MiR-93-5p는 소아 Mycoplasma pneumoniae 폐렴(MPP)에서 Toll-like receptor 4 (TLR4)를 직접적으로 표적합니다. MiR-93-5p의 하향 조절은 질환의 진행 및 이와 관련된 소화기계 손상에 기여할 수 있습니다. 이러한 결과는 miR-93-5p가 MPP 및 소화기계 손상을 동반한 MPP의 잠재적인 진단 바이오마커로 활용될 수 있음을 시사합니다.
연구 논문
소화기계 손상을 동반한 Mycoplasma pneumoniae 감염 아동에서 miR-93-5p의 역할 평가
이 논문에서
요약
초록
MiR-93-5p는 급성 폐 손상을 조절하는 것과 관련이 있는 것으로 알려져 있으나, 소화기계 손상을 동반한 소아 Mycoplasma pneumoniae 폐렴(MPP)에서의 역할과 진단적 가치는 아직 불분명합니다. 본 연구에서는 소아 MPP 및 관련 소화기 합병증의 잠재적 진단 바이오마커로서 miR-93-5p의 역할을 평가하였습니다. MPP 소아 환자와 건강한 대조군으로부터 임상 시료를 수집하였습니다. MiR-93-5p 발현량은 역전사 정량 PCR로 측정하였습니다. Mycoplasma pneumoniae (MP)에 감염된 A549 세포를 사용하여 세포 수준의 MPP 모델을 구축하고, 세포 생존율과 염증성 사이토카인의 변화를 평가하였습니다. miR-93-5p에 의한 Toll-like receptor 4 (TLR4) 타겟팅은 루시퍼레이즈 리포터 분석을 통해 평가하였습니다. 진단 성능은 ROC(receiver operating characteristic) 곡선 분석을 사용하여 평가하였습니다. 건강한 대조군과 비교하여 MPP 환자의 MiR-93-5p 수치는 유의하게 감소하였으며(P < 0.001), 소화기계 손상을 동반한 MPP 환자는 MPP 단독 환자와 비교하여 더욱 감소하였습니다. MP 감염은 세포 생존율을 감소시키고 IL-6 및 TNF-α 수치를 증가시켰으나, miR-93-5p 과발현은 이러한 효과를 완화시켰습니다. TLR4 발현은 MP 감염 후 증가하였으며 miR-93-5p에 의해 부정적으로 조절되었습니다. 임상적으로 MPP 환자의 소화기계 손상은 더 낮은 miR-93-5p 수치와 연관이 있었습니다. ROC 곡선 분석 결과, 건강한 대조군과 MPP 환자를 구분하고, MPP 단독 환자와 소화기계 손상을 동반한 MPP 환자를 구분하는 데 있어 우수한 진단 성능을 보였습니다. MiR-93-5p는 소아 MPP에서 TLR4를 직접적으로 타겟팅하며, miR-93-5p의 발현 감소는 질병의 진행 및 관련 소화기계 손상에 기여할 수 있습니다. 이러한 결과는 miR-93-5p가 MPP 및 소화기계 손상을 동반한 MPP의 잠재적인 진단 바이오마커로 활용될 수 있음을 시사합니다.
서론
Mycoplasma pneumoniae (MP)는 소아 폐렴을 일으키는 주요 병원체이며1, 전 세계적으로 심각한 호흡기 질환을 초래하는 경우가 많습니다. MP는 주로 폐 감염을 유발하지만, 여러 장기 시스템이 포함된 폐외 합병증을 일으킬 수도 있습니다2. M. pneumoniae 감염 시 가장 빈번하게 보고되는 위장관 증상으로는 메스꺼움, 구토, 설사 및 복통이 있습니다3. 다양한 위장관 상태 및 증상 또한 M. pneumoniae 관련 폐외 질환(MPEPDs)의 일부로 확인되었습니다2. 소화기계 손상이 동반된 소아 M. pneumoniae 폐렴 (MPP) 환자는 질병의 중증도를 악화시키고 관리를 어렵게 만드는 임상적 난제를 나타냅니다4. 최근의 증거들은 이러한 연관성의 근거가 될 수 있는 폐 감염과 장 기능 장애 사이의 상호작용을 시사합니다5,6. MP 감염 중 면역 반응의 조절 장애 또한 소화기계 손상과 관련이 있을 수 있습니다7.
진단 방식의 발전에도 불구하고8, MPP의 조기 및 정확한 식별은 다른 호흡기 감염과의 겹치는 임상 증상과 다양한 폐외 침범으로 인해 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다9. 폐와 장은 공통 점막 면역 체계의 핵심 구성 요소이며, 폐 질환 중의 장 장애와 그 상호 작용에서 나타나듯이 이들 기관은 서로의 기능에 영향을 미칠 수 있는데, 이러한 현상을 폐-장 크로스토크(lung-gut crosstalk)라고 합니다10. 더욱이, 소아 간호는 주로 호흡기 증상 관리에 집중하는 반면11, 위장관 증상은 충분히 인식되지 않거나 치료 부작용으로 치부될 수 있습니다. 이러한 간극은 지지적 간호 중재를 최적화하기 위해 폐와 위장관 평가를 모두 통합한 종합적인 평가의 필요성을 강조합니다12. 최근의 분자 생물학적 연구들은 MPP에서 폐 병리와 장 염증 모두에 관여하는 염증 신호 전달 경로의 조절 인자들을 조명해 왔습니다12,13.
MiR-93-5p는 급성 폐 손상의 병태생리에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 이의 발현 감소는 폐 기능 저하 및 염증 반응 악화와 상관관계가 있습니다14,15. 이러한 발견을 바탕으로, MPP 환아의 혈청에서도 miR-93-5p가 유사하게 감소했을 것이라는 가설을 세웠습니다. TargetScan 데이터베이스를 이용한 생물정보학적 분석을 통해 Toll-like receptor 4 (TLR4)가 miR-93-5p의 잠재적인 직접 표적인 것으로 확인되었습니다. TLR4는 폐-장 축(lung-gut axis) 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었으며16,17, 따라서 MPP의 위장관 합병증과 관련이 있을 가능성이 있다고 판단되었습니다. 이에 따라, 본 연구에서는 소화기계 손상을 동반한 소아 MPP 환자에서 miR-93-5p의 관여도를 조사하였습니다.
프로토콜
본 연구는 양저우 대학교 부속 병원 윤리 위원회의 심의 및 승인을 받았습니다(승인 번호 2023-YKL01-(16); 2023년 1월 17일). 관련 실험실 분석을 위해 각 참가자로부터 말초 정맥혈 샘플을 채취하였습니다. 참여 전, 모든 참가자의 법적 보호자로부터 고지된 동의를 얻었습니다. 본 프로토콜에 사용된 시약, 장비 및 도구는 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 임상 시료 수집
2023년 2월부터 2024년 12월 사이에 Yangzhou University 부속 병원에서 2~14세 아동 총 108명을 모집하였다. 108명의 아동 모두 흉부 영상 진단과 비인두 검체의 MP DNA에 대한 중합효소 연쇄 반응(PCR) 검사를 통해 MPP로 진단되었다. 비인두 면봉 검체의 MP DNA는 MP 특이적 P1 adhesin 유전자를 표적으로 하는 정량적 실시간 PCR을 통해 검출되었다.
환자들은 질환 상태에 따라 DSI가 없는 MPP 군(n = 60)과 DSI가 동반된 MPP 군(n = 48)의 두 그룹으로 분류되었습니다. DSI는 설사(하루 3회 이상의 묽은 변 또는 수양변이 지속됨)를 포함하여 적어도 하나 이상의 위장관 증상이 있는 것으로 정의되었습니다. >24시간), 구토, 메스꺼움, 또는 반발 압통의 동반 여부와 관계없는 지속적인 복통이 있으며, 최소 하나 이상의 비정상적인 실험실 검사 수치 및/또는 확진 복부 영상 소견이 동반된 경우였다. 비정상적인 실험실 검사 수치에는 혈청 트랜스아미나제, 아밀라아제 또는 리파아제의 상승 및/또는 D-lactate 및 엔도톡신과 같은 장 투과성 마커의 증가가 포함되었다. 확진 복부 영상 소견에는 초음파 또는 컴퓨터 단층촬영으로 검출된 장벽 증후, 장간막 림프절 비대 또는 복수 저류가 포함되었다. 또한, 정기 검진을 받는 건강한 아동 60명을 대조군으로 설정하였다.
- 선정 기준
위장관 증상과 함께 실험실 검사 또는 영상 의학적 이상 소견을 보이는 환자를 DSI 그룹으로 분류하였습니다. - 제외 기준
제외 기준에는 바이러스성 또는 세균성 폐렴, 결핵, 연구 약물에 대한 약물 알레르기 병력, 면역 질환, 영양실조, 신장 기능 장애, 위장관 기형 및 입원 전 항생제 치료 이력이 포함되었습니다.
2. 세포 배양 및 MPP 모델
Mycoplasma pneumoniae 표준 균주 ATCC 15531을 PPLO broth에서 배양하였다. 인간 폐포 상피 A549 세포는 10% fetal bovine serum이 포함된 RPMI-1640 배지에서 37 °C, 5% CO₂ 조건의 습윤 환경에서 배양하였다.
MPP의 인비트로(in vitro) 모델을 구축하기 위해, A549 세포에 감염다중도(MOI) 1:10018의 M. pneumoniae 현탁액을 감염시켰습니다. 감염 후, 배양액을 교체하여 결합하지 않은 박테리아를 제거했습니다. 감염 효율은 감염 후 배양 상층액 내의 MP DNA를 qPCR로 검출하여 확인했습니다.
3. 플라스미드 구축 및 형질전환
MiR-93-5p mimic, TLR4 과발현(oe-TLR4) 플라스미드 및 그에 해당하는 음성 대조군은 상업적으로 합성되었습니다. MP 감염 A549 세포는 지질 기반의 transfection 시약을 사용하여 transfection 하였습니다. Transfection 효율은 transfection 48 h 후에 역전사 정량 PCR(RT-qPCR)을 통해 평가되었습니다.
4. RT-qPCR 분석
실험 종료 시 수확한 A549 세포에서 총 RNA를 추출하였습니다. 인산염 완충 식염수(PBS)를 사용하여 세포를 용해하고 균질화하였습니다. 페놀 기반의 RNA 추출 시약을 사용하여 총 RNA를 정제하였습니다. miR-93-5p의 역전사를 위해 역전사 키트를 사용하였으며, mRNA 분석을 위한 상보적 DNA는 시판되는 역전사 시약을 사용하여 합성하였습니다. RT-qPCR 분석은 SYBR Green 화학법을 사용하여 수행되었습니다.
5. MTT 분석
각 실험군에서 형질전환된 A549 세포를 수확하여 96-well plate에 well당 2 × 103 cells 밀도로 분주하였다. 이어서 각 well에 20 µL의 methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) 시약을 첨가하였다. 37 °C에서 2시간 동안 추가로 배양한 후, 상층액을 조심스럽게 제거하였다. 대사 활성 세포에 의해 형성된 포르마잔(formazan) 결정을 분석법 지침에 따라 용해시켰다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 490 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 세포 생존율을 간접적으로 정량화하였다.
6. 효소결합면역흡착측정법
인터루킨-6 (IL-6) 및 종양괴사인자-α (TNF-α)의 수치를 측정하기 위해 상용 효소결합면역흡착측정법 (ELISA) 키트를 사용하였다. 분석은 제조사의 지침에 따라 수행되었다. 정확성과 재현성을 보장하기 위해 두 번의 독립적인 실험 반복 수행 시 각각 3회 반복 측정하였다.
7. 이중 루시페레이스 리포터 분석
TargetScan 데이터베이스를 사용하여 TLR4의 3′ 비번역 영역(UTR) 내 MiR-93-5p 결합 부위를 예측하였습니다. 야생형(WT) 또는 변이형(MUT) 서열을 포함하는 단편을 루시퍼레이즈 리포터 벡터에 클로닝하였습니다. 지질 기반의 transfection 시약을 사용하여 A549 세포에 500 ng의 WT 또는 MUT 컨스트럭트를 miR-93-5p mimic 또는 대조군과 함께 공동 transfection하였습니다. 48시간 후, dual-luciferase 리포터 분석을 통해 루시퍼레이즈 활성을 측정하였습니다. transfection 효율을 보정하기 위해 Firefly 루시퍼레이즈 활성을 Renilla 루시퍼레이즈 활성으로 정규화하였습니다.
8. 웨스턴 블로팅 분석
Western blotting을 위해, 세포 용해물을 로딩 버퍼와 혼합하고 10,000 × g에서 3분 동안 원심분리하였다. 상층액을 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis로 처리하고, 단백질을 polyvinylidene fluoride 막으로 전이시켰다. 막을 5% bovine serum albumin (BSA)로 상온에서 1시간 동안 블로킹한 후, Tween 20과 5% BSA가 포함된 Tris-buffered saline에서 1:1000으로 희석한 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 및 inhibitor kappa B alpha (IκBα) 항일차항체와 함께 4 °C에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 세 차례 세척 후, 막을 HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG (1:500)와 함께 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 추가 세척 후, enhanced chemiluminescence substrate를 사용하여 단백질 밴드를 시각화하고 chemiluminescence imaging system으로 이미지를 획득하였다. 표적 단백질과 GAPDH의 밴드 강도를 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 세 번의 독립적인 실험으로부터 정량화하였다.
9. 통계 분석
통계 분석은 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 측정 데이터의 정규성은 Shapiro-Wilk 검정을 통해 평가되었습니다. 정규 분포를 따르는 데이터는 평균으로 나타냅니다. ± 표준편차로 나타냈으며, 두 그룹 간의 비교에는 독립표본 t-검정을, 세 그룹 이상의 비교에는 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하였다. ANOVA 결과 전체적인 유의미한 차이가 확인된 경우, 사후 분석으로 Tukey 검정을 실시하여 쌍별 비교를 수행하였다. 정규분포를 따르지 않는 데이터는 Mann-Whitney U 검정을 사용하여 분석하였다. 범주형 변수는 빈도와 백분율로 표시하였으며, 카이제곱 검정을 사용하여 비교하였다. MPP 또는 DSI를 동반한 MPP를 예측하는 miR-93-5p의 진단 잠재력을 평가하기 위해 수신자 조작 특성(ROC) 곡선 분석을 사용하였다. DSI를 동반한 MPP와 관련된 예측 요인을 식별하기 위해 다변량 로지스틱 회귀 분석을 수행하였다. 모델에 포함된 변수는 연령, 성별, 발열 기간, 항생제 사용 기간, 그리고 중앙값으로 이분화한 miR-93-5p 발현량이었다. 양측 P 값 <0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
결과
소아 MPP에서 MiR-93-5p의 감소
소아 MPP의 바이오마커로서의 잠재력을 탐색하기 위해 miR-93-5p의 진단 성능을 평가하였다. 그림 1A에서와 같이, 건강한 대조군과 비교하여 소아 MPP 환자에서 miR-93-5p의 발현이 유의하게 감소하였다. 두 그룹의 인구통계학적 및 혈액학적 특성은 표 1에 요약되어 있다. 그룹 간 연령 또는 성별 분포에서는 통계적으로 유의한 차이가 관찰되지 않았다 (P > 0.05). 그러나 말초 백혈구 수(WBC), 중성구 백분율(Net%) 및 C-반응성 단백질(CRP) 수치는 건강한 대조군에 비해 MPP 그룹에서 유의하게 상승하였다 (P < 0.001).
MPP 환자와 건강한 아동을 구분하는 miR-93-5p의 진단 성능을 추가로 평가하기 위해 수신자 조작 특성(ROC) 곡선 분석을 수행하였습니다 (그림 1B). 곡선 아래 면적(AUC)은 0.9009 [95% 신뢰 구간(CI): 0.8537–0.9482]였으며, 민감도는 80.56%, 특이도는 88.33%였습니다. 이러한 결과는 혈청 miR-93-5p 수치의 감소가 소아 MPP와 연관되어 있음을 나타냅니다.
MPP 세포 모델에 미치는 miR-93-5p의 영향
MPP 세포 모델에서 miR-93-5p의 효과를 평가하기 위해 일련의 인비트로(in vitro) 실험을 수행하였다. 대조군 세포와 비교하여, MPP 세포 모델에서는 miR-93-5p의 발현이 감소하였다(그림 2A). 또한 MP 감염은 A549 세포의 생존력 감소와 관련이 있었다(그림 2B). 아울러, 대조군과 비교했을 때 MPP 모델에서는 염증성 사이토카인인 IL-6 및 TNF-α의 수치가 증가하였다(그림 2C).
miR-93-5p의 기능적 효과를 추가로 평가하기 위해, MP 감염 A549 세포에서 miR-93-5p 과발현 모델을 구축하였습니다(그림 2D). miR-93-5p 과발현은 miR-93-5p를 과발현시키지 않은 MPP 모델과 비교하여 세포 생존능을 유의미하게 증가시켰습니다(그림 2E). 이러한 결과와 일관되게, miR-93-5p 발현의 증가는 IL-6 및 TNF-α 생성의 감소를 동반하였습니다(그림 2F). 이 결과들은 MP 감염 동안 miR-93-5p 발현의 감소가 세포 생존능 감소 및 염증 반응 증가와 관련이 있는 반면, miR-93-5p 과발현은 이러한 변화를 완화시켰음을 나타냅니다.
MiR-93-5p의 TLR4 표적화
miR-93-5p와 TLR4 사이의 조절 관계를 밝히기 위해 정보생물학적 분석을 수행한 결과, TLR4 mRNA의 3′ 비번역 부위(UTR) 내에서 miR-93-5p 결합 예상 부위를 확인하였다(그림 3A). 대조군과 비교하여 MP 세포 모델에서 TLR4 발현이 증가하였다(그림 3B). 이후 루시퍼레이스 리포터 분석을 통해 예측된 상호작용을 평가하였다. miR-93-5p mimic을 공동 형질전환 했을 때 야생형 구조체의 루시퍼레이스 활성이 감소하였으며, 이는 예측된 부위에 특이적으로 결합했음을 나타낸다(그림 3C).
MP 감염 세포에서 miR-93-5p를 과발현시키면 mimic 처리를 하지 않은 감염 대조군에 비해 TLR4 발현이 감소했습니다(그림 3D). TLR4 조절과 관련된 하위 효과를 추가로 조사하기 위해 TLR4가 과발현된 A549 세포 모델을 구축했습니다(그림 3E). Western blot 분석 결과, TLR4 과발현 이후 IκBα 수준이 증가한 것으로 나타났습니다(그림 3F).
MP 감염 후, TLR4 과발현은 대조군 세포에 비해 세포 생존율을 현저히 감소시켰으나, miR-93-5p의 동시 과발현은 이러한 감소를 역전시켰습니다(Figure 3G). 염증성 사이토카인 측정 결과, TLR4 과발현은 전염증성 매개체 수치를 증가시킨 반면, miR-93-5p 과발현은 TLR4가 과발현된 상태에서도 이러한 변화를 완화하는 것으로 나타났습니다(Figure 3H). 이러한 결과는 miR-93-5p가 TLR4 발현을 부정적으로 조절하며, MP 감염과 관련된 세포 변화를 완화한다는 것을 나타냅니다.
MPP 및 DSI를 동반한 MPP에서 miR-93-5p의 진단적 가치
이전 보고서들은 폐 및 결장 조직에서 TLR4의 관여를 기술하였습니다16. 이에 따라 MPP에서 miR-93-5p와 소화기계 손상 간의 잠재적 연관성을 임상적으로 평가하였습니다. 그림 4A에서 알 수 있듯이, miR-93-5p 발현은 MPP 그룹에 비해 MPP+DSI 그룹에서 감소하였습니다.
인구통계학적 및 혈액학적 특성은 표 2에 요약되어 있습니다. 연령이나 성별에서는 그룹 간에 유의미한 차이가 관찰되지 않았습니다. 하지만 발열 기간과 항생제 사용 기간은 DSI가 동반된 환자에서 유의미하게 더 길었습니다(P < 0.05).
DSI가 있는 MPP 사례와 DSI가 없는 사례를 구분하는 miR-93-5p의 진단 가치를 ROC 곡선 분석을 통해 평가하였습니다. AUC는 0.7866 (95% CI: 0.6889–0.8843) (그림 4B), 민감도는 85.71%, 특이도는 57.45%였습니다.
다변량 로지스틱 회귀 분석 결과, 낮은 miR-93-5p 발현, 연장된 발열 기간 및 장기간의 항생제 사용이 MP 감염 중 소화기계 손상과 관련된 요인인 것으로 확인되었습니다(표 3; P < 0.05).
그림 1: 건강한 대조군(n = 60)과 MPP 환자(n = 108)에서 miR-93-5p의 발현 및 진단적 가치. (A) MPP 환자에서 miR-93-5p 발현이 감소했다. (B) miR-93-5p의 ROC 곡선 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: MP 감염 세포 모델에서 miR-93-5p의 기능적 효과. (A) MP 감염 모델에서 miR-93-5p의 발현이 감소했다. (B) MP 감염 모델에서 세포 생존율이 감소했다. (C) MP 감염 모델에서 TNF-α 및 IL-6 수치가 증가했다. (D) miR-93-5p mimic의 형질전환 효율. (E) miR-93-5p 과발현 후 세포 생존율이 증가했다. (F) miR-93-5p 과발현 후 TNF-α 및 IL-6 수치가 감소했다. n = 3. P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: MiR-93-5p는 TLR4를 직접적으로 표적으로 한다. (A) miR-93-5p와 TLR4 사이의 예측된 결합 부위. (B) MP 감염 모델에서의 TLR4 발현. (C) 이중 루시퍼레이즈 리포터 분석. (D) miR-93-5p에 의한 TLR4의 음성 조절. (E) TLR4 과발현 효율. (F) IκBα의 웨스턴 블롯 분석. (G) 세포 생존율. (H) TNF-α 및 IL-6 수준. n = 3. P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
그림 4: MPP 환자(n = 60) 및 DSI를 동반한 MPP 환자(n = 48)에서 miR-93-5p의 발현 및 진단적 가치. (A) MPP+DSI 군의 miR-93-5p 발현. (B) miR-93-5p의 ROC 곡선 분석. 여기를 클릭하여 이 그림의 확대 버전을 확인하십시오.
| 변수 | 건강 대조군 (n = 60) | MPP (n = 108) | P |
| 연령 (years) | 6.81± 3.14 | 7.12 ± 3.55 | 0.559 |
| 성별 (남성/여성) | 28/32 | 49/59 | 0.872 |
| WBC ( × 109/L) | 7.27 ± 0.89 | 9.86 ± 1.36 | <0.001 |
| CRP (mg/L) | 2.35 ± 0.17 | 11.53 ± 2.01 | <0.001 |
| Net % | 42.55 ± 5.62 | 56.51 ± 15.40 | <0.001 |
표 1: 건강한 대조군과 MPP 환자 간의 인구통계학적 특성 및 일반 혈액 파라미터 비교. 이 표는 연령, 성별, WBC, 호중구 백분율, 호산구 백분율, 호염구 백분율 및 CRP를 포함하여 건강한 대조군과 MPP 환자의 인구통계학적 특성과 일반 혈액학적 파라미터를 요약한 것입니다. 그룹 간 비교 결과와 그에 따른 P 값이 제시되어 있습니다.
| 변수 | MPP (n = 60) | MPP+DSI (n = 48) | P |
| 연령 (세) | 6.88 ± 3.87 | 7.42 ± 3.11 | 0.441 |
| 성별 (남성/여성) | 31/29 | 28/20 | 0.494 |
| WBC (× 10⁹/L) | 8.9 ± 0.89 | 11.05 ± 0.76 | <0.001 |
| CRP (mg/L) | 10.94 ± 1.62 | 12.27 ± 2.22 | <0.001 |
| 순 백분율 (%) | 55.87 ± 14.75 | 57.32 ± 16.29 | 0.629 |
| 발열 기간(일) | 4.60 ± 1.83 | 7.26 ± 1.04 | <0.001 |
| 항생제 투여 기간 (일) | 4.65 ± 1.147 | 6.29 ± 0.771 | <0.001 |
표 2: MPP 환자와 MPP+DSI 환자 간의 인구통계학적 특성 및 일반 혈액 파라미터 비교이 표는 MPP 단독 환자와 DSI가 동반된 MPP 환자 간의 인구통계학적 특성, 일반 혈액학적 파라미터 및 관련 임상 특성을 비교합니다. 군 간 비교 및 그에 따른 P 값이 제시되어 있습니다.
| 변수 | OR | 95% CI | P 값 | |
| 하한값 | 상한값 | |||
| miR-93-5p (낮음 vs 높음) | 6.702 | 1.487 | 30.211 | 0.013 |
| 연령 | 1.126 | 0.286 | 4.437 | 0.866 |
| 성별 | 1.071 | 0.27 | 4.248 | 0.923 |
| 발열 기간 | 73.416 | 15.018 | 358.895 | <0.001 |
| 항생제 사용 시간 | 7.921 | 1.877 | 33.421 | 0.005 |
표 3: 소화기계 손상을 동반한 MP 감염 아동의 로지스틱 회귀 분석. 이 표는 MP 감염 아동 중 소화기계 손상과 관련된 요인을 평가한 로지스틱 회귀 분석 결과를 보여줍니다. 분석 내용에는 각 변수에 대한 OR, 95% CI 및 P 값이 포함되어 있습니다.
약어: Baso%, 호염구 백분율; CI, 신뢰 구간; CRP, C-반응성 단백질; DSI, 소화기계 손상; Eos%, 호산구 백분율; IκBα, inhibitor kappa B alpha; IL-6, 인터루킨-6; MP, Mycoplasma pneumoniae; MPP, Mycoplasma pneumoniae 폐렴; NC, 음성 대조군; Net%, 호중구 백분율; oe-TLR4, TLR4 과발현; OR, 오즈비; ROC, 수신자 조작 특성; TLR4, Toll-like receptor 4; TNF-α, 종양괴사인자-α; WBC, 백혈구 수.
데이터 가용성:
그림과 표의 근거가 되는 원시 수치 데이터는 보충 표 1로 제공됩니다.
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토론
MP 감염은 주로 폐 병원체로 간주되지만, 폐 이외의 여러 장기 시스템에 영향을 미치는 다양한 폐외 합병증을 유발할 수 있습니다19,20. 최근의 증거들은 폐-장 축(lung-gut axis)을 따른 상호작용을 시사하며, 폐 병변 동안 방출된 염증 매개체들이 장내 미생물 총의 균형21과 장 기능22을 무너뜨립니다. 이러한 양방향 상호작용은 호흡기 증상과 위장관 건강을 모두 다루는 종합적인 환자 평가의 중요성을 강조합니다. 따라서 혈청 순환 바이오마커는 진단적 또는 예후적 가치를 지닌 최소 침습적 도구로서 점점 더 많은 관심을 받고 있습니다23,24. MiRNA는 그 안정성과 MP 발병 기전에 관여하는 염증 관련 신호 전달 경로를 조절하는 역할 덕분에 유망한 후보로 떠올랐습니다25,26,27. 본 연구에서는 소아 MPP, 특히 소화기계 손상이 동반된 경우의 miR-93-5p의 역할과 임상적 중요성을 체계적으로 탐구했습니다. MPP 소아 환자의 miR-93-5p 수치는 건강한 대조군에 비해 감소했으며, 소화기계 손상이 있는 환자들에게서는 더욱 감소했습니다. 이러한 결과는 폐 병변에서 miR-93-5p의 조절 장애가 잠재적인 역할을 하며, 폐외 증상에 대한 가능한 바이오마커가 될 수 있음을 나타냅니다.
MiRNA는 중증 폐렴에서 유망한 민감도, 특이도 및 전반적인 진단 정확도를 보이며 진단적 가치를 입증하였습니다28,29. 임상적으로, 소화기계 침범(DSI)이 동반된 MPP 환아는 소화기 합병증이 없는 환아에 비해 발열 기간이 길었고 항생제 치료 기간이 연장되었습니다. 다변량 로지스틱 회귀 분석 결과, 낮은 miR-93-5p 수치는 이러한 임상 매개변수와 함께 소화기계 침범과 독립적인 연관성이 있는 것으로 나타났습니다. 또한, ROC 곡선 분석 결과, 혈청 miR-93-5p는 DSI가 동반된 MPP 환자와 DSI가 없는 환자를 구분하는 데 유리한 진단 성능을 보였습니다. 따라서 miR-93-5p 측정은 소아 MP 감염의 조기 식별 및 위험 층분류에 추가적인 가치를 제공할 수 있습니다.
일반적인 임상 염증 마커와 비교한 혈중 miR-93-5p의 진단 성능과 관련하여, 연구 결과는 miR-93-5p가 기존 지표를 대체하기보다는 보완적인 가치를 제공할 수 있음을 시사합니다. CRP와 프로칼시토닌(PCT)은 감염 중증도를 평가하고 항생제 치료를 안내하기 위해 임상 현장에서 여전히 흔히 사용되는 바이오마커이며, 메타 분석에 따르면 세균성 폐렴에서 PCT가 CRP보다 약간 더 우수한 진단 정확도를 보이는 것으로 나타났습니다30. 그러나 이러한 급성기 반응 물질들은 다양한 염증 자극에 반응하기 때문에 대체로 비특이적이며, MP 감염을 다른 호흡기 병원체와 신뢰성 있게 구별하거나 폐외 합병증의 위험을 구체적으로 반영하지 못합니다. 이와 대조적으로, TLR4/nuclear factor kappa B (NF-κB) 신호 전달과 관련된 조절 분자인 miR-93-5p는 기존 마커를 보완하는 별도의 병태생리학적 정보를 제공할 수 있습니다. miR-93-5p와 CRP 사이의 상관관계는 상대적으로 낮게(Pearson r = 0.2698) 보고되었으며, 이는 miR-93-5p가 전신성 급성기 반응과는 다른 측면의 염증 반응을 반영할 수 있음을 시사합니다.
동물 모델을 통한 최근의 증거들은 Mycoplasma pneumoniae 감염이 호흡기 병변뿐만 아니라 장내 미생물군에 의해 매개되는 폐-장 축(lung-gut axis)을 통해 소화기계 손상을 유발할 수 있음을 입증하였습니다31. MP에 감염된 마우스에서는 폐와 결장 모두에서 병리적 손상이 관찰되었으며, Corynebacterium glutamicum과 같은 유익균의 풍부도 감소 및 Lachnospiraceae NK4A136 group과 Escherichia-Shigella와 같은 잠재적 병원균의 풍부도 증가를 포함한 장내 미생물군 조성의 변화가 함께 나타났으며, 결장 내용물과 혈액 내 리포폴리사카라이드(LPS) 수치의 상승이 동반되었습니다32. 또한, Baicalin이 TLR4/NF-κB 경로를 통해 MPP 마우스의 폐 염증을 완화하고 장내 미생물군을 조절한다는 보고가 있으며, 이는 폐-장 상호작용(crosstalk)에 이 신호 전달 체계가 관여함을 뒷받침합니다33. 이러한 발견은 본 연구에서 조사한 miR-93-5p/TLR4 축에 NF-κB 신호 전달이 관여할 가능성과 일치합니다.
기전적 수준에서, 염증성 반응과 관련된 선천성 면역의 핵심 매개체인 TLR434,35,36,37는 MP 감염 동안 상향 조절되었습니다. TLR4 발현의 증가는 염증성 사이토카인인 IL-6 및 TNF-α 수치의 증가와 상피 세포 생존력의 감소를 동반했습니다. miR-93-5p의 과발현은 TLR4 발현을 억제하고 염증성 사이토카인 방출을 완화하며, 감염 조건 하에서 세포 생존력을 개선했습니다. 따라서 MPP 환자, 특히 소화기계 손상이 있는 환자에서 miR-93-5p의 하향 조절은 TLR4 매개 염증 신호 전달의 증가 및 광범위한 전신 염증 반응과 관련이 있을 수 있습니다. 인산화된 IκBα 및 p65를 평가하지 않았기 때문에, 본 연구 결과로 하위 NF-κB 경로의 활성화를 확정 지을 수는 없습니다.
본 연구의 몇 가지 제한점을 인정해야 합니다. 첫째, 본 연구는 상대적으로 적은 표본 크기, 특히 DSI 하위 그룹의 표본 크기가 작은 단일 센터 연구였으므로 통계적 검정력과 일반화 가능성이 제한될 수 있습니다. 이러한 발견을 확인하고 신뢰할 수 있는 임상적 컷오프 값을 설정하기 위해서는 더 큰 규모의 다기관 코호트를 통한 외부 검증이 필요합니다. 둘째, Western blotting을 통해 IκBα를 검출하였으나, MyD88, p-IκBα, p65를 포함한 TLR4/NF-κB 경로의 다른 하위 구성 요소들에 대한 포괄적인 검증은 수행되지 않았습니다. 이러한 신호 전달 구성 요소들의 단백질 수준 검증이 이루어진다면 기전적 해석이 더욱 강화될 것입니다. 셋째, 관찰 연구 설계로는 인과 관계를 추론할 수 없습니다. miR-93-5p가 MPP 관련 소화기 손상에 직접적으로 기여하는지 결정하기 위해서는 in vitro 또는 in vivo에서의 miRNA mimic 또는 억제제를 이용한 기능 상실 및 획득 실험이 필요합니다. 넷째, in vitro 실험은 A549 폐 상피 세포에서 수행되었습니다. 이 모델은 폐 환경에서 miR-93-5p의 항염증 효과를 평가하는 데 적합하지만, 위장관 병리를 직접적으로 모델링할 수는 없습니다. 잠재적으로 폐-장 축을 통해 매개되는 폐 miR-93-5p/TLR4 신호 전달과 소화기 증상 사이의 제안된 연관성은 Caco-2 세포와 같은 장 상피 세포 모델 및 MP 감염 in vivo 동물 모델에서 직접적인 검증이 필요합니다. 마지막으로, RNA 안정성 및 정규화 전략을 포함하여 miRNA 검출과 관련된 기술적 어려움이 일상적인 임상 적용의 장애물로 남아 있습니다. 이러한 제한점에도 불구하고, 본 연구 결과는 향후 기전 연구 및 대규모 검증 노력을 위한 기초를 제공합니다.
결론적으로, miR-93-5p의 상향 조절은 TLR4의 억제를 통해 폐 상피 세포에서 MP로 유도된 염증을 완화했습니다. 임상적으로, 혈중 miR-93-5p 수치의 감소는 MPP 소아 환자의 소화기계 손상과 관련이 있었으며, 이는 위장관 합병증 위험이 있는 환자를 식별하기 위한 보조적 바이오마커로서의 잠재적 유용성을 시사합니다.
공개 사항
저자들은 이해관계의 충돌이 없음을 밝힙니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| A549 인간 폐포 상피 세포 | ATCC, USA | Cat# CCL-185; RRID: CVCL_0023 | in vitro MPP 모델에 사용된 인간 폐포 상피 세포주 |
| Anti-GAPDH 항체 | Hangzhou XianZhi Biological Technology, China | Cat# AB-P-R001; RRID: AB_3096355 | Western blotting에서 로딩 컨트롤로서 GAPDH 검출에 사용된 1차 항체 |
| Anti-IκBα 항체 | Beyotime, China | Cat# AG2741; RRID: AB_3731391 | Western blotting을 통한 IκBα 검출에 사용된 1차 항체 |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | Solarbio, China | Cat# A8012 | Western blotting 중 사용된 블로킹 시약 |
| 원심분리기 | Thermo Fisher Scientific, USA | Multifuge X4 Pro; Cat# 75016066; RRID: SCR_020726 | 세포 배양 및 시료 준비 중 사용된 원심분리기 |
| 화학발광 이미지 분석 시스템 | Tanon, China | 5200Multi; RRID: SCR_027114 | 화학발광 Western blot 신호를 시각화하는 데 사용된 이미지 분석 시스템 |
| Dual-Luciferase 리포터 분석 시스템 | Promega, USA | Cat# E1910 | 반딧불이 및 Renilla 루시퍼레이스 활성을 측정하는 데 사용됨 |
| 소 태아 혈청 (FBS) | Gibco, USA | Cat# A5256701 | 세포 배양 배지용 혈청 보충제 |
| Goat anti-rabbit IgG, HRP-접합 | Cell Signaling Technology, USA | Cat# 7074; RRID: AB_2099233 | Western blotting에 사용된 HRP-접합 2차 항체 |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 10.1.2; URL: https://www.graphpad.com | 통계 분석 및 그래프 작성에 사용된 소프트웨어 |
| Interleukin-6 (IL-6) ELISA 키트 | Elabscience, China | Cat# E-EL-H6156; RRID: AB_3665145 | IL-6 정량에 사용된 ELISA 키트 |
| Lipofectamine 3000 형질전환 시약 | Thermo Fisher Scientific | Cat# L3000015 | A549 세포 형질전환에 사용된 지질 기반 시약 |
| 마이크로플레이트 리더 | Tecan, Switzerland | Infinite M Plex; RRID: SCR_026522 | 490 nm에서 광학 밀도를 측정하는 데 사용된 마이크로플레이트 리더 |
| miR-93-5p mimic | Ribobio, China | Cat# miR10000093-1-5 | miR-93-5p 과발현에 사용된 합성 miR-93-5p mimic |
| miR-93-5p 음성 대조군 | Ribobio, China | Cat# miR1N0000001-1-5 | miR-93-5p mimic 형질전환을 위한 음성 대조군 |
| MTT 세포 증식 및 세포 독성 분석 키트 | Beyotime, China | Cat# C0009S | 세포 생존율 평가에 사용됨 |
| Mycoplasma pneumoniae 표준 균주 ATCC 15531 | ATCC, USA | Cat# 15531 | 감염 모델 구축에 사용된 표준 M. pneumoniae 균주 |
| pGL3-Basic 루시퍼레이스 리포터 벡터 | Promega, USA | Cat# E1751 | dual-luciferase 리포터 분석에 사용된 리포터 벡터 |
| 인산완충생리식염수 (PBS) | Solarbio, China | Cat# IP9212 | 세포 세척 및 시료 준비에 사용된 완충액 |
| Pierce ECL Western 기질 | Thermo Scientific, USA | Cat# 32209 | Western blot 검출에 사용된 화학발광 기질 |
| Pleuropneumonia-like organism (PPLO) 배지 | BD, USA | Cat# 255420 | M. pneumoniae에 사용된 배양 배지 |
| 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 막 | Bio-Rad | Cat# 1620177 | Western blotting 중 단백질 전이에 사용된 막 |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | Takara Bio Inc., Japan | Cat# RR036A | cDNA 합성에 사용된 역전사 마스터 믹스 |
| PrimeScript RT 시약 키트 | Takara Bio Inc., Japan | Cat# RR037A | 역전사에 사용된 시약 키트 |
| 실시간 PCR 시스템 | Applied Biosystems, USA | QuantStudio 3 Real-Time PCR System; RRID: SCR_020238 | qPCR 분석에 사용된 실시간 PCR 장비 |
| RPMI-1640 배지 | Gibco, USA | Cat# 11875135 | A549 세포에 사용된 세포 배양 배지 |
| SPSS | IBM | Version 27.0; RRID: SCR_016479 | 통계 분석에 사용된 소프트웨어 |
| TLR4 과발현 음성 대조군 | Ribobio, China | NA | TLR4 과발현 실험을 위한 음성 대조군 |
| TLR4 과발현 플라스미드 (oe-TLR4) | Ribobio, China | NA | TLR4 과발현에 사용된 플라스미드 |
| TRIzol 시약 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Cat# 15596026 | 총 RNA 추출에 사용된 시약 |
| Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α) ELISA 키트 | Elabscience, China | Cat# E-EL-H0109; RRID: AB_3665144 | TNF-α 정량에 사용된 ELISA 키트 |
| Universal SYBR qPCR Master Mix | Takara Bio Inc., Japan | Cat# BL697A | 정량적 PCR에 사용된 마스터 믹스 |
| Western blot 겔 전기영동 시스템 | Bio-Rad, USA | Mini-PROTEAN Tetra Cell; Cat# 1658004 | 단백질 분리에 사용된 전기영동 시스템 |
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