인되었습니다. 그 후 LASSO 회귀, XGBoost, 랜덤 포레스트(RF) 등 세 가지 머신러닝 접근법이 유전자를 추가로 필터링하기 위해 사용되었습니다. LASSO 회귀에서는 교차 검증을 통해 최적의 정규화 매개변수 λ를 선택하여 가장 큰 예측 가치를 가진 유전적 특징을 식별하였습니다. 0이 아닌 계수 유전자는 후속 분석을 위해 선정되었습니다. 그 후 XGBoost와 RF 알고리즘을 사용해 특징 중요성 점수를 계산하고 상위 20개의 유전자를 선별했습니다.

진단 모델의 구성 및 평가

GSE59867 데이터셋을 기반으로 로지스틱 회귀분석을 사용하여 진단 모델이 구축되었습니다. 그 후 이 모델을 적용하여 질병 상태를 예측하고 확률 점수를 계산했습니다. 모델 검증을 위해 동일한 핵심 유전자를 GSE57338 데이터셋에서 추출하여 훈련 데이터셋과 일치하도록 정규화한 후 외부 예측에 사용되었습니다. 모델 성능은 수신자 작동 특성(ROC) 곡선, 혼동 행렬, 보정 곡선, 결정 곡선 분석(DCA)을 사용하여 평가되었습니다.

유전자 집합 풍부 분석(GSEA) 및 세포 내 위치 분석

각 주요 유전자에 대해 상관관계 유전자를 식별하기 위해 스피어먼 상관분석을 사용했습니다. GSEA 분석은 R 패키지인 ClusterProfiler(버전 4.12.6)를 사용하여 주요 유전자의 관련 유전자에 대해 수행되었습니다. 한편, 세포 내 주요 유전자의 정확한 세포 내 아세포 위치 위치를 규명하기 위해 GeneCards 데이터베이스(https://www.genecards.org/)를 사용하여 세포 내 아세포 위치를 결정했습니다.

유전자-질병 연관성 및 약물 예측

확인된 주요 유전자의 임상적 관련성을 평가하기 위해 체계적인 질병 연관 및 약물 상호작용 분석이 수행되었습니다. 질병-유전자 연관성은 비교독성유전체학 데이터베이스(CTD; https://ctdbase.org/)를 사용하여 조사되었으며, 결과는 추론 점수와 참고문헌 수(상위 10개 연관성 보고)로 순위가 매겨졌습니다. 주요 유전자의 유전자-약물 상호작용 데이터는 약물-유전자 상호작용 데이터베이스(DGIdb)에서 얻었으며, 상호작용 점수 0.5< 기준으로 약물은 제외되었습니다. 이후 PDB 데이터베이스(https://www.rcsb.org/)에서 주요 유전자에 해당하는 단백질의 3D 구조를, PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 잠재적 약물의 분자 구조를 다운로드했습니다. 다음으로, CB-Dock227 (https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php)을 사용하여 분자 도킹 분석을 수행하여 잠재적 약물과 단백질 간의 결합 점수를 계산하였습니다. 결합 자유 에너지가 낮을수록 상호작용이 더 안정적임을 나타내며, 화합물이 더 큰 표적 잠재력을 가질 수 있음을 시사합니다.

면역 침윤 분석

면역 세포 침윤은 세 가지 보완 방법으로 평가하였다: 미세환경 세포 집단 계수법(MCP-counter)28, RNA 전사체의 상대적 하위 집합 추정을 통한 세포형 식별(CIBERSORT)29 , 그리고 단일 샘플 풍부 분석(ssGSEA)30. MCP 카운터 및 CIBERSORT 분석은 R 패키지 IOBR (v 0.99.0)31을 사용하여 수행되었습니다. 면역 및 기질 세포 풍부도를 추정하는 데 MCP-counter를 사용했고, CIBERSORT는 22가지 면역 세포 유형의 상대적 비율을 정량화하는 데 사용되었습니다. ssGSEA는 GSVA 패키지(v1.52.3)32 를 사용하여 면역 세포 아형의 샘플 수준 농축을 평가하기 위해 수행되었습니다.

경쟁 내인성 RNA(ceRNA) 조절 네트워크 구축

기존에 확인된 주요 유전자와 관련된 miRNA–lncRNA 조절 역할을 조사하기 위해 ceRNA 조절 네트워크가 구축되었습니다. R 패키지 multiMiR (v 1.26.0)33 은 PITA(https://omictools.com/pita-tool/)와 miRDB 데이터베이스(https://mirdb.org/)의 데이터를 통합하여 주요 유전자의 잠재적 마이크로RNA(miRNA)–mRNA 상호작용을 예측하는 데 사용되었습니다. 높은 신뢰도와 일관성을 가진 miRNA–mRNA 쌍이 선정되었습니다. 이후 lncRNA–miRNA 상호작용이 StarBase 데이터베이스(https://rnasysu.com/encori/)에서 검색되어 10건의 CLIP-seq 실험≥ 지지하는 상호작용을 필터링하여 lincRNA로 분류하였습니다. cRNA 네트워크는 lncRNA-miRNA-mRNA 상호작용을 통합하여 구축되었습니다.

qPCR 검증

주요 유전자의 발현을 검증하기 위해, 허베이의과대학 제3병원(W2025-065-1) 임상 코호트(n=6개)에서 승인된 프로토콜과 사전 동의 하에 혈액 샘플을 채취하였습니다. 총 RNA는 TRIzol 시약과 클로로포름, 이소프로판올을 함께 분리하여 분리하였다. 추출 후 RNA는 DEPC 처리수에 용해되었고, 그 농도와 순도를 나노드롭 분광광도계로 평가했습니다. 전사 분석을 위해 RNA는 Fast First-strand cDNA Synthesis Mix for RT(dsDNase 포함)를 사용해 cDNA로 역전사되었습니다. 이후 Fast Taq qPCR SYBR Green 믹스를 사용하여 정량 PCR이 수행되었습니다. 구체적인 프라이머 서열은 재료표에 자세히 나와 있습니다. 상대 유전자 발현 수준은 적절한 정규화와 함께 2-ΔΔCT 방법을 사용하여 계산하였습니다.

통계 분석

모든 통계 분석은 R 소프트웨어와 GraphPad Prism을 사용하여 수행되었습니다. 두 독립 그룹 간의 통계적 비교는 데이터 분포에 따라 학생 t-검정 또는 맨-휘트니 U 검정을 사용하여 수행되었습니다. p-값이 0.05 미만일 경우 통계적 유의성을 나타내는 것으로 간주되었습니다.

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결과

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교차하는 유전자의 식별 및 기능 풍부화

HF에서 SUM화와 미토콘드리아 기능에 관여하는 유전자를 규명하기 위해, 먼저 훈련 세트 GSE59867에서 품질 관리가 수행되었습니다(보충 그림 1A). 훈련 세트 내 모든 유전자, SRG, MRGs 사이에서 3자 교차 분석을 수행하여 113개의 중복 유전자를 확인하였습니다(그림 1A). 이 유전자들의 생물학적 잠재적 기능을 탐구하기 위해 GO 및 KEGG 경로 풍부 분석을 수행하였습니다. 그림 1B에서 보듯, GO 풍부화 과정에서 이 유전자들은 주로 미토콘드리아 자가포식 조절, 미토포지, 뉴클레오사이드 삼인산 대사, 그리고 방추 및 유사분열 방추 구조를 포함한 세포 주기 관련 구성 요소에 관여함을 밝혀냈다. 주요...

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토론

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HF는 다양한 심혈관 질환의 진행적이고 말기 단계로, 매우 복잡하고 다요인적인 병태생리학적 기전을 특징으로 합니다17,34. SUMOylation과 미토콘드리아 기능 장애가 각각 HF와 관련이 있음이 밝혀졌지만, 이들의 잠재적 시너지 역할은 특히 유전자 수준에서 충분히 탐구되지 않았습니다. 본 연구에서는 NFKB1, MYEF2, NSUN2, SQSTM1, FKBP4 등 다섯 가지 핵심 유전자를 확인하고, 다양한 머신러닝 접근법을 활용해 HF 진단 모델을 구축하였습니다. 우리는 생물정보학 분석을 통해 이들의 잠재적 생물학적 기능을 더욱 밝혔습니다.

임상 진단에서 머신러닝의 예측력을 활용하여, 우리는 LASSO 회귀, XGBoost, RF 알고리즘을 사용하여 SUMOylation 관련 유전자와 미토콘드리아 관련 유전자 ...

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공개 사항

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이 연구는 허베이성 의학과학연구프로젝트(연구비 번호: 20250084)의 지원을 받았습니다.

감사의 글

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저자들은 이해 상충을 신고할 필요가 없습니다.

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재료

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이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
클로로폼 대체제ServicebioG3014-02qPCR 시약
DEPC-처리된 물BiosharpBL510AqPCR 시약
RT용 Fast First-Strand cDNA 합성 믹스 (dsDNase 포함)Albatross Biology500-101qPCR 시약
Fast Taq qPCR SYBR Green 믹스Albatross Biology500-102qPCR 시약
FKBP4 프라이머TsingkeN/AForward: 5’-GAAGGCGTGCTGAAGGTCAT-3’
Reverse: 5’-TGCCATCTAATAGCCAGCCAG-3’
이소프로판올Hushi80109218qPCR 시약
MYEF2 프라이머TsingkeN/AForward: 5’-CAGCTCCAATGGCGTTAAAATG-3’
Reverse: 5’-TGGCCTTCTTACTTCCTGTAGAT-3’
NanoDrop 분광광도계Thermo Fisher ScientificNanoDrop 2000CqPCR 시약
NFKB1 프라이머TsingkeN/AForward: 5’-AACAGAGAGGATTTCGTTTCCG-3’
Reverse: 5’-TTTGACCTGAGGGTAAGACTTCT-3’
NSUN2 프라이머TsingkeN/AForward: 5’-GAACTTGCCTGGCACACAAAT-3’
Reverse: 5’-TGCTAACAGCTTCTTGACGACTA-3’
SQSTM1 프라이머TsingkeN/AForward: 5’-GCACCCCAATGTGATCTGC-3’
Reverse: 5’-CGCTACACAAGTCGTAGTCTGG-3’
TRIzol 시약VazymeR401-01qPCR 시약
β-actin 프라이머TsingkeN/AForward: 5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’
Reverse: 5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’
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