연구 논문

류마티스 관절염 환자의 혈청 내 Mir-488-3p 발현의 비침습적 진단 바이오마커로서의 활용

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DOI:

10.3791/72346

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2026년 8월 28일

 , 
1Department of Medical Laboratory, Hefei BOE Hospital

이 논문에서

요약

miR-488-3p는 류마티스 관절염(RA)의 새로운 비침습적 진단 마커로 활용될 수 있습니다. miR-488-3p는 ROCK1을 통해 활막세포의 생물학적 기능을 조절합니다. 이는 RA 환자의 질병 중증도와 유의미한 음의 상관관계를 보였습니다.

초록

기존 바이오마커의 한계로 인해 류마티스 관절염(RA)의 진단은 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다. 본 연구의 목적은 혈청 내 miR-488-3p의 RA 바이오마커로서의 가능성을 조사하고, 그 잠재적인 작용 기전을 밝히는 것입니다. 연구 대상에는 RA 환자 135명, 골관절염(OA) 환자 130명, 그리고 건강한 대조군 125명이 포함되었습니다. miR-488-3p의 발현 수준은 RT-qPCR로 측정하였습니다. 작용 기전은 기능성 시험(CCK-8, 유세포 분석, ELISA)과 표적 검증 실험(루시퍼레이스 리포터 유전자, RIP)을 통해 분석하였습니다. 혈청 miR-488-3p 발현 수준은 골관절염(OA) 환자 및 건강한 대조군보다 RA 환자에서 유의하게 낮았습니다 (p < 0.001). ROC 곡선 분석 결과, miR-488-3p는 RA를 건강한 대조군 및 OA 환자와 구별하는 데 높은 진단 정확도를 보였습니다. miR-488-3p는 적혈구 침강 속도(ESR), C-반응성 단백질(CRP), 류마티스 인자(RF) 및 DAS28 점수와 음의 상관관계를 나타냈습니다. 기능 검증 결과, miR-488-3p의 과발현은 활막세포의 증식과 염증 반응을 억제하는 동시에 세포 사멸을 유도하는 것으로 나타났습니다. 기전 연구를 통해 miR-488-3p가 Rho-associated coiled-coil containing protein kinase 1 (ROCK1)을 직접적으로 표적하며, 이를 통해 보호 효과를 매개한다는 것이 밝혀졌습니다. 혈청 miR-488-3p는 RA의 새로운 비침습적 진단 마커로서 가능성이 있으며, 활막세포를 손상으로부터 보호합니다.

서론

류마티스 관절염(RA)은 활막 염증, 관절 침식 및 파괴를 특징으로 하는 흔한 자가면역 질환입니다1,2. RA의 전 세계 유병률은 약 0.5%–1%이며3, 이는 환자의 삶의 질과 노동 능력에 심각한 영향을 미칩니다. 이 질환은 잠행성으로 발병하며, 초기 증상은 종종 비전형적이어서 오진되거나 간과되기 쉽습니다4. 질병이 진행됨에 따라 관절 변형 및 기능 상실로 이어질 수 있으며, 심혈관 질환과 같은 합병증의 위험을 증가시켜5 환자와 그 가족, 그리고 의료 체계에 상당한 부담을 줍니다.

현재 RA의 진단을 위해서는 임상 증상, 징후, 실험실 검사 및 영상 평가의 조합이 필요합니다6. 일반적으로 사용되는 실험실 지표에는 전신 염증의 비특이적 마커인 적혈구 침강 속도(ESR)와 C-반응성 단백질(CRP), 그리고 RA의 중요한 혈청학적 바이오마커인 류마티스 인자(RF) 및 항-환상 시트룰린화 펩타이드(anti-CCP) 항체가 포함됩니다7,8. 그러나 이러한 전통적인 바이오마커들은 한계가 있습니다. RF는 일부 건강한 사람이나 다른 자가면역 질환 환자에서도 양성으로 나타날 수 있으며(위양성률 약 5%), anti-CCP는 특이도는 매우 높지만(>95%) 질병 초기 단계에서의 민감도는 제한적이며(약 60–70%)4,9, 일부 RA 환자는 혈청 음성 상태로 남아 있습니다10. 따라서 RA의 조기 진단, 질병 모니터링 및 예후 평가를 위해 더 민감하고 특이적인 바이오마커를 찾는 것이 중요합니다11.

마이크로RNA(miRNAs)는 길이가 약 22–25 bases인 내인성 비코딩 조절 RNA 분자 집단입니다12,13. miRNA는 다양한 질환의 발생 과정에서 핵심 조절자로 작용하며, 이들의 비정상적인 발현은 질환의 병태생리와 밀접한 관련이 있는 것으로 밝혀져13,14,15, 질환 진단 및 치료 모니터링을 위한 유망한 바이오마커가 되고 있습니다. 지난 몇 년 동안 류마티스 관절염(RA)에서 miRNA의 역할에 대한 관심이 높아지고 있습니다16. 여러 연구에 따르면 RA 환자의 혈청, 활막 조직 및 말초혈액 단핵구(PBMCs)에서 다수의 miRNA(예: miR-146a, miR-155 등)의 발현 조절 이상이 관련되어 있음이 나타났습니다17,18,19. 이러한 miRNA는 염증성 사이토카인 생성을 조절하고, 활막 세포의 증식 및 침윤을 촉진하며, 파골세포 분화에 영향을 줌으로써 RA 병태생리에 기여합니다20. 그중 miR-488은 인간 염색체 1q25.2 영역에 매핑되어 있으며21, 이전 연구들을 통해 신경 보호 효과가 확인되었습니다. 이는 신경교종22 및 신경모세포종23의 진행 과정에서 조절 역할을 하며, 특히 miR-488-3p는 골관절염(OA)에서 골관절염 연골세포의 세포사멸을 촉진합니다24. OA와 RA는 서로 다른 관절 질환이지만, 활막 염증 및 연골 파괴의 병리 과정에서 공통된 메커니즘을 공유합니다25. 본 연구진은 miR-488-3p가 유사한 표적 경로를 조절함으로써 RA에서 역할을 할 것이라고 가설을 세웠습니다. 그러나 RA에서 miR-488-3p의 구체적인 역할과 잠재적 메커니즘은 아직 규명되지 않았습니다.

본 연구는 류마티스 관절염(RA) 환자의 혈청 miR-488-3p 발현 수준의 변화와 이것이 질병 활성도 및 임상 지표와 갖는 상관관계를 조사하여, RA의 비침습적 진단 마커로서의 잠재적 가치를 평가하고자 하였습니다. 본 연구는 RA의 조기 스크리닝 및 질병 진행 예측에 대한 새로운 통찰을 제공함으로써 RA 환자의 예후를 개선하는 데 기여합니다.

프로토콜

본 연구는 Hefei BOE 병원 윤리 위원회의 승인을 받았으며(승인 번호 2021–1), 모든 참여자로부터 등록 전 서면 동의서를 얻었습니다.

환자 및 검체

본 연구에서는 Hefei BOE 병원 류마티스내과에서 2010 ACR/EULAR 분류 기준에 따라 진단된 RA 환자 135명, 정형외과에서 2018년 중국의학회(Chinese Medical Association) OA 진단 기준에 따라 진단된 OA 환자 130명, 그리고 동일 병원 건강검진센터에서 연령과 성별을 맞춘 건강 대조군 125명을 모집하였다. 참가자의 연령은 30~80세였다. 건강 대조군은 종합적인 병력 검토, 신체 검사 및 실험실 검사를 통해 자가면역 질환, 관절 질환 및 급성 감염이 없음을 확인하였다. 동반 자가면역 질환이 있거나, 최근 3개월 이내에 감염 또는 외상 이력이 있는 경우, 악성 종양이 있는 경우, 또는 임신이나 수유 중인 경우는 참가자에서 제외하였다.

시료 채취 및 준비

모든 연구 대상자로부터 공복 정맥혈을 채취하였다. 실온에서 30분간 응고시킨 후, 1500 × g 에서 15분간 원심분리하여 혈청 샘플을 분리하였다. 혈청은 추가 분석 전까지 -80°C에서 보관하였다.

임상 및 혈청학적 마커의 검출

질병 상태와 염증 활성도를 종합적으로 평가하기 위해, 표준화된 임상 실험실 방법을 사용하여 임상 및 혈청학적 바이오마커를 측정하였습니다. 비특이적 전신 염증을 평가하기 위해 Westergren 법으로 ESR을 측정하였습니다. 급성기 염증 반응을 평가하기 위해 면역탁도 측정법(정상 참고치: <10 mg/L)을 사용하여 CRP를 정량화하였습니다. RF는 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 사용하여 측정하였으며, 정상 참고치는 ≤20 IU/mL였습니다. RA 진단을 위한 혈청학적 근거를 제공하기 위해 2세대 ELISA를 사용하여 Anti-CCP 항체를 측정하였습니다.

세포주 및 배양

류마티스 관절염(RA)의 영향을 받은 인간 섬유아세포 유사 활막세포(HFLS-RA)를 10% fetal bovine serum (FBS)과 1% penicillin-streptomycin이 첨가된 Dulbecco's Modified Medium (DMEM)에서 배양하였습니다. 세포는 37 °C, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 유지하였으며, 모든 실험에는 3대에서 6대 사이의 계대 세포를 사용하였습니다.

RNA 추출 및 정량적 실시간 RT-PCR

RNA 추출 시약을 사용하여 혈청 샘플에서 총 RNA를 추출하였다. 제조사의 지침에 따라 miRNA의 경우 miRNA first-strand synthesis kit를 사용하여 역전사를 수행하였으며, 메신저 RNA(mRNA) 표적 유전자의 경우 reverse transcription kit를 사용하여 역전사를 수행하였다. SYBR Green 기반의 PCR master mix와 real-time PCR 시스템을 사용하여 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR)을 수행하였다. 열 순환 프로그램은 95 °C에서 30초 동안 사전 변성을 수행한 후, 증폭 과정(95 °C에서 5초 동안 변성 및 60 °C에서 30초 동안 어닐링/신장)을 40회 반복하도록 설정하였다. 각 샘플은 3회 반복 측정하여 분석하였다. miRNA와 mRNA의 정규화를 위한 내인성 참조 유전자로 각각 U6 small nuclear RNA(U6 snRNA)와 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)를 사용하였다. 프라이머 서열은 Supplementary Table 1에 요약하였다. miR-488-3p 및 그 표적 유전자의 상대적 발현 수준은 2−ΔΔCt 방법으로 계산하였다. 또한 miR-488-3p의 과발현 또는 억제 후 표적 유전자의 mRNA 수준 변화를 분석하여 이들의 조절 관계를 검증하였다.

세포 transfection

HFLS-RA 세포를 6-웰 플레이트에 웰당 5 × 105 cells/well 밀도로 분주하였다. 세포는 제조사의 지침에 따라 리포좀 기반의 transfection 시약을 사용하여 transfection하였다. transfection 그룹은 단독 transfection 그룹과 공동 transfection 그룹으로 나누었다. 단독 transfection 그룹은 다음과 같다: 1) 대조군—transfection되지 않은 세포; 2) mimic 음성 대조군 (NC)—miR-488-3p mimic의 음성 대조군을 transfection한 세포; 3) miR-488-3p mimic—miR-488-3p mimic을 transfection한 세포; 4) inhibitor NC—miR-488-3p inhibitor의 음성 대조군을 transfection한 세포; 5) miR-488-3p inhibitor—miR-488-3p inhibitor를 transfection한 세포. 공동 transfection 그룹은 다음과 같다: 1) miR-488-3p mimic + overexpression-NC (oe-NC)—miR-488-3p mimic과 ROCK1 과발현 벡터의 음성 대조군을 공동 transfection한 세포; 2) miR-488-3p mimic + oe-ROCK1—miR-488-3p mimic과 ROCK1 과발현 벡터를 공동 transfection한 세포. 모든 transfection 서열은 부록 표 1 (Supplementary Table 1)에 요약되어 있다. ROCK1 과발현 벡터는 코딩 서열 (CDS) 영역을 pcDNA 3.1 플라스미드에 클로닝하여 제작하였다. transfection된 세포는 transfection 48 h 후에 후속 실험에 사용되었다.

세포 기능 분석

세포 증식 분석 (Cell Counting Kit-8 [CCK-8]): 형질전환된 HFLS-RA 세포를 96-well 플레이트에 웰당 5 × 103 cells/well의 밀도로 접종하였으며, 그룹당 3개의 반복 웰을 설정하였다. 형질전환 후 0, 24, 48, 72시간에 각 웰에 10 µL의 CCK-8 용액을 첨가하고, 37 °C에서 2시간 동안 배양하였다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450 nm(검출 파장) 및 630 nm(참조 파장)에서 흡광도를 측정하였다. 상대적 증식률은 0시간을 기점으로 계산하였다.

세포 사멸 검출 (유세포 분석): Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC)/propidium iodide (PI) 세포 사멸 분석법으로 세포 사멸을 평가하였다. 적절한 플라스미드를 세포에 형질전환시킨 후, 트립신 처리를 통해 세포를 수집하였다. 세포 사멸률은 유세포 분석법으로 측정하였다.

염증 인자 분석 (효소결합 면역흡착 분석법 [ELISA]): HFLS-RA 세포를 24-well 플레이트에 분주하고, 지정된 miR-488-3p mimic, miR-488-3p inhibitor 또는 각각의 음성 대조군을 사용하여 48시간 동안 transfection을 수행하였다. 세포 배양 상층액 내 interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-α (TNF-α) 및 interleukin-1β (IL-1β)의 농도를 ELISA 키트를 사용하여 정량하였다.

타겟 검증

표적 예측: TargetScan 데이터베이스26를 사용하여 ROCK1이 miR-488-3p의 하위 표적일 것으로 예측되었습니다. miR-488-3p와 ROCK1 3′-비번역 지역(3′UTR) 사이의 예측된 결합 부위 또한 확인되었습니다.

이중 루시퍼레이스 리포터 유전자 분석: ROCK1의 야생형 또는 변이형 3′UTR을 pGL3 플라스미드에 클로닝하였다. 예측된 결합 부위 및 변이 부위는 그림 4에 나타내었다. HEK- 293T 세포에 miR-488-3p mimic 또는 inhibitor를 구축된 벡터와 함께 공동 형질전환시켰다27. miR-488-3p mimic 또는 inhibitor를 형질전환시킨 48시간 후에 루시퍼레이스 활성을 측정하였다.

RNA 면역침강법 (RIP): HFLS-RA 세포를 anti-Argonaute 2 (Ago2) 항체 (RRID: AB_2882071, 1:200 희석) 또는 면역글로불린 G (IgG) 대조 항체 (RRID: AB_2819160, 1:5000 희석)와 함께 배양한 후, 앞서 설명한 바와 같이 RNA 추출 및 quantitative PCR (qPCR)을 수행하여 ROCK1 mRNA의 농축 정도를 분석하였다.

통계 분석

본 연구의 통계 분석은 SPSS 23.0 (RRID: SCR_002865) 및 GraphPad Prism 9.0 (RRID: SCR_002798)을 사용하여 수행하였다. 측정 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 표기하였다. 모든 실험은 3회의 생물학적 반복 실험으로 수행되었으며, 각 생물학적 반복 시료는 3번씩 반복 측정하여 분석하였다. 원시 데이터는 보충 자료에 첨부하였다. 모수적 통계 검정 전, 정규 확률(P-P) 플롯을 사용하여 데이터의 정규성을 평가하였다. 연령, 체질량지수(BMI) 등과 같은 연속형 기저 변수의 비교에는 독립표본 t-검정을 사용하였고, 성별 등과 같은 범주형 변수에는 카이제곱 검정을 사용하였다. 유전자 발현 수준은 독립표본 t-검정을 통해 비교하였다. 서로 다른 시점에서의 세포 증식 변화는 반복측정 분산분석(ANOVA)으로 분석하였으며, 유세포 분석으로 측정된 세포 사멸률의 비교에는 일원 분산분석(one-way ANOVA)을 사용하였다. 상관관계 분석은 정규분포를 따르지 않는 변수의 경우 Spearman 분석을, 정규분포를 따르는 변수의 경우 Pearson 분석을 통해 수행하였다. 진단 성능은 수신자 조작 특성(ROC) 곡선 분석을 통해 평가하였다. 최적 차단값(cutoff value), 민감도 및 특이도는 최대 Youden 지수를 사용하여 결정하였다. 모든 통계 검정은 양측 검정으로 수행되었으며, p < 0.05일 때 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

결과

연구 참여자의 기본 특성

본 연구에서는 체계적인 분석을 위해 건강한 대조군 125명, 골관절염(OA) 환자 130명, 류마티스 관절염(RA) 환자 135명을 포함하였습니다(표 1). 세 그룹 간의 연령(p = 0.191), 성비(p = 0.203) 및 BMI(p = 0.562)의 기저 특성에는 유의미한 차이가 없었으며, 이를 통해 연구 대상 집단의 비교 가능성을 확보하였습니다. 질환 특성과 관련하여, RA 그룹의 ESR(82.63 ± 40.32 vs. 18.39 ± 6.38 mm/h, p < 0.001) 및 CRP 수치(56.33 ± 38.07 vs. 10.54 ± 4.98 mg/L, p < 0.001)는 OA 그룹보다 유의하게 높았으며, 이는 전신 염증 수준을 반영합니다. 한편, RA와 관련된 혈청학적 표지자인 RF는 70.37%(95/135)에서 양성을 보였으며, 혈청 농도가 유의하게 높았습니다(144.13 ± 81.05 vs. 5.10 ± 1.37 IU/mL, p < 0.001). 또한 RA 환자의 anti-CCP 양성률은 56.30%(76/135)였으며, DAS28 점수는 4.12 ± 1.36이었습니다.

RA 환자에서 miR-488-3p의 발현 특성 및 진단적 가치

RA 환자의 혈청 내 miR-488-3p 발현 수준은 OA 환자 및 건강한 대조군에 비해 유의하게 감소되어 있었다(p < 0.0001, Figure 1A). ROC 곡선 분석 결과, miR-488-3p는 RA를 OA 및 건강한 대조군과 구별하는 데 있어 높은 진단 정확도를 보였다. RA와 건강한 대조군을 구별할 때 AUC 값은 0.931 (95% CI: 0.896–0.967), 민감도는 96.15% (95% CI: 91.31%–98.35%), 특이도는 80.95% (95% CI: 73.22%–86.85%, p < 0.001, Figure 1B)였으며, RA와 OA 환자를 구별할 때 AUC 값은 0.800 (95% CI: 0.747–0.854), 민감도는 85.93% (95% CI: 79.06%–90.80%), 특이도는 66.15% (95% CI: 57.66%–73.72%, p < 0.001, Figure 1C)였다. 다변량 로지스틱 회귀 분석을 통해 miR-488-3p가 RA 위험과 관련된 독립적 요인임을 확인하였다 (OR = 0.166, 95% CI: 0.097–0.284; Table 2).

RA 임상 지표와 miR-488-3p의 상관관계 분석

혈청 miR-488-3p 발현 수준은 ESR, CRP, RF 및 DAS28을 포함한 RA의 주요 임상 지표와 유의미한 음의 상관관계를 보였다 (모두 p < 0.001; 표 3). 구체적으로, miR-488-3p는 ESR (r = −0.718), CRP (r = −0.726), RF (r = −0.805) 및 DAS28 점수 (r = −0.836)와 음의 상관관계를 나타냈다 (표 3).

miR-488-3p의 과발현은 HFLS-RA 세포의 세포 증식과 염증 반응을 억제하고 세포 사멸을 유도한다

miR-488-3p가 HFLS-RA 기능에 미치는 영향을 조사하기 위해, mimic 및 inhibitor를 이용한 transfection으로 miR-488-3p의 발현을 조절하였습니다. RT-qPCR 분석 결과, miR-488-3p mimic 그룹의 miR-488-3p 발현 수준은 대조군에 비해 유의하게 높았으며 (p = 0.0001), miR-488-3p inhibitor 그룹의 발현 수준은 유의하게 낮았습니다 (p = 0.0003, Figure 2A). CCK-8 분석 결과, miR-488-3p의 과발현은 세포 증식을 억제하였으며, 이는 24 h, 48 h, 72 h에서 대조군보다 유의하게 낮았습니다 (p = 0.0208, p < 0.0001, p = 0.0036). 반면 miR-488-3p 발현의 억제는 세포 증식을 유의하게 증가시켰습니다 (Figure 2B). 유세포 분석 결과, miR-488-3p의 과발현은 세포 사멸(apoptosis)을 유의하게 촉진하였습니다 (p = 0.0033, Figure 2C).

이후 miR-488-3p 발현 상향 조절이 염증성 사이토카인 수치에 미치는 영향을 조사하기 위해 ELISA를 수행했습니다. 결과적으로 miR-488-3p를 과발현시켰을 때 염증성 사이토카인(IL-6, TNF-α, IL-1β)의 수치가 유의하게 감소한 반면(p < 0.0001, 그림 3A-C), miR-488-3p 발현을 억제했을 때는 반대 효과가 나타났습니다. 이러한 유의미한 조절 효과는 세 차례의 독립적인 생물학적 반복 실험 모두에서 검증되었으며, 음성 대조군에서는 유의한 변화가 나타나지 않았습니다(p > 0.05).

MiR-488-3p는 ROCK1 분자의 ROCK1 발현을 조절한다

RA 질환 진행에서 miR-488-3p의 역할에 내재된 분자적 기전을 규명하기 위해, 우리는 miR-488-3p의 하위 타겟을 탐색하였습니다. 생물정보학 분석 결과, miR-488-3p가 ROCK1의 3'UTR 영역에 결합하는 것으로 예측되었습니다(그림 4A). 이중 루시페레이스 리포터 분석을 통해 야생형 ROCK1 3'UTR을 miR-488-3p mimic과 함께 공동 형질전환시켰을 때 루시페레이스 활성이 유의하게 감소하였으며(p < 0.0001), miR-488-3p 발현을 억제했을 때는 루시페레이스 활성이 유의하게 증가함을 확인하였습니다(p < 0.0001). 반면, 결합 부위를 돌연변이시킨 후에는 이러한 조절 효과에 유의한 변화가 없었습니다(그림 4B). RIP 실험을 통해 이러한 조절 관계를 추가로 검증하였으며, IgG 대조군과 비교하여 Ago2 항체로 농축된 복합체에서 ROCK1 mRNA의 발현 수준이 유의하게 증가한 것을 확인하였습니다(p < 0.0001, 그림 4C).

또한, 임상 시료에서 ROCK1은 miR-488-3p와는 반대되는 발현 패턴을 보였으며, OA 환자와 건강한 대조군 모두에 비해 ROCK1의 유의미한 상향 조절이 관찰되었습니다(그림 4D). HFLS-RA 세포에서 RT-qPCR 분석 결과, miR-488-3p의 과발현은 ROCK1 발현의 유의미한 감소를 초래한 반면(p = 0.0093), miR-488-3p의 억제는 ROCK1 발현을 유의미하게 증가시켰습니다(p = 0.0003, 그림 4E).

ROCK1은 HFLS-RA 세포에 대한 miR-488-3p의 조절 효과를 매개한다

HFLS-RA 세포에서 miR-488-3p 과발현에 의한 ROCK1 발현 억제는 ROCK1 과발현 벡터의 transfection을 통해 반전되었습니다 (Figure 5A). 마찬가지로, miR-488-3p 과발현이 세포 증식에 미치는 억제 효과는 ROCK1 과발현에 의해 약화되었습니다 (Figure 5B). 또한, ROCK1 과발현은 miR-488-3p에 의해 유도된 세포 사멸 증가를 반전시켰으며 (Figure 5C), miR-488-3p 과발현으로 인해 억제되었던 염증성 사이토카인 수치를 회복시켰습니다 (Figure 5D).

RA 연구에서의 발현 분석 및 민감도-특이도를 나타내는 바이올린 도표 및 ROC 곡선
그림 1. 류마티스 관절염(RA), 골관절염(OA) 환자 및 건강한 대조군에서 miR-488-3p의 발현 수준 및 진단 성능. (A) RA 환자, OA 환자 및 건강한 대조군에서 miR-488-3p의 상대적 발현 수준 비교. (B) 건강한 대조군으로부터 RA를 구별하기 위한 miR-488-3p의 수신자 조작 특성(ROC) 곡선 분석. (C) OA 환자로부터 RA를 구별하기 위한 miR-488-3p의 ROC 곡선 분석. AUC, 곡선 아래 면적; CI, 신뢰 구간. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

유전자 발현 분석; 막대 그래프 및 선 그래프; 세포 생존력, 세포 사멸, miR-488-3p의 효과.
그림 2. HFLS-RA 세포에서 miR-488-3p의 기능적 효과. (A) 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR)으로 측정한 형질전환된 HFLS-RA 세포 내 miR-488-3p의 상대적 발현량. (B) miR-488-3p의 과발현 및 억제가 세포 증식에 미치는 영향. (C) miR-488-3p의 과발현 및 억제가 세포 사멸에 미치는 영향. 데이터는 평균 ± SD로 표시됨. 모든 측정은 3회의 생물학적 반복 실험과 각 실험당 3회의 기술적 반복 실험을 통해 수행됨. p < 0.05는 표시된 그룹 간에 통계적으로 유의미한 차이가 있음을 나타냄. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

사이토카인 농도 막대 그래프; 패널 A-C; IL-6, TNF-α, IL-1β; 통계적 비교.
그림 3. 염증성 사이토카인 분비에 미치는 miR-488-3p의 영향. (A) Interleukin-6 (IL-6). (B) Tumor necrosis factor-α (TNF-α). (C) Interleukin-1β (IL-1β). 사이토카인 농도는 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA)으로 측정하였다. 데이터는 평균 ± SD로 나타내었다. 모든 측정은 3회의 생물학적 반복 실험을 수행하였으며, 각 실험당 3회의 기술적 반복 실험을 실시하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

루시페라아제 분석 도식: miRNA와 ROCK1의 상호작용, 막대 그래프 및 데이터 분석 결과.
그림 4miR-488-3p의 ROCK1 표적 조절의 기저에 있는 분자적 기전 검증. (A) ROCK1의 3′-비번역부위(3′UTR) 내 miR-488-3p의 예측 결합 부위. (B) miR-488-3p와 야생형 또는 변이형 ROCK1 3′UTR 간의 상호작용을 입증하는 이중 루시퍼레이스 리포터 분석. (C) Argonaute 2 (Ago2) 항체 농축 복합체에서 ROCK1 전령 RNA (mRNA)의 농축을 보여주는 RNA 면역침강 (RIP) 분석. (D) RA 환자, OA 환자 및 건강한 대조군에서의 상대적 ROCK1 발현 수준. (E) 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-qPCR)으로 측정한 형질전환된 HFLS-RA 세포의 상대적 ROCK1 발현량. 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 나타내었다. 모든 측정은 3회의 생물학적 반복 실험을 수행하였으며, 각 반복 실험당 3회의 기술적 반복 실험을 실시하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

miR-488-3p mimic 방법을 사용하여 ROCK1 수준과 염증성 마커를 비교한 유전자 발현 차트.
그림 5. miR-488-3p에 의한 HFLS-RA 세포 조절에서 ROCK1의 관여. (A) 세포 형질전환 후 HFLS-RA 세포 내 ROCK1 발현 조절. (B) miR-488-3p 과발현 조건에서 ROCK1 과발현이 세포 증식에 미치는 영향. (C) miR-488-3p 과발현 조건에서 ROCK1 과발현이 세포 사멸에 미치는 영향. (D) miR-488-3p 과발현 조건에서 ROCK1 과발현이 염증성 사이토카인 생성에 미치는 영향. 데이터는 평균 ± SD로 표시됨. 모든 측정은 각각 3회의 기술적 반복을 포함하는 3회의 생물학적 반복을 통해 수행됨. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

변수대조군 (n = 125)골관절염 (n = 130)RA (n = 135)p-값
연령 (세)55.10 ± 9.3057.21 ± 10.2755.22 ± 11.610.191
성별 (수컷/암컷)74/5163/6769/660.203
BMI (kg/m²2)22.79 ± 1.7322.98 ± 1.9823.04 ± 2.050.562
질병 기간 (년)-7.96 ± 4.008.03 ± 3.830.882
Anti-CCP 양성 (n/%)--76 (56.30)-
적혈구 침강 속도 (mm/h)18.39 ± 6.3882.63 ± 40.32<0.001
CRP (mg/L)10.54 ± 4.9856.33 ± 38.07<0.001
RF 양성--95 (70.37)
RF (IU/mL)-5.10 ± 1.37144.13 ± 81.05<0.001
DAS28--4.12 ± 1.36-

표 1: 연구 참여자의 기초 특성. 세 연구 그룹은 인구통계학적 특성 면에서 서로 비슷하였다. RA 환자들은 염증 마커와 RF 수치가 상승된 양상을 보였다.

변수또는95% 신뢰구간pp-값
연령 (세)1.4110.822–2.4220.211
성별 (수컷/암컷)1.2090.707–2.0670.489
BMI (kg/m²)]2)1.3360.778–2.2950.293
질환 기간 (년)1.130.663–1.9290.653
MiR-483-3p0.1660.097–0.284<0.001

표 2: 골관절염에서 류마티스 관절염으로의 진행과 연관된 다변량 로지스틱 회귀 분석 기반 독립 요인. MiR-488-3p가 골관절염 환자의 류마티스 관절염 발생 위험과 연관되어 있음이 확인되었다.

항목MiR-488-3p (류마티스 관절염)pp-값
상관관계(r)
적혈구 침강 속도 (mm/h)-0.718<0.001
CRP (mg/L)-0.726<0.001
RF (IU/mL)-0.805<0.001
DAS28 -0.836<0.001

표 3: RA 환자의 miR-488-3p와 임상병리학적 특징 간의 상관관계. RA 환자에서 miR-488-3p는 ESR, CRP, RF 및 DAS28 점수와 유의미한 음의 상관관계를 보였다.

보충 표 1. 세포 형질전환 및 PCR 분석의 서열 정보. 본 연구에 사용된 프라이머 서열과 형질전환 시약이 요약되어 있습니다.여기를 클릭하여 파일을 다운로드하십시오.

토론

RA의 진단 및 치료에 관한 최신 가이드라인에서 Smolen 등1이 강조했듯이, 새로운 바이오마커의 개발은 상당한 임상적 가치를 지닙니다. 본 연구에서 우리는 RA 환자의 혈청 내 miR-488-3p가 유의하게 하향 조절되었음을 확인하였으며, 상대적으로 만족스러운 민감도와 특이도를 보이며 유망한 진단 성능을 나타냈습니다. RA의 조기 진단은 항상 임상적인 어려움이었으며, 기존의 바이오마커들은 RA 진단에 있어 충분히 민감하지 않았으나, miR-488-3p의 유의미한 진단 잠재력은 특히 혈청 음성 RA 환자의 식별에 있어 이러한 공백을 메울 수 있을 것입니다. 건강한 대조군과 비교했을 때, RA 환자는 더 뚜렷한 전신 염증을 보였습니다. OA 환자는 주로 국소적인 퇴행성 관절 질환을 겪지만, 저등급의 전신 염증이 빈번하게 관찰됩니다. 따라서 miR-488-3p의 판별 효율은 OA 환자와 비교했을 때보다 건강한 대조군과 비교했을 때 훨씬 더 높았습니다. miR-488-3p의 진단 성능을 기존의 임상 바이오마커들과 직접적으로 비교하지는 않았습니다. 본 연구에 포함된 환자들은 anti-CCP 항체, RF, ESR, CRP와 같은 확립된 바이오마커들을 통합한 현재의 RA 임상 표준 진단 기준에 따라 진단되었습니다. OA 환자와 RA 환자 사이에서 이러한 마커들의 유의미한 차이가 관찰되었습니다(Table 1). 따라서 본 코호트는 miR-488-3p의 진단 성능을 이러한 기존 바이오마커들과 직접적으로 비교하기에는 적합하지 않았습니다. 이러한 비교를 위해서는 독립적인 검증 코호트가 필요합니다.

또한, miR-488-3p의 발현 수준은 전신 염증 마커(ESR, CRP)28 및 자가항체(RF)6를 포함한 RA의 다양한 임상 지표와 유의미한 음의 상관관계가 있는 것으로 나타났습니다. 특히 임상적으로 중요한 점은, miR-488-3p가 질병 활성도 점수(DAS28)와 강한 음의 상관관계를 보였다는 것입니다. DAS28은 관절 부종, 압통, 염증 및 환자의 임상 상태를 기반으로 질병 활성도를 반영하는 복합 지표입니다. 따라서 이러한 결과는 miR-488-3p가 RA의 질병 활성도를 나타내는 잠재적 바이오마커로 활용될 수 있음을 시사합니다. 이는 또한 RA 발병 기전에서 miR-488-3p의 조절 역할을 뒷받침하며, 염증성 신호 전달 경로 또는 자가면역 반응을 억제함으로써 질병 진행에 영향을 미칠 수 있음을 보여줍니다29.

기능 실험에서, miR-488-3p는 RA 환자 유래 HFLS-RA 세포의 증식을 억제하고 세포 사멸을 촉진하며, 염증성 사이토카인(IL-6, TNF-α 및 IL-1β)의 생성을 유의하게 감소시키는 것을 확인했습니다. HFLS-RA 세포는 RA의 병리 과정에서 핵심적인 역할을 하며30, 이들의 비정상적인 증식과 침습적 성장은 활막 증식 및 관절 파괴로 이어질 수 있는 반면, 염증 인자의 과잉 생산은 국소 및 전신 염증 반응을 더욱 악화시킵니다31. 따라서 miR-488-3p에 의한 HFLS-RA 기능 조절은 RA에서 활막 침습과 골 미란을 직접적으로 억제할 수 있으며, 이는 새로운 표적 치료 전략 개발을 위한 이론적 근거를 제공합니다. 이전 연구들에서 miR-155와 같은 다른 miRNA들이 활막 세포 기능을 조절함으로써 RA 진행에 영향을 미칠 수 있음이 밝혀졌으며19, 이는 본 연구의 결과를 더욱 뒷받침합니다.

기전 연구 결과, miR-488-3p가 ROCK1의 3'UTR에 결합하여 이를 직접적으로 표적하고 발현을 억제할 수 있음이 입증되었습니다. ROCK1은 세포골격 재구성, 염증 반응 및 섬유화에 관여하는 Rho/ROCK 신호 전달 경로의 핵심 작동 분자입니다32. 이전 연구들에 따르면, ROCK1은 RA 활막세포에서 높게 발현되며 이들의 이동과 침습을 촉진하는 것으로 나타났습니다33. 예상대로, ROCK1의 과발현은 HFLS-RA 세포에서 miR-488-3p가 나타내는 효과를 유의미하게 되돌렸으며, 이는 RA 진행 과정에서 miR-488-3p의 조절 역할에 ROCK1이 관여하고 있음을 나타냅니다.

하지만 향후 연구에서 수행해야 할 과제가 여전히 많이 남아 있습니다. 임상 샘플에서의 miR-488-3p 발현은 U6를 내부 대조군으로 사용하여 RT-qPCR로 평가되었습니다. 이전 연구들은 특히 혈청과 같은 순환 샘플에서 U6의 안정성에 대해 서로 상충되는 결과를 보고한 바 있습니다. 본 연구에서는 U6의 안정성을 확보하기 위해 예비 실험을 수행하였으나, U6의 잠재적인 변동성은 여전히 한계점으로 남아 있으며, 이는 오진의 위험을 높일 수 있습니다. 따라서 더 안정적인 내부 대조 유전자를 이용한 추가 검증이 필요합니다. 한편, miR-488-3p의 임상 평가는 외부 검증 없이 단일 센터 코호트를 기반으로 이루어졌습니다. 샘플 크기가 상대적으로 작았으며, 병원 규모로 제한되었습니다. 또한, miR-488-3p의 예후 가치를 평가하는 종단적 추적 관찰이 부족했습니다. 이러한 한계점들은 향후 연구에서 다루어져야 합니다. 아울러, 일부 연구에서는 miRNA의 in vivo 전달이 임상 적용을 위한 주요 과제로 남아 있음을 보여줍니다34. 향후 연구에서는 조건부 녹아웃 마우스를 구축하거나 나노캐리어와 같은 표적 전달 시스템을 사용하여 miR-488-3p의 in vivo 치료 잠재력을 검증할 수 있을 것입니다35.

결론적으로, 본 연구는 RA의 진단 및 잠재적 치료 표적으로서 miR-488-3p의 잠재적 가치를 밝혔습니다. miR-488-3p는 높은 진단 성능을 보였으며, HFLS-RA 세포의 증식과 염증 반응을 억제하는 동시에 세포 사멸을 촉진했습니다. 이는 miR-488-3p가 RA의 새로운 치료 전략 개발을 위한 유망한 표적이 될 수 있음을 시사합니다. 향후 연구는 1) 대규모 다기관 코호트에서 miR-488-3p의 진단 안정성을 검증하고, 2) JAK 억제제나 생물학적 제제28와 같은 기존 치료제와의 시너지 효과를 탐색하며, 3) 임상적 중개 가능성을 높이기 위해 miRNA 전달 시스템을 최적화하는 것36에 집중해야 합니다.

데이터 가용성:

본 연구의 결과를 뒷받침하는 원시 데이터는 이 원고와 함께 제출된 보충 자료에서 확인할 수 있습니다.

공개 사항

저자들은 이해 상충 관계가 없음을 선언합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Annexin V-FITC Apoptosis Detection KitBD Bioscience556547세포 사멸
anti-Ago2 antibodyProteintech66720-1-IgRNA 면역침전
CCK-8 solutionDojindoCK04세포 증식
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher121000146세포 배양
Fetal bovine serumThermo Fisher10437028세포 배양
유세포 분석기BD Bioscience FACSCalibur세포 사멸
Human anti-CCP antibody ELISA KitCusabioCSB-E09077h anti-CCP 검출
Human RF-IgA ELISA KitFeien BiotechnologyEH4270RF 검출
인간 류마티스 관절염 섬유아세포样 활막세포 (HFLS-RA)Cell ApplicationsHFLS-RA-200miR-488-3p 기능의 인 비트로 검증
IgG 대조 항체Abcamab205718RNA 면역침전
Interleukin-1β (IL-1β) ELISA KitR&D SystemsDY201-05세포 내 IL-1β 농도
Interleukin-6 (IL-6) ELISA KitR&D SystemsD6050B세포 내 IL-6 농도
Liposome Transfection Reagent 3000Ingenuity Life TechnologiesL3000015세포 형질전환
마이크로플레이트 리더BioTek ELx808ELISA 분석
Mir-XTM miRNA First-Strand Synthesis KitNihonbao Bioengineering Co., Ltd.638313역전사
Opti-MEM mediumIngenuity Life Technologies, Inc31985070세포 형질전환
pcDNA 3.1InvitrogenV790-20ROCK1 과발현
Penicillin-streptomycinThermo Fisher15140122세포 배양
Phadia 250 Laboratory SystemThermo Fisher Phadia 250혈액 분석
PrimeScriptTM Reverse Transcription KitNihonbao Bioengineering Co., Ltd.RR037A역전사
Propidium iodide (PI)/ ribonuclease (RNase)BD Bioscience550825세포 사멸
QuantStudio 5 systemApplied Biosystems, Inc.A28138PCR 분석
RNAiso Plus reagentNihonbao Bioengineering Co., Ltd.9108RNA 분리
SYBR Green Premix Ex TaqNippon Poh Bio-Engineering Co., Ltd.RR420APCR 증폭
TargetScan 데이터베이스TargetScanN/A결합 부위 예측, (https://www.targetscan.org/) 
Tina-quant C-Reactive Protein IVRoche Diagnostics7876033190CRP 검출
Tumor necrosis factor-α (TNF-α) ELISA KitR&D SystemsDY210-05세포 내 TNF-α 농도

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