맞춤형 케이지 시스템을 이용한 쥐의 자발적 집단 사육 호환 대변 샘플 수집

요약

이 프로토콜은 집단 사육 쥐로부터 자발적이고 복지 친화적이며 동시, 개별적으로 배설물 샘플을 채취할 수 있는 맞춤형 케이지 시스템을 설명합니다.

초록

대변 코르티코스테론 대사산물의 신뢰성 있는 측정은 개별 동물에게 할당하고 정해진 시간 내에 수집할 수 있는 대변 샘플이 필요합니다. 집단 사육 쥐에서는 집에서 우리에 모여 개체 배정이 불가능하고, 일시적 분리가 동물 복지와 연구 결과에 영향을 줄 수 있어 도전적입니다. 이 프로토콜의 목표는 집단 사육 쥐로부터 자발적이고 동시적이며 개별적으로 배설물 샘플을 채취할 수 있는 간단하고 저렴한 케이지 시스템을 제시하는 것입니다. 시스템은 철사 상단의 폴리카보네이트 홈 케이지와 세 개의 개별 수집함으로 구성되어 있습니다. 습관과 훈련 후, 쥐들은 자발적으로 상자에 들어가 작은 음식 보상을 받습니다. 그 후 문을 쫓거나 다루거나 강제 이동하지 않고도 닫을 수 있습니다. 배설 펠릿은 각 상자에서 별도로 수집되어, 샘플을 개별 동물에게 할당하면서 샘플링 기간 외에는 사회 주택을 유지할 수 있습니다. 이 프로토콜은 비침습적 종단 샘플링을 지원하며, 대변 코르티코스테론 대사산물 또는 기타 대변 바이오마커 측정 연구에 적합합니다. 이 설계는 표준 케이지 재질과 아크릴 유리로 쉽게 제작할 수 있으며, 분해하여 청소할 수 있고, 여러 케이지를 병행하여 샘플링할 수 있습니다. 취급 관련 교란을 줄이고 샘플링 창의 표준화를 개선함으로써, 이 방법은 집단 집 쥐에서 내분비 모니터링을 실용적으로 개선할 수 있게 합니다.

서론

혈장 코르티코스테론 농도를 평가하는 데 있어 주요 과제는 샘플링 절차 자체가 급성 코르티코스테론 증가를 유발하여 측정을 혼란시키고 연구 결과 해석에 영향을 줄 수 있다는 점입니다 ^1,2,3. 대변 코르티코스테론 대사산물(FCMs) 측정은 비침습적 대안을 제공하는데, FCM 농도는 종, 균주, 성별, 장 통과 시간에 따라 샘플링 몇 시간 전 순환 글루코코르티코이드 수치를 반영하기 때문입니다 ^4,5. 그러나 집단 집 쥐에서의 신뢰할 수 있는 FCM 분석은 여전히 어렵습니다. 집 우리에서 채취한 집 대변 샘플은 개별 동물에게 할당할 수 없으며, 개체 간 글루코코르티코이드 분비 차이와 정확한 샘플링 창의 불확실성으로 인해 큰 변동성을 보일 수 있습니다. 동물을 장기간 분리하는 것은 연구 목적에 방해가 될 수 있으며, 개별 샘플 채취를 위한 단기 분리는 노동 집약적이고 처리량을 제한하며 스트레스를 유발할 수 있습니다².

최소한의 취급으로 집단 사육 쥐의 개별 대변 샘플을 채취할 수 있도록 맞춤형 대변 수집 케이지가 개발되었습니다(그림 1A-E). 이 설계는 이전에 설명된 가시 쥐⁶ 용 배설물 수집 케이지를 변형하여 실험실 쥐에 맞게 수정되었습니다. 이 시스템은 표준 폴리카보네이트 타입 III 케이지와 세 개의 개별 수집 상자에 연결되어 있으며, 동물들은 자발적으로 접근하여 미닫이문을 통해 닫을 수 있습니다. 이 시스템은 샘플링 기간 동안 직접 다루지 않고도 개별 쥐로부터 배설물 샘플을 채취할 수 있게 하며, 여러 동물의 동시에 샘플링을 가능하게 합니다. 따라서 케이지는 집단 사육 쥐에서 비침습적이고 개별적으로 귀속 가능한 FCM 샘플링을 위한 실용적인 접근법을 제공합니다.

다음 프로토콜은 개별 쥐의 대변 샘플을 수집하고 식별할 수 있는 시스템을 설명하며, 집단 거주 환경을 유지하며, 맞춤형 우리를 사용해 비접촉 대변 샘플링을 할 수 있도록 합니다.

프로토콜

비엔나 의과대학의 동물 윤리 위원회는 연구 진행 전에 협의를 받았으며, 공식 동물 실험 허가가 필요하지 않다는 조언을 받았다; 따라서 승인이나 프로토콜 번호는 제공되지 않습니다. 이 연구는 확립된 번식 및 사육 관행과 비침습적 대변 샘플 채취만을 포함했습니다. 침습적 시술은 시행되지 않았습니다. 지침 2010/63/EU에 따라, 동물들에게 가해지는 예상 부담은 우수 수의학 관행에 따라 바늘 삽입과 동등하거나 그 이상인 통증, 고난, 고통 또는 지속적인 피해의 임계값 이하로 평가되었습니다. 모든 동물은 기관 동물 복지 기준에 따라 수용되고 돌봄을 받았습니다.

1. 우리 제작 (재료 목록 참조)

1. 5mm 플렉시글라스/아크릴 유리에서 1-4 부품을 그림 2A-C에 표시된 템플릿에 따라 절단합니다.
   참고: 정확한 치수를 가진 템플릿은 DIN A3 형식으로 인쇄할 수 있습니다(보완 그림 1 및 보충 그림 2).
2. 그림 2D에 표시된 폴리카보네이트 타입 II(PTII) 케이지 바닥을 잘라냈습니다. 이 부분은 나중에 배설물 수집 상자의 상단 덮개로 사용될 것입니다.
3. 그림 2D에 표시된 대로 PTII 케이지의 이전 바닥에 구멍과 슬롯을 뚫으세요.
   참고: 정확한 치수는 보충 그림 3에 제공되어 있습니다.
4. 그림 2E에 표시된 대로 PTIII 케이지의 앞면과 짧은 측면에 구멍을 뚫습니다.
   참고: 정확한 치수는 보충 그림 4에 제공되어 있습니다.
5. 2부를 템플릿으로 사용해 PTIII 케이지의 짧은 면과 긴 면에 해당하는 드릴 구멍을 표시하세요.
6. 표시된 구멍을 뚫고 PTIII 케이지, PTII 케이지, 그리고 부품 2를 나사산 나사로 부착하세요. 이는 그림 2F에 나타난 것입니다.
7. PTII 케이지 바닥에 1부를 삽입하세요. 4a와 4b 부품을 1부분이 고정되도록 위치시키고, 샘플링 케이지를 별도의 수집 상자로 나누세요. 핫글루건으로 고정하세요.
8. 부품 4a와 4b의 하단 돌출부를 부품 1의 슬롯에 밀어 넣으세요. 이 돌출부들이 헌금함의 다리를 형성합니다.
9. 4a와 4b 부분의 상단 돌출부를 PTII 케이지의 이전 하단인 상단 덮개를 통과시켜 고정하세요.
10. 돌출부의 구멍에 나무 젓가락이나 막대를 꿰어 상단에 한 개, 아래쪽에 두 개의 막대를 사용해 구조를 안정시키고 고정하세요.
    참고: 목재 재료는 세척이 불가능하므로 일회용일 때만 비바리움에 사용해야 합니다. 그렇지 않다면 대체 조성의 막대를 사용해야 합니다.
11. 남은 틈이나 사소한 부정확한 부분은 핫글루건으로 메우세요. 3a, 3b, 3c(그림 2B)는 홈 케이지와 수집 상자 사이에 미닫이문으로 사용하세요.
    참고: 날카로운 모서리, 접착제 잔여물, 돌출된 물질이 동물에게 닿지 않도록 주의하세요. 이 프로토타입에 사용된 아크릴 유리/플렉시글라스 부품은 증기 오토클레이브 멸균에 적합하지 않습니다. 따라서 멸균된 케이지 관련 재료가 필요한 SPF 시설에서 시스템을 사용할 경우, 기관에서 승인한 비고동멸균 소독 절차를 사용하거나, 아크릴 부품을 동일한 치수를 유지하면서도 오토클레이브 가능한 재료로 교체해야 합니다.

2. 동물 준비 및 사육

1. 연구에 적합한 균주에 필요한 수의 마우스를 확보하세요.
   참고: 대표 데이터는 8주 된 C57BL/6J 쥐 30마리(암컷 20마리, 수컷 10마리)로부터 얻어졌습니다. 이 쥐들은 FELASA 기준에 따라 특정 병원체가 없는 것으로 독일 술츠펠트의 Charles River Laboratories에서 입수했습니다.
2. 기존 조건 하에서 적응된 폴리카보네이트 타입 III 우리에 가둬 최대 3마리의 성체 쥐를 우리에 넣습니다.
   참고: 이 연구에서는 분리된 수컷을 표준 폴리카보네이트 타입 II 우리에 수용하였습니다.
3. 동물실은 22± 2°C, 55± 상대습도, 12시간의 빛/어둠 주기 동안 오전 6시에 조명을 켜 유지하세요.
4. 표준 유지 식단과 수분을 자유롭게 제공하세요.
5. 각 우리에는 아스펜 나무 침구, 종이 화장구, 빨간색 투명 플라스틱 집, 종이 타월을 둥지 재료로 추가하세요.
6. 쥐는 주로 자연스러운 꼬리 무늬로 식별하세요. 필요하다면 무게를 재는 동안 꼬리 무늬가 비슷한 동물에게 일시적으로 펜 표시를 붙여 주세요.

3. 동물의 습관화 및 훈련

참고: 완성된 케이지는 홈 케이지 PTIII와 세 개의 별도 수집함 PTII가 있는 샘플링 케이지로 구성되어 있습니다. 가정용 우리도 깔개, 케이지 풍부함, 외부 고정장치가 없는 철사 뚜껑, 그리고 음식과 물을 제공하는 일반 우리처럼 사용할 수 있습니다. 이 시스템은 세척을 위해 분해할 수 있으며, 샘플링 주간에만 사용할 수 있습니다. 샘플링이 없는 몇 주 동안에는 동물을 표준 PTIII 우리에 보관할 수 있습니다.

1. 첫 번째 계획된 샘플링 최소 2주 전에 동물들을 우리 시스템에 넣으세요.
2. 동물들이 수집 상자에 익숙해지도록 하룻밤 동안 미닫이문을 제거해 동물들이 자유롭게 상자를 탐색할 수 있게 하세요.
3. 첫 샘플링 세션 전에 세 번의 훈련 세션을 수행하세요. 동일한 조명 조건과 같은 시간대에 훈련을 실시하여 이후 샘플링을 계획했으며, 이상적으로는 암기 단계 시작 직후 적색 조명 아래에서 진행됩니다.
4. 각 수집함 입구 맞은편 벽에 헤이즐넛 크림, 땅콩버터, 몰트 페이스트 등 먹기 좋은 음식 같은 소량의 보상을 바르세요.
5. 첫 훈련일에는 문을 열어두고 동물들이 자발적으로 보상을 발견하고 먹도록 하세요.
6. 두 번째 훈련일에는 동물이 수집 상자에 들어와 보상을 핥기 시작할 때까지 기다립니다. 동물 뒤에서 미닫이문을 조심스럽게 닫고 10분 후에 놓아주세요.
7. 세 번째 훈련 날에는 이 과정을 반복하며 동물들이 수집 상자에 머무는 시간을 점차 늘려가세요.
   참고: 훈련은 차분하고 일관되게 해야 합니다. 동물을 상자 안으로 쫓아넣지 마세요. 이는 스트레스를 증가시키고 이후 샘플링 세션에서 자발적인 참여를 줄일 수 있습니다.

4. 대변 샘플 채취

1. 샘플 채취 시기
   1. 생물학적 질문과 혈장 코르티코스테론과 대변 코르티코스테론 대사물 배설 사이의 예상 지연에 따라 샘플링 시간을 계획하세요. 쥐에서 대변 코르티코스테론 대사산물은 일반적으로 샘플링 약 8-10시간 전에 순환하는 글루코코르티코이드 수치를 반영합니다.
      참고: 정확한 시기가 중요하다면, 특정 균주, 성별, 실험 조건에서 FCM 배설의 시간 경로를 파악하기 위한 파일럿 연구를 수행하십시오. 이 파일럿은 훈련 세션과 결합할 수 있습니다.
   2. 대변량이 많은 시기에 샘플링 일정을 잡으세요. 샘플링은 보통 암흑기와 활성 단계의 초기에 가장 효율적입니다.
   3. 연구 기간 내내 모든 샘플링 세션을 같은 시간에 수행하여 FCM 수치의 일주 리듬으로 인한 변동을 줄이세요.
      참고: 저희 경험상, 오전 10시경에 발생한 사건은 동물실의 조명 일정에 따라 오후 6시에서 8시 사이에 샘플링이 예정되어 있을 때 잘 반영됩니다.
2. 샘플링 절차 및 실질적 조언
   1. 샘플 채취 전에 개체별로 표시하세요. 귀 모양이나 개별 꼬리 표시를 사용하세요.
      참고: 빨간 불 아래에서는 발가락 표시와 색상 코드가 박스 안에서 알아보기 어려울 수 있습니다.
   2. 조명 단계에는 보상을 각 상자 뒷벽에 붙여 수집 상자를 준비하세요.
      참고: 낮에 상자를 준비하면 실험자의 시야가 좋아지고, 동물들이 샘플 추출 전에 보상 냄새를 맡을 수 있습니다.
   3. 예정된 샘플링 시간에 채집 상자를 열고 동물들이 자발적으로 들어올 때까지 기다리세요.
   4. 쥐가 수집함에 들어오면 그 뒤에 있는 미닫이문을 조심스럽게 닫으세요.
   5. 모든 동물이 상자에 들어간 후, 각 쥐의 신원과 위치를 준비된 샘플링 시트에 기록하세요.
   6. 한 세션에서 10개 이상의 케이지를 샘플링할 경우, 동물 식별, 문 다루기, 문서화 지원을 위해 두 번째 실험자를 참여시키세요.
   7. 예상되는 대변 배출량과 연구 설계에 따라 계획된 샘플링 기간인 보통 30분에서 2시간 동안 동물을 수집 상자에 보관하세요.
      참고: 개체 신원을 확실히 식별할 수 없거나, 배설 펠릿이 다른 동물의 소변, 침구, 배설물로 오염되었거나, 샘플링 시간이 계획된 시간 창과 크게 차이가 나거나, FCM 분석에 충분한 분변 물질이 없는 경우 샘플을 제외하십시오.
      참고: 50mg 사용은 저희 표준 프로토콜이며, 이 용량은 모든 검증 및 5^{, 7}, ⁸ 논문에서 사용되었습니다. 보통은 쉽게 구할 수 있습니다.
   8. 샘플링 기간이 끝나면 미닫이문을 열고 쥐들이 집 우리로 돌아갈 수 있도록 하세요.
   9. 쥐가 떠난 후 즉시 채취 상자를 닫아 재유입과 샘플 교차 오염을 방지하세요.
   10. 각 수집 상자에서 긴 겸자를 사용해 대변 펠릿을 제거하여 개별 라벨이 붙은 채집관으로 옮기세요.
   11. 샘플은 FCM 분석이 추가 준비될 때까지 -20 °C에서 보관합니다.
       참고: 상자가 단단히 닫혀 있고 쥐가 다시 들어올 수 없다면, 배설물 채취는 다음 빛 단계로 미룰 수 있습니다. 하지만 이는 연구 내에서 일관되게 이루어져야 합니다.
   12. 다음 케이지 교체 때까지 동물들을 홈 케이지 구역(PTIII)에 두세요. 그 후 분해해서 일반 케이지 세탁기로 세척할 수 있습니다.

결과

대변 코르티코스테론 대사산물(FCM)은 맞춤형 대변 샘플링 케이지로 채취한 샘플에서 영구 및 간헐적 번식된 마우스를 비교한 종단 연구에서 성공적으로 정량화되었습니다. 대표적인 FCM 분석에는 30마리의 동물이 포함되었습니다: 영구 번식군, n = 5개의 우리에 15마리; 간헐적으로 번식하는 그룹, n = 5개의 우리에 10마리의 동물이 있으며, 수컷 5마리는 단일 사육 상태였으며, 3번의 번식 행사에서는 암컷과 함께 사육되었습니다. 샘플은 케이지 교체일과 주말에 격주로 19개 시점에 수집되었습니다. 대부분의 동물이 상자에 들어오기까지 평균 시간은 7.5분(SD = 3.07)이었으며, 대부분의 동물은 총 30마리의 쥐 중 평균 27.6마리(SD = 1.44)였습니다. 모든 쥐는 평균 11.69분 후에 상자에 들어갔습니다(SD = 3.29). 모든 쥐의 평균 가두기 시간은 24.56분(SD = 15.51)이었고, 첫 마우스가 상자에 들어간 후 방출 시작 시점까지 평균 시간은 43.14분(SD = 8.51)이었습니다. 평균 방출 시간은 14.86분(SD = 22.82), 전체 시술의 평균 지속 시간은 68.00분(SD = 11.87)이었습니다. 19개의 샘플(3개 시험 + 16개 일반 샘플)에서 480개의 샘플을 예상했으나, 쥐가 갇혀 있는 동안 배설하지 않아 2개의 샘플이 누락되었고, 3개의 샘플은 쥐가 매우 임신 중이거나 출생 직후였기 때문에 채취할 수 없었으며, 5마리의 마우스는 부드러운 지지가 필요했기 때문에 진입이 불가능했습니다. 처음 세 번의 샘플에서 채취된 샘플의 평균 무게는 51.16 mg(표준표준값 = 25.39)이었습니다. 수집된 모든 샘플(475개) 중 473개가 분석되어 결과를 얻었습니다.

개별 동물들이 생물학적 복제체로 간주되었습니다. 8주간의 연구 기간 동안 동일한 동물에서 반복적으로 채취한 대변 샘플은 독립적인 생물학적 복제가 아닌 종단 반복 측정으로 취급되었습니다. 분석은 성별, 번식군, 표본일, 케이지당 쥐 수로 고정 효과, 우리를 무작위 인터셉트로 하는 선형 혼합 효과 모델을 사용했다. 성별, 번식 그룹, 표본 채취일 간의 상호작용도 모델에 포함되었습니다. 우리당 쥐 수는 추가 고정 효과로 포함되었으나, 특히 간헐적으로 번식하는 수컷에서 이 변수가 실험 설계와 일부 혼동되어 상호작용 측면에서 테스트되지는 않았습니다.

모델은 성별이 FCM 농도에 명확한 영향을 미치는 것을 보여주었다(그림 3A-D). 암컷은 번식 조건과 표본 채취일에 걸쳐 수컷보다 FCM 농도가 더 높았으며, 추정치 = 28.30, SE = 2.58, t = 10.98, P < 0.0001. 사후 비교 결과, 두 번식 그룹 내에서도 이 성별 차이가 확인되었습니다. 영구 번식된 동물에서는 일요일에 암컷이 수컷보다 FCM 농도가 높았으며, 추정 = 53.41, SE = 8.28, P < 0.0001, 수요일에는 추정 = 55.27, SE = 8.37, P < 0.0001. 간헐적으로 번식하는 동물들에서도 일요일에 관찰된 패턴이 관찰되었으며, 추정치 = 58.04, SE = 12.00, P < 0.0001, 수요일에는 추정치 = 59.68, SE = 9.88, P < 0.0001.

모델은 또한 번식 그룹에 따른 유의미한 주효과(추정치 = 11.59, SE = 4.65, t = 2.49, P = 0.0227)를 나타냈습니다. 그러나 Tukey 조정 사후 비교에서는 개별 성별/일일 조합 내에서 영구 번식과 간헐적 번식동물 간에 유의미한 차이가 발견되지 않았습니다. 암컷의 경우, 영구 및 간헐적 번식하는 동물은 일요일에 큰 차이가 없었으며, 추정치 = 24.51, SE = 12.20, P = 0.2085, 수요일에는 추정 = 17.31, SE = 12.20, P = 0.4950. 마찬가지로 수컷에서는 일요일에 유의미한 번식 그룹 차이가 관찰되지 않았으며, 추정치 = 29.14, SE = 14.00, P = 0.1708, 수요일에는 추정치 = 21.72, SE = 13.30, P = 0.3682. 따라서 번식군의 유의한 주효과는 전체 모델 수준 효과로 해석되어야 하며, 성별과 표본일 내 투키-조정 사후 비교에서는 견고한 쌍별 그룹 차이가 확인되지 않았습니다.

수컷 사이에 번식 그룹 간 큰 차이가 없다는 점이 특히 중요한데, 수컷은 일요일에 항상 단독 사육을 했기 때문입니다. 따라서 수컷의 일요일 비교 결과, 샘플링 방법 자체가 적어도 수컷 쥐에서는 FCM 농도를 증가시키지 않는다는 것을 알 수 있습니다. 대변 샘플링 케이지는 오염된 침구 감시쥐^{와 대조}군의 FCM을 비교한 또 다른 연구에도 사용되었습니다.

그림 1: 맞춤형 대변 샘플링 케이지 개요. 케이지 시스템은 집단 케이지에 있는 개별 쥐로부터 직접 다루지 않고도 대변 샘플을 채취할 수 있게 해줍니다. (A) 집 케이지와 부착된 배설물 샘플링 케이지로 구성된 완전 조립된 케이지 시스템. (B) 부착된 샘플링 케이지의 측면 모습. (C) 각 개별 수금함으로 들어가는 세 개의 별도 입구를 보여주는 위쪽 모습. (D) 홈 케이지 내부에서 샘플링 박스 입구를 향해 바라보세요. (E) 개방된 샘플링 케이지, 배설물 제거 및 청소를 위한 수집 상자에 접근할 수 있게 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: 대변 샘플링 케이지의 건설 계획 및 조립. (A-C) 샘플링 케이지의 바닥, 측벽, 미닫이문, 칸막이 등을 만드는 데 아크릴 유리 부품이 사용됩니다. (D) 폴리카보네이트 타입 II 케이지를 개조하여 바닥을 제거하고 수집함 덮개를 위한 구멍과 슬롯을 개조합니다. (E) 폴리카보네이트 타입 III 홈 케이지를 앞면에 세 개의 입구 구멍을 뚫어 개조. (F) 조립된 케이지 시스템의 도식적 측면 모습으로, 폴리카보네이트 타입 III 홈 케이지가 수정된 폴리카보네이트 타입 II 샘플링 케이지와 부품 1, 2, 4의 위치를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: 맞춤형 케이지를 이용한 대변 샘플 채취 후 얻은 대표성 FCM 데이터. 맞춤형 대변 샘플링 케이지를 사용해 집단 사육 쥐에서 개별적으로 채취한 대변 코르티코스테론 대사산물(FCM)을 측정하였습니다. 값은 영구 및 간헐적으로 번식된 쥐에 대해 8주마다 샘플링하는 시점에 걸쳐 표시됩니다. 샘플은 케이지 체인지 이동일이나 주말에 채취되었습니다. 점과 연결선은 각 시점에서의 군 평균을 나타냅니다. 오류 막대와 음영 리본은 평균 ± 표준편차(SD)를 나타냅니다. (A) 우리 교체일에 샘플링된 암컷. (B) 주말에 채취된 암컷. (C) 우리 교체일에 샘플링된 수컷. (D) 주말에 표본을 채취한 수컷. 그림은 이 방법이 모든 그룹과 시점에서 측정 가능한 FCM 농도를 산출했음을 보여줍니다. 암컷은 일반적으로 수컷보다 FCM 농도가 더 높았으며, 번식 그룹 간 차이는 덜 일관되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 1: 아크릴 유리 부품 템플릿 1-3. 5mm 아크릴 유리/플렉시글라스에서 부품 1, 2, 3a-c를 절단하는 템플릿, 대변 샘플링 케이지 제작에 사용됩니다. 1부는 수정된 폴리카보네이트 타입 II 케이지의 하단 삽입물 역할을 합니다. 2부는 폴리카보네이트 타입 III 케이지를 폴리카보네이트 타입 II 케이지에 연결하고 해당 드릴 구멍을 표시하는 데 사용됩니다. 3a-c는 수집 시스템의 내부 구분대/구조적 요소를 형성합니다. 흰색 원형 표시는 공기 구멍을, 작은 표시는 나사 구멍을 나타냅니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 2: 아크릴 유리 부품 4a와 4b 템플릿. 5mm 아크릴 유리/플렉시글라스에서 부품 4a와 4b를 절단하는 템플릿입니다. 이 부품들은 1부에 삽입되어 하단 인서트를 고정하고 샘플링 케이지를 별도의 배설물 수집 상자로 나누는 역할을 합니다. 아래쪽 돌출부는 수집함의 다리를 형성하며, 윗부분은 상단 덮개를 통과해 나무 막대나 젓가락으로 고정하여 구조를 안정시킵니다. 흰색 원은 막대나 공기 구멍을 위한 구멍을 나타냅니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 그림 3: 폴리카보네이트 타입 II 케이지의 개조. 폴리카보네이트 타입 II 케이지 수정을 위한 도식 템플릿. 케이지 바닥은 표시된 대로 잘려 나가 나중에 배설물 수거 상자의 상단 덮개로 사용됩니다. 제거된 하단 부분에는 구멍과 슬롯이 뚫려 부품 4a와 4b의 삽입 및 고정이 가능합니다. 나사 구멍은 폴리카보네이트 타입 II 케이지, 폴리카보네이트 타입 III 케이지, 그리고 Part 2를 부착하는 데 사용됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 4: 폴리카보네이트 타입 III 케이지 전면의 수정. 폴리카보네이트 타입 III 케이지 앞면을 드릴하기 위한 도식 템플릿입니다. 케이지의 짧은 면에는 홈 케이지와 배설물 샘플링 케이지 사이에 접근할 수 있도록 세 개의 원형 구멍이 뚫려 있습니다. 추가 나사 구멍은 Part 2와 폴리카보네이트 타입 II 케이지에 고정하는 데 사용됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

이 프로토콜은 집단 사육 쥐에서 개별적으로 할당 가능한 배설물 샘플을 수집하는 간단한 케이지 시스템을 설명합니다. 이 방법의 주요 장점은 개별 표본 귀속과 사회 주택의 핵심 측면, 특히 케이지 동료와의 시각적·후각 접촉 유지를 결합한다는 점입니다. 이는 동물 복지를 위해 집단 주택이 자주 요구되며 실험 설계의 일부일 수 있기 때문에 중요합니다^. 집 내 케이지 샘플링과 달리, 이 시스템은 샘플 채취 전이나 채취 중에 장기간 개별 수용을 피하면서 개별 동물에게 FCM 값을 할당할 수 있습니다.

실험실 쥐에서 대변 샘플 채취에 일반적으로 사용되는 방법은 집에서 우리를 채취하는 공동 집 내 샘플링, 깨끗한 우리 내 임시 개별 거주지, 대사 케이지, 그리고 취급 또는 이송 후 직접 채취하는 방법이 있습니다. 집에서 채취한 우리 샘플은 구하기 쉽고 비침습적이며 저렴하고 여러 케이지 병행 샘플링과 호환되지만, 집단 사육 동물에서는 개별 귀속을 허용하지 않습니다. 임시 개별 사육이나 깨끗한 우리로의 이동은 개별 표본 할당을 가능하게 하지만, 동물을 사회적 집단에서 분리시키고 다루기, 새로움, 사회적 분리로 인한 급성 스트레스를 유발할 수 있습니다. 이는 특히 FCM 분석에 중요한데, 코르티코스테론 관련 측정값이 샘플링^{절차 자체에} 의해 발생하는 스트레스에 민감하기 때문입니다. 대사 우리(Metabol cage)는 샘플 수집을 통제하고 배설물과 소변을 분리할 수 있게 하지만, 전문 장비가 필요하고 일상적인 사육과는 덜 적합하며 보통 개별 사육이 필요합니다. 직접 취급 기반 채취도 개별적으로 귀속 가능한 샘플을 제공할 수 있지만, 동물을 반복적으로 다루거나 조작해야 하므로 스트레스 관련 수치에 영향을 줄 수 있습니다.

기존 접근법과 비교하면, 본 시스템은 반복적이고 비침습적인 개별 대변 샘플링을 위한 집단 및 주택 호환 정제로 설계되었습니다. 습관화와 훈련 후, 쥐들은 작은 먹이 보상에 자발적으로 샘플링 박스에 들어갑니다. 따라서 샘플은 쫓아가거나 다루거나 별도의 우리로 강제 옮기지 않고도 채취할 수 있습니다. 이 시스템은 직접적인 복지 조치가 본 연구에 포함되지 않았으므로 엄격한 실험적 의미에서 복지 개선이나 스트레스 감소가 입증되었다고 해석해서는 안 됩니다. 하지만 샘플 채취 시 사회적 분리 정도를 줄이기 위해 설계되었기 때문에 기존의 개인 채취 방식보다 덜 방해가 될 수 있습니다. 또한 여러 동물과 여러 케이지를 병행하여 샘플링 창을 표준화하는 데 도움을 주는데, 이는 FCM 농도가 일주기 리듬에 따라 달라지며 ^5,12 샘플링 몇 시간 전에 글루코코르티코이드 분비를 반영하기 때문에 중요합니다.

대표적인 결과는 이 시스템이 FCM 농도를 분석할 수 있는 대변 샘플 수집에 적합함을 보여줍니다. 측정 가능한 FCM 농도를 그룹과 시점에 걸쳐 얻었으며, 이 방법은 여성에서 남성보다 FCM 농도가 더 높게 예상되는 명확한 성차를 검출했습니다. 또한 남성의 기존 단독 주택과의 내부 비교도 포함되었습니다. 일요일에는 간헐적 번식 그룹의 수컷을 단독 사육했으며, 영구 번식된 수컷은 새로 개발된 수집 시스템을 통해 샘플링되었습니다. 일요일에 FCM 농도는 이들 그룹 간에 유의미한 차이가 없었습니다. 이는 자발적으로 표본 케이지에 들어가고 단기간 채집함 내에 머무는 것이 기존 단일 주택 채취에 비해 FCM 농도를 현저히 증가시키지 않았음을 시사합니다. 그럼에도 불구하고 이 비교는 남성에 한정되었으며, 전용적인 동등성이나 교차 검증 연구로 설계된 것은 아니었습니다. 따라서 추가 연구에서는 균형 잡힌 실험 조건 하에서 기존 개체 주거 또는 대사 케이지 접근법과 시스템을 비교하고, 샘플링 중 급성 스트레스의 행동 지표를 포함해야 합니다.

대변 코르티코스테론 대사산물 평가 외에도, 이 시스템은 개별 대변 샘플의 단기 수집이 필요한 다른 응용 분야에도 유용할 수 있습니다. 잠재적 응용 분야로는 기생충학 검사, 미생물군 분석, 소화 연구 또는 기타 대변 바이오마커 분석이 포함됩니다. 약간의 기술적 수정을 통해, 예를 들어 천공된 바닥과 동물 아래에 적합한 수집 트레이를 도입하여 소변 수집에도 적용할 수 있습니다. 이러한 응용 분야에서, 샘플 채취 시 케이지 동료와의 근접성을 유지하는 가능성은 기존의 개별 케이지나 대사 케이지 방식보다 유리할 수 있습니다. 그러나 시스템의 적합성은 각 특정 샘플 유형과 후속 분석, 특히 오염, 샘플 부피, 채취 시간 또는 저장 조건이 중요한 경우에 대해 검증되어야 합니다.

일반적으로 동물들은 첫 샘플링 전에 상자에 익숙해지도록 해야 하며, 개별 표시는 사용된 조명 조건에서 명확히 보여야 하며, 샘플링은 연구 내내 같은 시간에 이루어져야 합니다. 개별 신원이 불확실하거나, 펠릿이 오염되었거나, 샘플링 기간이 계획된 시간대와 상당히 다르거나, 대변 물질^{이 분석에} 불충분한 경우 샘플은 제외되어야 합니다. 표본 시스템의 적용 가능성에는 우위 계층, 공격적 상호작용, 음식 동기의 변동성, 품종 차이, 그리고 비만, 노령, 임신, 산후 또는 기타 장애가 있는 동물의 이동성 감소 또는 행동 변화 등 여러 실질적인 요인이 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나 현재 학년에서는 자발적 입학과 샘플링 성공률이 높았습니다. 480개의 정기 샘플 중 두 개는 쥐가 갇혀 있는 동안 배설하지 않아 누락되었고, 세 개는 동물이 임신 중이거나 출산 직후라 채취할 수 없었다. 따라서 475개의 샘플이 수집되었으며, 그중 473개는 분석 가능한 결과를 제공했습니다. 이 데이터는 본 연구에서 사용된 조건 하에서 상자 진입 거부와 샘플 채취 실패가 드물었음을 보여줍니다. 그럼에도 불구하고, 다른 균주, 더 큰 집단, 또는 이동성, 신체 상태, 건강 상태, 사회적 행동이 변화된 동물에 대해서는 추가적인 습관화 또는 프로토콜 조정이 필요할 수 있습니다. 추가적인 한계로는 이 방법이 훈련이 필요하며 현재 세 마리 소규모 쥐 그룹용으로 설계되었고, 아크릴 유리/플렉시글라스 부품은 증기 오토클레이브가 불가능하다는 점이 있습니다.

이 케이지는 저렴하고, 표준 케이지 재료와 아크릴 유리로 쉽게 만들 수 있으며, 전자 부품이 필요하지 않습니다. 이 설계는 분해, 청소, 그리고 정기적인 케이지 교체 루틴에 통합할 수 있어 반복적인 종방향 샘플링에 적합합니다. 전반적으로 이 시스템은 쥐에서 비침습적이고 개별적으로 배정 가능한 대변 샘플링을 위한 실용적이고 집단 주거 적합 접근법을 대표합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
드릴 비트 5 mm	Craftomat	22380487	5mm 직경; 수량 1
드릴 비트 60 mm	Bosch	32064647	60 mm 직경; 수량 1
드릴 비트 7 mm	Craftomat	22380520	7 mm 직경; 수량 1
드릴링 기계	Makita	25730054	표준 휴대용 또는 벤치 드릴; 수량 1
핫 글루 건	Einhell	29051207	케이지 조립용; 수량 1
핫 글루 스틱	Einhell	29049664	핫 글루 건과 호환 가능; 수량 5-10
Makrolon 케이지	Animalab	31200129	표준 타입 II 케이지; 수량 1
Makrolon 케이지	Animalab	31200256	표준 타입 III 케이지; 수량 1
플렉시글라스 / 아크릴 유리	Bauhaus	29122352	총 약 0.25 m²; 두께 5 mm; 수량  2DIN A3 시트
톱 또는 밀링 장치	Scheppach	32079641	소형 밴드 톱, 퍼질 톱 또는 CNC 밀; 수량 1
나사 식 나사	Profi Depot	10807533	20 mm × 3 mm; 수량 4
나무 젓가락 / 막대	Ikea	903.429.71	둥근 나무 막대; 수량 3