본 프로토콜은 습윤 챔버를 포함하는 쥐 피부 절제 창상 모델에 대해 설명합니다. 이 시스템을 통해 국소 액상 제형, 세포 현탁액, 생체 재료 및 기타 창상 치료제의 효능을 평가할 수 있습니다.
이 논문에서
요약
초록
피부 상처는 전 세계적으로 주요한 보건 의료 과제이며, 상당한 이환율과 경제적 부담을 초래합니다. 조직 수복 메커니즘을 조사하고 새로운 치료 전략을 평가하기 위해서는 신뢰할 수 있고 임상적으로 유의미한 동물 모델이 필수적입니다. 그러나 기존의 설치류 절제 상처 모델은 panniculus carnosus로 인한 빠른 상처 수축으로 인해 제한적이며, 이는 인간의 상처 치유 과정과 크게 다릅니다. 인간의 상처 치유는 주로 육아 조직 형성 및 재상피화를 통해 이루어집니다. 본 연구에서는 상처 수축을 제한하는 동시에 민감한 치료적 개입을 테스트할 수 있는 보호 환경을 제공하도록 설계된 쥐 절제 상처 모델을 설명합니다. Sprague Dawley 쥐의 등 부위에 10-mm 전층 절제 상처를 만들고, 결절 봉합으로 고정한 니트릴 부타디엔 고무(NBR) O-링을 사용하여 안정화했습니다. 습윤 상처 환경을 유지하기 위해 Eakin cohesive seal과 투명 점착 필름을 도포하여 세포, 생체 재료 또는 의약품 화합물의 국소 투여에 적합한 챔버를 형성했습니다. 동물이 드레싱을 제거하는 것을 방지하기 위해 폼 드레싱, 접착 테이프, 관형 붕대 및 이중 어깨 고정 시스템으로 구성된 추가 보호층을 사용했습니다. 상처 치유 과정은 14일 동안 디지털 평면 측정법과 hematoxylin and eosin 염색을 이용한 조직학적 평가를 통해 모니터링되었습니다. 이 절차는 동물당 약 30분이 소요되었으며 일관된 상처 치유 결과를 나타냈습니다. NBR O-링은 상처 수축을 제한하는 부목으로 사용되었습니다. 치유는 주로 육아 조직 형성 및 재상피화를 통해 일어났습니다. 드레싱은 감염 징후 없이 최대 7일 동안 온전하게 유지되었습니다. 조직학적 분석 결과, 표피 재생과 염증 세포 침윤을 특징으로 하는 활발한 조직 수복이 확인되었습니다. 본 모델은 상처 치료제 및 첨단 재생 치료의 전임상 평가를 위한 플랫폼을 제공합니다.
서론
치유가 어려운 상처를 포함한 피부 상처는 전 세계적으로 4,000만 명 이상의 환자에게 영향을 미치며, 2024년 기준 연간 비용이 220억 달러에 달해 의료 시스템에 상당한 부담을 주고 있습니다. 유럽에서만 매년 400만 명의 환자가 치유가 어려운 상처로 고통받고 있으며, 이는 가용한 급성기 입원 병상의 최대 절반을 차지합니다1. 외과적 기술, 수술 중 처치 및 고급 상처 드레싱의 보급과 같은 발전에도 불구하고, 일부 상처는 난치성으로 남거나 결국 합병증이 발생하게 됩니다. 따라서 다양한 국소 도포 재료를 테스트하기 위해 피부 상처의 실험적 동물 모델이 필요한 새로운 치료 접근법을 개발하는 것이 필수적입니다.
실험적 피부 상처 동물 모델 중에서 피부 절제술은 상처 치유 모델을 구축하는 데 가장 적용 가능한 기술입니다2. 이러한 모델은 출혈, 염증 반응, 육아 조직 형성, 재상피화, 혈관 형성 및 조직 리모델링을 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다3. 절제성 상처는 주로 동물의 등 부위에서 정의된 피부 영역을 외과적으로 제거하여 생성합니다. 자발적인 치유를 방지하기 위해 상처는 임계 크기(critical size)여야 합니다. 이러한 임계 크기 절제성 상처는 다양한 화학 물질, 세포 또는 생체 재료의 국소 도포와 이들이 치유 과정에 관여하는 바를 조사하기 위한 직접적인 접근 방법을 제공합니다4,5.
설치류와 인간의 피부는 지혈, 염증, 증식 및 재형성을 포함한 상처 치유의 세포 및 분자 단계 에서 유사성을 공유합니다. 쥐(rat)와 생쥐(mouse)는 확보가 용이하고 크기가 작으며, 유전자 조작과 취급이 상대적으로 쉽기 때문에 상처 모델에서 가장 널리 사용되는 종입니다. 쥐는 생쥐보다 몸집이 더 크고 피부가 더 두꺼우며, 각질세포 층이 생쥐보다 더 많다는 점에서 여러 실질적인 이점을 제공합니다. 생쥐의 상처는 일반적으로 7일 이내에 치유되는 반면, 쥐의 경우 치유 과정을 약 12~14일에 걸쳐 평가할 수 있습니다6.
피부가 느슨한 설치류를 사용할 때 발생하는 주요 과제는 상처 수축입니다.3설치류의 피부는 판니쿨루스 카르노수스(panniculus carnosus) 층은 손상 후 수축하여 노출된 부위를 줄입니다. 이와 대조적으로, 인간의 상처는 수축 능력이 제한적이며, 치유를 위해 육아 조직 형성 및 재상피화에 의존합니다.7동물 모델의 한계를 극복하기 위한 한 가지 방법은 상처 부위 주변의 피부를 물리적으로 고정하거나 부목을 대는 것입니다.8상처 수축을 방지하기 위해 성공적으로 개발된 장치 중에는 티타늄 상처 챔버가 있었습니다.9하지만 챔버의 무게로 인한 동물 스트레스가 높고, 외과적 설치 과정이 복잡하며, 장치가 이탈하거나 감염이 발생할 가능성이 있고 비용이 많이 든다는 단점이 있었습니다. 부목 고정 상처 모델(splinted wound model)의 개념은 Galiano 등에 의해 도입되었습니다.10 2004년에 상처 가장자리에 단단한 실리콘 링을 봉합함으로써 이루어졌습니다. 이 접근 방식은 상처 수축을 현저히 감소시킵니다.11하지만 몇 가지 단점과 한계가 있으며, 이는 주로 다음과 같은 점에 집중되어 있습니다. 연조직 손상 가능성, 높은 부목 이탈률, 그리고 불완전한 상처 치유 등이 발생할 수 있습니다. 부목(강성 실리콘 링 등)은 특히 잘못 적용되었을 경우 주변 피부에 과도한 압박을 가해 허혈, 자극 및 괴사를 유발할 수 있습니다. 실리콘 부목은 동물의 움직임이나 그루밍으로 인해 훼손, 파손 또는 이탈되는 경우가 빈번합니다. 8,11불균일한 봉합은 종종 상처 주변에 불균등한 장력을 유발하여 일관되지 않은 치유로 이어집니다. 본 모델에서는 니트릴 부타디엔 고무(Nitrile Butadiene Rubber, NBR) O-링 주변에 8~12개의 단순 단속 폴리아미드 봉합사를 균일하게 배치하여 피부 상처 가장자리에 봉합합니다. 이러한 접근 방식은 앞서 언급한 위험을 최소화하고 상처 수축을 충분히 제한함으로써, 인간의 상처 치유 과정과 유사하게 육아 조직 형성 및 재상피화를 통해 상처가 치유되도록 할 것으로 기대됩니다. 이러한 치유 메커니즘은 동물 모델에서 얻은 연구 결과를 임상 응용으로 전환하는 것을 용이하게 할 것입니다.
습윤 상처 치유 이론은 1962년 George D. Winter에 의해 상처 치료 제품 설계를 위한 개념으로 도입되었습니다12. 이 이론을 바탕으로 지난 수십 년 동안 거즈, 투명 필름, 폼, 하이드로젤과 같은 다양한 상처 드레싱이 개발되었습니다13. 한편, 누출을 방지하고 보호하기 위해 1974년에 성형 가능한 하이드로콜로이드 장루 보호 링 씰(barrier ring seal)이 설계 및 개발되었습니다. 이는 상처 경계면에 맞게 쉽게 모양을 잡고 성형할 수 있으며, 특히 장루 관리 응용 분야에서 유용합니다. 이 모델에서는 응집성 씰을 상처 외부에 부착하며, 멸균 투명 필름과 함께 사용하여 치료 중인 피부 상처 환자의 임상 상황을 모방한 습윤 챔버를 생성함으로써 상처의 상피화를 촉진하고 국소 제제(예: 세포, 생체 재료, 화합물)의 누출을 방지합니다.
상처 드레싱은 상처 부위를 물리적 외상과 미생물 감염으로부터 보호하는 데 매우 중요합니다. 쥐는 드레싱에 대한 내성이 낮아 쥐 모델에서의 상처 드레싱은 항상 까다로운 작업이었습니다. 쥐는 마취에서 깨어나자마자 드레싱을 물어뜯거나 찢어 제거하는 경우가 빈번합니다. 이로 인해 세포나 의약품과 같은 국소 도포제의 유지 및 외부 병원균과 오염 물질로부터의 상처 보호가 불가능해집니다. 이는 특히 생물학적 제제 테스트, 세포 기반 치료 및 첨단 치료 의약품과 같이 무균 환경이 필요한 연구에서 설치류 모델이 해결해야 할 또 다른 과제입니다. 본 모델에서는 폼 드레싱과 접착 테이프를 사용하여 습윤 챔버를 덮었습니다. 그 후, 쥐가 붕대를 제거하거나 훼손하는 것을 방지하기 위해 탄력성 튜브 붕대, 고정 붕대 및 마이크로포 수술용 테이프를 사용하여 이중 어깨 교차 드레싱을 적용하였습니다.
여기에 보고된 모델은 여러 다른 프로토콜의 요소들을 결합하여 수년에 걸쳐 개발되었습니다. 본 연구의 목적은 동물에게 무리가 가지 않는 습윤 챔버를 사용하여 쥐의 절제 창상 모델을 구축하고, 특히 액체 형태의 민감한 국소 도포 물질의 테스트를 용이하게 하는 것이었습니다.
프로토콜
아래에 제시된 모든 동물 실험 절차는 스웨덴의 Linköping 윤리위원회(Dnr 5163-2023)의 승인을 받았습니다. 사용된 시약 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 실험정신 활동을 하는 동물들
- 8~14주령의 성체 수컷 Sprague Dawley 랫드를 사용하십시오.
- 실험 전, 표준 식단을 제공하며 12시간 명/암 주기 조건에서 랫드를 최소 1주일 동안 적응시키십시오.
2. 수술 전 준비
- 1.0–1.5 L/min의 산소와 혼합된 1.5%–2.5% isoflurane(유도 시 4.5%)을 사용하여 동물을 마취합니다. 동물을 따뜻하게 유지하기 위해 가열 패드 위에 복와위(prone position)로 눕힙니다. 안구를 보호하기 위해 안구 윤활제를 도포하고, 수술 후 통증 완화를 위해 식염수에 희석한 0.05 mg/kg의 Buprenorphine을 동물의 등 부위에 피하 투여합니다.
참고: 동물과 패드 사이에 일회용 패드를 얇게 깔아 격리하는 것이 중요합니다.
주의: Isoflurane은 중추 신경계 억제제이자 호흡기 자극제입니다. 증기 노출을 방지하기 위해 활성 폐가스 회수 시스템이 장착된 교정된 기화기를 사용하십시오. - 전동 클리퍼를 사용하여 목 기저부부터 아래로 약 10 cm까지 등 부위를 제모합니다. 제모 부위를 chlorhexidine과 70% ethanol로 두 번 철저히 세척한 후, 세척된 부위만 노출되도록 천공된 수술용 드레이프로 동물을 덮습니다.
3. 절제 상처 생성
- 가위와 포셉 등 적절한 멸균 수술 도구를 사용합니다.
- 수술용 네임펜과 템플릿을 사용하여 목 기저부에서 꼬리 쪽으로 약 4 cm 떨어진 지점에 지름 10 mm의 원을 그립니다.
- 포셉으로 표시된 피부의 중앙을 잡고 가위로 표시된 피부 조직을 절제합니다. 상처의 깊이는 표층 근막까지 도달해야 합니다. 이는 피부 전층을 분리했을 때 근육을 덮고 있는 반투명한 근막을 시각적으로 확인하여 판별할 수 있습니다.
- 피부 상처 가장자리에 NBR O-링을 배치하고 8~12바늘을 봉합하여 위치를 고정합니다. 링 고정의 목적은 피부 수축을 방지하는 것입니다. 12시 방향에 첫 봉합을 하고, 이어서 6시, 3시, 9시 방향 순으로 봉합하십시오. 8바늘을 봉합하는 경우, 기본 봉합 지점들 사이의 중간 지점에 각각 봉합합니다(그림 1A).
- NBR O-링 외부에 응집성 씰(cohesive seal)의 접착 특성을 이용하여 도포하고, 멸균 투명 접착 필름과 함께 습윤 챔버를 형성합니다(그림 1B). 이 단계에서 상처는 NBR O-링으로 지지되며, 도포 챔버의 측벽은 피부 가장자리와 응집성 씰로 형성되고, 바닥은 노출된 상처 표면이, 천장은 투명 필름이 형성하게 됩니다.
- 상처를 필름 한 층으로 덮은 후, 필름을 통해 상처 표면에 치료 용액(세포 용액 또는 화합물 용액)을 투여합니다. 설명된 크기의 챔버에는 100 µL가 쉽게 수용됩니다.
- 치료제가 누출되는 것을 방지하기 위해 주입 부위를 필름 한 층으로 더 덮습니다(그림 1C).
- 필름을 보호하기 위해 부드러운 실리콘 붕대로 필름을 덮습니다(그림 1D).
- 접착 테이프를 붙이고(그림 1E), 고정 붕대와 마이크로포 수술용 테이프를 사용하여 쥐의 몸 주변을 더블 숄더(double-shoulder) 구성으로 탄력성 관형 붕대로 감쌉니다(그림 1F–H).
- 쥐가 드레싱을 뜯어내는 것을 방지하기 위해 쥐의 발톱을 다듬습니다.
- 마취를 깨우기 전, 식염수에 희석한 carprofen (5 mg/kg 체중)을 동물에게 피하 투여합니다.
4. 수술 후 절차
- 동물이 마취에서 깰 때까지 담요로 덮어 가열 패드 위에 둡니다. 동물들이 서로를 물거나 드레싱을 제거하는 것을 방지하기 위해 개별 케이지에 넣거나 칸막이가 있는 단일 케이지에 배치합니다.
- 수술 후 통증 관리를 위해 다음 날 아침, 생리식염수에 희석한 carprofen 5 mg/kg(체중당)을 피하 투여합니다. 쥐의 수술 후 통증이나 체중 감소 여부를 매일 모니터링해야 하며, 필요한 경우 진통제를 추가 투여할 수 있습니다.
5. 상처 측정 및 드레싱 교체
- 상처 수술 후 첫 일주일 동안 매일 각 동물을 관찰하십시오 . 동물이 움직이는 데 어려움을 겪거나 불편함을 보이면 드레싱 상태를 점검하고 수정해야 합니다.
- 7일째에 단계 2.1에서 설명한 대로 동물을 마취시킨 상태에서 드레싱을 교체하십시오.
- 피부에서 드레싱 커버를 조심스럽게 제거하십시오. 크기 비교를 위해 자와 함께 상처 부위를 촬영합니다. 상처 표면적을 평가하기 위해 Fiji/ImageJ 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석했습니다.
- 연구자의 필요에 따라 측정 또는 기타 절차를 수행하십시오.
- 단계 3.8–3.11과 같이 깨끗한 드레싱을 적용하고, 단계 4.1에서 설명한 대로 동물이 회복되도록 하십시오.
6. 상처 수집 및 안락사
- 14일 차에 2.1항에 언급된 대로 마취를 실시하거나, 별도의 구체적인 실험 계획에 따라 마취합니다. 드레싱을 제거하고 상처 부위의 사진을 촬영합니다.
- 드레싱을 제거하고 상처 부위의 사진을 촬영합니다.
- 상처 피부 조직을 수집합니다. 메스를 사용하여 일부 건강한 조직을 포함하여 상처 주변의 피부를 절제합니다.
- 절제한 조직을 2 mL 튜브에 넣고 액체 질소로 급속 냉동하여 추후 분자 분석에 사용하거나, 조직학적 분석을 위해 실온에서 4% 완충 포름알데히드에 보관합니다. 또는, 두 가지 분석을 모두 수행하기 위해 절제 부위를 두 조각으로 나눕니다.
- 상처 조직을 제거한 후, 윤리 승인 내용에 따라 CO2 흡입 또는 대체 방법으로 동물을 안락사시킵니다.
주의: CO2는 의식을 잃기 전까지 통증, 괴로움 및 점막의 급격한 산성화를 유발합니다. 챔버 내부의 공기를 치환하기 위해 조절된 유량계를 사용하십시오.
7. 조직화학 염색: 상처 고정, 포매 및 절편 제작
- 상처 조직 생검 시료를 4% formaldehyde 용액에 넣고 상온에서 3시간 동안 고정한 후, 4 °C에서 하룻밤 동안 보관한다.
주의: Formaldehyde는 독성이 있으며, 강력한 감작제이자 알려진 인체 발암 물질이다. 개인 보호 장구를 착용한 상태로 화학 흄후드 내에서 용액을 취급해야 한다. - 생검 시료를 PBS로 각각 30분씩 두 번 세척한다.
- PBS를 에탄올(70%)로 교체하고 4 °C에서 보관한다.
- 항원 손실을 방지하려면 처리 전 최대 24–48시간 동안 생검 시료를 보관하고, 단순한 조직학적 특성 분석을 위한 경우에는 1–2주 동안 보관한다.
- 흐르는 수돗물로 생검 시료를 충분히 세척하여 잔류 formaldehyde를 제거한다.
- 다음 순서의 에탄올 배스에서 조직을 탈수한다: 70% 에탄올에서 20분, 95% 에탄올로 2회 교체하여 각각 20분, 100% 에탄올로 2회 교체하여 각각 20분.
- 생검 시료를 파라핀 배스의 65 °C 온도에서 유지한다.
- 녹은 파라핀을 지정된 몰드에 붓고 생검 시료를 중앙에 배치한 후, 냉각되어 응고되도록 둔다. 절편 제작 시 모든 피부층을 시각화할 수 있도록 생검 시료를 몰드 표면에 수직으로 배치해야 한다.
- 파라핀으로 포매된 조직 블록을 마이크로톰을 사용하여 5 μm 두께로 절편화하고, 탈이온수가 담긴 39 °C 수조에 띄운다.
- 절편을 슬라이드로 옮겨 건조시켜 조직이 슬라이드 표면에 부착되도록 한다. 슬라이드는 나중에 사용하기 위해 4 °C에서 보관하거나 즉시 조직화학 염색을 진행할 수 있다.
8. 헤마톡실린 및 에오신(HE) 염색
- 60 °C 핫플레이트에서 30분 동안 슬라이드의 왁스를 제거한 다음, 자일렌(또는 대체제)을 3회 교체하며 각각 5분씩 처리하고, 이어서 PBS를 1회 교체하며 2분 동안 처리한다.
주의: 자일렌은 독성이 있고 인화성이 매우 높다. 표준 개인 보호 조치를 적용하여 흄 후드 내에서 용액을 취급하십시오. - 100% 에탄올, 96% 에탄올, 그리고 dH2O 순으로 각각 5분씩 처리하여 재수화를 수행한다.
- 헤마톡실린 염색을 5분 동안 수행한 후, 흐르는 수돗물로 5분 동안 세척한다.
- 0.3% 산성 알코올(70% 에탄올 내 0.3% 염산)에 몇 차례 담가 분별 염색을 수행한 후, 흐르는 수돗물로 5분 동안 세척한다.
- Eosin Y (0.2%)로 30초 동안 염색한 후, 흐르는 수돗물로 5분 동안 세척한다.
- 96% 에탄올에서 1분, 100% 에탄올에서 1분 동안 탈수한다.
- 마운팅 매질을 몇 방울 떨어뜨린 후 커버슬립을 덮는다.
- 광학 현미경으로 슬라이드를 관찰하고 디지털 사진을 촬영한다.
결과
쥐 절제 상처 모델 수술은 효율적으로 수행했을 때 동물당 약 30분이 소요되었습니다. 모델 제작, O-링 고정 및 드레싱의 각 단계는 그림 1에 나와 있습니다.
그림 2는 7일째와 14일째의 상처 치유 진행 과정을 보여줍니다. 상처 반지름은 mm 단위로 측정하였으며, 표면적은 공식(면적 = πr2)을 사용하여 계산하였습니다(0일째 r = 5 mm). 상처 폐쇄 진행률은 14일째에 유도된 상처 면적 대비 덮이지 않은 면적의 백분율로 나타냈습니다. Fiji/ImageJ 소프트웨어를 사용하여 상처 부위의 디지털 이미지를 분석하였으며, 이미지에 포함된 자를 사용하여 스케일을 10 mm로 보정하였습니다(그림 2D). 상처 부위의 윤곽을 그려 측정하면 면적이 mm2 단위로 표시됩니다. 14일째의 잔여 상처 면적(29.4% ± 10.1%; n = 7)은 그림 3에 제시되어 있습니다.
14일 차 피부 상처의 HE 염색 결과가 그림 4에 제시되어 있습니다. 절편 분석 결과, 생검 조직은 주변부에서 중심부로 이어지는 피부 상처의 자연적인 치유 과정을 따르는 것으로 나타났습니다. 상처 치유는 불완전한 상태였으며, 중심부에는 얇은 표피층과 함께 정상적인 전형적 다층 구조가 결여되어 있었습니다. 진피에서는 생리적 치유 과정에 중요한 풍부한 염증 세포 침윤이 관찰되었습니다. 전반적으로 해당 모델은 동물에게 잘 내용되었으며, 피부 수축이 억제되고 불완전하지만 생리적인 치유가 일어났습니다.
그림 1: 절제 상처 생성 및 드레싱 절차. (A) 쥐의 등쪽 표면에 절제 상처를 생성하고, 상처 가장자리에 O-링을 봉합한 모습. (B) O-링 주변에 성형 가능한 하이드로콜로이드 배리어 링을 적용한 모습. (C) 하이드로콜로이드 배리어 링 위에 투명 접착 필름 드레싱을 두 겹으로 적용한 모습. (D) 투명 접착 필름 드레싱 위에 폼 드레싱을 배치한 모습. (E) 드레싱을 고정하기 위해 탄력 접착 테이프를 적용한 모습. (F–H) 쥐의 몸 주변에 튜브형 고정 붕대를 감은 후, 드레싱을 고정하기 위해 더블 숄더 구성으로 배치한 고정 붕대와 수술용 테이프. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 상처 치유의 대표 이미지. (A) 7일 차에 얻은 대표 상처 이미지. (B–D) 14일 차에 얻은 대표 상처 이미지로, O-링이 장착된 상태의 상처(B)와 O-링을 제거한 후의 상처(C,D)를 보여줌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 14일 차 상처 부위의 정량 분석. 상처 크기 감소를 보여주는 14일 차의 잔존 상처 면적 백분율. 데이터는 평균 ± 표준 편차(SD) (n = 7)로 표시됨. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 14일 차 상처 치유의 조직학적 평가. 10×, 20×, 40× 배율의 상처 조직 대표 헤마톡실린 및 에오신(HE) 염색 단면. 상처 중심부는 불완전한 재상피화를 보인 반면, 상처 가장자리는 생리학적 표피 치유를 나타냈다. 진피에는 정상적인 상처 치유 반응과 일치하는 풍부한 염증 세포가 포함되어 있었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
토론
난치성 피부 상처는 예상되는 시간 내에 정상적인 치유 단계를 거치지 않는 상처를 말하며, 혈관 부전, 당뇨병, 비만 등 여러 건강 문제의 이차적 결과일 뿐만 아니라 수술 절차, 외상 및 알레르기 반응으로 인해 발생할 수 있습니다14. 여러 관리 방법이 존재함에도 불구하고, 많은 환자가 적절하게 치유되지 않습니다. 따라서 세포 기반 치료법, 화학 물질, 식물 추출물 및 새로 발견된 화합물과 같은 새로운 치료 경로를 조사하는 것은 새로운 관리 전략을 식별하는 데 매우 중요합니다. 본 모델은 광범위한 상처 치유 연구에 적용될 수 있습니다. 약물, 세포 및 생물학적 치료법을 테스트하기 위한 표준화된 프로토콜을 수립하면 전임상 상처 치유 연구를 촉진할 수 있습니다. 여기에서 설명하는 절제성 상처 모델과 프로토콜은 연구에서 쥐 피부 상처 모델의 주요 한계점인 피부 수축과 상처 드레싱 문제를 해결합니다.
티타늄 스플린트는 생쥐 절제 상처 모델에서 상처 수축을 줄이기 위해 흔히 사용되지만, 그 적용에는 몇 가지 한계가 있습니다. 스플린트의 강성은 상처 및 주변 조직의 기계적 환경을 변화시키며, 이는 세포 반응, 염증 및 매트릭스 리모델링에 영향을 줄 수 있습니다. 그 결과, 치유는 처리되지 않은 설치류 피부와는 다른 조건에서 일어납니다. 수축을 제한함으로써 인간의 상처 폐쇄와의 비교 가능성을 높일 수 있지만, 스플린트에 의해 가해지는 기계적 제약은 치유 과정에 영향을 주는 인위적인 변수를 도입할 수 있으므로 실험 결과를 해석할 때 이를 반드시 고려해야 합니다15.
이를 위해, 피부 수축을 제한하고자 모델에 NBR O-링을 사용하였으며, 이를 원래의 상처 가장자리에 고정하였습니다. 동물들은 이 링에 잘 적응하였으며, 14일의 실험 기간 동안 위치가 안정적으로 고정되었습니다. 정성적으로 관찰했을 때 어떤 동물에서도 뚜렷한 상처 수축은 나타나지 않았으나, 향후 연구에서는 상처 가장자리에 문신을 새기거나 다른 정량적 방법을 사용한다면 상처 수축에 대한 평가를 더욱 강화할 수 있을 것입니다. 따라서 문신 작업은 본 프로토콜에서 선택적인 단계로 고려될 수 있습니다.
드레싱의 적용은 상처 부위의 치료 상태를 유지하면서 오염과 감염으로부터 상처를 보호하며, 이는 피부 상처 치유 모델에서 매우 중요합니다. 하지만 일부 동물들이 다양한 유형의 드레싱을 제거하는 경우가 드물지 않습니다. 쥐는 상처 부위를 자주 다듬거나 건드리는 습성이 있어, 접착 필름이나 2차 고정 방법을 사용하더라도 드레싱이 밀리거나 완전히 제거될 수 있습니다. 드레싱 덮개의 소실은 상처 환경을 변화시키고 치료제 전달에 영향을 주며, 동물 간의 변동성을 증가시킬 수 있습니다16. 본 모델에서는 드레싱이 동물에 의해 제거되거나 손상되지 않고 최대 7일 동안 온전하게 유지되었습니다. 실험 동물 모두에서 피부 상처 감염의 징후는 나타나지 않았습니다. 동물이 성장하고 체중이 증가함에 따라 드레싱이 꽉 조여질 수 있으므로, 드레싱을 매주 교체하는 것이 권장됩니다. 드레싱이 너무 헐거워 동물이 제거할 수 없도록 하면서도, 견고한 고정과 동물의 가동성 사이의 균형을 맞추는 데 주의를 기울여야 합니다.
본 프로토콜은 유연하며 사용자 맞춤 설정이 가능합니다. 빠른 회복과 높은 안전성을 위해 isoflurane 흡입 마취를 권장하지만, isoflurane 기화기를 사용할 수 없는 경우 ketamine/xylazine과 같은 주입형 마취제를 대안으로 사용할 수 있습니다. 본 연구에서는 수컷 쥐만 사용하였으나, 이 프로토콜은 암컷 쥐에게도 동일하게 적용 가능합니다.
통증 완화 효과를 높이기 위해 buprenorphine을 carprofen과 함께 투여하는 것을 권장합니다. buprenorphine은 작용 시간이 비교적 길기 때문에 단독으로도 적절한 수술 후 진통 효과를 제공할 수 있습니다. 이 약물은 다른 오피오이드에 비해 면역 기능에 미치는 영향이 미미하여 염증 과정에 따른 상처 치유에 유리합니다17. 염증을 억제하고 통증을 줄이는 비스테로이드성 항염증제는 염증을 연구할 때는 피해야 합니다. 본 연구에서는 동물당 하나의 상처를 만들었으나, 연구자는 윤리적 승인 및 실험 설계에 따라 동일한 프로토콜을 사용하여 추가 상처를 만들 수 있습니다. 동물 복지 고려 사항과 3R 원칙을 신중하게 고려해야 합니다. 연구자는 동물 모델을 사용할 때 3R 원칙(대체, 감소, 개선)을 준수하고 동물 복지를 존중해야 합니다. 수술 절차는 가이드라인과 일치해야 하며 승인된 동물 프로토콜을 엄격히 따라야 합니다. 본 연구에서 상처 치유는 상처 면적 측정과 조직학적 평가를 통해 분석했으며, 재상피화는 치유 반응의 한 구성 요소로 간주되었습니다. 링 고정과 관련된 봉합사의 존재는 국소 치유를 방해할 수 있습니다. 봉합사의 수는 동물 간에 일관되어야 합니다. 상처 면적 평가는 봉합 부위를 포함한 모든 생성 부위를 포함해야 합니다18. 이 모델은 허혈, 당뇨, 노화와 같이 피부 상처와 관련된 다양한 기저 질환을 포함하도록 발전시킬 수 있습니다. 본 연구의 주요 한계점은 비부목(non-splinted) 대조군의 부재, 상처 수축에 대한 정량적 평가 부족, 그리고 상처 면적 평가와 기술적 조직학 외에 정량적 생물학적 결과 측정치가 제한적이었다는 점입니다. 이 모델을 개발하는 동안 다양한 기술적 문제와 문제 해결 과정이 나타났습니다. 동물 복지와 성공적인 상처 치유를 위해서는 보호 조끼/드레싱을 적절하게 착용하는 것이 필수적입니다. 드레싱이 헐거우면 마취 회복 후 동물이 제거할 수 있으며, 반대로 너무 꽉 조이면 움직임을 제한하거나 혈액 순환을 방해하고 호흡에 영향을 줄 수 있습니다. 드레싱과 피부 사이에 손가락 하나(작은 쥐의 경우 새끼손가락)가 들어갈 정도의 충분한 공간이 있어야 합니다. 동물을 매일 모니터링하고, 불편함, 가동성 저하 또는 비정상적인 자세가 관찰되면 드레싱을 조정해야 합니다. 수술 후 통증 관리는 진통제 민감도 차이로 인해 개체마다 다를 수 있습니다. 구부정한 자세, 활동 감소, 식욕 저하, 체중 감소 등 통증 관련 징후가 있는지 정기적으로 평가해야 합니다. 기관 가이드라인에 따라 필요한 경우 추가 진통제를 제공해야 합니다. 상처 수축을 방지하려면 링의 일관된 고정이 매우 중요합니다. 8–12개의 단순 중단 봉합사는 인장력을 균일하게 분산시키고 들뜸이나 변형을 방지하기 위해 링 주변에 고르게 배치해야 합니다. 각 봉합사는 회복 중 헐거워지는 것을 최소화하기 위해 외과의 매듭(surgeon’s knot)으로 고정해야 합니다. 마지막으로, 변동성을 최소화하기 위해 한 연구 내에서는 동일한 계통, 연령, 체중 및 성별의 쥐를 사용할 것을 권장합니다. 또한, 숙련된 동일한 연구자가 모든 수술 절차를 수행하는 것이 좋습니다. 편향을 피하기 위해 조직학 및 분자 분석에는 이중 맹검법을 사용할 것을 권장합니다.
공개 사항
저자들은 공개할 사항이 없습니다.
감사의 글
저자들은 본 연구에 연구비를 지원해 준 Östergötland 지역 정부에 감사드립니다. 또한 동물 모델 구축 과정에서 제언과 지원, 도움을 준 린셰핑 대학교(Linköping University) CBR의 Anders Delleskog 씨에게 감사드립니다. 아울러 피부 조직 임베딩, 절편 제작 및 HE 염색 과정에서 지원과 지도를 제공해 준 린셰핑 대학교 핵심 시설(Core Facility)의 Maria Ntzouni 박사에게도 감사드립니다. R의 Sallam Abdallah에게 특별한 감사를 전합니다.&피부 및 배양 세포용 #38;D 장치, 린셰핑 대학교(Linköping University), 피부 시료 준비 및 HE 염색용.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 부프레노르핀 | Salfarm Scandinavia | 451790 | 농도 0.3 mg/mL |
| 카프로펜 | Zoetis Animal Health | 191380 | Rimadyl 50 mg/mL |
| 이킨 씰(Eakin seal) | Swemed | 2076152 | 두께 3 mm |
| 포매기 | Leica Biosystems | EG1150 H&C | |
| 에오신 | 히스토랩(Histolab) | 1650 | 0.2% 색소 용액 |
| 절대 에탄올 | Solveco | 1015 | 분석 등급 |
| 고정 붕대 | Swemed | 2048934 | 4cm x 4m PA/비스코스 |
| 포름알데히드 | 히스토랩(Histolab) | 2176 | PBS 내 4%, pH 7.2-7.4 |
| 모발 절단기 | 스웨벳 | F95000 | 절단 길이: 0.5 mm |
| 헤마톡실린 | 히스토랩(Histolab) | 1800 | Harris HTX |
| Histolab-Clear | 히스토랩 | 14250 | 자일렌 대체제 |
| 이소플루레인 | VM Pharma | 448210 | Attane vet 1000 mg/g |
| Lekotape | Swemed | 2056774 | |
| Mepilex | Swemed | 2059125 | 7.5x8.5cm |
| Mepore 필름 | Swemed | 2057753 | 프레임 포함 6x7cm |
| 마이크로포어 수술용 테이프 | Swemed | 2063856 | 1.2cm x 9.1m |
| 마이크로톰 | Thermo Fisher Scientific | 387861 | Microm HM355S |
| 봉입제 | 히스토랩(Histolab) | 00840-05 | Pertex |
| O링 | 루일로고드 | 제시된 텍스트가 "B0B1TRQBRT"라는 무작위 문자열 또는 코드 형태이므로, 번역할 수 있는 언어적 내용이 없습니다. 원본 텍스트를 다시 확인해 주시기 바랍니다. | 내경 11mm 폭 1mm |
| 봉합사 (ethilon 4-0) | Scandivet | 21274-A | 비흡수성 폴리아미드 |
| 조직 탈수 | Leica Biosystems | Leica TP1020 | |
| Tubifast 2방향 신축성 제품 | Swemed | 2069292 | 7.5cm x 10m PES/PA |
참고문헌
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