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방법 논문

Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 및 리포폴리사카라이드에 의해 유도된 코로나바이러스 감염증 2019 관련 폐 손상 마우스 모델

109 조회수

⸱

2026년 9월 11일

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1Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Sichuan Center for Disease Control and Prevention

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)와 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide)를 함께 비강 내로 투여하여 유도한 코로나바이러스 감염증 2019 관련 폐 손상 마우스 모델에 대해 설명합니다. 이 모델을 통해 폐 염증 반응, 저해된 제1형 인터페론 반응 및 잠재적인 치료적 개입을 조사할 수 있습니다.

초록

백신 접종과 항바이러스 치료가 널리 시행되었음에도 불구하고, SARS-CoV-2 감염은 취약 계층에서 여전히 상당한 이환율과 사망률을 유발하고 있으며, 이는 COVID-19의 병인론을 조사하고 약물 작용 기전을 규명하며 잠재적 치료 전략을 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 실험 모델의 시급한 필요성을 강조합니다. SARS-CoV-2 감염은 과도한 염증 반응과 제1형 인터페론(IFN-I) 매개 항바이러스 면역의 손상을 특징으로 하는 심각한 폐 손상을 일으킬 수 있으나, 현재의 동물 모델은 COVID-19와 관련된 불균형한 면역-염증 반응을 재현하는 데 한계가 있습니다. 이에 COVID-19의 주요 면역 병리학적 특징을 재현하기 위해 SARS-CoV-2 및 LPS 유도 COVID-19 관련 폐 손상 마우스 모델을 개발하였습니다. 이 모델은 염증 세포 침윤, 폐포 구조 파괴, 전염증성 사이토카인의 발현 증가와 더불어 IFN-I 반응의 손상을 포함한 폐 조직의 두드러진 병리학적 특징을 유도합니다. 본 연구에서는 SARS-CoV-2 및 LPS 유도 폐 손상 마우스 모델을 구축하는 데 사용된 절차를 상세히 기술하고, 폐 조직병리학적 변화, 바이러스 양, 염증성 사이토카인 및 IFN-I 수치 분석을 통해 이 모델의 특성을 체계적으로 규명합니다. 이 모델은 COVID-19 관련 폐 손상의 기저에 있는 면역-염증 기전과 폐 조직 회복 과정에 관여하는 프로세스를 연구하기 위한 실험 플랫폼을 제공하며, 면역-염증 불균형을 완화하고 폐 기능 회복을 촉진하기 위한 치료 전략을 평가하는 기초를 제공합니다.

서론

2019년 말 출현 이후, SARS-CoV-2는 전 세계적인 공중 보건 위기를 초래했으며, 지속적인 바이러스 진화는 기존 백신 및 치료 전략에 계속해서 도전 과제가 되고 있습니다1,2,3. 따라서 COVID-19 관련 폐 손상에 대한 추가 연구는 질병 기전을 규명하고 치료 전략을 발전시키는 데 필수적입니다.

SARS-CoV-2 감염은 심각한 폐 손상을 유발할 수 있으며, 급성 호흡곤란 증후군(ARDS) 및 다기관 기능 부전 증후군으로 진행될 수 있습니다4,5. 점차 많은 증거들이 COVID-19 관련 폐 손상의 발병 기전이 매우 복잡하며, 면역 및 염증 반응의 조절 장애가 핵심적인 특징임을 시사하고 있습니다6,7,8,9. 한편으로 SARS-CoV-2 감염은 과도한 염증 반응을 유도하여 interleukin-6 (IL-6), interleukin-1β (IL-1β), tumor necrosis factor-α (TNF-α)와 같은 전염증성 사이토카인의 대량 방출을 초래하며, 이를 통해 소위 “사이토카인 폭풍”을 유발하는데10,11, 이는 폐 손상 및 질병 진행의 주요 동인으로 간주됩니다. 다른 한편으로, 감염 초기 단계에서 SARS-CoV-2는 여러 기전을 통해 숙주의 IFN-I 반응을 억제하여, IFN-I 매개 항바이러스 면역을 손상시킵니다12,13,14. 따라서 전염증성 사이토카인 수치의 상승을 동반한 지연된 인터페론 반응은 COVID-19의 특징적인 특성으로 여겨집니다6,15.

현재 이용 가능한 COVID-19 동물 모델은 주로 hACE2 형질전환 마우스, 마우스 적응 바이러스 균주, 또는 페럿 및 비인간 영장류와 같은 다른 종에 의존하고 있습니다16,17. 그러나 마우스에서의 일반적인 SARS-CoV-2 감염 모델은 COVID-19의 과염증 특성을 완전히 재현하지 못하는 경우가 많습니다18,19,20. TLR4 작용제인 LPS는 강력한 염증 반응을 유도하며 급성 폐 손상 모델에서 널리 사용됩니다21. 따라서 본 연구에서 설명하는 SARS-CoV-2 및 LPS 유도 모델은 COVID-19 관련 폐 손상, 특히 과도한 염증 활성화 및 손상된 항바이러스 면역 반응의 기전에 초점을 맞춘 연구를 위해 설계되었습니다. SARS-CoV-2 단독 모델과 비교하여, 이 접근 방식은 바이러스 감염 맥락을 유지하면서 면역 염증 특성을 강조합니다. 이 모델은 바이러스 전파나 SARS-CoV-2 감염의 전체적인 자연 경과를 모델링하기보다는 면역 염증 기전을 조사하는 데 상당한 잠재력을 가지고 있습니다.

본 프로토콜은 SARS-CoV-2 및 LPS로 유도된 COVID-19 관련 폐 손상 마우스 모델의 절차적 수립 방법을 설명합니다. 기존 모델들이 COVID-19와 관련된 면역-염증 조절 장애를 재현하는 데 한계가 있다는 점을 고려하여, 이 접근 방식은 질환 기전을 연구하고 잠재적인 치료 전략을 평가하기 위한 실용적인 플랫폼을 제공합니다. 해당 모델은 폐 조직병리학, 바이러스 수치, 염증성 사이토카인 및 IFN-I 반응을 통해 체계적으로 평가되었습니다.

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프로토콜

본 연구는 SARS-CoV-2와 LPS의 비강 내 점적 투여를 통해 COVID-19 관련 폐 손상 마우스 모델을 구축함으로써, 형질전환 마우스 모델을 대체할 수 있는 안정적이고 비용 효율적인 대안을 제시하였습니다. 해당 실험 프로토콜은 사천(Sichuan) 질병관리예방센터의 승인을 받았으며, 동물 실험 윤리 승인[Sichuan CDC (Animal Ethics) Approval No. 005 (2025)]을 획득하였습니다. 모든 절차는 관련 가이드라인 및 생물 안전 규정을 엄격히 준수하여 수행되었습니다.

주요 시약 및 장비에 대한 자세한 정보는 재료 표에 제공되어 있습니다.

1. 연구 프로토콜 설계

  1. BALB/c 마우스를 대조군 또는 모델군에 무작위로 배정합니다.
  2. 0일 차에 모델군 마우스의 비강 내로 SARS-CoV-2를 투여합니다.
  3. 2일 차에 모델군 마우스의 비강 내로 LPS를 투여합니다.
  4. 대조군 마우스에는 해당 시점에 동일한 부피의 생리 식염수를 비강 내로 투여합니다.
  5. SARS-CoV-2 감염 3일 차에 모든 마우스를 안락사시키고, 모델 검증을 위해 폐 조직을 수집합니다.
    참고: 실험 워크플로우는 그림 1A에 도식화되어 있습니다.

2. 준비 단계

  1. 동물 준비
    1. 연령 6–8개월, 체중 약 25–30 g의 특정 병원체 제거(SPF) 암컷 BALB/c 마우스를 사용한다.
    2. 난수표를 사용하여 마우스를 대조군 또는 모델군으로 무작위 배정하며, 그룹당 4마리씩 배정한다.
    3. 사료와 물을 자유롭게 섭취할 수 있는 표준 실험실 조건에서 마우스를 사육한다.
      참고: 이전 연구들에 따르면 고령 마우스가 어린 마우스보다 비강 내 SARS-CoV-2 감염에 더 취약한 것으로 나타났다18,22. 따라서 본 연구에서는 SARS-CoV-2 관련 폐 손상 모델 구축을 용이하게 하기 위해 고령 BALB/c 마우스를 선정하였다.
    4. 각 마우스의 비강 내에 마우스당 최종 감염 용량이 4.5 x 105 TCID₅₀에 해당하는 100 µL의 바이러스 현탁액을 접종한다.
      참고: SARS-CoV-2는 Sichuan Center for Disease Control and Prevention에서 제공받았다. 본 연구에 사용된 균주는 SARS-CoV-2 오미크론 변이체이며, 바이러스 스톡 농도는 4.5 x 106 TCID₅₀/mL였다.
      주의: SARS-CoV-2는 고병원성 미생물이므로, 모든 바이러스 관련 절차는 동물 생물안전 3등급(ABSL-3) 시설에서 수행한다. 다른 바이러스 변이체나 동물 모델을 사용할 때는 예비 실험을 바탕으로 감염 용량을 최적화한다.
  2. 작업 스톡 준비
    1. LPS 스톡 용액 준비: LPS 분말 3 mg을 정밀히 달아 생리식염수 1 mL에 녹인다. 완전히 용해될 때까지 부드럽게 섞거나 계속해서 볼텍싱하여 3 mg/mL 농도의 스톡 용액을 얻는다. 투여 전, 마우스의 체중에 따라 생리식염수로 스톡 용액을 원하는 작업 농도로 추가 희석한다.
    2. 마취액 준비: Zoletil 패키지에 포함된 멸균 주사용 증류수로 분말을 재구성하여 이후 사용에 필요한 질량-부피 비율의 용액을 준비한다.
    3. 바이러스 작업 용액 준비: 사용 전, 바이오안전 작업대(BSC) 내의 얼음 위에서 1 mL의 SARS-CoV-2 바이러스 현탁액을 천천히 해동한다.
      참고: 모든 작업 용액을 준비하고 사용할 때는 각 제조사의 지침을 따른다.

3. 마우스의 비강 내 투여

  1. 투여 전 각 마우스의 체중을 측정하고 기록합니다.
  2. 각 마우스의 체중에 따라 Zoletil과 LPS의 투여량을 계산합니다.
  3. 해당하는 작업 용액을 조제하고, 이후 투여를 위해 적절한 주사기로 필요한 부피를 흡입합니다.
  4. 마우스 보정: 왼손의 엄지와 검지로 귀와 목 뒤쪽의 피부를 잡아 마우스의 목덜미를 부드럽게 잡습니다.
  5. 동물을 손바닥 위에 놓고 약지와 소지로 등과 꼬리를 고정합니다. 복부가 완전히 노출되고 신체가 안정되도록 마우스를 앙와위(supine orientation)로 배치합니다.
  6. 소독: 멸균 면봉을 사용하여 75% ethanol로 복부 주사 부위를 소독합니다.
  7. 마취: Zoletil (25mg/kg)이 담긴 주사기 바늘을 하복부 중앙선에서 측면으로 약 0.5 cm 지점에 삽입합니다. 피부 관통 후 바늘을 45° 각도로 복강 내에 약 2–3 mm 깊이까지 진입시킵니다. 혈액이 섞여 나오지 않는지 확인하기 위해 흡인한 후 마취제를 천천히 투여합니다.
    참고: 충분한 마취를 보장하고 폐사율을 최소화하기 위해 예비 실험을 바탕으로 마취 용량을 최적화하십시오. 조직 손상을 최소화하기 위해 반복적인 천자를 피하십시오.
  8. 마취 확인: 호흡 곤란이나 호흡 부전의 징후 없이 안정적이고 규칙적인 호흡이 관찰되는지 확인하여 마취 상태를 확인합니다.
  9. SARS-CoV-2 비강 내 점적 투여 (0일차): 마이크로피펫 또는 주사기를 사용하여, 안정적인 호흡 주기 중 흡기 시작 시점에 SARS-CoV-2 바이러스 현탁액 100 µL(콧구멍당 50 µL)를 외비공에 천천히 한 방울씩 투여합니다.
  10. 균일한 흡입을 돕기 위해 콧구멍을 번갈아 가며 투여합니다. 대조군 마우스에는 동일한 절차를 사용하여 동일한 부피의 생리식염수를 처리합니다.
    참고: 용액을 한 방울씩 투여하며, 목표 부피에 도달할 때까지 다음 방울을 투여하기 전 각 방울이 비강 내로 흡입되었는지 확인하십시오.
  11. 투여 후 처리: 비강 내 점적 투여 후 약 30–60 s 동안 마우스의 머리를 약간 높게 유지하여 용액이 하기도로 잘 전달되도록 합니다. 마취 회복 징후가 관찰되면 마우스를 케이지로 복귀시키고 완전히 의식을 회복할 때까지 관찰합니다.
  12. 기록 및 모니터링: 각 마우스의 투여 부피와 식별 번호를 기록합니다. 실험 기간 동안 동물의 생존 상태와 일반적인 생리적 상태를 지속적으로 모니터링합니다.
  13. LPS 비강 내 점적 투여 (2일차): SARS-CoV-2 감염 후 2일차에 마우스에 LPS를 투여합니다. SARS-CoV-2 투여에 사용된 것과 동일한 프로토콜에 따라 LPS (5 mg/kg)를 비강 내로 투여합니다. 대조군 마우스에는 동일한 절차를 사용하여 동일한 부피의 생리식염수를 투여합니다.
    참고: 이 단계에서 LPS와 생리식염수는 마취 및 비강 내 투여를 포함하여 SARS-CoV-2 접종과 동일한 절차로 투여되었습니다.

4. 마우스 해부 및 폐 조직 수집

  1. SARS-CoV-2 감염 후 3일 차에 조직 수집을 위해 마우스를 안락사시킵니다. 먼저 동물을 마취한 후 경추 탈골법으로 희생시킵니다. 대조군 마우스도 동일한 절차로 처리합니다.
    참고: 경추 탈골에 관한 상세 절차는 보충 파일 1을 참조하십시오.
  2. 안락사시킨 마우스를 해부판 위에 복부와 흉부 부위가 완전히 노출되도록 앙와위로 고정합니다. 오염을 최소화하기 위해 복부 털을 75% 에탄올로 적십니다.
  3. 멸균 가위를 사용하여 양측 갈비뼈 가장자리를 따라 흉골을 조심스럽게 절개하고 흉강을 서서히 엽니다. 핀셋을 사용하여 조직을 부드럽게 견인하고, 폐 조직의 기계적 손상을 최소화하면서 주변 흉부 구조물로부터 폐를 단계적으로 박리합니다.
    참고: 절단 시 심장, 폐 및 주요 혈관 구조의 손상을 방지하기 위해 가위 끝의 방향을 주의 깊게 조절하십시오.
  4. 적출한 폐 조직을 즉시 냉각된 PBS 또는 생리식염수에 넣고 2~3회 가볍게 헹구어 잔류 혈액과 부유물을 제거합니다. 보풀 없는 여과지로 표면의 과잉 액체를 조심스럽게 닦아내며, 조직의 구조적 손상을 방지하기 위해 압착하지 않도록 주의합니다.
  5. 처리된 폐 조직의 무게를 전자저울로 즉시 측정하고 그 값을 기록합니다.
  6. 우측 미엽을 절제하여 이후의 조직병리학적 분석을 위해 조직 부피의 10배에 해당하는 4% 파라포름알데히드에 즉시 고정합니다.
    주의: 파라포름알데히드는 독성이 있으므로 기관 안전 가이드라인에 따라 취급하십시오.
  7. 나머지 폐 조직을 수집하여 크라이오바이알에 분주하고, 액체 질소로 빠르게 냉동시킨 후 보존을 위해 −80 °C에 저장합니다. 우측 상엽, 우측 중엽 및 부엽은 SARS-CoV-2 바이러스 부하 및 염증성 사이토카인 검출용으로 할당하고, 좌측 폐는 ELISA 분석용으로 남겨둡니다.
    주의: 액체 질소는 매우 차가우므로, 저온 화상이나 동상을 방지하기 위해 취급 시 적절한 저온 장갑과 보안경을 착용하십시오.
  8. 해부를 완료한 후 모든 기구를 표준 절차에 따라 철저히 세척하고 멸균합니다. 동물 사체와 생물학적 폐기물은 동물 실험에 관한 기관 및 규제 가이드라인을 준수하여 처리합니다.

5. 헤마톡실린-에오신 (HE) 염색23

  1. 신선한 폐 조직을 4% 파라포름알데히드에 넣고 상온에서 24시간 동안 고정합니다.
    참고: 고정 시간을 주의 깊게 조절하십시오. 고정이 불충분하면 조직 보존이 제대로 되지 않을 수 있으며, 고정 시간이 너무 길어지면 과도한 단백질 가교 결합이 발생하여 염색 품질에 영향을 줄 수 있습니다.
  2. 자동 조직 처리기를 사용하여 고정된 조직의 단계적 탈수, 투명화 및 파라핀 침투 과정을 진행합니다.
    참고: 자동 조직 처리기 프로토콜은 Supplementary File 2에 제공되어 있습니다.
  3. 파라핀이 침투된 조직을 임베딩 몰드에 넣습니다. 용융된 파라핀을 붓고 조직의 방향을 주의 깊게 잡습니다.
  4. 몰드를 콜드 플레이트로 옮겨 응고시킵니다. 완전히 굳은 후 몰드에서 파라핀 블록을 꺼냅니다.
  5. 파라핀 블록을 마이크로톰에 장착하고 절단면이 칼날과 평행하도록 조정합니다. 약 3–5 µm 두께로 연속 절편을 제작합니다.
  6. 절편이 완전히 펴지도록 즉시 약 45 °C의 온수조로 옮겨 부상시킵니다.
  7. 슬라이드의 한쪽 끝을 수직으로 물에 담가 절편을 낚아올리며, 핀셋을 사용하여 절편이 슬라이드 표면에 적절히 부착되도록 돕습니다.
  8. 조직 부착력을 높이기 위해 슬라이드를 65 °C 슬라이드 건조기에 넣고 약 1시간 동안 건조합니다.
    참고: 조직 유형, 절편 두께 및 장비 상태에 따라 건조 시간을 조정하십시오. 조직 손상을 방지하기 위해 과열되지 않도록 주의하십시오.
  9. 자동 염색기를 사용하여 건조된 절편의 HE 염색을 수행합니다.
    참고: 자동 염색기 프로토콜은 Supplementary File 3에 제공되어 있습니다.
  10. 염색된 절편을 꺼내어 자연 건조합니다. 중성 봉입제를 한 방울 떨어뜨리고 커버글라스를 덮습니다. 봉입제가 굳은 후 광학 현미경으로 절편을 관찰합니다.

6. 폐 조직 내 SARS-CoV-2 바이러스 부하 및 염증성 사이토카인 발현

  1. 폐 조직 균질화
    1. 4~5개의 스테인리스 스틸 비드(직경 3 mm)와 균질화 매질로 사용할 900 µL의 냉각된 용해 버퍼를 넣어 RNase-free 균질화 튜브를 준비한다.
      참고: 용해 버퍼의 부피는 조직 무게에 따라 조절하며, 일반적으로 조직 1 g당 약 9 mL의 비율로 사용한다.
    2. 약 50 mg의 폐 조직을 측정하여 미세하게 다진 후, 균질화 튜브에 옮긴다.
    3. 조직 분쇄기(60 Hz, 60 s, 사이클 간 10 s 간격으로 2~3회 사이클)를 사용하여 조직을 균질화한다.
      참고: 기기 및 조직 유형에 따라 균질화 매개변수를 최적화한다.
    4. 균질화 후 샘플을 검사하여 완전히 분해되었는지 확인한다. 균일한 용해물이 얻어질 때까지 눈에 보이는 조직 파편이 남아 있다면 균질화 과정을 반복한다.
  2. 폐 조직으로부터의 컬럼 기반 총 RNA 추출
    ​참고: 제조사의 지침에 따라 컬럼 기반 정제법을 사용하여 폐 조직에서 총 RNA를 추출한다. 해당되는 경우, 관련 제품 매뉴얼에 따라 대체 RNA 추출 방법을 수행한다.
    1. 균질물을 새로운 2 mL RNase-free 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴다. gDNA Eliminator 용액 100 µL를 첨가한다. 튜브 캡을 닫고 15~20 s 동안 강하게 흔든다.
    2. 캡을 잠시 열고 클로로포름 180 µL를 첨가한 후, 15 s 동안 철저히 볼텍싱한다.
      주의: 클로로포름은 휘발성 및 독성이 있으므로 환기가 잘 되는 구역이나 화학 흄 후드 내에서 취급하고, 흡입 및 피부 접촉을 피하기 위해 적절한 개인 보호 장구를 착용한다.
    3. 샘플을 상온에서 2분 동안 배양한 후, 4 °C에서 12,000 x g로 15분 동안 원심분리한다.
    4. 상층의 수성층을 주의 깊게 새 튜브로 옮긴다. 70% 에탄올을 동일한 부피로 첨가하고 볼텍싱하여 충분히 섞는다.
      참고: RNA 순도를 보장하기 위해 수성층을 수집할 때 계면과 유기층을 건드리지 않도록 주의한다. 70% 에탄올을 첨가한 후 원심분리 없이 즉시 다음 단계로 진행한다.
    5. 혼합물을 스핀 컬럼으로 옮기고 8,000 x g에서 15 s 동안 원심분리한다. 통과액은 버린다.
    6. 스핀 컬럼에 세척 버퍼 700 µL를 첨가하고 8,000 x g에서 15 s 동안 원심분리한다. 통과액은 버린다.
    7. 스핀 컬럼에 세척 버퍼 500 µL를 첨가하고 8,000 x g에서 15 s 동안 원심분리한다. 이 세척 단계를 1회 더 반복한다.
    8. 스핀 컬럼을 새로운 수집 튜브로 옮기고 12,000 x g에서 1분 동안 원심분리하여 잔류 세척 버퍼를 제거한다.
    9. 스핀 컬럼을 새로운 1.5 mL RNase-free 마이크로 원심분리 튜브에 넣는다. 멤브레인 중앙에 RNase-free water 30 µL를 직접 첨가하고 8,000 x g에서 1분 동안 원심분리하여 RNA를 용출한다.
      참고: 후속 응용 분야에 따라 RNase-free water의 부피를 30~50 µL 범위에서 조절한다. 더 높은 RNA 농도가 필요한 경우 용출 부피를 낮게 설정한다.
  3. 역전사 디지털 PCR(RT-dPCR)을 이용한 SARS-CoV-2 바이러스 양 검출
    ​참고: SARS-CoV-2 RNA의 절대 정량을 위해 원스텝 RT-dPCR 분석법을 사용하였다. 바이러스 RNA 복제 수를 결정하기 위해 뉴클레오캡시드(N) 유전자를 표적으로 하는 특정 프라이머-프로브 세트를 사용하였다.
    1. RNA 샘플과 시약을 얼음 위에서 해동한다.
    2. 제조사의 지침에 따라 RT-dPCR 반응 혼합물을 준비한다.
    3. RT-dPCR 반응 혼합물 20 µL와 RNA 템플릿 20 µL를 혼합한다. 혼합물을 짧게 볼텍싱하고, 짧게 원심분리(short spin)한 후 얼음 위에 보관한다.
    4. 40 µL의 반응 혼합물을 디지털 PCR 칩 웰에 로딩하고, 기기 프로토콜에 따라 칩을 밀봉한다.
    5. 다음의 열 순환 조건으로 증폭을 수행한다: 50 °C에서 40분(1 사이클), 95 °C에서 2분(1 사이클), 이어서 95 °C에서 15 s 및 57 °C에서 60 s로 40 사이클을 수행한다. 검출 채널은 GREEN(250 ms)과 RED(150 ms)로 설정한다.
  4. 역전사 정량 PCR(RT-qPCR)을 이용한 염증성 사이토카인 발현 검출
    1. UV 분광광도계를 사용하여 RNA 농도와 순도를 측정한다.
    2. 제조사의 지침에 따라 역전사를 통해 상보적 DNA(cDNA)를 합성하기 위해 반응당 1,000 ng의 총 RNA를 사용한다.
    3. SYBR Green PCR 마스터 믹스와 유전자 특이적 프라이머를 사용하여, 반응당 100 ng의 cDNA를 템플릿으로 RT-qPCR을 수행한다. 다음의 사이클 조건을 사용한다: 95 °C에서 2분, 이어서 95 °C에서 5 s 및 60 °C에서 10 s로 40 사이클을 수행한다. 프라이머 서열은 표 1에 나열되어 있다.
      참고: 사용된 특정 시약 및 기기에 따라 반응 조건을 최적화하고, 해당 제조사의 지침을 따른다.
    4. GAPDH를 내부 참조 유전자로 사용하고 2−ΔΔCt 방법을 사용하여 상대적 유전자 발현 수준을 계산한다.

7. 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 이용한 폐 조직 내 염증성 사이토카인 검출24

참고: 각 제조사에서 제공하는 특정 프로토콜에 따라 ELISA 키트를 사용하십시오. 다른 공급업체의 키트를 사용할 때는 해당 제조사의 지침을 엄격히 따르십시오.

  1. 위에서 설명한 대로 폐 조직을 균질화합니다. 균질화 매질로는 PBS 또는 ELISA 전용 조직 용해 버퍼를 사용합니다.
  2. 균질화된 샘플을 원심분리하고(예: 12,000 x g, 4 °C, 10분), 이후 분석을 위해 상층액을 수집합니다.
  3. 사용 전 ELISA 키트를 실온에서 30분 동안 평형화합니다. 알루미늄 호일 파우치에서 필요한 마이크로플레이트 스트립을 꺼냅니다.
  4. 제조업체의 지침에 따라 표준 물질, 샘플 웰 및 공백 웰을 준비합니다. 표준 웰에는 표준 물질 50 µL를, 샘플 웰에는 샘플 10 µL와 샘플 희석 버퍼 40 µL를 첨가합니다. 각 표준 물질과 샘플에 대해 두 번의 기술적 반복 실험(technical replicates)을 수행합니다.
  5. 공백 웰을 제외한 각 표준 및 샘플 웰에 horseradish peroxidase (HRP)-접합 검출 항체 100 µL를 첨가합니다. 플레이트를 접착 필름으로 밀봉하고 37 °C에서 60분 동안 배양합니다.
  6. 배양 후 각 웰의 액체를 버리고, 플레이트를 흡수지에 가볍게 두드려 잔류 액체를 제거합니다.
  7. 각 웰에 세척 버퍼를 넣고 1분 동안 방치한 후 버퍼를 버립니다. 플레이트를 닦아 건조합니다. 이 세척 단계를 총 5회 반복합니다.
  8. 각 웰에 기질 용액 A 50 µL와 기질 용액 B 50 µL를 순차적으로 첨가합니다. 플레이트를 가볍게 섞고 암소의 37 °C에서 15분 동안 배양하여 발색시킵니다.
  9. 각 웰에 정지 용액 50 µL를 첨가하여 반응을 종료합니다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 10분 이내에 450 nm에서 흡광도(OD)를 측정합니다.
  10. 표준 농도(x축)를 OD 값(y축)에 대해 플롯하여 표준 곡선을 생성하고 곡선을 피팅합니다. OD 값을 표준 곡선 방정식에 대입하여 샘플 내 표적 사이토카인의 농도를 계산하고, 해당하는 희석 배수를 곱합니다.
  11. BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 폐 조직의 총 단백질 농도를 결정합니다. 최종 사이토카인 수치를 총 단백질 함량으로 정규화하고, 결과를 총 단백질 1mg당 표적 사이토카인의 양(예: pg/mg protein)으로 표시합니다.

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결과

대조군과 모델군 모두에서 폐의 조직병리학적 변화, SARS-CoV-2 바이러스 부하, 전염증성 사이토카인 및 제1형 인터페론 수치를 평가하여 모델 검증을 수행하였습니다.

통계 분석

데이터는 평균 ± 표준 오차(SE)로 표시되었습니다. 모델 그룹과 대조군 간의 비교를 위해 비쌍체 Student’s t-test를 사용하였습니다. 이 테스트는 두 독립 집단 간의 연속 변수 평균을 비교하는 데 적합하므로 선택되었습니다. 본 연구에서는 마우스가 두 그룹에 독립적이고 무작위로 배정되어 표본의 독립성 가정을 충족하였습니다. p-value < 0.05인 경우를 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였습니다.

마우스의 체중 및 폐 지수의 변화

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토론

본 연구에서는 SARS-CoV-2와 LPS의 비강 내 투여를 통해 COVID-19 관련 폐 손상 마우스 모델을 구축하였습니다. 연구 결과, SARS-CoV-2와 LPS를 비강 내로 공동 투여하면 IFN-I 신호 전달의 억제와 함께 강력한 염증 반응이 유도되는 것으로 나타났습니다. 모델 군의 마우스는 현저한 체중 감소와 폐 지수 증가를 보였으며, 이는 전신 쇠약과 악화된 폐 손상을 나타냅니다. HE 염색을 통해 모델 군에서 폐포 구조의 파괴와 광범위한 염증 세포 침윤을 특징으로 하는 전형적인 미만성 폐 손상이 나타남을 추가로 확인하였습니다. 또한, 대조군과 비교하여 모델 군의 폐 조직에서는 IL-6, IL-1β, TNF-α를 포함한 주요 전염증성 사이토카인의 발현이 유의하게 증가한 반면, IFN-α 및 IFN-β의 수치는 현저히 감소하였습니다. 이러한 결과는 항바이러스 면역의 억제와 함께 전염증성 반응의 과도한 활성화로 특징지어지는 면역 불균형 상태를 시사하며, 질병의 면역병리학적 특성을 재현하는 데 있어 본 모델의 잠재적 가치를...

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공개 사항

저자들은 공개할 이해관계 충돌이 없습니다.

감사의 글

본 연구는 중국 국가자연과학재단(82374291), 쓰촨성 과학기술 프로그램(2024NSFJQ0059), 쓰촨성 중의약관리국 과학연구 특별 과제(2024zd005); 2022 "Tianfu Qingcheng Plan" Tianfu 과학기술 선도 인재 프로젝트(Chuan Qingcheng No. 1090), 청두시 위생위원회 및 청두 중의약대학교 공동 혁신 기금(WXLH202403091)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
자동 조직 처리기Dakewe Biotech Co., Ltd.HP300조직 탈수에 사용됨.
자동 염색기Leica BiosystemsLEICA ST5010HE 염색에 사용됨.
원심분리기DLAB 사이언티픽 D3024R시료 또는 시약의 원심분리에 사용됩니다.
항온 수조Shanghai LICHEN-BX Instrument Technology Co., Ltd.HH-6항온 수조에 사용됩니다.
디지털 PCR 시스템QIAGENQIAcuity OneRT-dPCR에 사용됨.
qPCR용 TransScript All-in-One First-Strand cDNA 합성 슈퍼믹스 (1단계 gDNA 제거)TransGen Biotech Co.,Ltd.AT341역전사 과정에 사용됨.
에오신 용액BASOBA4024조직학적 염색에 사용됨.
형광 정량 PCR 시스템Rocgene (Beijing) Technology Co., Ltd.Archimed X6RT-qPCR에 사용됨.
헤마토실린 용액BASOBA4041조직학적 염색에 사용됨.
IBM SPSS Statistics 소프트웨어IBM Corp., 미국 뉴욕주 아몬크버전 22.0통계 분석에 사용됨.
Escherichia coli O55:B5 유래 리포폴리사카라이드Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd.L2880마우스 모델링에 사용됨.
마이크로플레이트 리더Molecular Devices SpectraMax Plus 384ELISA에 사용됨.
마우스 IFN-α 엘라이자 키트ZCIBIO Technology Co., Ltd.ZC-37863WIFN-을 검출하는 데 사용됨α 마우스 폐 조직 내 수치.
마우스 IFN-β 엘라이자 키트ZCIBIO Technology Co., Ltd.ZC-37887WIFN-을 검출하는 데 사용됨β 마우스 폐 조직 내 수준.
마우스 IL-1β ELISA 키트ZCIBIO Technology Co., Ltd.ZC-37974WIL-1 검출에 사용됨β 마우스 폐 조직 내 수치.
마우스 IL-6 ELISA 키트ZCIBIO Technology Co., Ltd.ZC-37988W마우스 폐 조직 내 IL-6 수치를 검출하는 데 사용됨.
마우스 TNF-α ELISA 키트ZCIBIO Technology Co., Ltd.ZC-39024WTNF-를 검출하는 데 사용됨α 마우스 폐 조직 내 수치.
디지털 PCR용 원스텝 RT-PCR 키트QIAGEN4829104디지털 PCR에 사용됨.
파라핀 매립기Hubei Aristion Medical Industrial Co., Ltd.ABM-7L마우스 폐 조직의 파라핀 포매에 사용됨.
QuantiNova SYBR PCR 믹스 키트QIAGEN1129280RT-qPCR에 사용됨.
RNeasy Plus Universal Mini KitQIAGEN1062832총 RNA 추출에 사용됨.
슬라이서Leica BiosystemsLEICA RM2235파라핀 절편에 사용됨.
조직 균질기용 스테인리스 스틸 비드Beyotime BiotechnologyF6621폐 조직 균질화에 사용됨.
디지털 PCR용 XG 프라이머 풀 1.0QIAGEN4828104디지털 PCR에 사용됨.
Zoletil 50VIRBACBN9VS7A마우스 마취에 사용됨.

참고문헌

  1. Zhang X, et al. SARS-CoV-2 Evolution: Immune Dynamics, Omicron Specificity, and Predictive Modeling in Vaccinated Populations. Adv Sci (Weinh). 2024;11(40):e2402639.
  2. Yu Y, et al. COVID-19 Serum Drives Spike-Mediated SARS-CoV-2 Variation. Viruses. 2024;16(5):763.
  3. Alhamlan FS, Al-Qahtani AA. SARS-CoV-2 Variants: Genetic Insights, Epidemiological Tracking, and Implications for Vaccine Strategies. Int J Mol Sci. 2025;26(3):1263.
  4. Habashi NM, Camporota L, Gatto LA, Nieman G. Functional pathophysiology of SARS-CoV-2-induced acute lung injury and clinical implications. J Appl Physiol (1985). 2021;130(3):877-891.
  5. Nie X, et al. Multi-organ proteomic landscape of COVID-19 autopsies. Cell. 2021;184(3):775-791.e14.
  6. Blanco-Melo D, et al. Imbalanced Host Response to SARS-CoV-2 Drives Development of COVID-19. Cell. 2020;181(5):1036-1045.e9.
  7. Wang J, Li Q, Qiu Y, Lu H. COVID-19: imbalanced cell-mediated immune response drives to immunopathology. Emerg Microbes Infect. 2022;11(1):2393-2404.
  8. Sa Ribero M, Jouvenet N, Dreux M, Nisole S. Interplay between SARS-CoV-2 and the type I interferon response. PLoS Pathog. 2020;16(7):e1008737.
  9. El-Saber Batiha G, Al-Gareeb AI, Saad HM, Al-Kuraishy HM. COVID-19 and corticosteroids: a narrative review. Inflammopharmacology. 2022;30(4):1189-1205.
  10. Ye Q, Wang B, Mao J. The pathogenesis and treatment of the 'Cytokine Storm' in COVID-19. J Infect. 2020;80(6):607-613.
  11. Jiang Y, et al. Cytokine storm in COVID-19: from viral infection to immune responses, diagnosis and therapy. Int J Biol Sci. 2022;18(2):459-472.
  12. Zhang S, Wang L, Cheng G. The battle between host and SARS-CoV-2: Innate immunity and viral evasion strategies. Mol Ther. 2022;30(5):1869-1884.
  13. Beyer DK, Forero A. Mechanisms of Antiviral Immune Evasion of SARS-CoV-2. J Mol Biol. 2022;434(6):167265.
  14. Lei X, et al. Activation and evasion of type I interferon responses by SARS-CoV-2. Nat Commun. 2020;11(1):3810.
  15. Mostafa-Hedeab G, et al. A raising dawn of pentoxifylline in management of inflammatory disorders in Covid-19. Inflammopharmacology. 2022;30(3):799-809.
  16. Chen Z, et al. SARS-CoV-2 immunity in animal models. Cell Mol Immunol. 2024;21(2):119-133.
  17. Johansen MD, et al. Animal and translational models of SARS-CoV-2 infection and COVID-19. Mucosal Immunol. 2020;13(6):877-891.
  18. Zhang Y, et al. SARS-CoV-2 rapidly adapts in aged BALB/c mice and induces typical pneumonia. J Virol. 2021;95(11):e02477-20.
  19. Sun SH, et al. A Mouse Model of SARS-CoV-2 Infection and Pathogenesis. Cell Host Microbe. 2020;28(1):124-133.e4.
  20. Muñoz-Fontela C, et al. Animal models for COVID-19. Nature. 2020;586(7830):509-515.
  21. Liu T, et al. Therapeutic potential of inosine in acute lung injury: mechanistic insights into TLR4 suppression and macrophage polarization. Phytomedicine. 2025;143:156854.
  22. Powers JM, et al. Divergent pathogenetic outcomes in BALB/c mice following Omicron subvariant infection. Virus Res. 2024;341:199319.
  23. Fan F, et al. Association between systemic immune-inflammation indexes and Nuodikang capsule's protection in LPS-induced acute lung injury in mice. Phytomedicine. 2025;147:157229.
  24. Xie N, et al. Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation. Phytomedicine. 2022;103:154240.
  25. Jiang S, et al. Generic Diagramming Platform (GDP): a comprehensive database of high-quality biomedical graphics. Nucleic Acids Res. 2025;53(D1):D1670-D1676.
  26. Onohuean H, et al. Covid-19 and development of heart failure: mystery and truth. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2021;394(10):2013-2021.
  27. Zarrilli G, et al. The Immunopathological and Histological Landscape of COVID-19-Mediated Lung Injury. Int J Mol Sci. 2021;22(2):974.
  28. Fernandes de Souza WD, et al. Lung Inflammation Induced by Inactivated SARS-CoV-2 in C57BL/6 Female Mice Is Controlled by Intranasal Instillation of Vitamin D. Cells. 2023;12(7):1092.
  29. Ciesielska A, Matyjek M, Kwiatkowska K. TLR4 and CD14 trafficking and its influence on LPS-induced pro-inflammatory signaling. Cell Mol Life Sci. 2021;78(4):1233-1261.
  30. Brandenburg K, et al. A Comparison between SARS-CoV-2 and Gram-Negative Bacteria-Induced Hyperinflammation and Sepsis. Int J Mol Sci. 2023;24(20):15169.
  31. Samsudin F, et al. SARS-CoV-2 spike protein as a bacterial lipopolysaccharide delivery system in an overzealous inflammatory cascade. J Mol Cell Biol. 2023;14(9):mjac058.
  32. Petruk G, et al. SARS-CoV-2 spike protein binds to bacterial lipopolysaccharide and boosts proinflammatory activity. J Mol Cell Biol. 2020;12(12):916-932.
  33. Martin-Sancho L, et al. Functional landscape of SARS-CoV-2 cellular restriction. Mol Cell. 2021;81(12):2656-2668.e8.
  34. Minkoff JM, tenOever B. Innate immune evasion strategies of SARS-CoV-2. Nat Rev Microbiol. 2023;21(3):178-194.

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