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방법 논문

해부학적 지표를 이용한 마우스 심근경색 모델에서의 좌전하행관상동맥 정밀 결찰

180 조회수

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DOI:

10.3791/72336

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2026년 8월 18일

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1Department of Cardiovascular Medicine, Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital, 2National Traditional Chinese Medicine Clinical Research Base, Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital, 3Key Laboratory of Medical Electrophysiology, Ministry of Education & Medical Electrophysiological Key Laboratory of Sichuan Province (Collaborative Innovation Center for Prevention of Cardiovascular Diseases), 4School of Integrated Traditional and Western Medicine, Southwest Medical University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 정확한 봉합 위치 선정을 위해 전심실구(anterior interventricular sulcus)를 재현 가능한 표면 지표로 활용하여, 좌전하행관상동맥을 영구적으로 결찰함으로써 마우스에서 심근경색을 유도합니다. 경색 여부는 심전도, 심초음파, 조직학적 염색 및 혈청 바이오마커 분석을 통해 검증합니다.

초록

좌전하행(LAD) 관상동맥의 영구 결찰은 전임상 심혈관 연구에서 심근경색(MI) 마우스 모델을 구축하기 위해 가장 널리 사용되는 방법입니다. 그러나 기존 프로토콜에서는 결찰 부위를 일반적으로 좌심방 부속기 아래 1–2 mm 지점에 설정하는데, 이는 수술 중 신뢰성 있게 식별하기 어려운 지표인 경우가 많습니다. 여기에 마우스 관상동맥 구조의 상당한 개체 간 변동성이 더해져, LAD 위치 파악이 부정확해지고 결찰 부위가 불일치하며, 실험자 간 재현성이 떨어지는 결과가 빈번하게 발생합니다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 본 프로토콜에서는 LAD 결찰의 안내 지표로 전심실간구(AIS)를 도입합니다. AIS는 현미경 하에서 직접 보일 정도로 얕은 표면 홈이며, LAD가 바로 그 아래에 위치합니다. 기존 방식과 달리 AIS는 결찰 부위를 더 일관되게 선택할 수 있도록 돕는 안정적인 해부학적 기준을 제공하며, 숙련되지 않은 실험자도 쉽게 식별할 수 있습니다. 본 프로토콜은 표준화된 이소플루레인 흡입 마취와 비침습적 기관 내 삽관을 결합하며, 심전도, 심초음파, 효소결합면역흡착측정법(ELISA), 조직병리학적 염색 및 3차원 관상동맥 영상을 통해 MI를 검증합니다. 본 프로토콜은 MI 이후의 병태생리학적 및 면역학적 변화를 조사하기 위해 마우스에서 MI를 유도하는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 실험 방법을 제공합니다.

서론

전 세계적으로 심혈관 질환의 이환율과 사망률의 주요 원인 중 하나인 심근경색(MI)은 인류 건강에 상당한 위협이 되고 있습니다1. 갑작스러운 발병, 위중한 임상 경과, 높은 치사율이 특징인 심근경색은 주로 관상동맥의 혈전성 폐색으로 인해 발생하며, 이는 심각한 심근 허혈, 이어지는 심근세포 괴사, 그리고 부정맥, 심부전, 급성 심장사 등을 포함한 일련의 합병증으로 이어질 수 있습니다2. 임상 심장학의 괄목할 만한 발전에도 불구하고, 인간의 심근 조직에 대한 접근성이 제한적이어서 심근경색의 근본적인 병태생리학적 메커니즘 연구와 효과적인 치료 전략 개발에 여전히 어려움이 있습니다3. 따라서 심근경색의 임상적 특징과 진행 과정을 충실히 재현하는 신뢰성 있고 재현 가능하며 임상적으로 유의미한 in vivo 동물 모델은 메커니즘 연구 및 전임상 치료 평가를 위해 필수적입니다.

1954년 Johns와 Olson이 마우스 MI 모델을 처음으로 확립한 이후, 마우스에서 MI를 유도하는 방법론은 지속적으로 개선되어 왔습니다4. 직접적인 현미경 시각화 하에서 좌전하행(LAD) 관상동맥을 영구적으로 결찰하는 방법은 국소 심근 허혈, 심근 괴사, 경색 후 심실 리모델링을 포함하여 인간 MI의 주요 병리학적 특징을 재현하므로 가장 널리 채택되는 기술이 되었습니다5. 그러나 전통적인 LAD 결찰은 일반적으로 광범위한 훈련을 통해서만 습득할 수 있는 상당한 미세수술 전문 지식을 필요로 하며, 이는 연구자 및 실험실 간의 절차적 일관성과 재현성을 제한합니다6. 또한 출혈, 폐 손상 또는 허탈, 결찰 위치 오류, 부적절한 환기로 인한 기계적 조직 손상을 포함한 수술 중 및 수술 후 합병증은 상대적으로 높은 주술기 사망률의 원인이 되어, 이 모델의 광범위한 적용을 더욱 제한합니다7. 이러한 한계에 대응하여 Gao 등은 심장 외반을 통한 LAD 결찰을 포함하는 수정된 기술을 도입하였으며, 이는 수술 절차를 단순화하고 모델 확립을 위한 기술적 장벽을 낮추었습니다8. 관상동맥 냉동 손상 및 약물 유도 심근 손상을 포함한 추가적인 실험적 접근법 또한 특정 연구 응용 분야를 위해 개발되었습니다9,10. 그럼에도 불구하고, 직접 시각화 하에서의 영구적 LAD 결찰은 경색 크기와 위치를 조절하여 유도할 수 있으면서 인간 MI의 주요 병태생리학적 특징을 가장 유사하게 재현하기 때문에 여전히 선호되는 방법으로 남아 있습니다.

광범위하게 사용되고 있음에도 불구하고, 전통적인 LAD 결찰법은 결찰 부위 식별의 가변성, 절차적 불일치, 상대적으로 높은 수술 전후 사망률, 그리고 재현성의 실험실 간 편차로 인해 제한적이며, 이는 모두 실험 결과의 신뢰성과 비교 가능성에 영향을 미칠 수 있습니다11. 본 프로토콜의 전반적인 목표는 혈관 위치 파악을 위한 외부 해부학적 지표로 전심실구(anterior interventricular sulcus, AIS)를 사용하여, 마우스에서 영구적 LAD 결찰을 위한 보다 표준화되고 재현 가능한 방법을 확립하는 것입니다. 이 프로토콜은 좌심방이(left atrial appendage) 하단의 고정된 거리를 통해 결찰 부위를 추정하는 대신, 현미경 시야에서 직접 보이며 LAD 위에 위치한 얕은 표면 홈인 AIS를 결찰 안내를 위한 안정적인 해부학적 기준점으로 식별합니다. 전통적인 지표 기반의 추정 방식과 비교하여, 이 접근법은 결찰 부위의 보다 일관된 선택을 용이하게 하고, 시술자 간의 편차를 줄이며, 표준 마우스 MI 절차와의 호환성을 유지하면서 숙련도가 낮은 외과 의원의 접근성을 높이는 것을 목적으로 합니다. 따라서 본 프로토콜은 심근 손상, 심실 리모델링, 염증 및 관련 심혈관 질환 기전 연구를 위한 영구적 MI 모델 생성에 있어 재현 가능한 수술 방법을 찾는 연구자들에게 적합합니다.

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프로토콜

동물을 대상으로 하는 모든 실험은 Southwest Medical University 동물실험센터 윤리위원회의 승인 하에 수행되었습니다(승인 번호: SWMU20240146). 본 연구에는 8~10주령이며 체중이 20.0 ± 3.0 g인 수컷 C57BL/6J 마우스(특정 병원균 제거 [SPF])가 사용되었습니다. 실험 시작 전 표준 실험실 조건(22°C ± 2°C, 12시간 명기/12시간 암기 주기)에서 마우스를 1주일 동안 적응시킵니다.

1. 수술 전 준비

  1. 수술 당일 핀셋, 안과용 가위, 니들 홀더, 마이크로 모스키토 지혈집게, V자형 눈꺼풀 견인기, 바늘이 달린 3/8원 7-0 나일론 봉합사, 6-0 나일론 봉합사 및 5-0 나일론 봉합사를 포함한 모든 수술 기구를 준비하고 멸균한다. 모든 금속 기구는 시술 전 121°C에서 20분 동안 오토클레이브하고, 동물 간 교체 시에는 유리구슬 멸균기(250°C에서 15초)를 사용하여 재멸균한 후 멸균 패드 위에서 냉각시킨다. 봉합사는 밀봉된 멸균 포장 제품을 사용한다.
  2. 무균 기술을 유지하기 위해 두 개의 별도 작업 영역을 설정한다. 한 영역에는 핀셋, 마우스 기도 삽관 키트 및 마취기를 준비하고, 두 번째 멸균 수술 영역에는 멸균된 기구, 면봉, 포비돈-아이오딘 및 멸균 거즈를 준비한다.
  3. 흉부 부위에 제모 크림을 1분 동안 도포한다. 멸균 증류수 또는 식염수를 적신 멸균 거즈를 사용하여 크림과 털을 부드럽게 제거한다.
    1. 제모만으로는 수술용 피부 준비가 완료된 것이 아니다. 마우스를 마취하고 삽관하여 수술 플랫폼에 고정한 후, 피부 절개 직전(단계 2.6)에 최종적인 무균 피부 소독 및 멸균 드레이핑을 수행한다.
  4. 수술 1시간 전에 세파졸린(300 mg/kg)을 복강 내 주사로 투여한다. 주사용 세파졸린 나트륨을 멸균 0.9% 식염수에 녹여 30 mg/mL의 작동 농도로 조제하고, 목표 용량을 맞추기 위해 체중 20 g당 약 0.2 mL를 투여한다. 수술 후 5일 동안 매일 1회 투여를 계속한다.
    참고: 본 프로토콜에서는 전신 또는 국소 약물 지혈제를 투여하지 않는다. 수술 중 지혈은 멸균 면봉으로 10–30초 동안 또는 출혈이 멈출 때까지 부드럽게 지속적인 압박을 가하여 수행한다.

2. 마취 유도 및 기관 삽관

  1. 마우스를 마취기에 연결된 유도 챔버(16 × 10 × 11 cm)에 넣는다. 운반 가스 유량을 0.5 L/min으로 설정하고 3.5%–4.0% isoflurane으로 마취를 유도한다.
    참고: 발Withdrawal 반사가 없는 것을 확인하여 적절한 마취 상태인지 확인한다. 이 설정에서 마우스는 일반적으로 2–4 min 이내에 수술 가능 마취 단계에 도달한다.
  2. 마취된 마우스를 마우스 기관 삽관 플랫폼 위에 앙와위(supine)로 배치한다. 머리와 목이 약 45° 각도로 신전되도록 상악 절치(upper incisors)를 플랫폼의 고무밴드에 걸어 마우스를 고정한다. 구강, 인두, 후두 축을 정렬하여 성문(glottis)이 직접 보이게 한다.
  3. 구강 기관 삽관을 수행한다.
    1. 제어된 기계적 환기를 위해 기관 절개술 없이 직접 후두경 검사를 통해 구강 기관 삽관을 수행한다. 기관 내 튜브로 20 G 정맥 카테터(외경 약 0.9 mm, 길이 약 15 mm)를 사용한다.
    2. 입을 벌리고 핀셋을 사용하여 혀를 조심스럽게 한쪽으로 밀어낸다. 소동물용 후두경 블레이드를 혀의 등쪽을 따라 삽입하고 혀 뿌리 부분을 누른다.
    3. 후두개(epiglottis)가 보일 때까지 후두경을 진전시킨다. 후두경 핸들의 축을 따라 위쪽 및 앞쪽으로 들어 올려 후두개를 들어 올리고, V자 모양의 성문 개구부와 창백한 성대(vocal cords)를 노출시킨다.
    4. 성대를 직접 시각화한 상태를 유지하면서 흡기 중에 열린 성문을 통해 카테터를 진전시킨다. 카테터가 성문을 통과한 후 후두경을 제거한다.
    5. 카테터를 약 5–7 mm 깊이까지 진전시킨다. 스타일렛(stylet)을 제거하고 카테터를 인공호흡기에 연결한다.
      참고: 인공호흡기와 동기화된 대칭적인 양측 흉벽 움직임을 관찰하여 기관 내 튜브가 정확하게 배치되었는지 확인한다. 흉벽 움직임이 최소화되고 대신 리듬감 있는 복부 움직임이 나타나며 마취 정도가 점차 얕아지는 경우, 식도에서 카테터를 제거하고 삽관을 다시 수행한다.
    6. 성문을 시각화할 수 없는 경우, 후두경을 제거하고 머리와 목이 약 45°로 신전된 상태에서 마우스를 삽관 플랫폼에 다시 배치한다. 구강, 인두, 후두 축을 다시 정렬하고, 멸균 면봉으로 구인두 분비물을 제거한 후 후두경 검사를 반복한다. 마우스가 마취에서 깨어나는 징후를 보이면 유도 챔버로 되돌려 마취를 심화시킨 후 삽관을 다시 시도한다.
    7. 마우스에게 청색증, 후두 출혈 또는 지속적인 무호흡증이 발생하는 경우 절차를 중단한다. isoflurane 투여를 중단하고 마우스가 완전히 회복될 때까지 온도 조절 가열 패드(37°C) 위에 둔다.
    8. 기관 삽관에 실패한 경우 흉곽 절개술을 진행하지 않는다. 절차를 다음 세션으로 재편성하거나 해당 동물을 연구에서 제외하고 절차 실패로 기록한다.
      참고: 반복적인 삽관 시도는 후두 부종을 유발하여 수술 후 호흡 곤란의 위험을 증가시킬 수 있다. 대부분의 경우 성문을 직접 시각화한 후 처음 두 번의 시도 내에 삽관에 성공한다. 구강 기관 삽관 숙달에는 연습과 기술적 익숙함이 필요하다.
  4. 운반 가스로 공기를 0.5 L/min의 유량으로 공급하고 1.5%–2.0% isoflurane으로 마취를 유지한다. 인공호흡기의 호흡수를 130 breaths/min, 1회 호흡량(tidal volume)을 2 mL, 흡기-호기 비율을 5:4로 설정한다.
    참고: 인공호흡기에 설정된 1회 호흡량은 인공호흡기 회로의 압축 가능 부피와 기관 내 튜브의 사강(dead space)을 보정하기 때문에 체중으로 추정한 이론값보다 높다. 청색증 및 기흉, 피하 기종을 포함한 기압성 외상(barotrauma) 징후를 관찰하여 절차 전반에 걸쳐 환기 상태를 평가한다.
    1. 절차 전반에 걸쳐 마취 깊이를 지속적으로 모니터링한다. 2 min마다 호흡 패턴과 발Withdrawal 반사를 평가한다. 심전도(ECG)를 사용하여 심박수를 지속적으로 모니터링하고, 심박수가 400–500 beats/min으로 유지되도록 isoflurane 농도를 조절한다. 일반적으로 1.5%–2.0%의 isoflurane 농도로 충분하다. 절차 전반에 걸쳐 인공호흡기에 대항하는 자발적 호흡 노력, 수염의 움직임 및 점막 색깔의 변화를 관찰한다.
    2. 발Withdrawal 반사가 다시 나타나거나 수염의 움직임이 관찰되거나 인공호흡기에 대항하는 자발적 호흡 노력이 발생하는 경우, isoflurane 농도를 0.5%씩 증가시켜 최대 3.0%까지 올린다. 심박수가 350 beats/min 미만으로 떨어지면 isoflurane 농도를 0.5%씩 감소시켜 최소 1.0%까지 낮춘다. 이러한 징후가 관찰될 때마다 수술 절차를 일시 중단하고 심박수, 호흡 패턴, 점막 색깔 및 수염 움직임을 계속 모니터링하며, 생리학적 파라미터가 안정된 후에만 절차를 재개한다.
  5. 왼쪽 흉벽이 노출되도록 마우스를 왼쪽이 위로 오게 하여 오른쪽으로 기울인다. 접착 테이프를 사용하여 네 다리와 꼬리를 플랫폼에 고정한다.
  6. 포비돈-요오드(povidone–iodine)를 세 번 연속 도포하여 수술 부위를 소독한다. 각 도포 시 새로운 멸균 면봉을 사용하여 계획된 절개 부위부터 시작해 모든 방향으로 의도한 절개선 밖으로 약 1 cm까지 동심원 나선형으로 움직이며 닦는다. 각 도포 후 면봉을 버리며, 사용한 면봉을 수술 필드의 중심으로 다시 가져가지 않는다. 마지막 도포 후 완전히 자연 건조시킨 다음, 멸균 드레이프를 덮어 피부 절개 전에 수술 필드만 노출시킨다.

3. 흉강 절개 및 심장 노출

참고: 동물 배치, 흉곽 절개, 심장 노출, 좌전하행동맥(LAD) 결찰, 흉곽 폐쇄 및 수술 후 회복을 포함한 전체적인 수술 과정은 다음에서 설명되어 있습니다. 그림 1 및 그림 2.

결찰 지점과 관상동맥이 표시된 심장 해부도; 수술 부위 이미지.
그림 1: 전심실구(anterior interventricular sulcus)를 이용한 좌전하행 관상동맥 결찰 부위의 해부학적 위치. (A) 결찰 전 노출된 마우스 심장의 복측 뷰로, 전심실구(AIS)가 나타나 있다. (B) 좌전하행(LAD) 관상동맥 결찰 후 동일 부위의 뷰; 원형으로 표시된 영역이 결찰 부위이다. (C) AIS와 관상동맥 간의 공간적 관계를 보여주는 모식도. LAD는 AIS를 따라 주행하며, 결찰 지점은 이 구의 상단 1/3 지점에 위치한다. RCA, 우관상동맥; LCA, 좌관상동맥; LCX, 좌회선관상동맥. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

마우스 수술 절차 순서, 심장 노출, 실험 연구, 단계별 도식.
그림 2: 마우스의 전심실간구 유도 좌전하행 관상동맥 결찰 수술 절차. (A) 왼쪽 흉부 부위의 털을 제거한 후, 마취된 마우스를 배치하고 고정한다. (B) 왼쪽 흉벽 상단에 피부 절개를 실시한다. (C) 흉근을 분리하고 흉강 절개술을 위한 적절한 늑간 공간을 확인한다. (D,E) 늑간 공간을 확장하여 수술 부위를 노출시키기 위해 흉부 견인기를 삽입하고 배치한다. (F) 노출된 심장을 시각화하고 전심실간구(AIS)를 확인한다. (G) 7-0 나일론 봉합사를 AIS를 가로질러 좌전하행(LAD) 관상동맥 아래로 통과시킨다. (H) 봉합사를 고정하여 영구적인 LAD 결찰을 유도한다. (I) 흉부 견인기를 제거하고 흉벽을 닫는다. (J,K) 근육층과 피부층을 순차적으로 봉합한다. (L) 수술 후 마우스가 보온 상태에서 회복하도록 한다. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 안과용 가위를 사용하여 왼쪽 흉벽에 흉골의 장축과 평행하며 왼쪽 흉골 가장자리에서 약 2 mm 외측으로 1 cm 길이의 피부 종절개를 실시합니다. 하부의 흉근을 노출시킵니다.
  2. 미세 핀셋을 사용하여 대흉근과 소흉근을 근섬유 방향을 따라 둔하게 분리합니다. 늑골과 늑간 공간을 노출시키기 위해 근육을 외측으로 견인하며, 출혈을 최소화하기 위해 근육을 절단하지 않도록 주의합니다.
  3. 흉강을 열기 전 적절한 늑간 공간을 확인합니다. 늑골과 평행하게 늑간 공간 내로 주행하는 내흉동맥의 분지인 전늑간동맥의 위치를 파악하고, 제4 늑간 공간에서 가장 일관되게 관찰되는 동맥의 바로 두측에 위치한 제3 늑간 공간을 확인합니다.
  4. 전늑간동맥이 명확하게 보이지 않을 경우, 제1 늑골을 촉지하고 미측으로 세어 제3 늑골과 제4 늑골 사이의 공간을 확인합니다. 진행하기 전에 선택한 늑간 공간을 통해 좌심방이와 좌심실 전벽이 직접적으로 방해 없이 보이는지 확인합니다.
    참고: 제3 늑간 공간을 정확하게 확인하는 것이 필수적입니다. 흉벽 절개 부위가 잘못될 경우 심장 시각화가 제한되어 시술에 영향을 줄 수 있기 때문입니다.
  5. 왼쪽 제3 늑간 공간을 통해 흉강 절개를 실시합니다. V자형 안검 견인기를 사용하여 늑간 공간을 부드럽게 벌려, 수술 시야 내에 좌심방이와 좌심실의 상부 1/3이 명확하게 노출되도록 합니다.
    참고: 이 단계에서는 심장이 심낭에 덮여 있으므로 AIS를 확실하게 식별할 수 없습니다. AIS는 단계 4.2-4.3에 설명된 대로 심낭을 절개(단계 3.6)한 후에만 식별하십시오.
  6. 한 쌍의 미세 핀셋으로 심낭을 부드럽게 잡고 심근에서 들어 올립니다. 다른 미세 핀셋을 사용하여 심낭을 천천히 찢어 열어 심장을 완전히 노출시킵니다.

4. 랜드마크 가이드 기반 좌전하행지 관상동맥 결찰

  1. 6-0 나일론 봉합사를 흉벽에 통과시킨 후 부드럽게 견인하여 수술 시야를 넓힙니다. 결찰 부위를 확인하기 전에 AIS를 완전히 노출시킵니다 (Figure 1A).
  2. 심장 기저부에서 심첨부 방향으로 비스듬히 이어지며 좌심실과 우심실 사이의 표면 경계를 나타내는 얕은 홈인 AIS를 확인합니다 (Figure 1C). 현미경 하에서 좌심방이의 하단 가장자리로부터 약 1–2 mm 아래에 위치한 유사 원형의 함몰 부위로 확인합니다.
  3. AIS 확인이 어려운 경우, 따뜻한 식염수를 적신 면봉으로 심외막 표면을 부드럽게 닦아냅니다. 현미경으로 수술 시야를 다시 검토하여 홈을 더 명확하게 확인합니다.
    참고: 해부 현미경 하에서 AIS는 심실 간 경계를 해부학적으로 구분 짓는 쉽게 식별 가능한 얕은 홈이며, LAD 관상동맥이 그 바로 아래로 지나갑니다. 닦아낸 후에도 AIS가 불분명한 경우, 먼저 흉강 절개술을 통해 충분한 노출이 확보되었는지 확인하십시오. 그런 다음 이전에 보고된 방법에 따라 LAD를 직접 확인합니다. 동반된 심장 정맥과 비교했을 때, 동맥은 색이 더 분홍색이고 구경이 더 작으며 뚜렷한 박동성이 있습니다12.
    1. AIS 또는 LAD 관상동맥을 확인할 수 없는 경우, 먼저 흉강 절개술이 왼쪽 제3늑간을 통해 수행되었는지 확인하십시오. 필요한 경우 단계 3.3–3.5에 설명된 대로 흉강 절개 위치를 조정하고, 단계 4.1–4.3에 설명된 대로 AIS와 LAD 확인 과정을 반복합니다.
    2. 10분간의 세심한 검사 후에도 AIS 또는 LAD를 확인할 수 없는 경우, 조절되지 않는 출혈이 발생하는 경우, 전체 개흉 절차 시간이 20 min을 초과하는 경우, 또는 마취 깊이 조절에도 불구하고 심박수가 300 beats/min 미만으로 유지되는 경우 절차를 중단합니다. 마우스를 5% isoflurane으로 깊게 마취시킨 후 경추 탈구법으로 안락사시키고, 수술 결과 분석에 포함시키기 위해 해당 동물을 절차 실패로 기록합니다.
  4. AIS의 상단 1/3 지점의 홈을 가로질러 7-0 나일론 봉합사를 통과시킵니다 (Figure 1B). 바늘을 심외막 표면에 수직으로 약 0.5–1 mm 깊이까지 삽입하며, 진입점과 진출점은 홈의 반대편에 위치하고 홈의 최대 너비를 가로지르도록 배치합니다.
  5. 서전스 매듭(surgeon’s knot)을 사용하여 결찰을 고정합니다. 첫 번째 매듭 후에 국소 조직의 뚜렷한 함몰 없이 결찰 부위 원위부의 심근에서 즉각적인 창백화(blanching)가 일어날 때까지 결찰 강도를 조절합니다.
    참고: 관상동맥 혈류를 차단할 수 있을 정도로만 봉합사를 조이십시오. 과도한 장력은 인접한 심근을 손상시키거나 봉합사가 혈관 및 주변 조직을 절단하게 할 수 있습니다.
  6. 결찰 후 1 min 이내에 결찰 부위 원위부 심근의 반점형 허혈성 창백화를 관찰하여 관상동맥 폐쇄가 성공했는지 확인합니다12. ECG에서 ST분절 상승을 확인하여 폐쇄를 추가로 확증합니다.
  7. 허혈 부위가 지나치게 작거나 창백화가 나타나지 않는 경우, 결찰을 풀고 결찰 절차를 반복합니다.

5. 봉합 및 수술 후 회복

  1. V자형 눈꺼풀 견인기를 조심스럽게 제거한다. 바늘을 인접한 3번째와 4번째 갈비뼈 주변으로 통과시켜 3번째 늑간 공간을 다시 밀착시킨 후, 단일 결절 5-0 nylon 봉합사로 흉강 절개 부위를 봉합한다. 늑간 신경혈관다발의 손상을 방지하기 위해 바늘을 갈비뼈 표면에 가깝게 유지한다. 봉합사를 묶기 전, 호기 말에 흉부를 부드럽게 압박하여 잔류 흉강 내 공기를 배출시킨 다음, 서전스 매듭(surgeon’s knot)으로 봉합사를 고정하는 동안 압박 상태를 유지한다.
  2. 5-0 nylon 봉합사를 사용하여 피부 절개 부위를 층별로 봉합한다. 다음 단계로 진행하기 전 상처 가장자리가 완전히 밀착되었는지 확인한다.
  3. 마우스를 온도 조절 가열 패드(37°C) 위에 놓고 isoflurane 투여를 중단하며, 자발 호흡이 재개될 때까지 기계적 환기를 계속한다. 꼬리나 수염의 움직임, 약 150 breaths/min의 규칙적인 호흡 패턴 회복 등 동물이 마취에서 회복되는지 관찰한다.
  4. 규칙적인 자발 호흡, 환기 주기와 동기화된 흉벽의 가시적 움직임, 사지나 수염의 의도적인 움직임을 확인하여 기관 내 삽관 제거 준비가 되었는지 확인한다. 호기 단계에서 기관 내 튜브를 천천히 제거한 후, 가열 패드 위에서 마우스를 3~5 min 동안 계속 모니터링하며 호흡 곤란이 없는지 확인한다.
    참고: 삽관 제거 후 발생하는 호흡 곤란은 주로 늑간 공간의 불완전한 폐쇄로 인한 기흉 때문에 발생한다. 호흡 곤란이 발생하면 일시적으로 마우스를 재마취 및 환기시키고, 피부 봉합 부위를 다시 열어 늑간 폐쇄 상태를 점검하며, 공기 누출 부위에 추가 봉합을 실시한 후 삽관 제거 절차를 반복한다.
  5. 마취에서 회복된 후 마우스를 원래의 케이지로 돌려보낸다. 수술 직후 및 초기 48시간 동안 4~6 h마다 buprenorphine(0.1 mg/kg, 피하 주사)을 투여한다.
  6. 수술 후 첫 3일 동안은 매일 최소 2회, 그 이후에는 매일 1회 각 마우스를 모니터링한다. 체중, 자세, 활동성, 호흡 패턴 및 수술 상처를 평가하며, 지속적인 호흡 곤란, 음식이나 물 섭취 불능, 자극에 반응하지 않는 웅크린 채 움직이지 않는 자세 등 미리 정의된 인도적 종료 시점에 해당하는 동물은 안락사시킨다.

6. 심전도(ECG) 평가

  1. ECG 증폭기가 장착된 다채널 생리적 기록 시스템을 사용하여 심전도 신호를 기록합니다. 마우스에 세 개의 피하 사지 유도 전극을 삽입하여 양극 입력(VIN+)은 왼쪽 뒷다리에, 음극 입력(VIN−)은 오른쪽 앞다리에, 접지(GND)는 오른쪽 뒷다리에 연결합니다.
  2. ECG 증폭기 모듈을 데이터 수집 장치에 연결합니다. 노치 필터를 50 Hz(또는 해당 지역의 전원 주파수에 따라 60 Hz)로 설정한 다음, 수집 소프트웨어를 열고 아날로그 채널 설정에서 새로운 ECG 증폭기 모듈을 추가합니다.
    1. 증폭기 파라미터를 다음과 같이 구성합니다: gain = 2000, mode = normal, low-pass filter = 150 Hz, high-pass filter = 0.05 Hz. 수집 설정을 열어 샘플링 속도를 1 kHz로 설정하고 설정 창을 닫습니다.
    2. 전극을 배치한 후, Start를 클릭하여 기록을 시작합니다. 표시 시간 기준(time base)을 주 눈금당 0.5 s로, 수직 스케일을 주 눈금당 0.25 mV로 설정한 후 ECG를 최소 30 s 동안 연속적으로 기록합니다. 분석 및 대표성 제시를 위해 아티팩트가 없는 안정적인 구간을 선택합니다.
  3. 마우스를 1.5% isoflurane 마취 상태로 유지하고 가온 패드에서 정상 체온을 유지하며, 결찰 직후에 ECG를 기록합니다. MI 그룹과 정상 대조군(NC) 그룹 모두에서 동일한 시점에 유사한 마취 조건 하에 ECG를 기록합니다.

7. 심초음파 검사

  1. 영상 촬영 1일 전에 제모 크림을 사용하여 전흉부의 털을 제거합니다. 검사 전 과정 동안 1.5% isoflurane으로 마우스를 마취합니다.
  2. 마우스를 가열 플랫폼 위에 등으로 눕히고(supine), 네 가지를 ECG 전극에 고정한 후 흉골 전부에 초음파 겔을 도포합니다. 심박수가 400 beats/min 이상으로 유지되도록 isoflurane 농도를 필요에 따라 조절합니다.
  3. 초음파 프로브를 왼쪽 흉골 경계를 따라 제3-4 늑간 공간에 배치합니다. 프로브 마커를 오른쪽 앞다리 방향으로 약 30° 각도가 되도록 향하게 하고, 프로브를 심장의 장축과 일치시킵니다.
  4. 중심 송신 주파수 30 MHz, 대역폭 20–46 MHz, 축 분해능 50 μm의 선형 어레이 트랜스듀서를 사용하여 모든 영상을 촬영합니다. 송신 출력은 100%, 영상 깊이는 13 mm, 영상 너비는 11 mm, 다이내믹 레인지는 60 dB, 2차원 이득은 40 dB로 설정합니다. 210 frames/s의 프레임 속도로 B-모드 시네 루프를 획득합니다.
  5. 이러한 획득 파라미터를 시스템 프리셋으로 저장합니다. 모든 동물과 모든 영상 촬영 세션에 대해 동일한 트랜스듀서, 프리셋, 송신 출력, 다이내믹 레인지, 영상 깊이 및 영상 너비를 사용하며, NC 그룹과 MI 그룹 간에 영상 깊이를 수정하지 않습니다.
  6. 동일한 장축 뷰 내에서, M-모드 샘플링 라인을 심실 중간 수준에서 심실 중격 및 좌심실 후벽에 수직이 되도록 배치하고, 샘플링 게이트가 좌심실의 전체 전후 직경을 포괄하도록 합니다. 이후 분석을 위해 M-모드 트레이싱을 기록합니다.
  7. 좌심실, 좌심방 및 대동맥근이 명확하게 시각화되는 B-모드 영상을 획득하고, 이후 분석을 위해 시네 루프를 기록합니다. 동일한 영상 평면에서 이에 대응하는 M-모드 영상을 획득합니다.
  8. 획득한 영상에서 좌심실 이완기말 내경(Dd), 좌심실 수축기말 내경(Ds) 및 심실 중격 두께를 측정합니다. 5회의 연속적인 심장 주기 영상을 획득하여 평균값을 보고합니다.
    참고: 영상 소프트웨어를 사용하여 좌심실 이완기말 용적(LVEDV)과 좌심실 수축기말 용적(LVESV)을 자동으로 계산합니다. 분획 단축률(FS)은 FS = (Dd − Ds) / Dd × 100%로, 박출률(EF)은 EF = (LVEDV − LVESV) / LVEDV × 100%로 계산합니다.

8. 조직 채취, 조직학적 염색 및 ELISA

  1. 조직 채취
    1. MI 유도 후 7일째에 각 마우스에 대해 심초음파 검사를 수행한다. 마우스를 4% isoflurane으로 마취시키고, 안와하 출혈법으로 약 1.5 mL의 혈액을 채취한 뒤, 경추 탈골로 안락사시키고 심장을 적출한다.
    2. 혈액 샘플을 4°C에서 하룻밤 동안 응고시킨다. 샘플을 4°C에서 2000 × g로 10분간 원심 분리하여 혈청을 수집하고, 분석 전까지 −80°C에 보관한다.
  2. 효소결합면역흡착측정법 (ELISA)
    1. 효소결합면역흡착측정법 (ELISA) 키트를 사용하여 혈청 내 B-type natriuretic peptide (BNP), interleukin-1β (IL-1β), tumor necrosis factor-α (TNF-α), 및 nuclear factor-κB p65 (NF-κB p65)를 정량한다.
      1. 모든 시약과 혈청 샘플을 실온으로 맞추고 키트 지침에 따라 작업 용액을 준비한다. 혈청 샘플을 phosphate-buffered saline (PBS)로 1:5 비율로 희석한다 (즉, 혈청 1부피에 PBS 4부피를 추가).
      2. 표준 물질, PBS, 희석된 혈청 샘플을 각각 표준 웰, 제로 웰, 샘플 웰에 50 μL씩 넣고, 블랭크 웰은 비워둔다. 블랭크를 제외한 모든 웰에 horseradish peroxidase (HRP)-접합 검출 항체 100 μL를 넣고, 플레이트를 밀봉한 뒤 암조건의 37°C에서 60분 동안 배양한다.
      3. 각 웰의 내용물을 버리고 세척 버퍼로 플레이트를 5회 세척하며, 각 세척 주기 동안 버퍼가 각 웰에 20초 동안 머물게 한다. 보풀 없는 종이로 플레이트의 물기를 닦아낸다.
      4. 갓 준비한 기질 (용액 A와 B를 1:1 부피 비율로 혼합) 100 μL를 각 웰에 넣는다. 밀봉된 플레이트를 암조건의 37°C에서 15분 동안 배양하고, 정지 용액 50 μL를 추가한 후 450 nm에서 흡광도를 측정한다.
    2. 각 측정값에서 블랭크 흡광도를 빼고, 4-매개변수 로지스틱 (4PL) 회귀 모델을 사용하여 표준 곡선을 생성한다. 적합된 곡선으로부터 각 샘플의 농도를 계산하고, 이 값에 희석 배수 5를 곱하며, 중복 웰의 평균값을 기록한다.
  3. 조직 처리, 포매 및 절편 제작
    1. 적출한 각 심장을 얼음처럼 차가운 phosphate-buffered saline으로 짧게 헹궈 잔류 혈액을 제거한다. 조직을 4% paraformaldehyde에 넣고 실온에서 최소 24시간 동안 고정한다.
    2. 각 심장을 다듬어 평평한 단축 표면이 드러나게 한 뒤, 라벨이 부착된 조직 카세트에 넣는다. 단계별 에탄올 시리즈(75% 에탄올 4시간, 85% 에탄올 2시간, 90% 에탄올 2시간, 95% 에탄올 1시간, 그리고 절대 에탄올을 30분씩 2회 교체)를 통해 조직을 탈수한다. 조직을 에탄올-자일렌 혼합액에 5~10분 동안 옮기고, 자일렌을 10분씩 2회 교체하여 투명화한 후, 녹은 파라핀을 1시간씩 3회 교체하여 침투시킨다.
    3. 단축이 블록 표면을 향하도록 각 심장을 포매한다. 유두근 중간 높이에서 3 μm 두께로 연속 절편을 제작하고, 40°C 항온수조에 절편을 띄운 뒤 유리 슬라이드에 부착하고 60°C에서 건조한다.
    4. 자일렌(각 15분, 2회 교체)으로 절편을 탈파라핀화한 후, 절대 에탄올(각 5분, 3회 교체), 75% 에탄올(5분), 그리고 역삼투(RO)수(5분) 순으로 처리한다.
      주의: Paraformaldehyde는 발암 가능 물질이며 호흡기 및 피부 자극제이고, xylene은 인화성 및 신경 독성이 있다. 이러한 시약은 멸균 의료용 장갑, 실험복, 보호 안경을 착용한 상태에서 화학 흄 후드 내에서 취급하고, 기관의 유해 폐기물 처리 절차에 따라 폐기한다. Ethanol과 n-butanol은 인화성 물질이므로 점화원으로부터 멀리 떨어진 곳에 보관한다.
  4. 조직학적 염색
    1. 헤마톡실린-에오신 염색
      1. 탈파라핀화 및 재수화된 절편을 hematoxylin에 3~5분 동안 담근다. 절편을 물로 헹군다.
      2. 1% 산성 알코올로 절편을 분별 염색하고 물로 헹군다. 0.5% 암모니아수로 절편을 청색화한 후 다시 헹군다.
      3. 절편을 85% 에탄올, 95% 에탄올, 절대 에탄올 순으로 각각 5분 동안 옮긴다. eosin으로 3~5분 동안 대조 염색한다.
      4. 절대 에탄올을 5분씩 3회 교체하여 절편을 탈수하고, 이어서 n-butanol에 5분 동안 둔다. 자일렌을 5분씩 3회 교체하여 절편을 투명화하고, 중성 수지로 봉입한다.
        참고: 핵은 파란색으로 나타나며, 세포질과 세포외 기질은 빨간색으로 나타난다.
    2. Masson’s trichrome 염색
      1. 탈파라핀화 및 재수화된 절편을 2.5% potassium dichromate 용액에 넣고 실온에서 하룻밤 동안 약 15시간 동안 매염한다. 노란색 빛이 사라질 때까지 흐르는 물에 약 30초 동안 절편을 헹군다.
      2. 조직이 밝은 빨간색으로 보일 때까지 Ponceau–acid fuchsin 용액에서 6분 동안 염색한다. 색이 옅게 유지되면 염색 시간을 연장하고, 씻겨 내려오는 물이 무색이 될 때까지 흐르는 물에 절편을 헹군다.
      3. 절편이 마르지 않도록 주의하며 과잉 수분을 제거한다. 콜라겐이 옅게 보이고 근섬유가 빨간색으로 남을 때까지 수성 phosphomolybdic acid로 1~2분 동안 분별 염색한다.
      4. 헹구지 않고 절편을 aniline blue 용액으로 즉시 옮긴다. 절편을 6~30초 동안 배양한다.
      5. 1% acetic acid를 3~5회 교체하며 회당 약 8초 동안 절편을 분별 염색한다. 절대 에탄올을 각각 약 3, 5, 5초 동안 3회 교체하여 빠르게 탈수한다.
      6. n-butanol에 5분, 이어서 xylene에 5분 동안 절편을 투명화한다. 중성 수지로 절편을 봉입한다.
        참고: 콜라겐 섬유는 파란색으로 나타나며, 근섬유, 피브린, 적혈구는 빨간색으로 나타난다.
    3. Sirius Red 염색
      1. 탈파라핀화 및 재수화된 절편을 Sirius Red 용액 A에 넣고 65°C 오븐에서 30분 동안 배양한다. 노란색 빛이 사라질 때까지 흐르는 물에 절편을 세척한다.
      2. 과잉 액체를 닦아내고 절편을 Sirius Red 용액 B에 2분 동안 담근다. 절편을 짧게 세척하고 과잉 액체를 닦아낸다.
      3. 절편을 Sirius Red 용액 C에 30분 동안 담근다. 1~2초 동안 짧게 헹군다.
      4. 절대 에탄올을 약 3초씩 3회 교체하여 절편을 탈수한다. 자일렌을 5분씩 3회 교체하여 투명화하고, 중성 수지로 봉입한다.
        참고: 명시야 조명 하에서 콜라겐 섬유는 노란색 배경에 대해 빨간색으로 나타난다.
  5. 영상 획득 및 정량화
    1. 디지털 슬라이드 스캐너를 사용하여 모든 조직학 영상을 획득한다. 모든 그룹의 모든 절편에 대해 동일한 조명, 화이트 밸런스, 노출 및 배율 설정을 사용하고, 모든 영상에 캘리브레이션 스케일 바를 포함한다.
    2. 영상 분석 전 공간 척도를 교정한다. 연구 영상과 동일한 해상도 및 픽셀 크기로 획득한 스케일 바가 포함된 참조 영상을 불러온다. Measure > Calibration > Set System에서 새로운 공간 교정을 생성하고, 단위를 μm로 설정하며, 교정 지점을 스케일 바에 맞춰 픽셀-마이크로미터 변환 값을 정의한 후 교정 값을 저장하고 모든 영상에 적용한다.
    3. Masson’s trichrome 염색 절편을 불러오고 불규칙 관심 영역(AOI) 도구를 사용하여 좌심실의 외곽선을 그린다. 심실강, 우심실 및 조직 처리 과정에서 발생한 아티팩트를 제외한 후, 총 좌심실 면적을 기록한다.
    4. Measure > Count/Size를 열고 Select Colors를 선택하여 세그멘테이션 대화 상자를 연다. Color Cube 기반 세그멘테이션을 선택하고 매개변수를 다음과 같이 설정한다: sensitivity = 4, expand selection by 1 color index, minimum color size = 1 pixel, kernel size = 3 × 3. 동일한 세그멘테이션 설정을 모든 절편에 적용한다.
    5. 스포이드 도구를 시드 포인트로 사용하여 파란색 콜라겐 양성 픽셀을 선택한다. 명확하게 콜라겐 양성인 영역만 샘플링하여 미리보기 영상을 생성하고, 마스크가 빨간색으로 염색된 심근, 심실강 및 배경을 제외하고 콜라겐 양성 영역을 포함하고 있는지 확인한다. 마스크를 적용하기 전 필요한 경우 시드 포인트를 조정한다.
      참고: 절편 간의 미세한 염색 강도 차이를 고려하여 각 절편마다 시드 픽셀을 다시 선택한다. 모든 영상에 대해 동일한 세그멘테이션 매개변수(민감도, 확장 정도, 최소 색상 크기 및 커널 크기)를 유지하며, 미리보기에서 비콜라겐 구조가 제외되고 콜라겐 양성 영역이 완전히 포함된 경우에만 세그멘테이션을 승인한다.
    6. 세그멘테이션 마스크를 적용하고 대화 상자를 닫는다. Measure > Select Measurements에서 Area를 선택하고, Count를 클릭한 뒤, View > Statistics를 열어 합산된 콜라겐 양성 면적을 기록한다.
    7. 콜라겐 양성 면적을 총 좌심실 면적으로 나누어 콜라겐 부피 분율(CVF)을 계산하고, 결과를 백분율로 표시한다.

9. 조직 투명화 및 3차원 관상동맥 영상화

  1. 관상 혈관의 형광 표지
    1. 주입 200 µL 관상 혈관을 표지하기 위해 2% Evans Blue 용액을 꼬리 외측 정맥에 주입합니다. 염료가 전신 순환될 수 있도록 마우스를 케이지로 옮겨 60분 동안 둡니다.
    2. 마우스를 마취기에 연결된 유도 챔버(16 × 10 × 11 cm)에 넣고 4% isoflurane으로 마취를 유도한다. 경추 탈골법으로 마우스를 안락사시킨 후, 흉강을 열어 온전한 심장을 적출하고 PBS로 헹군 다음, 4% 파라포름알데히드(PFA)에서 24시간 동안 고정한다. 4°C.
      주의: PFA는 발암 가능 물질이며 호흡기 및 피부 자극제입니다. 무균 의료용 장갑, 실험복 및 보호 안경을 착용한 상태에서 화학 흄 후드 내에서 PFA를 취급하고, 기관의 유해 폐기물 처리 절차에 따라 폐기하십시오.
    3. RO수로 3% 아가로스 용액을 준비하고, 결찰 부위가 영상 촬영에 적절한 방향이 되도록 고정된 심장을 매립하십시오. 주입하십시오. 1 µL 마이크로리터 시린지를 사용하여 결찰 부위 주변 8곳에 DAPI 용액을 주입하고, 시료를 실온에서 2일 동안 배양합니다.
  2. 조직 투명화
    1. 제조사의 지침에 따라 FDISCO(우수한 형광 보존 능력을 갖춘 용매 투명화 장기 3차원 이미징) 조직 투명화 키트를 사용하여 조직 투명화를 수행하십시오. 해당 키트는 6가지 시약(A-F)으로 구성되어 있습니다. 시약 A, B, C, D, E는 각각 50%, 70%, 80%, 100%, 100%의 테트라하이드로퓨란(THF) 수용액이며, 시약 F는 디벤질 에테르입니다.
      주의: THF는 인화성이 매우 높으며, 보관 중 폭발성 과산화물을 형성하고, 호흡기 및 피부 자극제입니다. 디벤질 에테르는 피부 및 눈 자극제입니다. 무균 의료용 장갑, 실험복, 보안경을 포함한 적절한 개인 보호 장구를 착용한 상태에서 화학 흄 후드 내에서 모든 시약을 취급하십시오. 폐기물은 기관의 유해 폐기물 처리 절차에 따라 처리하십시오.
    2. 각 심장을 시약 A, B, C, D, E 순으로 각각 6시간 동안 배양하십시오. 심장 하나당 각 시약을 10mL씩 사용하여, 시료 대비 시약 부피 비율을 최소 1:5로 유지하십시오.
    3. 샘플을 시약 F로 옮기고 조직이 광학적으로 투명해질 때까지, 일반적으로 약 1시간 동안 배양을 계속하십시오.
    4. 모든 투명화 단계를 다음 온도에서 수행하십시오. 6°C–8°C 부드럽게 교반하며 진행하십시오. 형광을 보존하기 위해 샘플을 알루미늄 호일로 감싼 유리 용기에 담아 전 과정 동안 빛으로부터 보호하십시오.
  3. 라이트시트 형광 이미징
    1. 투명화된 시료를 시료 홀더에 장착하십시오. 4배율 대물렌즈(개구수 = 0.28; 작동 거리 = 20.0 mm)가 장착된 라이트시트 형광 현미경을 사용하십시오.
    2. 장착된 시료를 이미징 챔버 내의 디벤질 에테르(dibenzyl ether)에 담급니다. 시편의 양측에서 빛을 조사하고, 405 nm에서 DAPI를, 이어서 647 nm에서 Evans Blue를 순차적으로 여기시킵니다.
    3. 획득 파라미터를 다음과 같이 설정하십시오. 405 nm 채널의 경우 레이저 강도는 3,000 임의 단위, 노출 시간은 30 ms로 설정하고, 647 nm 채널의 경우 레이저 강도는 4,000 임의 단위, 노출 시간은 30 ms로 설정합니다. 모든 이미지는 다음의 z-단계 크기를 사용하여 획득하십시오. 6 μm 그리고 1,024 × 1,024 픽셀의 이미지 해상도.
    4. 카메라 획득 모드를 XYCZT로 설정하십시오. 이 모드에서는 이미징 소프트웨어 설정에 따라 측면(XY) 이미지를 먼저 획득한 후, 순차적 채널 획득(C), 축 방향 단계 이동(Z), 그리고 시간 지점 획득(T) 순으로 진행됩니다.
  4. 영상 데이터 처리 및 3차원 재구성
    1. 현미경과 함께 제공된 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 가공되지 않은 TIFF 이미지 파일들을 스티칭하십시오. 파일(File)을 선택하여 스티칭된 이미지 파일들을 IMS 형식으로 변환하십시오. > Imaris로 변환하십시오.
    2. 변환된 IMS 파일을 3차원 분석 소프트웨어로 가져옵니다. 기본 렌더링 설정을 사용하여 볼륨 렌더링 재구성 이미지를 생성하고, Snapshot 모듈을 사용하여 대표 이미지를 내보냅니다.
      참고: 3차원 재구성은 수정 없이 소프트웨어의 기본 렌더링 파이프라인을 사용하여 생성되었습니다. 이미지 분할, 임계값 설정, 노이즈 제거, 배경 제거 또는 기타 전처리는 적용되지 않았습니다. 재구성된 이미지는 관상혈관의 정성적 시각화를 위해 사용되며, 정량적 분석을 목적으로 하지 않습니다.

10. 통계 분석

  1. 모든 데이터는 평균 ± 표준 오차(SEM)로 표시하십시오. GraphPad Prism 소프트웨어(버전 5.0)를 사용하여 통계 분석을 수행하십시오.
  2. 실험 단위를 개별 동물로 정의하십시오. 모든 기능적, 바이오마커 및 조직형태학적 엔드포인트에 대해 그룹당 n = 8마리의 마우스를 분석하십시오.
  3. 그룹 할당에 대해 연구자 블라인딩을 유지하면서 코드화된 샘플 식별자를 사용하여 데이터 수집 및 분석을 수행하십시오. 모든 정량 분석이 완료된 후에만 그룹 할당을 공개하십시오.
  4. 적절한 통계 검정을 선택하기 전에 GraphPad Prism(버전 5.0)에서 Shapiro–Wilk 검정으로 데이터 정규성을, Levene 검정으로 분산의 균질성을 평가하십시오.
  5. 정규성과 등분산 가정이 충족되는 경우, 양측 꼬리 무관 Student's t-검정을 사용하여 두 그룹을 비교하십시오. 그렇지 않은 경우, Mann–Whitney U 검정을 수행하십시오.
  6. P < 0.05를 통계적으로 유의미한 것으로 간주하십시오. 통계적 유의성은 P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001로 표시하십시오.

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결과

AIS는 LAD 관상동맥의 위치 파악과 결찰 부위 식별을 위한 해부학적 지표로 활용되었다(Figure 1A–C). AIS를 확인한 후, 흉곽 절개, 심장 노출, LAD 결찰, 흉강 폐쇄 및 수술 후 회복을 포함한 MI 유도를 위한 순차적 수술 과정이 Figure 2A–L에 표시된 대로 수행되었다. 단순화된 프로토콜을 통해 마우스에서 MI를 신속하고 재현성 있게 유도할 수 있었다. 본 프로토콜은 안정적으로 수행하기 위해 장기간의 실습 교육이 필요하며, 특히 기관 내 삽관과 AIS 유도 결찰의 두 단계에서 학습 곡선이 가장 가파르다. 교육 초기 단계에서는 수술 후 첫 7일 이내의 주술기 사망률이 50% 이상에 달할 수 있으며, 모델 유도 성공률은 30% 이하로 떨어질 수 있다. 이러한 기술을 숙달하면 수술 성공률은 일관되게 90%를 상회한다. 본 연구에서는 수술 후 ...

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토론

최근 심근경색(MI)의 임상 및 실험 모델은 심혈관 연구에서 점점 더 중요해지고 있으나, MI의 발병 기전과 치료 전략에 관한 많은 의문점은 여전히 해결되지 않은 상태입니다. 본 논문은 몇 가지 중요한 절차적 단계에 특히 주의를 기울여야 하는 정교한 마우스 MI 모델 구축 방법을 설명합니다. 첫 번째 핵심 단계는 기관 내 삽관입니다. 일부 기존 프로토콜에서는 기관 절개술을 통해 기도를 확보하는데, 이는 삽관 전 경부 피부를 절개하고 조직을 박리하여 기관을 노출시키는 과정이 필요합니다13. 다른 방법들은 구강 기관 삽관 방식을 유지하면서도, 시술 중 시야 확보를 개선하기 위해 경부 정중선 절개를 권장합니다14. 이 두 가지 접근 방식과 달리, 본 프로토콜은 후두경을 사용하여 구인두를 조명하고, 경부 절개 없이 성문을 직접 시각화하며 구강 기관 삽관을 수행합니다. 이 방식은 술자의 기술적 숙련도를 더 많이 요구하지만, 경부 조직의 손상을 피하고 감...

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공개 사항

저자들은 공개할 사항이 없습니다.

감사의 글

본 연구는 Sichuan 과학기술 프로그램(Nos. 2026NSFSC1823 및 2022YFS0618), Sichuan 성 중의약관리국 프로젝트(Sichuan 성 중의약관리국 사무소 No. 7 [2024]), Sichuan 중서의결합학회 프로젝트(No. ZXY2025019) 및 Southwest 의과대학 프로젝트(Grant Nos. 2023ZYYQ04 및 2023ZYYQ17)의 지원을 받아 수행되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.9% 멸균 식염수Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd. - Cefazolin 재구성
3% 아가로스Sigma-AldrichA0169시료 임베딩
4% 파라포름알데히드Sigma-Aldrich158127조직 고정
절대 에탄올Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.05.001.0170A조직 탈수; 가연성
산성 푸크신 (Acid fuchsin)AladdinA104916-100gMasson's trichrome 염색을 위한 Ponceau–acid fuchsin 용액 조제
AcqKnowledge 소프트웨어BIOPAC SystemsAcqKnowledge 4.0심전도 획득 및 분석
암모니아 용액, 0.5% 수용액Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.05.001.2528A헤마톡실린 및 에오신 염색 중 청색화(bluing)
아닐린 블루 (Aniline blue), 산 용해성AladdinA111200-100gMasson's trichrome 염색을 위한 아닐린 블루 용액 조제
무균 의료용 장갑Nanchang Feixiang Latex Products Co., Ltd. - 화학 및 생물학적 보호
부프레노르핀 (Buprenorphine)Qinghai Pharmaceutical Factory Co., Ltd.H10940181수술 후 진통
주사용 Cefazolin 나트륨CSPC Zhongnuo Pharmaceutical (Shijiazhuang) Co., Ltd. - 수술 전후 항생제 예방
면봉Shijiazhuang Kangertai Medical Equipment Co., Ltd. - 심외막 닦기 및 무균 준비
DAPI 염색 용액Thermo FisherD1306핵 표지
제모 크림Veet - 흉부 제모
디지털 슬라이드 스캐너3DHISTECHPannoramic MIDI II전슬라이드 이미징 (Whole-slide imaging)
ECG 증폭기BIOPAC SystemsECG100C심전도 증폭
심전도 기록 시스템BIOPAC SystemsMP160심전도 기록
ELISA 키트, 마우스 B형 나트륨 이뇨 펩타이드 (BNP)Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.RXW202726M혈청 BNP 정량 분석
ELISA 키트, 마우스 인터루킨-1βQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.RX203063M혈청 IL-1β 정량 분석
ELISA 키트, 마우스 nuclear factor-κB p65Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.RX201879M혈청 NF-κB p65 정량 분석
ELISA 키트, 마우스 종양 괴사 인자-αQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.RX202412M혈청 TNF-α 정량 분석
임베딩 카세트Jiangsu Shitai22022조직 임베딩
기관 내 카테터, 20 GShenzhen Bailide Biotechnology Co., Ltd.B11103구강 삽관; 외경 약 0.9–1.0 mm; 사용 전 약 15 mm로 절단
에오신 Y (Eosin Y), 알코올 용해성Hefei BASF Biotechnology Co., Ltd.Y0310-100G헤마톡실린 및 에오신 염색 중 세포질 대조 염색
에반스 블루 (Evans Blue)JarvisbioA312001관상동맥 혈관 표지
정밀 핀셋RWD Life ScienceF12011-10조직 처리 및 심낭 절개
정밀 핀셋, 미세수술용RWD Life ScienceFC12002T-08미세수술 조직 처리
정밀 가위RWD Life ScienceS12000-09피부 절개 및 박리를 위한 안과용 가위
빙초산Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd. - Masson's trichrome 분별 염색을 위한 1% 아세트산 조제
유리 슬라이드Jiangsu Shitai80312/80302절편 마운팅
유리구슬 멸균기RWD Life ScienceRS3002동물 간 기구 멸균
GraphPad Prism 소프트웨어GraphPad SoftwareVersion 5.0통계 분석
가열 패드RWD Life Science69020수술 후 체온 조절
헤마톡실린 염색 용액Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1004헤마톡실린 및 에오신 염색 중 핵 염색
Horseradish peroxidase-결합 검출 항체Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.ELISA 키트에 포함ELISA 검출
염산Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.05.001.1337A헤마톡실린 분별 염색을 위한 산성 알코올 조제
Image-Pro Plus 소프트웨어Media CyberneticsVersion 6.0콜라겐 부피 분율 정량 분석
Imaris 소프트웨어BitplaneVersion 7.2.33차원 재구성 및 분석
이소플루란 (Isoflurane)RWD Life ScienceR510-22-10흡입 마취제
이소플루란 마취 시스템RWD Life ScienceTAIJI-IE이소플루란 공급
후두경, 소동물용Shanghai Yuyan Scientific Instrument Co., Ltd.SR310-MR삽관 중 직접 시각화
라이트시트 형광 현미경Light Innovation TechnologyLiToneXL3차원 형광 이미징
LitScan 소프트웨어Light Innovation TechnologyVersion 3.31이미지 스티칭 및 변환
기계식 인공호흡기Chengdu Taimeng Software Co., Ltd.HX-101E기계적 환기; 130 breaths/min; 1회 호흡량 2 mL
미세 모스키토 지혈집게 (Micro-mosquito hemostat)RWD Life ScienceFC21001R-12결찰 및 봉합 중 바늘 고정
마이크로리터 시린지Shanghai Gaoge Industry and Trade Co., Ltd. - 국소 DAPI 주입
마이크로플레이트 리더Molecular Devices (Shanghai) Co., Ltd.SpectraMax iD5450 nm에서 광학 밀도 측정
실체 현미경Maishidi (Dongguan) Technology Co., Ltd.MSD204수술 중 시각화
정립 광학 현미경LeicaDM500조직학적 이미징
마이크로톰 칼날EprediaMX35 ULTRA파라핀 절편 제작
Modified Sirius Red 염색 키트Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1078콜라겐 염색; 용액 A, B, C 포함
n-부탄올 (n-Butanol)Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.05.001.0886A조직학적 탈수 및 투명화; 가연성
중성 마운팅 수지Shanghai YiyangYSQN41-91슬라이드 마운팅
나일론 봉합사, 3/8-circle 7-0 (바늘 포함)Ningbo Medical Needle Co., Ltd. - 좌전하행 관상동맥 결찰
나일론 봉합사, 5-0Ningbo Medical Needle Co., Ltd. - 흉벽 및 피부 봉합
나일론 봉합사, 6-0Ningbo Medical Needle Co., Ltd. - 흉벽 노출 및 견인
파라핀 임베딩 스테이션Wuhan Junjie ElectronicsJB-L5조직 임베딩
파라핀 왁스NANA조직 침투 및 임베딩
인산 완충 식염수 (PBS)Sigma-AldrichP3813조직 세척 및 시약 희석
몰리브덴산 인 (Phosphomolybdic acid)Tianjin Aopusheng Chemical Co., Ltd. - Masson's trichrome 분별 염색
Ponceau 2RAladdinP104989-25gMasson's trichrome 염색을 위한 Ponceau–acid fuchsin 용액 조제
중크롬산 칼륨Zhengzhou Paini Chemical Reagent Factory7778-50-9Masson's trichrome 매염제
포비돈–요오드SingleLadyGB26368-2010피부 소독
역삼투수실험실 정제해당 없음용액 조제
회전 마이크로톰Leica Instruments (Shanghai)RM2016파라핀 절편 제작
시료 홀더 어댑터Light Innovation TechnologyLiToneXL에 포함라이트시트 이미징을 위한 투명화 시료 마운팅
피부 접착 테이프Qingdao Schultz Biotechnology Co., Ltd. - 사지 및 꼬리 고정
슬라이드 커버글라스Jiangsu Shitai80340-1630커버글라스 덮기
슬라이드 건조기Shaoxing Luyue101-3B슬라이드 건조
정지 용액 (Stop solution)Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.ELISA 키트에 포함ELISA 반응 중단
기질 용액 A 및 BQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.ELISA 키트에 포함ELISA 발색
조직 부유조 (Tissue flotation bath)Wuhan Junjie ElectronicsJK-5/6절편 부유
조직 처리기Wuhan Junjie ElectronicsJT-12S자동 조직 처리
조직 투명화 키트, 시약 A–FJarvisbioJA11012용매 기반 조직 투명화
기관 삽관 플랫폼RWD Life ScienceRe20-M구강 삽관 위치 조정
초음파 분석 소프트웨어Fujifilm VisualSonicsVevoLAB 3.2.6심초음파 데이터 분석
초음파 젤Tianjin Jinya Electronics Co., Ltd.TM-100심초음파 커플링
초음파 이미징 시스템Fujifilm VisualSonicsVevo 3100심초음파 검사
V자형 눈꺼풀 견인기Suqian Shengshi Medical Equipment Co., Ltd.SS5009G늑간 및 갈비뼈 견인
세척 버퍼Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.ELISA 키트에 포함ELISA 플레이트 세척
수질 정화 시스템Sichuan ULUPURE Ultrapure Technology Co., Ltd.UPT-II-20T역삼투수 생산
자일렌 (Xylene)Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.05.001.0586A조직 투명화 및 탈파라핀화; 가연성 및 신경독성

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