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연구 논문

확장성 심근병증에서 노화 및 미토콘드리아 관련 허브 유전자의 식별

55 조회수

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DOI:

10.3791/72286

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2026년 8월 25일

1Henan University of Chinese Medicine, 2The Second Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 다차원 전사체 데이터를 머신러닝과 통합하여 확장성 심근병증에서 노화 및 미토콘드리아 관련 유전자를 식별함으로써 바이오마커 발굴 및 분자 하위 유형 분류를 수행합니다.

초록

확장성 심근병증(DCM)은 좌심실 확장 및 수축기 기능 장애를 특징으로 하며, 미토콘드리아 기능 장애 및 면역-염증성 활성화와 관련이 있습니다. 그러나 DCM에서 노화 관련 분자적 특성과 미토콘드리아 조절 경로는 아직 완전히 밝혀지지 않았습니다. 본 연구에서는 Gene Expression Omnibus 데이터베이스에서 6개의 벌크 전사체 데이터셋과 1개의 단일 세포 RNA 시퀀싱 데이터셋을 분석하였습니다. 데이터 정규화, 배치 보정 및 세포 유형 주석 처리 후, 차등 발현 분석, 가중 유전자 공동 발현 네트워크 분석 및 단백질-단백질 상호작용 네트워크 구축을 통해 노화 및 미토콘드리아 관련 후보 유전자를 식별하였습니다. 핵심 유전자는 최소 절대 수축 및 선택 연산자(LASSO) 회귀, 랜덤 포레스트 및 서포트 벡터 머신-재귀적 특징 제거(SVM-RFE)를 사용하여 추가로 선별되었습니다. DCM의 심장 면역 미세환경을 특성화하기 위해 면역 세포 침윤, 세포 간 통신 및 분자 서브타이핑 분석을 수행하였습니다. 총 66개의 노화 관련 유전자와 16개의 미토콘드리아 관련 유전자가 DCM과 연관되어 있었으며, 주로 저산소 유도 인자-1(HIF-1) 신호 전달, 산화적 인산화 및 산화질소 합성효소 관련 경로에 농축되어 있었습니다. 머신 러닝 및 단일 세포 RNA 시퀀싱 분석을 통해 SERPINE1, TGFB2, CYBB 및 TLR2를 핵심 유전자로 식별하였습니다. CYBB와 TLR2는 단핵구와 대식세포에서 높게 발현된 반면, SERPINE1과 TGFB2는 주로 기질 세포에서 발현되었습니다. 면역 랜드스케이프 분석 결과, DCM 샘플에서 염증성 대식세포 활성화가 증가하고 세포 간 통신이 변화했음을 확인하였습니다. 핵심 유전자 발현을 기반으로 DCM 샘플을 혈관 내피 성장 인자 신호 전달 및 일차 담즙산 생합성과 각각 연관된 두 가지 분자 서브타입으로 나누었습니다. 본 프로토콜은 DCM의 후보 바이오마커와 분자 서브타입을 식별하기 위한 통합적인 프레임워크를 제공합니다.

서론

확장성 심근병증(DCM)은 좌심실 확장과 수축 기능 저하를 특징으로 하는 심근 질환입니다. 이는 심부전의 세 번째로 흔한 원인이며, 전 세계적으로 심장 이식을 시행하는 가장 주요한 적응증입니다1. 인구 기반 연구에 따르면 성인 250명당 약 1명 꼴로 유병률이 나타나며, 남성에서 더 높은 유병률을 보이고 단일 유전자 변이에 의한 사례가 상당한 비율을 차지하는 것으로 추정됩니다2. 이러한 결과는 유전적 소인과 환경적 요인 모두가 DCM의 발생과 진행에 기여함을 시사합니다.

DCM의 병태생리는 염증성 활성화, 산화적 스트레스, 심근세포 아포토시스 및 조절되지 않는 섬유화 촉진 신호 전달을 포함하여 서로 연결된 프로세스들과 관련이 있습니다. tumor necrosis factor-α 프로모터 변이체를 포함한 염증 유전적 다형성은 바이러스성 DCM에 대한 감수성과 관련이 있는 것으로 알려져 있습니다3. 또한, 증가된 산화적 스트레스는 인간 DCM 하위 유형에서 심근세포 사멸 및 좌심실 기능 부전과 관련이 있습니다4. 이에 더해, Wnt/β-catenin 및 calcineurin/nuclear factor of activated T cells 신호 전달의 비정상적인 활성화는 심근 비대와 간질성 섬유화를 촉진하여 질병의 진행에 기여합니다5,6. 심근세포는 에너지 요구량이 높기 때문에 미토콘드리아 기능 장애 또한 DCM의 또 다른 중요한 구성 요소입니다. 미토콘드리아 생합성, 칼슘 항상성, 미토파지 및 미토콘드리아 DNA 무결성의 파괴는 산화적 인산화를 손상시키고 점진적인 심장 기능 부전에 기여할 수 있습니다7,8,9,10.

이러한 기전적 발견에도 불구하고 여전히 중요한 지식 공백이 존재합니다. 특히, DCM의 시작 및 진행 과정에서 미토콘드리아 구조 재형성과 생체 에너지 기능 장애 사이의 시간적 및 인과적 관계가 아직 완전히 정의되지 않았습니다11. 이에 따라 여러 치료 전략이 연구되어 왔습니다. 줄기세포 치료는 파라크라인, 세포 보호 및 면역 조절 효과를 통해 재생 가능성을 보여주었으나, 세포원, 전달 경로 및 이식 후 생존율의 최적화가 여전히 필요합니다12. 아데노 부속 바이러스 기반 전달 및 CRISPR 기반 게놈 편집을 포함한 유전자 치료 접근법 또한 정밀 치료 전략으로서 잠재력을 제공합니다. 하지만 심장 친화성, 벡터 면역원성 및 장기적 안전성과 관련된 한계점들은 아직 해결되지 않은 상태입니다13.

Gene Expression Omnibus (GEO)와 같은 리포지토리의 공개 전사체 데이터셋은 DCM의 바이오마커 발굴에 널리 활용됩니다. 이러한 리소스는 다기관 임상 코호트에 대한 접근을 가능하게 하고, 비용 효율적이며 재현 가능한 연구를 지원하며, 데이터셋 간 통합을 통해 통계적 검정력을 향상시킬 수 있습니다14. 또한 전사체 프로파일링을 통해 전장 유전체 수준의 후보 유전자 스크리닝, 분자 아형 분류 및 경로 수준의 분석이 가능합니다15. 하지만 공개 데이터셋은 기술적 배치 효과, 임상적 및 병인론적 이질성, 인과 관계 추론 능력의 한계, 그리고 불완전한 종단적 또는 예후 정보와 같은 내재적인 한계가 있습니다16. 따라서 공개 전사체 데이터셋에서 도출된 결과는 가설 생성 및 후보 바이오마커 우선순위 선정에 가장 적합하며, 독립적인 코호트와 실험 모델을 통한 검증이 필요합니다.

DCM에 관한 많은 생정보학 연구들은 주로 차별 발현 분석에 의존하고 있으나, 이는 위양성 결과를 생성할 수 있으며 심장 조직 내의 유전자 공동 발현 네트워크나 세포 이질성을 완전히 특성화하지 못합니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 본 연구에서는 상호 보완적인 방법들을 결합한 통합 분석 전략을 채택하였습니다. 벌크 전사체 분석은 대조군 비교에 적합한 조직 수준의 발현 프로파일을 제공합니다. 가중 유전자 공동 발현 네트워크 분석(WGCNA)은 표현형 특성과 관련된 유전자 모듈을 식별하며, 개별 차별 발현 유전자가 아닌 기능적으로 연관된 유전자 세트의 우선순위를 정할 수 있게 합니다. 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크 분석은 네트워크 토폴로지를 기반으로 연결성이 높은 유전자를 식별합니다. 통합 데이터셋 전반에서 후보 바이오마커를 식별하기 위해 LASSO 회귀, 랜덤 포레스트, 서포트 벡터 머신-재귀적 특성 제거라는 세 가지 머신러닝 알고리즘이 사용되었습니다¹⁷. 이후 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)을 통해 세포 유형별 발현 패턴과 세포 간 통신 네트워크를 조사하였습니다18.

DCM에서 미토콘드리아 기능 장애와 노화 관련 분자 변화가 각각 연구되어 왔으나, 질병 관련 전사 변화와 이들의 통합적인 연관성에 대해서는 아직 충분히 연구되지 않았습니다. 본 연구에서는 다수의 bulk 전사체 및 scRNA-seq 데이터셋을 통합하여 DCM의 노화 및 미토콘드리아 관련 허브 유전자를 식별하고, 심장 면역 미세환경의 특성을 분석하며, 식별된 유전자를 기반으로 분자 아형을 조사하였습니다. 이러한 통합적 접근 방식은 후보 바이오마커의 우선순위를 정하고, 후속 기전 연구 및 검증 연구를 위한 기초를 제공하는 데 사용되었습니다.

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프로토콜

모든 동물 실험 절차는 중국 중의약대학교 제2부속병원의 실험동물 윤리위원회의 검토 및 승인을 받았습니다(승인 번호 HNSZYYYJS2023011150). 모든 절차는 실험동물 복지 윤리 심사 지침(GB/T 35892-2018) 및 대체(Replacement), 감소(Reduction), 개선(Refinement)의 3R 원칙에 따라 수행되었습니다. 본 연구에 사용된 시약, 데이터베이스, 소프트웨어 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다. 

1. 데이터 리소스 및 실험 재료
자발적 확장성 심근병증(DCM) 표현형을 가진 체중 25 ± 2 g의 SPF 등급 수컷 CTNTR141W 형질전환 마우스를 모델군으로 사용하였다. 체중 25 ± 2 g의 연령이 일치하는 SPF 등급 수컷 C57BL/6J 마우스를 대조군으로 사용하였다. 각 군에는 12마리의 마우스가 포함되었다. 모든 동물은 유효한 실험동물 생산 허가를 보유한 기관에서 구입하였으며, 22 ± 2 °C 온도와 40%–60% 상대 습도, 12시간 명/암 주기의 SPF 등급 차단 환경에서 사육하였으며, 멸균된 사료와 물을 자유롭게 섭취하도록 하였다. 1주일의 적응 기간 후, 모든 마우스를 동일한 조건에서 4주 더 유지한 뒤 심기능 평가 및 시료 수집을 수행하였다. 실험 시작 시 모든 마우스의 연령은 6–8주였다. 마우스는 깊게 마취시킨 후 경추 탈구법으로 안락사시켰다.

DCM 환자의 좌심실 심근 조직에 대한 7개의 공개 전사체 데이터셋을 Gene Expression Omnibus (GEO)19 데이터베이스에서 검색하였습니다. 이 데이터셋에는 6개의 bulk 전사체 데이터셋과 1개의 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq) 데이터셋인 GSE145154가 포함되었습니다. CD45 양성 및 CD45 음성 분획이 모두 분석에 포함되었습니다. CD45 양성 및 CD45 음성 세포 분획은 클러스터링 전에 결합되었습니다. 샘플 식별 정보는 Harmony 통합을 위한 주요 배치 변수로 사용되었습니다. GSE145154의 정상 좌심실 및 DCM 좌심실 샘플, 구체적으로 GSM4307515, GSM4307516, GSM4307520 및 GSM4307521이 포함되었습니다. 본 연구에 사용된 데이터셋은 GSE145154, GSE5406, GSE42955, GSE57338, GSE79962, GSE116250 및 GSE141910입니다. DCM 이외의 모든 샘플은 제외되었으며, 대조군 샘플(Control group)과 DCM 샘플(DCM group)만 유지되었습니다. 품질 관리 후 제거된 샘플은 없었습니다. 포함된 GEO 데이터셋의 샘플 정보는 다음과 같이 요약됩니다: GSE5406은 102개 샘플(대조군 16개, DCM 샘플 86개), GSE42955는 17개 샘플(대조군 5개, DCM 샘플 12개), GSE57338은 231개 샘플(대조군 136개, DCM 샘플 95개), GSE79962는 20개 샘플(대조군 11개, DCM 샘플 9개), GSE116250은 51개 샘플(대조군 14개, DCM 샘플 37개), 그리고 GSE141910은 322개 샘플(대조군 161개, DCM 샘플 161개)을 포함하였습니다.

2. 벌크 전사체 데이터 전처리
6개의 벌크 데이터 세트에 대한 원시 발현 행렬과 임상 주석 파일은 GEOquery 패키지20를 사용하여 다운로드하였습니다. Affymetrix 마이크로어레이 데이터 세트의 경우 원시 CEL 파일을 추출하였으며, RNA-seq 데이터 세트의 경우 원시 카운트 행렬을 추출하였습니다. 마이크로어레이 데이터의 배경 보정, 분위수 정규화 및 발현량 계산은 affy 패키지21에 구현된 RMA(robust multi-array average) 알고리즘을 사용하여 수행하였습니다.

RNA-seq 카운트 데이터는 edgeR 패키지22의 TMM(trimmed mean of M-values) 방법을 사용하여 정규화되었으며, log₂ 변환된 CPM(counts per million) 값으로 변환되었습니다. 프로브 식별자는 플랫폼 특이적 주석 파일을 사용하여 공식 유전자 기호로 변환되었습니다. 여러 개의 프로브가 동일한 유전자에 매핑된 경우, 평균 발현값을 계산하였습니다.

sva 패키지의 ComBat 알고리즘을 사용하여 데이터셋 간의 기술적 배치 효과를 제거했습니다23. 데이터셋 출처와 검출 플랫폼을 배치 요인으로 지정하였습니다. 배치 효과 제거의 효율성을 평가하기 위해 배치 교정 전후로 주성분 분석을 수행하였습니다.

3. 단일 세포 전사체 데이터 전처리 및 세포 주석 지정
GSE145154의 유전자 발현 행렬을 Seurat 버전 524로 가져와 Seurat 객체를 구축하였습니다. 세포당 검출된 유전자 수 200–6,000개, 총 고유 분자 식별자(unique molecular identifier) 수 500개 초과, 미토콘드리아 유전자 비율 25% 미만이라는 다음 임계값을 사용하여 저품질 세포를 제외하였습니다. 이러한 품질 관리 임계값을 벗어나는 세포는 저품질 또는 파열된 세포로 간주하여 제외하였습니다. 상술한 품질 관리 임계값만을 사용하여 저품질 세포를 제외하였습니다.

NormalizeData 함수를 사용하여 스케일 인자 10,000으로 로그 정규화를 수행하였습니다. vst 방법을 적용한 FindVariableFeatures 함수를 사용하여 상위 3,000개의 고변동성 유전자를 선정하였습니다. ScaleData를 사용하여 데이터를 스케일링한 후, 선형 차원 축소를 위해 주성분 분석을 수행하였습니다.

배치 효과(Batch effects)는 샘플 식별자를 그룹화 변수로 지정하여 RunHarmony 함수를 통한 Harmony 알고리즘25으로 보정하였다. FindNeighbors 및 FindClusters 함수를 사용하여 처음 15개의 주성분(principal components)으로 세포를 클러스터링하였다. 클러스터링은 0.15의 해상도에서 Leiden 알고리즘을 사용하여 수행되었다. 비선형 차원 축소 및 시각화는 UMAP(uniform manifold approximation and projection)을 통해 수행되었다.

세포 유형은 SingleR 패키지26를 이용한 자동 주석 처리와 함께 표준 마커 유전자를 사용하여 주석을 달았습니다. 마커 유전자는 다음과 같습니다: B 세포, IGKC, MS4A1, CD79A; 심근세포, TNNI3, MYL2, ACTC1; 내피세포, VWF, PECAM1, EGFL7; 대식세포, C1QC, C1QB, C1QA; 단핵구, S100A8, S100A9, G0S2; 자연살해세포, NKG7, GNLY, CCL5; 평활근세포, MYL9, TAGLN, ACTA2; 기질세포, FBLN1, LUM, DCN; 그리고 T 세포, CD3E, CD3G, CD3D.

4. 차등 발현 분석 및 유전자 세트 풍부도 점수 산출
DCM 그룹과 건강한 대조군 간의 유전자 발현을 비교하기 위해 limma 패키지27를 사용하여 선형 모델을 구축하였습니다. P value < 0.05이며 절대 폴드 변화(absolute fold change)가 1.5보다 큰 유전자(절대 log₂ 폴드 변화 0.58보다 큰 경우에 해당)를 유의미하게 차등 발현된 것으로 정의하였습니다.

각 샘플의 노화 관련 및 미토콘드리아 관련 유전자 세트에 대한 풍부도 점수를 계산하기 위해 단일 샘플 유전자 세트 풍부도 분석을 수행하였습니다28. DCM 그룹과 건강한 대조군 그룹 간의 풍부도 점수 차이는 Wilcoxon 순위 합 검정을 사용하여 평가하였으며, P value < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였습니다.

단일 세포 수준에서, Seurat의 AddModuleScore 함수를 사용하여 노화 관련 및 미토콘드리아 모듈 점수를 계산하였습니다. 그룹 간의 모듈 점수 차이는 Wilcoxon 순위합 검정을 통해 평가하였습니다.

노화 관련 유전자 시그니처는 CellAge 데이터베이스(https://genomics.senescence.info/cells/)에서 검색하였으며, 미토콘드리아 관련 유전자 세트는 GeneCards(https://www.genecards.org/)에서 확보하였습니다. 점수 계산에 사용된 전체 유전자 목록은 보충 파일 1(Supplementary File 1)에 제공되어 있습니다.

5. 가중 유전자 공동 발현 네트워크 구축
벌크 전사체 데이터에서 발현 분산이 가장 높은 상위 5000개의 단백질 코딩 유전자를 네트워크 구축을 위해 유지하였습니다. pickSoftThreshold 함수를 적용하여 여러 소프트 임계값 거듭제곱 조건에서의 척도 없는 토폴로지 적합 지수를 계산하였습니다. 최적 임계값은 R2 값이 0.9 이상인 척도 없는 네트워크를 생성하는 최소 거듭제곱 값으로 결정하였습니다. 이에 따라, 이후의 네트워크 분석을 위해 β = 5의 소프트 임계값 거듭제곱을 채택하였습니다.

최소 모듈 크기를 30으로 설정하여 blockwiseModules 함수를 이용해 부호 있는 가중치 공발현 네트워크(signed weighted co-expression network)를 구축했습니다. 각 모듈 고유유전자(eigengene)와 노화 관련 또는 미토콘드리아 농축 점수 간의 피어슨 상관 계수를 계산했습니다. 상관 계수의 절대값이 0.4보다 크고 P < 0.001인 모듈을 유의미하게 연관된 모듈로 간주했습니다.

유의미하게 연관된 모듈 내의 유전자들을 차별 발현 유전자들과 교차 분석하여 DCM 관련 노화 후보 유전자 및 DCM 관련 미토콘드리아 후보 유전자를 식별하였습니다.

6. 기능적 풍부도 분석
clusterProfiler 패키지29를 사용하여 후보 유전자에 대해 Gene Ontology (GO) 및 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) 경로 분석을 포함한 기능적 풍부도 분석을 수행하였다. GO 풍부도 분석은 생물학적 과정, 세포 구성 성분, 분자 기능의 세 가지 표준 범주를 대상으로 하였다.

모든 분석은 인간 종 주석(human species annotation)을 사용하여 수행되었으며, P-값 보정을 위해 허위 발견율(FDR)을 적용하고 q-값 임계값은 0.05로 설정하였습니다. 유전자 세트는 10~500개의 유전자 범위로 제한하였으며, FDR이 < 0.05을 통계적으로 유의미한 것으로 정의하였다. 마지막으로, GO 농축 분석 결과를 시각화하였다. ~을 통해 / ~을 경유하여 그룹 막대 그래프로 나타내었으며, KEGG 농축 결과는 버블 플롯을 사용하여 표시하였다.

7. PPI 네트워크 구축 및 허브 유전자 스크리닝
후보 유전자들을 STRING 버전 11.5 데이터베이스30에 입력하였으며, 생물종은 Homo sapiens로, 상호작용 신뢰도 임계값은 결합 점수 0.7 초과로 설정하였다. 연결되지 않은 노드는 숨겼으며, 상호작용 데이터는 탭 구분 값(TSV) 형식으로 내보냈다.

상호작용 데이터는 시각화를 위해 Cytoscape 버전 3.9.1로 가져왔습니다31. 노드 위상 점수는 Degree, maximum neighborhood component, maximal clique centrality의 세 가지 알고리즘을 사용하는 CytoHubba 플러그인32을 통해 계산되었습니다.

네트워크 내의 핵심 기능 모듈은 다음과 같은 기본 매개변수(degree cutoff 2; k-core 2; node score cutoff 0.2; maximum depth 100)를 설정한 MCODE 플러그인33을 사용하여 식별하였습니다. 세 가지 위상 알고리즘 모두에서 상위 10위 내에 랭크된 유전자들을 MCODE 핵심 서브네트워크의 유전자들과 교차 분석하여 최종 단백질-단백질 상호작용 허브 유전자를 식별하였습니다.

8. 머신러닝 기반의 핵심 유전자 선택 및 진단 모델 구축
재현성과 균형 잡힌 표현을 보장하기 위해, 통합 벌크 전사체 데이터셋을 고정된 랜덤 시드(seed = 123456)를 사용하여 7:3의 비율로 훈련 세트와 검증 세트로 무작위 분할하였습니다. 이러한 분할은 두 세트 간의 일관된 클래스 비율을 유지하기 위해 질환군(DCM 대 대조군)에 따라 층화 추출 방식으로 수행되었습니다. 분할 전, 서로 다른 데이터셋 소스에서 발생하는 배치 효과는 sva 패키지를 사용하여 보정하였으며, 통합된 샘플들은 무작위 할당 과정에서 하나의 통합된 코호트로 처리되었습니다.

후보 유전자를 선별하기 위해 세 가지 머신러닝 알고리즘이 적용되었습니다. 먼저, LASSO 로지스틱 회귀 분석을 수행하였습니다. ~을 통해 glmnet 패키지의 cv.glmnet 함수34AUC를 평가 지표로 채택하여 5-겹 교차 검증 이진 분류 모델을 구축하였다. lambda.min에서 계수가 0이 아닌 유전자를 후보 유전자로 선정하였다.

둘째, randomForest 패키지35를 사용하여 500개의 결정 나무를 포함하는 랜덤 포레스트 분류 모델을 구축하였습니다. 각 분할 시 샘플링되는 변수의 수는 전체 특성 수의 제곱근으로 설정하였습니다. 지니 계수를 기반으로 유전자 중요도를 정량화하였으며, 중요도 점수가 가장 높은 상위 10개 유전자를 선정하였습니다.

셋째, caret 패키지36의 rfe 함수를 사용하여 SVM-RFE 분석을 수행하였습니다. 특성 수는 1–10 범위로 설정하였으며, 모델 학습을 위해 5-겹 교차 검증을 채택하였습니다. 최종적으로 교차 검증 정확도가 가장 최적화된 유전자 하위 집합을 선택하였습니다.

세 가지 알고리즘 모두에 의해 식별된 유전자를 DCM의 최종 핵심 노화 및 미토콘드리아 관련 유전자로 정의하였습니다. 이후 의사결정 나무, 그래디언트 부스팅 머신, 부스티드 일반화 선형 모델, k-최근접 이웃, 로지스틱 회귀, 신경망, 부분 최소 제곱, 랜덤 포레스트, 서포트 벡터 머신, extreme gradient boosting의 10가지 분류 알고리즘을 사용하여 진단 모델을 구축하였습니다.

pROC 패키지37를 사용하여 수신자 조작 특성 곡선을 생성하였습니다. 훈련 세트와 검증 세트에서의 진단 성능을 평가하기 위해 곡선 아래 면적, 정확도, 민감도 및 특이도를 계산하였습니다.

모델 예측에 대한 각 핵심 유전자의 기여도를 계산하기 위해 SHapley Additive exPlanations 분석을 수행하였다38. 요약 플롯(Summary plots)과 샘플별 워터폴 플롯(waterfall plots)을 생성하였다. 검증 세트에서 곡선 아래 면적(area under the curve)이 0.8보다 큰 최종 진단 모델을 진단 성능이 우수한 것으로 간주하였다.

9. 세포 간 통신 추론
심장 미세환경 내의 세포 간 통신 네트워크는 CellChat 패키지39를 사용하여 추론하였습니다. CellChatDB.human 데이터베이스를 이용해 CellChat 객체를 구축하였습니다. identifyOverExpressedGenes를 사용하여 차별적으로 발현된 리간드와 수용체를 식별하였으며, identifyOverExpressedInteractions를 사용하여 유의미한 상호작용 쌍을 필터링하였습니다.

세포 유형 간의 통신 확률은 computeCommunProb를 사용하여 계산하였습니다. 전역 세포 유형 수준의 통신 네트워크는 aggregateNet를 사용하여 집계하였습니다. 각 세포 유형 쌍 간의 상호작용 수와 통신 강도를 정량화하였으며, 이를 히트맵과 막대 그래프로 시각화하였습니다.

10. 면역 세포 침윤 정량화
단일 샘플 유전자 세트 풍부성 분석28 및 면역 세포 시그니처 유전자 세트40를 사용하여 각 벌크 샘플에 대해 28가지 면역 세포 유형의 풍부성 점수를 산출하였다. DCM 그룹과 건강한 대조군 간의 면역 세포 풍부성 점수를 비교하기 위해 Wilcoxon 순위합 검정을 사용하였다. P < 0.05일 때 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였다.

핵심 유전자 발현 수준과 면역 세포 풍부도 점수 간의 연관성을 평가하기 위해 피어슨 상관 분석(Pearson correlation analysis)을 수행하였습니다. P < 0.05인 모든 상관관계는 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였습니다.

11. 분자 아형 분류를 위한 합의 군집화
핵심 유전자 발현 프로파일을 사용하여 DCM 샘플의 비지도 합의 클러스터링을 수행하였다. ~을 통해 ConsensusClusterPlus 패키지41클러스터링 매개변수는 최대 클러스터 수 6, 재표본 추출 횟수 1,000회, 재표본 추출 비율 0.8로 설정하였다. 클러스터링에는 유클리드 거리를 이용한 Medoids 주변 분할법(Partitioning around medoids)을 채택하였으며, 재현성을 보장하기 위해 고정된 랜덤 시드(random seed)를 사용하였다.

델타 영역 도표(delta area plot)와 합의 클러스터 안정성 점수(consensus cluster stability scores)에 따라 최적의 서브타입 수를 결정하였으며, 최종적으로 K = 2로 확인되었습니다. 두 분자 서브타입의 뚜렷한 분리를 검증하기 위해 주성분 분석(Principal component analysis)을 추가로 수행하였습니다.

샘플별 KEGG 경로 농축 점수를 계산하기 위해 유전자 세트 변이 분석(Gene set variation analysis)42을 적용하였다. 서브타입 간의 차별적 경로 활성화를 검출하기 위해 limma 패키지27를 활용하였으며, P 값이 0.05 미만인 경우를 통계적으로 유의미한 것으로 정의하였다.

12. 심장 기능을 위한 심초음파 평가
마우스를 마취하였다. ~을 통해 1% 펜토바르비탈나트륨(30 mg/kg)을 복강 내 투여하고 항온 수술대 위에 앙와위로 고정하였다. 흉부의 털을 제거한 후, 심전 영역에 초음파 커플링 젤을 고르게 도포하였다.

소동물 초음파 시스템을 사용하여 좌심실 유두근 수준에서 2차원 유도 M-모드 심초음파 검사를 수행하였습니다. 좌심실 이완기말 직경, 수축기말 직경, 박출률 및 분획 단축률을 측정하기 위해 3회의 연속적이고 안정적인 심장 주기를 캡처하였습니다. 모든 심초음파 평가는 전문 초음파 검사자가 눈가림법으로 진행하였습니다.

심초음파 검사를 위해 각 그룹에서 생쥐 3마리를 무작위로 선정하였으며, 이들 총 6마리의 동물을 이후 희생시켜 심근 조직 수집 및 ELISA 측정을 수행하였습니다. 나머지 실험 동물들은 추가적인 병행 실험 분석을 거쳤으며, 해당 데이터는 본 연구에 포함되지 않았습니다.

13. 심근 조직 수집, 단백질 추출 및 효소 결합 면역 흡착 분석법
심초음파 평가 후, 마우스는 깊은 마취 상태에서 안락사되었습니다. 심장 조직을 신속하게 적출하였습니다. ~을 통해 정중 흉강 절개술을 시행하고, 좌심실 심근을 얼음 위에서 적출하였다. 분리된 조직은 심장 내 잔류 혈액을 제거하기 위해 ice-cold 인산염 완충 식염수(PBS)로 충분히 세척하였다. 멸균 여과지로 과잉 액체를 닦아낸 후, 시료를 즉시 액체 질소로 급속 냉동하여 −80 °C 이후 단백질 추출을 위해 보관하며, 반복적인 동결-해동 주기는 엄격히 피해야 한다.

동결된 심근 조직의 무게를 측정한 후, 얼음 위에서 약 1 mm3 크기의 조각으로 절단하였다. 조직은 protease 및 phosphatase 억제제가 포함된 차가운 RIPA lysis buffer에 조직 10 mg당 buffer 100 µL의 표준 비율로 넣어 용해시켰다. 샘플을 얼음 위에서 기계적으로 완전히 균질화한 후, 완전한 세포 용해를 위해 30분 동안 배양하였다.

용해물을 4 °C에서 12,000 × g로 15분 동안 원심분리했습니다. 생성된 상층액을 효소가 없는 튜브에 수집하였으며, 제조사의 프로토콜에 따라 bicinchoninic acid 단백질 분석 키트를 사용하여 총 단백질 농도를 정량하였습니다. 모든 샘플은 용해 버퍼를 사용하여 동일한 단백질 농도로 표준화했습니다.

심근 용해물 내 4가지 허브 유전자의 단백질 발현 수준을 해당 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA) 키트를 사용하여 측정하였다. 단계별로 희석한 표준 시료와 정규화된 조직 용해물을 미리 코팅된 마이크로플레이트에 중복으로(웰당 100 µL) 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 2 h 동안 배양한 후, 키트에 제공된 세척 완충액으로 충분히 세척하였다.

각 웰에 효소-접합 항체를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양한 후, 충분히 세척하였다. 그 다음 기질 발색 용액을 첨가하고 암실 상태의 실온에서 20분 동안 배양하였다. 정지 용액을 사용하여 발색 반응을 종료시켰으며, 전파장 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 450 nm(기준 파장: 570 nm)에서 흡광도를 측정하였다.

14. 통계 분석
모든 통계 분석 및 데이터 시각화는 R version 4.2.3을 사용하여 수행되었다. 각 표적 유전자(TGFB2, SERPINE1, CYBB, TLR2)의 ELISA 농도 측정값에 대해, 먼저 Control 군과 DCM 군의 데이터 정규성을 각각 평가하기 위해 Shapiro-Wilk 검정을 적용하였다. 이어서 두 군 간의 분산 균질성을 평가하기 위해 F-test를 사용하였다. 군 간 비교 방법은 분산 균질성 검정 결과에 따라 결정되었다. 분산이 균질한 경우(P ≥ 0.05)에는 군 간 평균값 비교를 위해 unpaired Student’s t-test를 채택하였으며, 분산이 불균질한 경우(P < 0.05)에는 보정된 Welch’s t-test를 사용하여 분석하였다. 모든 검정은 양측 검정으로 수행되었으며, 통계적 유의성 임계값은 P < 0.05로 설정하였다. 데이터는 개별 데이터 포인트가 jitter 형태로 표시된 박스 플롯(boxplot)으로 시각화하였다. 모든 검정의 P 값과 적용된 t-test의 유형은 각 그래프에 상세히 표기하였다.

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결과

데이터 전처리 및 차등 발현 분석
6개의 모든 벌크 전사체 데이터셋은 다운스트림 분석 전 표준화된 전처리와 배치 효과 보정을 거쳤습니다. 마이크로어레이 데이터는 robust multi-array average 알고리즘을 사용하여 정규화하였으며, RNA-seq 카운트 데이터는 trimmed mean of M-values 방법을 사용하여 정규화하였습니다. 데이터셋 출처 및 검출 플랫폼과 관련된 기술적 배치 효과를 제거하기 위해 ComBat 알고리즘을 적용하였습니다. 주성분 분석 결과, 보정 전에는 샘플들이 데이터셋 출처별로 군집을 이루었으나, 보정 후에는 배치에 의한 가시적인 분리 없이 더 균일하게 분포되었습니다.

limma 패키지를 사용하여 확장성 심근병증(DCM) 그룹과 건강한 대조군(HC) 그룹 간의 차등 발현 분석을 수행하였습니다. 가장 유의미하게 차등 발현된 20개 유전자의 히트맵은 두 그룹 간의 발현 프로필이 분리됨을 보여주었습니다(<...

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토론

통합 다층 워크플로우는 벌크 전사체 메타 분석, 가중 유전자 공발현 네트워크 구축, 앙상블 머신 러닝, 단일 세포 전사체 검증 및 in vivo 동물 모델 검증을 결합하였습니다. 노화 및 미토콘드리아 관련 허브 유전자인 CYBB, SERPINE1, TGFB2 및 TLR2의 4가지가 확장성 심근병증(DCM)의 진단 바이오마커 후보로 식별되었습니다. 마이크로어레이 및 RNA 시퀀싱 플랫폼을 포함하여 Gene Expression Omnibus 저장소에서 확보한 6개의 독립적인 좌심실 전사체 데이터 세트를 통합함으로써, 단일 데이터 세트의 편향을 줄이고 분석의 통계적 근거를 강화하였습니다43,44,45. 사전 정의된 노화 관련 및 미토콘드리아 유전자 세트와 결합된 가중 유전자 공발현 네트워크 분석을 통해, 단순한 차등 발현 분석에만 의존하지 않고 형질 관...

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공개 사항

저자는 이해관계의 충돌이 없음을 선언합니다.

감사의 글

Gene Expression Omnibus 데이터베이스를 통해 제공된 공개 데이터에 감사드립니다. 또한, 원고에 대해 건설적인 의견을 주신 심사위원과 편집자분들께 감사드립니다. 본 연구는 성-정 도급 과학 연구 프로젝트(지원 번호 2021JDZX2026), “Yiqi Huoxue 처방의 죽상경화성 혈관 리모델링 완화 기전”의 지원을 받아 수행되었습니다. ~을 통해 KLF2-Nrf2 매개 염증 조절.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Aquasonic Clear 초음파 겔Parker Laboratories, Inc.Mar-34소동물 심초음파 영상 촬영에 사용됨.
BCA 단백질 정량 분석 키트Thermo Fisher Scientific23227562 nm에서 검출; 범위, 20–2,000 µg/mL; 생쥐 심장 용해물의 총 단백질 정량에 사용되었습니다.
CellAge 데이터베이스인체 노화 유전체 자원https://genomics.senescence.info/cells/노화 관련 유전자 시그니처의 소스.
CytoHubba, Cytoscape 플러그인Cytoscape 앱 스토어버전 0.1단백질-단백질 상호작용 네트워크의 노드 토폴로지 점수 산출에 사용됨.
CytoscapeCytoscape 컨소시엄버전 3.9.1단백질-단백질 상호작용 네트워크 시각화에 사용됨.
전파장 마이크로플레이트 리더Thermo Fisher ScientificMultiskan FCELISA 분석에서 흡광도를 측정하는 데 사용됩니다.
유전자 발현 옴니버스국립생물공학정보센터https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/전사체 데이터 세트를 획득하는 데 사용된 공공 저장소.
GeneCards와이즈만 과학 연구소https://www.genecards.org/미토콘드리아 관련 유전자 세트의 출처.
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, 100×, EDTA 무첨가Thermo Fisher Scientific78441보관 조건 4 °C; 다음의 농도로 RIPA 완충액에 추가함 10 µL/mL 사용 직전에.
액체 질소지역 실험실 가스 공급업체해당 사항 없음심근 조직의 급속 냉동에 사용됩니다.
수컷 SPF 등급 C57BL/6J 마우스, 6마리–8주령, 25 ± 2 gBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.해당 없음동물생산허가번호 SCXK (Jing) 2021-0006; 정상 대조군으로 사용됨.
수컷 SPF 등급 CTNTR141W 형질전환 DCM 마우스, 6마리–8주령, 25 ± 2 g중국 의학科学院 실험동물과학연구소해당 사항 없음동물 생산 허가 번호 SCXK (Jing) 2021-0065; 자발성 DCM 모델로 사용됨.
MCODE, Cytoscape 플러그인Cytoscape 앱 스토어버전 2.0.2단백질-단백질 상호작용 네트워크 내에서 핵심 기능적 하위 네트워크를 식별하는 데 사용됩니다.
마우스 CYBB ELISA 키트BiogradetechA-QEK09250-96웰마우스 심근 조직 용해물에서 CYBB를 측정하기 위해 본 연구에서 사용되었다.
마우스 PAI-1 ELISA 키트EK-BIOML30970본 연구에서는 마우스 심근 조직 용해물 내의 SERPINE1 인코딩 단백질인 PAI-1을 측정하기 위해 사용되었습니다.
마우스 TGF-β2 ELISA 키트ElaBoXSEKM-0036본 연구에서는 TGF-를 측정하기 위해 사용되었습니다.β마우스 심근 조직 용해물 내의 2.
마우스 TLR-2 ELISA 키트SolarbioSEKM-0163마우스 심근 조직 용해물에서 TLR-2를 측정하기 위해 본 연구에서 사용되었다.
인산완충생리식염수, pH 7.4, 칼슘 및 마그네슘 제거생명공학 산업02-024-1ACS멸균 1× 용액; 보관 온도 4 °C; 조직 세척 및 희석에 사용됨.
R 패키지: caretCRAN버전 6.0-94서포트 벡터 머신-재귀적 특성 제거(support vector machine-recursive feature elimination)에 사용됨.
R 패키지: CellChatCellChat 개발자버전 1.6.1단일 세포 RNA 시퀀싱 데이터로부터 세포 간 통신 추론에 사용됨.
R 패키지: clusterProfilerBioconductor버전 4.8.3기능적 풍부도 분석에 사용됨.
R 패키지: ConsensusClusterPlusBioconductor버전 1.64.0비지도 합의 군집화에 사용됨.
R 패키지: edgeRBioconductor버전 3.42.4절단 평균 M-값(trimmed mean of M-values) 방법을 이용한 RNA 시퀀싱 데이터 정규화에 사용됩니다.
R 패키지: GEOqueryBioconductor버전 2.68.0Gene Expression Omnibus에서 데이터를 다운로드하는 데 사용됩니다.
R 패키지: glmnetCRAN버전 4.1-8최소 절대 수축 및 선택 연산자(least absolute shrinkage and selection operator) 로지스틱 회귀 분석에 사용됨.
R 패키지: limmaBioconductor버전 3.56.2차등 발현 분석 및 통계 모델링에 사용됩니다.
R 패키지: pROCCRAN버전 1.18.5수신기 작동 특성 곡선 분석에 사용됨.
R 패키지: randomForestCRAN버전 4.7-1.2랜덤 포레스트 머신러닝에 사용됨.
R 패키지: SeuratCRAN버전 5.0.1단일 세포 RNA 시퀀싱 데이터 분석에 사용됨.
R 패키지: SingleRBioconductor버전 2.2.0자동화된 세포 유형 주석 지정에 사용됩니다.
R 패키지: svaBioconductor버전 3.48.0ComBat 배치 효과 보정에 사용됨.
냉장 원심분리기Sigma-AldrichSIGMA 3-K심근 조직 용해물 원심분리에 사용됨.
RIPA 용해 및 추출 완충액Thermo Fisher Scientific89900즉시 사용 가능 1× 용액; 보관 조건 4 °C사용 전 프로테아제 및 포스파타아제 억제제를 첨가하였습니다.
소형 동물 초음파 영상 시스템VINNO Technology Co., Ltd.VINN06LAB심기능의 심초음파 평가에 사용됨.
펜토바르비탈 나트륨Sinopharm Chemical Reagent Co.20040428멸균 생리식염수에 1% 용액(10 mg/mL)으로 조제하여, 30 mg/kg의 용량으로 복강 내 마취에 사용하였다.
STRING 데이터베이스STRING 컨소시엄버전 11.5단백질-단백질 상호작용 네트워크 구축에 사용됨.
TGrinder H24 조직 균질기TIANGENOSE-TH-01RIPA 완충액에서 마우스 심근 조직을 6.0 m/s의 속도로 30초 동안 균질화하는 데 사용됨–2분 동안 60초씩–3회 반복.
소동물을 위한 항온 동물 플랫폼/가열 수술대Shanghai Yuyan Scientific Instrument Co., Ltd.T-30350마우스를 ~에서 유지하는 데 사용됨 37 °C 심초음파 검사 중; 작동 범위, 상온에서 50 °C.

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