본 프로토콜은 미생물 대사체 타겟 예측, 직장 점막 전사체 분석, 단백질-단백질 상호작용 및 경로 농축 분석, 분자 도킹, 분자 역학 시뮬레이션, 그리고 Molecular mechanics/Poisson–Boltzmann surface area (MM-PBSA) 결합 자유 에너지 추정을 통합하여, 실험적 후속 연구를 위해 우선순위가 지정된 대사체 관련 호스트 유전자 후보 목록과 구조적으로 우선순위가 정해진 단백질-리간드 복합체 목록을 생성합니다.
방법 논문
변비형 과민성 대장 증후군에서 미생물 대사물질 관련 호스트 유전자의 우선순위 결정을 위한 계산 워크플로우
이 논문에서
요약
초록
공개된 화학, 게놈 및 구조 데이터베이스로부터 미생물 대사체 관련 호스트 유전자와 단백질-리간드 복합체를 체계적으로 우선순위화하는 표준화된 계산 파이프라인은 존재하지 않습니다. 본 논문에서는 사용자가 정의한 장내 미생물 유래 대사체 세트를 입력값으로 하여, 실험적 후속 조치를 위한 후보 대사체 관련 호스트 유전자, 농축된 생물학적 경로 및 구조적으로 우선순위가 지정된 단백질-리간드 복합체의 순위화된 쇼트리스트를 생성하는 8단계 워크플로우를 설명합니다. 이 파이프라인은 (i) 화학정보학적 대사체 프로파일링, (ii) 단백질-화학물질 상호작용 및 리간드 기반 표적 예측 도구와 분자 도킹 프로그램을 이용한 다중 데이터베이스 후보 표적 예측, (iii) 공개된 전사체 데이터의 차등 유전자 발현 분석, (iv) 표적-차등 발현 유전자 중첩 분석, (v) 단백질-단백질 상호작용 네트워크 구축 및 경로 농축 분석, (vi) 분자 도킹 프로그램을 이용한 분자 도킹, (vii) 분자 동역학 시뮬레이션용 단백질 포스 필드를 적용한 분자 동역학 엔진을 이용한 200 ns 분자 동역학 시뮬레이션, (viii) MM-PBSA 결합 자유 에너지 추정 단계를 통합합니다. 적용 사례로서, 단쇄 지방산, 담즙산, 트립토판 유래 대사체 및 urolithin A를 대표하는 9종의 장내 미생물 유래 또는 미생물 변형 대사체를 공개된 IBS-C 직장 점막 전사체 데이터셋 GSE36701을 사용하여 처리하였습니다. 해당 워크플로우를 통해 이 데이터셋에서 차등 발현된 17개의 고유한 예측 대사체 관련 유전자의 순위를 매겼습니다. 도킹, 분자 동역학 시뮬레이션 및 MM-PBSA 분석을 통해 구조적으로 우선순위가 지정된 5개의 대사체-단백질 복합체는 다음과 같습니다: lithocholic acid-VDR, lithocholic acid-NR1H4/FXR, ursodeoxycholic acid-NR1H4/FXR, tryptamine-HTR2A (명시적 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) 지질 이중층에서 시뮬레이션됨), 및 urolithin A-CASP3. 본 프로토콜은 다른 대사체 세트, 질병 전사체 데이터셋 및 표적 클래스에 맞게 조정 가능하도록 설계되었습니다. 모든 출력물은 가설 생성 단계의 계산 예측이며, 인과 관계나 치료적 결론을 내리기 전에는 독립적인 전사체 복제, 단백질 수준의 검증 및 기능적 리간드 반응 분석이 필요합니다.
서론
변비형 과민성 장 증후군(IBS-C)은 반복적인 복통, 배변 습관의 변화, 팽만감 및 변비를 특징으로 하는 흔한 기능성 위장관 질환으로, 전 세계 일반 인구의 약 10–15%에서 발생하는 것으로 추정됩니다1,2. 분비 촉진제, 위장관 운동 촉진제 및 진경제를 포함한 현재의 약물 요법은 일부 환자의 개별 증상을 개선할 수 있으나, 치료 반응은 여전히 다양하며 지속적인 관해 상태에 도달하는 경우는 드뭅니다. 이는 해당 질환의 복잡하고 다요인적인 병리 생리학적 특성을 반영합니다1,3,4. 따라서 새로운 치료 표적에 대한 검증 가능한 가설을 세우기 위해서는 장내 미생물 신호가 점막 수준에서 어떻게 전달되는지에 대한 보다 완전한 기전적 이해가 필요합니다.
장내 미생물군은 단쇄 지방산(SCFA), 이차 담즙산, 트립토판 유래 화합물 및 우롤리틴과 같은 폴리페놀 유래 대사물을 포함하여 화학적으로 다양한 대사물을 생성하고 생체 변환함으로써 하부 위장관의 항상성에 기여합니다5,6,7,8. 이러한 분자들은 전형적인 대사물 감지 막 수용체를 훨씬 넘어 핵 수용체, 세포질 효소, 히스톤 수정 단백질, 펩타이드 호르몬 전구체 및 세포 내 신호 전달 단백질을 아우르는 광범위하고 아직 완전히 규명되지 않은 분자 표적 목록을 통해 호스트 세포와 소통합니다9. 과민성 대장 증후군(IBS) 환자에게서 장내 미생물 군집 구성과 대사물 프로필의 변화가 기록되었으며, 이는 미생물 대사물 반응성과 관련된 호스트 유전자가 IBS-C 직장 점막에서 전사적으로 교란되었는지 조사하는 생물학적 근거를 제공합니다10.
9가지 대사체 패널은 장내 미생물 유래 또는 미생물에 의해 변형된 소분자들의 집합을 조밀하고 화학적으로 다양하며 생물학적으로 해석 가능하게 제공하기 위해 사전에 정의되었다. 선정 기준은 다음의 다섯 가지였다: 호스트-미생물 신호 전달에 관여하는 주요 미생물 대사체 클래스의 대표성; 알려져 있거나 가능성 있는 원위부 장점막 노출; 명확한 PubChem 식별자 및 표준 구조의 가용성; 리간드 기반 표적 예측 및 도킹을 위한 분자 크기와 구조적 취급 가능성; 그리고 IBS-C에서의 상피, 신경면역, 장내분비, 핵 수용체 또는 운동성 관련 신호 전달에 대한 사전 가능성이다. 선정된 패널에는 SCFA로서 butyrate와 propionate; 담즙산으로서 chenodeoxycholic acid, lithocholic acid, ursodeoxycholic acid; tryptophan 유래 대사체로서 tryptamine, indole-3-propionic acid, indole-3-lactic acid; 그리고 장내 미생물 유래 폴리페놀 대사체로서 urolithin A가 포함되었다5,6,7,8,9,10.
대부분의 이전 전산 및 실험적 연구는 개별 대사체-수용체 또는 대사체-효소 쌍을 독립적으로 조사했으며, 이러한 접근 방식은 호스트 경로 전반에 걸친 미생물 대사체 신호 전달의 분산되고 수렴적인 특성을 포착하지 못합니다9,11. 여러 분석 단계의 통합은 단일 단계가 독립적으로 제공할 수 없는 상호 보완적인 필터링 능력을 부여합니다. 큐레이션된 데이터베이스를 기반으로 한 전산 표적 예측을 통해 각 대사체에 대한 광범위한 후보 호스트 단백질 세트를 도출합니다. 이를 질병 관련 전사체 데이터와 교차 분석하면 후보군이 상당히 필터링되어, 질병 상황에서 전사체가 변형된 후보들만 유지됩니다. 이후 경로 농축 및 단백질-단백질 상호작용 네트워크 분석을 통해 축소된 후보 목록을 알려진 생물학적 모듈에 매핑합니다. 분자 도킹은 각 후보 복합체에 대한 결합 포켓 보완성의 초기 전산 평가를 제공하며, MM-PBSA 결합 자유 에너지 분해를 이용한 추가적인 200 ns 분자 역학(MD) 시뮬레이션은 도킹 점수만으로는 얻을 수 없는 시간 분해능의 열역학적 차원에서 구조적 우선순위 결정을 가능하게 합니다. 체계적인 통합과 순차적 필터링 없이 각 단계를 독립적으로 수행할 경우, 후보 목록이 너무 광범위하여 실험적으로 다루기 어려워지며 수렴 경로 구조를 감지하는 데 실패하게 될 것입니다.
본 프로토콜 전체의 틀 내에서 “대사물질 관련 유전자”(metabolite-associated gene, MAG)라는 용어는, 적어도 하나 이상의 큐레이션된 계산 예측 데이터베이스에 의해 하나 이상의 장내 미생물 유래 대사물질의 추정 분자 표적으로 지명되었으며, 워크플로우를 입증하는 데 사용된 질병 관련 전사체 데이터셋에서 전사체가 차등 발현된 인간 유전자를 의미합니다. 이 조작적 정의는 막 수용체와 핵 수용체, 세포질 효소, 신호 전달 단백질, 펩타이드 호르몬 전구체 및 기타 세포 내 단백질을 의도적으로 포함합니다. MAG 지정은 대사물질이 결합하거나, 단백질-리간드 복합체를 형성하거나, 수용체를 활성화하거나, 단백질 양을 변화시키거나, 질병을 유발한다는 실험적 증거가 아니라, 실험적 검증이 필요한 계산 기반의 가설 생성 지명입니다.
본 프로토콜은 독립적인 재현, 다른 대사체 패널 또는 질병 데이터 세트로의 적응, 그리고 다른 호스트-미생물군집 상호작용 맥락으로의 확장이 가능하도록 충분한 운영 세부 사항을 포함한 전체 8단계 계산 워크플로(그림 1)를 설명합니다. 이 워크플로는 공개적으로 이용 가능한 오믹스 및 구조 자원만을 활용하여 작동하는 가설 생성 및 구조적 우선순위 지정 프레임워크로 명시적으로 범위가 설정되었으며, 계산 결과만으로 대사체 농도의 변화, 수용체 활성 상태, 단백질 발현 변화, 하위 신호 전달 활성 또는 임상적 유의성을 추론하지 않습니다. 여기서는 9가지 장내 미생물군집 유래 또는 미생물군집 변형 대사체와 공개 IBS-C 직장 점막 전사체 데이터 세트 GSE36701을 사용하여, MAG를 식별하고 후속 실험적 검증을 위한 대사체-단백질 복합체의 우선순위를 지정하는 것을 목표로 본 프로토콜의 실제 적용 사례를 시연합니다.
프로토콜
본 분석에는 GSE36701의 공개적으로 이용 가능한 비식별 전사체 데이터와 공개된 화학, 단백질 및 구조 데이터베이스만 사용되었습니다. 데이터베이스 접속은 2026년 1월부터 5월 사이에 이루어졌습니다. 그 이후의 접속 날짜는 별도의 재료 표(Table of Materials)에 기록되었습니다.
1. 연구 설계, 하드웨어 및 소프트웨어 요구사항
- 분석을 시작하기 전 워크플로우를 정의합니다. 대사체 선택, 타겟 예측, 차등 발현 분석, 타겟 및 차등 발현 유전자(DEG) 중첩, 단백질-단백질 상호작용(PPI)/경로 농축 분석, 분자 도킹, MD 시뮬레이션, MM-PBSA 추정의 8단계로 구성합니다.
- 도킹, MD 및 MM-PBSA는 구조적 우선순위 결정 도구일 뿐임을 기록합니다. 이러한 결과물을 결합, 수용체 활성화, 단백질 풍부도 변화, 치료 효능 또는 질병 인과관계에 대한 실험적 증거로 해석하지 마십시오.
- MD 시뮬레이션을 실행하기 전 컴퓨팅 하드웨어를 확인합니다. 64비트 Linux OS, 6코어 이상의 CPU, 8 GB 이상의 VRAM을 갖춘 GPU 가속 플랫폼 또는 그에 상응하는 8 GB 이상의 VRAM을 갖춘 GPU 가속 플랫폼을 사용하며, 최소 32 GB RAM 및 MD 시스템당 최소 200 GB의 여유 저장 공간을 확보합니다.
- 핵심 소프트웨어를 기록합니다: 분자 동역학 엔진, 타겟 단백질에 대한 대사체 리간드 분자 도킹 소프트웨어, 화학 파일 형식 변환 도구12, 3차원 리간드 생성 도구, 리간드 준비 도구, 도킹 입력 준비 툴킷, 타겟 단백질에 대한 대사체 리간드 분자 도킹 소프트웨어, 범용 프로그래밍 환경, 생물정보학 소프트웨어 프레임워크가 포함된 통계 컴퓨팅 환경, 그리고 차등 유전자 발현 분석 패키지를 기록합니다.
- 구조 분석 도구를 기록합니다: 웹 기반 막 시스템 구축 도구, CHARMM 호환 리간드 파라미터화 서비스, 분자 역학/연속체 용매 결합 에너지 계산 도구, 분자 위상 및 파라미터 변환 라이브러리, 3차원 분자 시각화 프로그램, 그리고 2021년판 분자 시각화 및 2차원 상호작용 다이어그램 도구를 기록합니다(다운로드 링크 및 버전 정보는 재료 표 참조).
- 분자 동역학 시뮬레이션에 사용된 정확한 단백질 포스 필드, CGenFF, CHARMM-GUI, R/생물정보학 소프트웨어 프레임워크 및 분자 역학/연속체 용매 결합 에너지 계산 도구의 릴리스 식별자를 재료 표/환경 파일에 기록합니다. 식별자를 찾을 수 없는 경우 "not recoverable"로 표시하고, 임의로 추정하지 마십시오.
2. 대사체 선택 및 화학정보학적 특성 분석
- 표적 예측 전에 대사체 패널을 정의합니다. butyrate (PubChem CID: 264), propionate (CID: 1032), chenodeoxycholic acid (CID: 10133), lithocholic acid (CID: 9903), ursodeoxycholic acid (CID: 31401), tryptamine (CID: 1150), indole-3-propionic acid (CID: 3744), indole-3-lactic acid (CID: 92904) 및 urolithin A (CID: 5488186)를 포함합니다.
- 각 대사체에 대한 표준 Simplified Molecular Input Line Entry System (SMILES) 및 PubChem CID를 검색합니다. 표적 예측 전에 동의어와 중복 구조를 확인합니다. 최종 식별자를 대사체 마스터 시트에 저장합니다.
- 표준 SMILES 문자열을 물리화학적 성질 및 ADME 예측 웹 도구13 (재료 표 참조)에 제출합니다. 분자량, 위상적 극성 표면적 (TPSA), 합의 logP, 수소 결합 공여체, 수소 결합 수용체, 회전 가능한 결합, 예측된 위장관 흡수도, P-glycoprotein 예측 및 Lipinski, Veber, Ghose, Egan, Muegge, PAINS 경고 사항을 기록합니다.
- 구조 인식이 성공하고, 분자량이 500 Da 이하이며, PAINS 경고가 없는 대사체만 유지합니다. 충족되지 않은 기준과 해당 대사체의 유지 또는 제외 결정을 기록합니다.
- 후속 표적 예측 및 도킹 전에 이온화 상태를 지정합니다. butyrate와 propionate는 탈양성자화된 카복실레이트 형태로, 담즙산은 중성 카복실산 형태로, tryptamine은 양성자화된 암모늄 형태로, 나머지 대사체는 중성 형태로 사용합니다.
3. 후보 인간 표적 예측
- 화학물질-단백질 상호작용 표적 예측 도구14 (재료 표 참조)를 엽니다. 각 대사물질의 이름 또는 PubChem CID를 입력하고, Homo sapiens (taxonomy ID: 9606)를 선택한 후, 최소 결합 상호작용 점수를 ≥0.700으로 설정합니다.
- 화학물질-단백질 상호작용 표적 예측에서 실험 및 큐레이션된 데이터베이스 증거 채널을 우선시합니다. 각 대사물질에 대한 전체 단백질 결합 표를 다운로드합니다.
- 분자 도킹 프로그램15 (재료 표 참조)를 엽니다. Homo sapiens를 선택한 상태에서 각 표준 SMILES 문자열을 제출하고, 확률이 ≥0.70인 표적을 유지합니다.
- 각 대사물질에 대하여 화학물질-단백질 상호작용 표적 예측 결과와 분자 도킹 프로그램 결과를 합집합으로 병합합니다. 두 데이터베이스 임계값 중 하나라도 충족하는 표적은 모두 유지하고, 완전히 중복되는 유전자 기호 항목은 제거합니다.
- 단백질 식별자를 표준화된 HGNC 승인 유전자 기호로 매핑하는 도구나 통합 인간 유전자 정보 데이터베이스(재료 표 참조)를 사용하여 단백질 항목을 HUGO Gene Nomenclature Committee (HGNC) 승인 유전자 기호로 표준화합니다. 별칭, 오래된 기호 및 이소형 주석을 단백질당 하나의 유전자 기호로 정리합니다.
- 각 표적을 막 수용체, 핵 수용체, 효소, 세포 내 신호 전달 단백질, 펩타이드 호르몬, 호르몬 관련 단백질 또는 기타 세포 내 단백질로 분류합니다. 표적 표에 해당 분류를 기록합니다.
4. 전사체 데이터 세트 및 차등 유전자 발현 분석
- NCBI 웹 기반 차등 유전자 발현 분석 도구16,17를 통해 GSE36701에 접속하십시오(재료 표 참조). 해당 데이터 세트에 IBS-C, 설사형 과민성 대장 증후군(IBS-D), 감염 후 IBS 및 건강한 자원자 그룹의 직장 점막 생검 발현 데이터가 포함되어 있음을 기록하십시오18.
- 독립적인 검증 코호트를 찾기 위해 GEO와 ArrayExpress를 검색하십시오. IBS-C, constipation-predominant irritable bowel syndrome, rectal mucosa, colonic mucosa, biopsy, transcriptome, microarray 및 RNA-seq의 조합을 사용하십시오. 리포지토리, 검색어, 검색 날짜 및 비교 가능한 검증 데이터 세트의 식별 여부를 기록하십시오.
- GSE36701 레코드에서 웹 기반 차등 유전자 발현 분석 도구를 실행하십시오(재료 표 참조). 18개의 IBS-C 샘플을 IBS-C 그룹으로 지정하고, 40명의 건강한 자원자를 대조군으로 지정하며, IBS-D 및 감염 후 IBS 샘플은 지정하지 않은 상태로 둡니다.
- Benjamini-Hochberg 위양성률(FDR) 보정19이 적용된 차등 유전자 발현 분석 패키지 프레임워크를 사용하여 차등 발현 분석을 수행하십시오. 프로브 ID, 유전자 심볼, 유전자 명칭, logFC, AveExpr, 조정된 t-통계량, raw P-value 및 adjusted P-value가 포함된 전체 결과 표를 다운로드하십시오.
- 프로브를 유전자 수준 항목으로 통합하십시오. 유전자 심볼이 없는 프로브는 제거하고, 중복된 심볼의 경우 FDR이 가장 낮은 프로브를 유지하며, 값이 같을 때는 절대값이 더 큰 logFC를 기준으로 선택하십시오.
5. 타겟-deg 중첩 분석 및 통계적 평가
- 각 대사물질별 예측 표적 리스트를 FDR < 0.05 수준의 유전자 수준 DEG 리스트와 교차 분석합니다. 중첩되는 유전자, 기원 대사물질, logFC, 보정된 P-value 및 발현 방향을 기록합니다.
- 대사물질별 중첩 리스트를 중복 없는 MAG 리스트로 병합합니다. 총 예측 표적 수, 대사물질별 중첩 수 및 총 고유 MAG 수를 계산합니다.
- 여러 개의 프로브가 있는 유전자에 대해 프로브 수준의 방향성 일치 여부를 평가합니다. 프로브 간 발현 방향이 일치하지 않는 유전자는 플래그를 표시합니다.
- 총 유전자 병합 항목 수, 총 DEG 수, 총 고유 예측 표적 수 및 관찰된 MAG 수를 사용하여 피셔 정확 검정(Fisher’s exact-test) 분할표를 구성합니다. 피셔 정확 검정 구현을 통해 단측 P-value, 오즈비(odds ratio) 및 95% 신뢰 구간을 계산합니다.
- 배경 DEG 비율이 50%를 초과하는 경우, 해당 중첩은 독립적으로 검증된 농축이 아닌 기술적 결과로 보고합니다. 별도의 방향성 검정이 수행되지 않는 한, 일관된 하향 조절은 기술적인 방향성 패턴으로 처리합니다.
6. 단백질-단백질 상호작용 네트워크 분석 및 경로 농축 분석
- 완성된 고유 MAG 목록을 단백질-단백질 상호작용 네트워크 구축 및 경로 농축 분석에 제출하십시오.20 (참조 재료 표). Homo sapiens를 선택하고 최소 상호작용 점수(interaction score)를 0.700으로 설정하십시오.
- 결합된 단백질-단백질 상호작용 네트워크 구축 및 경로 풍부성 네트워크와 전체 상호작용 표를 내보내십시오. 텍스트 마이닝으로 인해 위상 구조가 인위적으로 밀집된 경우, 텍스트 마이닝을 선택 해제하고 실험, 공발현 및 데이터베이스 채널만 유지하십시오.
- SCFA 관련, 담즙산 관련, 그리고 트립타민/세로토닌성 MAG에 대한 대사체 클래스 서브 네트워크를 생성하십시오. 단백질-단백질 상호작용 네트워크 구축 및 경로 풍부도 분석 시 동일한 생물체 및 신뢰도 설정을 사용하십시오.
- Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)를 이용한 단백질-단백질 상호작용 네트워크 구축 및 경로 농축 분석 수행21, Reactome22및 유전자 존재론(Gene Ontology, GO) 생물학적 과정23,24Benjamini–Hochberg(BH) FDR을 적용합니다. <0.05로 설정하고 모든 농축 표를 내보냅니다.
7. 분자 도킹
- Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank RCSB PDB25에서 실험적으로 결정된 수용체 구조를 가져옵니다 (재료 표 참조). 우선순위가 지정된 5가지 단백질-리간드 복합체로 VDR/1DB1, NR1H4/FXR/3DCT, CASP3/2DKO, HTR2A/6A93을 사용합니다.
- 체인 A는 유지하고 물, 공동 결정화된 리간드, 보조 인자, 이온 및 비단백질 HETATM 레코드를 제거하여 각 수용체를 준비합니다. 6A93의 경우, 수용체 준비 전에 T4 라이소자임 융합 세그먼트를 제거합니다.
- 분자 구조 툴킷을 사용하여 극성 수소를 추가하고 Gasteiger 전하를 할당한 후, 각 수용체를 PDBQT 형식으로 저장합니다. PDBQT 변환 전에 결합 부위 히스티딘의 양성자화 상태를 점검하고 선택한 상태를 기록합니다.
- 화학 구조 파일 변환 툴킷에서 각 리간드의 3D 구조를 생성합니다. Universal Force Field (UFF)로 500단계 동안 에너지 최적화를 수행하고, pH 7.4 이온화 상태를 할당하고, Gasteiger 전하를 할당한 후 PDBQT로 저장합니다.
- 공동 결정화된 리간드의 중심을 기준으로 25 Å x 25 Å x 25 Å 크기의 도킹 박스를 정의합니다. 중심 좌표는 VDR의 경우 (10, 19, 33), FXR의 경우 (137, 31, 78), CASP3의 경우 (37, 34, 32), HTR2A의 경우 (12, −1, 61)을 사용합니다.
- exhaustiveness = 8, seed = 42, num_modes = 9, energy_range = 3 kcal/mol 조건으로 표적 단백질에 대한 대사체 리간드의 분자 도킹26,27을 수행합니다. 모든 포즈에 대해 가장 순위가 높은 Vina 점수와 Root-mean-square deviation (RMSD) 값을 기록합니다.
- 우선순위가 지정된 각 복합체에 대해 모드 1을 선택합니다. 분자 시각화 및 2차원 상호작용 다이어그램 툴을 사용하여 2차원 리간드-잔기 다이어그램을 생성하고, 3차원 분자 시각화 프로그램을 사용하여 3차원 수용체-리간드 뷰를 생성합니다.
- VDR/1DB1 및 FXR/3DCT에 대해 리도킹(redocking) 대조군 실험을 수행합니다. 결정학적 포즈 대비 무거운 원자(heavy-atom) RMSD가 <2.0 Å인 경우 수용체 도킹 설정을 수용합니다.
- CASP3에 Lithocholic acid (LCA)를, VDR에 tryptamine을 도킹하여 교차 도킹(cross-docking) 대조군 실험을 수행합니다. 동종(cognate) 및 이종(non-cognate) 점수를 비교하고 점수 차이가 <1.0 kcal/mol인 사례를 기록합니다.
8. 분자 동역학 시뮬레이션
- CHARMM 호환 리간드 파라미터화 서비스28(재료 표 참조)를 사용하여 리간드 파라미터를 생성하십시오. 모든 penalty score를 검토하고 penalty가 >50인 파라미터는 표시하십시오.
- 포스필드 토폴로지 변환 스크립트를 사용하여 리간드 스트림 파일을 분자 동역학 엔진 호환 .itp 및 .prm 파일로 변환하십시오. 각 복합체에 대해 리간드와 단백질 토폴로지 파일을 결합하십시오.
- 분자 토폴로지 및 파라미터 변환 라이브러리를 사용하여 수소 질량 재분배(hydrogen mass repartitioning)를 적용하십시오. 분자 동역학 시뮬레이션29에 사용된 단백질 포스필드와 명시적 3-사이트 물 모델30을 사용하여 수성 토폴로지를 생성하십시오.
- 용질-에지 간격이 최소 1.2 nm인 정십이면체 박스 내에서 수성 복합체를 용매화하십시오. 시스템을 중성화하고 NaCl을 0.15 M까지 추가하십시오.
- 웹 기반 막 시스템 구축 도구31,32,33(재료 표 참조)를 사용하여 tryptamine-HTR2A 막 시스템을 구축하십시오. 막-단백질 배향 데이터베이스 정렬 수용체 좌표34(재료 표 참조), 순수 POPC 이중층, 22.5 Å 물 층, 그리고 0.15 M NaCl을 사용하십시오.
- 가장 가파른 하강법(steepest descent)으로 모든 시스템을 최대 50,000 단계까지 에너지 최소화하십시오. 평형화 전 Fmax <1000 kJmol-1nm-1에서 수렴되었는지 확인하십시오.
- 정입자 수, 정적 부피, 정온 앙상블(NVT) 및 정입자 수, 정압, 정온 앙상블(NPT) 단계로 수성 시스템을 평형화하십시오. 구속을 점진적으로 해제하는 6단계 웹 기반 다단계 분자 시스템 준비 및 평형화 워크플로를 사용하여 막 시스템을 평형화하십시오.
- 다섯 가지 모든 복합체에 대해 200 ns 프로덕션 MD를 수행하십시오. 수소 질량 재분배(HMR)를 적용한 4 fs 타임스텝, 310 K의 V-rescale 서모스탯, 1 bar의 Parrinello-Rahman 바로스탯, Particle mesh Ewald (PME) 정전기 상호작용35 및 LINCS 제약 조건36을 사용하십시오.
- 분자 동역학 궤적 분석 유틸리티를 사용하여 최종 궤적을 분석하십시오. 마지막 150 ns를 주요 분석 창으로 사용하여 백본 RMSD, Cα Root-mean-square fluctuation (RMSF), 회전 반경(radius of gyration), 용매 접근 가능 표면적(SASA) 및 단백질-리간드 수소 결합을 계산하십시오.
9. MM-PBSA 결합 자유 에너지 추정
- MM-PBSA 분석을 위해 트래젝토리 스냅샷을 추출합니다. 각 수성 복합체에 대해 2,001 프레임을 사용하고, 막 내장 HTR2A 하위 시스템에 대해 201개의 처리된 프레임을 사용합니다.
- 포아송-볼츠만 용매화, 내부 유전 상수 = 1, 외부 유전 상수 = 80, SASA 기반 비극성 용매화 및 엔트로피 보정 없음 설정을 사용하여 분자 역학/연속체-용매 결합 에너지 계산 도구37를 실행합니다. 평균 결합 자유 에너지와 표준 편차를 보고합니다.
- 5가지 복합체 모두에 대해 잔기별 분해 분석을 수행합니다. 절대 기여도가 0.5 kcalmol−1 이상인 안정화 및 불안정화 잔기를 보고합니다.
결과
후보 대사체 관련 표적
화학-단백질 상호작용 표적 예측 및 분자 도킹 프로그램을 통해 9가지 대사물질에서 서로 다른 예측 표적 세트가 생성되었습니다. 프로피온산, 트립타민, 담즙산 및 우로리틴 A는 위장관 신호 전달과 관련이 있는 것으로 알려진 여러 표적을 도출하였습니다. 예측된 표적 범위에는 전형적인 막 수용체, 핵 수용체, 세포 내 효소, 신호 전달 단백질 및 펩타이드 호르몬 관련 단백질이 포함되었습니다. 따라서 하위 결과는 수용체 단독 발견이 아닌 대사물질 관련 유전자(MAGs)로 기술되었습니다(표 1).
보고된 대사체-단백질 상호작용과의 벤치마킹
표적 예측 결과를 기존의 실험적 지식과 벤치마킹하기 위해, 예측된 대사체 관련 표적 관계를 세 가지 증거 수준으로 분류하였다: (i) 대사체 또는 밀접하게 연관된 내인성 대사체가 인코딩된 단백질에 결합, 활성화, 억제 또는 기능적으로 조절한다고 보고된 실험적 근거가 있는 직접적 또는 유사 클래스 수준의 대사체-단백질 상호작용, (ii) 예측된 표적이 기성 대사체 반응 경로 또는 수용체 가족에 속하지만 정확한 대사체-단백질 쌍에 대한 직접적인 증거는 제한적인 경로 또는 표적 클래스 기반 상호작용, 그리고 (iii) 검토한 문헌에서 직접적인 실험적 상호작용이 확인되지 않은 계산 기반 단독 연관성. 이러한 벤치마킹은 예측된 MAG를 검증하는 것이 아니라 맥락화하기 위해 사용되었다.
여러 예측 결과는 이전에 보고된 생물학적 기전을 재현하였습니다. FFAR2/GPR43은 전형적인 단쇄 지방산 수용체이므로, Propionate-FFAR2 상호작용은 실험적으로 입증된 것으로 처리되었습니다. Butyrate는 공인된 히스톤 탈아세틸화 효소 억제이며 예측된 중첩 부위가 HDAC 패밀리 구성원을 포함했으므로, Butyrate-HDAC3는 실험적 또는 클래스 기반으로 입증된 것으로 분류되었습니다. NR1H4/FXR 및 VDR과 관련된 담즙산 관련 예측은 확립된 담즙산 핵 수용체 생물학, 특히 LCA와 같은 소수성 담즙산의 경우 입증된 것으로 간주되었습니다. UDCA는 일반적으로 더 약하거나 상황 의존적인 FXR 리간드이기 때문에, Ursodeoxycholic acid (UDCA) 관련 FXR 예측은 신중하게 해석되었습니다. Tryptamine 관련 HTR1B, HTR2A, HTR2B 및 HTR6 예측은 직접적인 수용체 특이적 상호작용이 확인된 것이 아니라 세로토닌 경로에 의해 입증된 것으로 분류되었는데, 이는 tryptamine이 미생물 유래 tryptophan 유도 모노아민이며 세로토닌 수용체가 위장관 운동성 및 분비의 확립된 조절자이기 때문입니다. Urolithin A-CASP3는 urolithin A와 세포사멸/caspase 관련 반응 사이의 기발표된 연결 고리에 의해 경로 기반으로 입증된 것으로 간주되었으나, CASP3 결합에 대한 직접적인 증거에 의한 것은 아니었습니다. Indole-3-lactic acid-KYAT1 및 indole-3-propionic acid-KYAT1은 광범위한 문헌에서 미생물 indole 유도체에 의한 호스트 신호 전달은 지지하지만, 이 정확한 대사체들에 의한 직접적인 KYAT1 결합은 지지하지 않으므로 컴퓨터 예측 기반 가설로만 유지되었습니다7,8,38,39,40.
이에 따라 표 1에서는 계산적 타겟 지명(computational target nomination)을 사전 실험 또는 경로 지지 수준별로 구분하였습니다. 또한 각 타겟에 대해 예측 소스(화학물질-단백질 상호작용 타겟 예측, 분자 도킹 프로그램 또는 두 가지 모두), 화학물질-단백질 상호작용 타겟 예측의 통합 상호작용 점수, 그리고 분자 도킹 프로그램에 의해 타겟이 식별된 경우의 분자 도킹 프로그램 확률을 제공합니다. 직접적인 사전 실험 증거가 없는 예측 타겟은 독립적인 단백질 수준 및 리간드 반응 검증이 필요한 후보 대사물질 관련 유전자로 기술되었습니다.
예측된 표적과 IBS-C 차등 발현 유전자 간의 중첩
합집합으로 결합된 예측 표적 리스트와 유전자 수준의 차별 발현 결과의 교집합을 통해, 건강한 지원자와 비교하여 IBS-C에서 유의미하게 차별 발현된 17개의 고유한 예측 대사물질 관련 유전자를 식별하였습니다. 17개 유전자 모두 발현이 감소되었습니다. 이 세트에는 막 및 핵 수용체(CASR, FFAR2, GPR68, HTR1B, HTR2A, HTR2B, HTR6, NR1H4, TBXA2R, VDR)와 비수용체 단백질(CASP3, GCG, GNAQ, GPHN, HDAC3, KYAT1, MLN)이 포함되었습니다(표 1, 그림 2A,B).
17개의 MAG 전체가 0.05 미만의 허위 발견율(FDR) 임계값을 충족했으며, 17개 중 16개는 더 엄격한 기준인 FDR < 0.01을 충족하였고, 나머지 유전자(HTR1B)는 FDR < 0.05에서 유의미한 결과를 보였습니다. 17개의 표적 중 7개(CASP3, GCG, GNAQ, GPHN, GPR68, HDAC3, TBXA2R)는 FDR < 0.01과 1.0을 초과하는 절대 log2 배수 변화(logFC 범위 −1.34 ~ −1.10)를 모두 만족하였으며, 이는 해당 하위 집합에서 강하고 일관된 하향 조절이 일어났음을 나타냅니다. 나머지 표적들은 중간 정도의 통계적으로 유의미한 하향 조절(|logFC| 범위 0.45 ~ 0.97)을 보였습니다. 이러한 일관된 기술적 패턴은 데이터셋의 전유전체 발현 특성을 고려하여 신중하게 해석되었습니다(아래의 통계적 평가 참조).
표적-DEG 중첩의 통계적 평가
17개 유전자의 중첩에 대한 통계적 유의성을 공식적으로 평가하기 위해, 예측된 17개의 표적 유전자를 쿼리 세트로 하고 GSE36701에서 검출된 18,296개의 모든 고유 유전자 붕괴 항목(gene-collapsed entries)을 게놈 배경으로 하여 단측 피셔 정확 검정(Fisher’s exact test)을 실시하였다. 이 배경 중에서 17,296개의 유전자(94.5%)가 FDR < 0.05에서 차등 발현되었으며, 이는 IBS-C 직장 점막 비교에서 거의 보편적인 전사 억제가 일어났음을 반영한다. 예측된 17개의 표적 유전자는 모두 차등 발현 유전자에 포함되었다(관찰된 중첩 17/17, 10%). 94.5%의 배경 차등 발현율을 고려할 때, 무작위로 선택된 17개 유전자 세트의 기대 중첩 수는 16.1개이다. 피셔 정확 검정 결과 p = 0.384, 연속성 보정 오즈비(continuity-corrected odds ratio) 2.03(95% 신뢰 구간 0.12–33.73)으로 나타났으며, 이는 α = 0.05에서 통계적으로 유의하지 않았다(그림 3A–C).
이 결과는 관찰된 17/17의 중첩이 이 데이터셋의 전장 유전체 발현 프로파일 하에서 우연히 기대되는 중첩 수준을 초과하지 않음을 나타냅니다. 따라서 이러한 결과는 통계적 농축이나 게놈 배경에 대한 독립적인 검증의 근거라기보다, 예측된 17개 타겟 모두가 IBS-C 직장 점막 조직에서 일관되고 유의미하게 하향 조절되었다는 기술적인 방향성 패턴으로 해석됩니다. 공식적인 농축 테스트를 위해서는 전체 유전자의 절반보다 훨씬 적은 수만이 유의성에 도달하는, 보다 선택적인 차등 발현 프로파일을 가진 전사체 데이터셋에서의 재현이 필요할 것입니다. 이 데이터셋의 차등 발현 배경 자체가 주로 하향 조절되어 있으므로, 중첩된 유전자들 간의 공통된 하향 방향성은 예상 가능한 결과이며 공식적인 방향성 테스트를 거치지 않았기에, 17개 중첩 유전자 모두의 균일한 하향 조절은 별도로 검증된 통계적 결과가 아닌 기술적 관찰임을 강조해야 합니다. 따라서 이러한 균일한 방향성을 대사물질 특이적 조절의 독립적인 통계적 근거로 해석해서는 안 됩니다.
대사물질 특이적 패턴
Propionate은 CASR, FFAR2, GCG, GNAQ, GPHN, GPR68, MLN 및 TBXA2R을 포함하여 가장 많은 중첩 유전자를 나타냈으며, 이는 단쇄 지방산 반응성 및 Gq 관련 신호 전달의 관여 가능성을 시사합니다. Butyrate는 HDAC3와 중첩되었으며, 이는 butyrate 관련 히스톤 탈아세틸효소 생물학 및 일치하지만, mRNA 하향 조절만으로는 butyrate 반응성의 변화를 입증할 수 없습니다. 담즙산 관련 중첩에는 장내 담즙산 신호 전달의 공인된 작동자인 핵 수용체 VDR 및 NR1H4가 포함되었습니다38,39. Tryptamine은 HTR1B, HTR2A, HTR2B 및 HTR6와 중첩되어 위장관 운동성 및 분비에서 역할이 잘 확립된 시스템인 세로토닌성 신호 전달을 후보 모듈로 지목했습니다40. Indole-3-lactic acid와 indole-3-propionic acid는 KYAT1과 중첩되었으며, urolithin A는 CASP3와 중첩되었습니다.
경로 농축 분석
확인된 17개의 중복 유전자에 대한 기능적 농축 분석 결과, G 단백질 결합 수용체(GPCR) 하위 신호 전달, Gαq 신호 전달, GPCR 리간드 결합, 세로토닌 작동성 시냅스, 신경 활성 리간드-수용체 상호작용, 칼슘 신호 전달, cAMP 신호 전달 및 펩타이드 호르몬 분비와 관련된 경로가 식별되었습니다. 이러한 결과는 해당 유전자 세트의 구성과 일치하며 생물학적 일관성을 뒷받침하지만, 이는 경로 수준의 활성에 대한 독립적인 증거라기보다 제출된 유전자의 기능적 주석을 반영한 것입니다.
단백질-단백질 상호작용 네트워크 구조
단백질-단백질 상호작용 네트워크 구축 및 경로 농축 분석은 세 가지 상호 보완적인 네트워크를 통해 해석되었습니다. 17개 유전자가 결합된 메타 네트워크(네트워크 1)에서 가장 뚜렷하게 나타난 주석 지원 구조는 GNAQ를 중심으로 TBXA2R, CASR, HTR2A 및 HTR2B를 포함한 수용체 관련 유전자들과 GNAQ를 연결하는 GPCR/Gαq 신호 전달 구성 요소였습니다. 제한적인 세로토닌 수용체 연결성 또한 유지되었으며, 특히 HTR2A와 HTR2B 사이에서 가장 두드러졌으나, 다른 여러 유전자들은 선택된 신뢰 임계값에서 고립되거나 약하게 연결된 상태로 남았습니다. 프로피오네이트 특이적 네트워크(네트워크 2)는 더 제한적인 위상을 보였으며, GNAQ는 CASR 및 TBXA2R와의 주석 지원 연결을 유지한 반면, FFAR2, GPR68, GCG, GPHN 및 MLN은 고립되거나 약하게 연결되었습니다. 트립타민/세로토닌 네트워크(네트워크 3)에는 HTR1B, HTR2A, HTR2B 및 HTR6가 포함되었습니다. 이 하위 집합 내에서 HTR2A와 HTR2B는 주요한 주석 지원 연결을 보인 반면, HTR1B와 HTR6는 선택한 임계값에서 직접적으로 연결되지 않았습니다(그림 4A–C).
분자 도킹
선정된 5가지 대사체-단백질 복합체에 대해 분자 도킹을 수행하였습니다. 담즙산-핵 수용체 쌍은 urolithin A-CASP3 및 tryptamine-HTR2A보다 더 유리한 Vina 점수를 나타냈습니다. LCA-VDR이 −10.0 kcal/mol로 가장 좋은 점수를 기록했으며, LCA-NR1H4/FXR (−9.9 kcal/mol)과 UDCA-NR1H4/FXR (−9.4 kcal/mol)이 그 뒤를 이었습니다. Urolithin A-CASP3와 tryptamine-HTR2A는 상대적으로 낮지만 여전히 합리적인 수치인 −7.1 kcal/mol의 점수를 나타냈습니다(표 2).
LCA-VDR 복합체(PDB ID: 1DB1)의 경우, 예측된 포즈는 LCA 카르복실산 산소와 Ser278 사이의 일반적인 수소 결합(4.29 Å)과 더불어 Leu230, Val234, Trp286, Val30, His305, Tyr295, Leu23 및 His397이 관여하는 광범위한 소수성 접촉, 그리고 Met272, Leu313, Ile271, Ile268, Leu309, Phe422, Val418, Ala231, Ala303, Cys28, Ser275 및 Phe150과의 추가적인 반데르발스 접촉에 의해 뒷받침되었습니다. 가장 순위가 높은 포즈의 Vina 점수는 −10.0 kcal/mol, 공동 크기는 205 Å3이었으며, 그리드 중심은 (10, 19, 3)이었습니다(표 3, 그림 5A,B).
LCA-NR1H4/FXR 복합체(PDB ID: 3DCT)의 경우, −9.9 kcal/mol의 도킹 점수와 함께 His294 및 Ile35가 관여하는 예측 수소 결합, His294와의 π-Sigma 상호작용, 그리고 Met290, Met328, Ala291, Leu287, Ile352 및 His47이 관여하는 소수성 Alkyl 또는 π-Alkyl 접촉이 확인되었으며, 추가적인 van der Waals 접촉을 통해 FXR 포켓 내 스테로이드 골격의 수용이 뒷받침되었습니다(표 4, 그림 6A,B).
UDCA-NR1H4/FXR 복합체(PDB ID: 3DCT)의 예측된 포즈는 His47(3.6 Å)과의 전형적인 수소 결합, Gly32(3.46 Å)와의 또 다른 수소 결합, Val325(4.96 Å)와의 π-음이온 상호작용 및 Trp469(4.51 Å)와의 탄소-수소 결합을 보여주었습니다. 상호작용 맵에서는 Arg395(3.89 Å) 및 Gln396(3.40 Å)과의 불리한 공여자-공여자 접촉이 확인되었으며, 이는 동일한 수용체 포켓에서 UDCA의 Vina 점수가 LCA보다 낮은 이유가 덜 유리한 국소 기하학적 구조나 정전기적 특성 때문일 수 있음을 시사합니다(표 5, 그림 7A,B).
urolithin A-CASP3 복합체(PDB ID: 2DKO)에서 예측된 결합 모드는 Gln161(3.78 및 4.19 Å), Ser120(3.95 Å), Arg207(3.05 및 3.7 Å)과의 일반적인 수소 결합을 특징으로 하며, Arg207과의 π-양이온 상호작용, Cys163과의 π-공여체 수소 결합, 그리고 Arg64, Ala162, His121, Ser205 및 Trp206이 관여하는 추가적인 π-알킬 및 반데르발스 접촉에 의해 더욱 안정화되었습니다.표 6, 그림 8A,B).
tryptamine-HTR2A 복합체(PDB ID: 6A93)의 경우, 예측된 포즈는 tryptamine의 양성자화된 아민과 Asp15 사이의 정전기적 염교(salt bridge)에 의해 안정화되었습니다. 여기서 Asp155는 세로토닌 및 관련 수용체 전반에 걸쳐 아민성 리간드의 양성자화된 아민을 고정하는 보존된 transmembrane helix 3 aspartate(Ballesteros-Weinstein 번호 체계의 D3.32)입니다41,42,43. 이와 더불어 Thr160 및 Ser159와의 수소 결합, Phe340 및 Trp36과의 방향족 접촉, 그리고 Val156 및 Ile163과의 π-Alkyl 상호작용이 함께 작용하였습니다. Tyr370, Phe39, Ser242, Phe243, Phe32 및 Leu123과의 추가적인 반데르발스 접촉은 정형적 포켓 결합 패턴(표 7, 그림 9A,B)을 뒷받침하였습니다.
도킹 프로토콜 검증
도킹 프로토콜의 신뢰성을 평가하기 위해 두 가지 상보적인 대조 실험을 수행하였다. 리도킹(양성) 대조군으로는 공결정화된 리간드를 참조 X-선 구조에서 추출하여 원래의 결합 부위에 다시 도킹하였다. VDR/1DB1에서 비타민 D 유사체 VDX의 최상위 예측 포즈는 결정학적 위치에서 0.87 Å 벗어났으며, FXR/3DCT의 공결정 리간드 WAY-362450은 1.79 Å 벗어났다. 두 값 모두 일반적인 허용 임계값인 2.0 Å 미만이었으며, 이는 해당 수용체 시스템에 대한 도킹 프로토콜의 기하학적 타당성을 뒷받침한다(그림 10A,B). 교차 도킹(음성) 대조군의 경우, 리토콜산(lithocholic acid)을 리간드로 알려지지 않은 시스테인 프로테아제인 caspase-3(2DKO)에 도킹한 결과, 예측 점수(−8.3 kcal/mol)가 해당 표적인 VDR(−10.0 kcal/mol)보다 1.7 kcal/mol 더 낮게 나타나 예측된 결합 부위 선택성과 일치하였다. 트립타민(tryptamine)을 VDR에 도킹했을 때의 예측 점수는 −6.4 kcal/mol이었으며, 해당 표적인 HTR2A에서의 점수는 −7.1 kcal/mol로, 0.7 kcal/mol의 차이가 났다. 이 차이는 대사체 리간드의 표적 단백질 도킹 점수에서 보고된 불확실성 범위 내에 있으며, 따라서 이 작은 리간드에 대해서는 예측된 선택성이 낮음을 나타낸다(그림 10C). 종합하면, 이러한 대조 실험들은 테스트 조건 하에서 도킹 프로토콜이 알려진 결합 기하 구조를 재현하고 인지 표적 쌍과 비인지 표적 쌍을 구별함을 보여주지만, 이는 실험적인 친화도 측정값을 대체하지 않는 계산적 예측으로 남는다(표 8).
분자 동역학 시뮬레이션
우선순위가 지정된 5가지 복합체에 대해 20 ns의 생산 궤적(production trajectories) 동안 분자 동역학 시뮬레이션을 수행하였습니다. 4가지 수용성 및 핵 수용체 복합체는 명시적 수성 용매에서 시뮬레이션되었으며, tryptamine-HTR2A 복합체는 이 G 단백질 결합 수용체에 생리학적으로 적절한 막 환경을 제공하기 위해 명시적 POPC 지질 이중층에서 시뮬레이션되었습니다. 분석을 통해 시간 의존적 조건 하에서 도킹 포즈의 동적 안정성을 테스트하였으며, 복합체 간의 상대적인 구조적 거동을 비교하였습니다(표 9).
LCA-VDR/1DB1 복합체의 RMSD 프로파일은 처음 10 ns 동안 짧은 평형화 기간을 보였으며, 이후 0.20–0.28 nm 범위 내에서 주로 변동하며 안정적인 고원 상태(plateau)를 유지하였습니다.그림 1A). RMSF 값은 낮았으며, 백본 변동은 < 대부분의 잔기에 대해 0.15 nm (그림 11B). 수소 결합 분석 결과 2~5개의 수소 결합이 지속적인 네트워크를 형성하고 있었으며, 때때로 7개까지 증가하는 것이 확인되었다(그림 11C회전 반경(Rg)은 1.25–1.75 nm 범위 내로 유지되었으며, 용매 접근 가능 표면적(SASA)은 약 130 nm로 유지되었다.2 (그림 11D,E).
urolithin A-CASP3/2DKO 복합체는 더 큰 동적 활성을 보였습니다. RMSD는 초기에 증가한 후 0.4에서 0.7 nm 사이에서 진동하였으며, 약 165 ns 부근에서 짧은 고편차 이벤트가 관찰되었습니다(그림 12A). RMSF 분석 결과 잔기 수준에서 높은 가동성이 나타났으며, 잔기 175 주변의 유연한 루프 영역에서 가장 큰 변동이 확인되었습니다(그림 12B). 수소 결합 분석 결과, 처음 30–40 ns 동안은 약 2–5개의 결합으로 이루어진 광범위한 네트워크가 형성되었으나, 이후에는 대부분 0에서 2개의 간헐적인 결합이 나타났습니다(그림 12C). 이에 상응하는 회전 반경 및 SASA 프로파일은 그림 12D,E에 제시되어 있습니다.
NR1H4/FXR (3DCT) 담즙산 시스템의 경우, 주쇄 RMSD 프로파일은 궤적의 대부분에서 비교적 좁은 범위 내에 유지되었으며(그림 13A), RMSF 프로파일은 코어 영역에서는 낮은 이동성을, 유연한 영역에서는 높은 변동성을 보였습니다(그림 13B). LCA-3DCT 복합체는 궤적 전반에 걸쳐 약 3~4개의 지속적인 수소 결합을 유지한 반면, UDCA-3DCT 복합체는 더 큰 수소 결합 변동을 보였으며 약 125 ns 이후에는 수소 결합이 감소했습니다. LCA 및 UDCA 결합 시스템의 회전 반지름 프로파일은 각각 그림 13C,D에 나타나 있으며, 이에 해당하는 SASA 프로파일은 그림 13E,F에 나타나 있습니다.
트립타민-HTR2A 복합체의 막 분자 동역학
tryptamine-HTR2A/6A93 복합체는 258개의 지질 분자로 구성된 명시적 POPC 지질 이중층, 명시적 3-사이트 수분 모델 및 0.15 M NaCl 내에서 20 ns 동안 시뮬레이션되었으며, 전체 시스템 크기는 약 10,925개의 원자였습니다3,4,45. 수용체는 궤적 전반에 걸쳐 이중층 내에 안정적으로 매립된 상태를 유지했습니다(그림 14). 주쇄 RMSD는 처음 10 ns 이내에 약 0.10 nm에서 0.15–0.20 nm 근처의 안정적인 평탄 영역까지 상승한 후 계속 안정적으로 유지되었으며, 모든 값이 0.25 nm 미만으로 나타나 수용체가 전반적인 언폴딩 없이 막 환경에서 안정적인 구조를 유지했음을 보여주었습니다(그림 15A). 잔기별 RMSF는 전형적인 GPCR 유연성과 일치하게, transmembrane 헬릭스 코어에서는 낮은 변동성을 보였고 루프 및 말단 영역에서는 예상대로 더 높은 가동성을 보였습니다(그림 15B). 회전 반경은 약 2.06 nm에서 2.12 nm 사이로 좁게 제한되었으며, SASA는 점진적인 드리프트 없이 좁은 범위 내에서 변동하여, 두 지표 모두 조밀한 transmembrane 번들이 보존되었음을 확인해 주었습니다(그림 15C,D).
단백질과 리간드 사이의 수소 결합은 궤적 전반에 걸쳐 유지되었으며(그림 15E), 수소 결합 수는 1개에서 3개 사이로 주요한 변동을 보였다. 핵심적인 이온 상호작용의 지속성을 구체적으로 평가하기 위해, 트립타민의 양성자화된 암모늄 질소와 Asp15(D3.32)의 카복실산 산소 원자 사이의 최소 거리를 전체 궤적 동안 모니터링하였다. 이 거리는 평균 0.270 nm(최소 0.247 nm, 최대 0.424 nm) 주변으로 좁게 분포되었으며, 염교(salt-bridge) 접촉(< 0.4 nm)은 단 두 번의 짧은 일시적 이탈만이 있었을 뿐 시뮬레이션의 9.9% 동안 유지되었고, 지속적인 해리 현상은 나타나지 않았다(그림 16). 이러한 결과는 보존된 Asp15 이온 상호작용이 막 시뮬레이션 전반에 걸쳐 HTR2A 정위성 결합 포켓(orthosteric pocket) 내의 트립타민을 안정화하는 데 충분했음을 시사한다.
MM-PBSA 결합 자유 에너지 및 잔기별 분해
5개의 복합체에 대해 추가적인 에너지 우선순위 분석 층을 더하기 위해 MM-PBSA 분석을 수행하였습니다(표 10). 4개의 수성 복합체의 경우, 잔기별 분해 분석을 통해 예측된 각 결합 모드에 대한 주요 에너지 기여 요인을 확인하였습니다. LCA-VDR/1DB1 복합체에서는 리간드와 Gln317이 유리한 기여를 보인 반면, Trp286은 불리한 기여를 나타냈습니다. urolithin A-CASP3/2DKO 복합체에서는 Arg64와 Arg207이 강한 음의 잔기별 기여도를 보여 상당한 극성 또는 정전기적 안정화를 나타냈으나, 그럼에도 불구하고 해당 궤적은 매우 역동적인 상태로 유지되었으며, 이는 유리한 잔기 수준의 에너지학만으로는 복합체의 지속적인 안정성을 보장할 수 없음을 보여줍니다. 3DCT 시스템의 경우, LCA 결합은 주로 Arg31에 의해 주도된 반면, UDCA 결합은 Glu326, Asp394, Arg395, Arg41 및 Asp470으로 구성된 보다 분산된 에너지 네트워크가 관여하였습니다. 4개의 수성 시스템 전반에 걸쳐, MM-PBSA 분해 분석은 LCA 기반 복합체의 상대적 우선순위를 뒷받침하였습니다.
막 내장형 tryptamine-HTR2A/6A93 복합체의 경우, 이중층 궤적에서 추출된 단백질-리간드 하위 시스템에 대해 MM-PBSA 분석을 수행하였다46,47. 리간드와 Asp155 (D3.32)에서 유리한 기여도가 관찰되었으며, 특히 Asp15는 잔기 수준에서 가장 지배적인 안정화 기여 인자였는데, 이는 도킹 및 궤적 거리 분석 모두에서 확인된 염교(salt-bridge) 상호작용과 일치한다. Trp137은 결합 포켓을 둘러싸는 방향족 및 극성 접촉 네트워크를 형성하는 주변 정식 결합 부위(orthosteric-pocket) 잔기들(Ser86, Phe87, Phe13, Phe140, Phe141, Val156, Ser159, Thr160, Ile163, Val167, Tyr171) 중 가장 큰 불리한 잔기별 기여도를 보였다. 이러한 값들은 구조적 우선순위 결정을 위한 상대적인 계산 추정치이며, 실험적인 결합 친화도는 아니다.
그림 1IBS-C에서의 대사물질 관련 숙주 유전자 우선순위 결정을 위한 계산 워크플로우. 대사체 선택, 표적 예측, 전사체 차등 발현, 중첩 분석, 네트워크 및 경로 풍부성 분석, 분자 도킹, 분자 동역학 시뮬레이션, 그리고 MM-PBSA 결합 자유 에너지 분석을 통합한 8단계 워크플로우의 도식적 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2IBS-C 점막의 차등 발현 및 대사체-표적 중첩 분석. (A) GSE36701의 유전자 수준 차등 발현을 나타낸 볼케이노 플롯(Volcano plot). 파란색 점은 유의하게 하향 조절된 유전자, 빨간색 점은 유의하게 상향 조절된 유전자, 회색 점은 유의하지 않은 유전자를 나타냄. 선택된 중첩 대사체 관련 유전자들이 표기되어 있음. (B) 30개의 고유한 예측 대사체 표적과 GSE36701에서 발현이 감소된 유전자 사이의 중첩을 보여주는 벤 다이어그램; 17개의 유전자가 공통으로 나타남. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3GSE36701에 대한 17개 예측 대사체 표적 유전자의 통계적 평가. (A) 유의성 단계별로 색상을 구분한 17개 전체 유전자의 유전자당 log2 fold change. (B) Fisher의 정확 검정(Fisher’s exact test)을 통한 배경 유전자와 예측 표적 유전자의 차등 발현율. (CFisher의 정확 검정(Fisher’s exact test)을 위해 2x2 분할표가 사용되었습니다. 17개의 표적 모두 유의하게 하향 조절되었으며, 중첩되는 부분은 통계적 농축보다는 기술적인 방향성 패턴으로 해석됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4복합 단백질-단백질 상호작용 네트워크 구축 및 중첩된 대사물질 관련 유전자의 경로 농축 단백질-단백질 상호작용 네트워크. (A) 네트워크 1: 17개 모든 유전자의 결합 메타 네트워크. (B) 네트워크 2: 8개 유전자(CASR, FFAR2, GCG, GNAQ, GPHN, GPR68, MLN, TBXA2R)로 구성된 프로피온산 특이적 네트워크. (C) 네트워크 3: 4개 유전자(HTR1B, HTR2A, HTR2B, HTR6)로 구성된 트립타민/세로토닌 네트워크. 네트워크는 단백질-단백질 상호작용 네트워크 구축 및 경로 농축 신뢰도 $\ge 0.70$을 사용하여 최소 *Homo sapiens*를 대상으로 생성되었다. 엣지는 주석으로 뒷받침되는 기능적 연관성을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5VDR(PDB ID: 1DB1)와 복합체를 이룬 리토콜산의 3차원 및 2차원 구조 표현. (A) 리토콜산이 구체로 표시된 3차원 표면 및 카툰 표현. (BSer278 수소 결합과 주변 소수성 및 반데르발스 접촉을 보여주는 2차원 상호작용 맵. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6NR1H4/FXR (PDB ID: 3DCT)와 복합체를 이룬 리토콜산의 3차원 및 2차원 구조 표현. (A) 3차원 표면 및 카툰 표현. (B) His294 및 Ile35와의 수소 결합, π-Sigma 상호작용 및 주변 접촉을 보여주는 2차원 상호작용 지도. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7NR1H4/FXR(PDB ID: 3DCT)와 복합체를 이룬 우르소데옥시콜산의 3차원 및 2차원 구조 표현. (A) 3차원 표면 및 카툰 표현. (BHis47 및 Gly322와의 수소 결합, Val325와의 π-음이온 상호작용, Trp469와의 탄소-수소 결합, 그리고 Arg395 및 Gln396와의 불리한 도너-도너 접촉을 보여주는 2차원 상호작용 지도. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8CASP3(PDB ID: 2DKO)와 복합체를 이룬 urolithin A의 3차원 및 2차원 구조 표현. (A) 3차원 표면 및 카툰 표현. (BGln161, Ser120 및 Arg207과의 수소 결합, Arg207과의 π-양이온 상호작용, Cys163과의 π-공여체 수소 결합 및 주변 접촉을 보여주는 2차원 상호작용 지도. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9HTR2A(PDB ID: 6A93)와 복합체를 이룬 트립타민의 3차원 및 2차원 구조 표현. (A3차원 분자 시각화 프로그램으로 생성한 3차원 표면 및 카툰 표현.B분자 시각화 및 2차원 상호작용 도표 도구를 통해 생성된 2차원 상호작용 지도로, Asp15 염교(salt bridge) 및 추가적인 결합 부위 상호작용을 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10도킹 프로토콜 검증. (A, B) VDR/1DB1(RMSD 0.87 Å) 및 FXR/3DCT(RMSD 1.79 Å)로의 공동 결정화된 리간드 재도킹; 결정 구조 포즈와 재도킹된 포즈가 겹쳐져 있으며, 두 경우 모두 2.0 Å 허용 임계값 미만임. (C) 교차 도킹 선택성: 리토콜산(lithocholic acid) 및 트립타민(tryptamine)에 대한 동종(cognate) 대 비동종(non-cognate) Vina 점수. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 120ns 동안의 LCA-VDR/1DB1 복합체에 대한 분자 동역학 궤적 분석. (A) RMSD 프로파일. (B) RMSF 프로파일. (C) 수소 결합 수. (D) 회전 반경 프로파일. (ESASA 프로필. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 1220ns 동안의 urolithin A-CASP3/2DKO 복합체에 대한 분자 동역학 궤적 분석. (ARMSD 프로파일은 광범위한 구조적 변동과 165 ns 근처에서의 일시적인 고편차 현상을 보여준다.B) 잔기 175 부근에서 뚜렷한 잔기 수준의 유연성을 보여주는 RMSF 프로파일. (C) 수소 결합 수. (D) 회전 반경 프로파일. (ESASA 프로필. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 1320 ns 동안의 NR1H4/FXR (3DCT) 담즙산 시스템에 대한 분자 동역학 궤적 분석. (A) 3DCT 복합체의 주쇄(Backbone) RMSD 프로파일. (B) 주쇄 RMSF 프로파일. (C) 3DCT-LCA의 회전 반경 프로파일. (D) 3DCT-UDCA의 회전 반경 프로파일. (E) 3DCT-LCA의 SASA 프로파일. (F) 3DCT-UDCA의 SASA 프로파일. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 14명시적 POPC 지질 이중층에 삽입된 트립타민-HTR2A 복합체. 수용체는 이중층을 가로지르는 카툰 형태로, POPC 지질은 인산염 헤드그룹이 강조된 선 형태로, 트립타민은 정위적 포켓(orthosteric pocket) 내에 표시되어 있습니다. 물은 막의 위아래에 표시되어 있습니다. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 15명시적 POPC 지질 이중층 내에서 20ns 동안 수행된 tryptamine-HTR2A/6A93 복합체의 분자 역학 궤적 분석. (A) 백본 RMSD 프로파일. (B) 잔기별 RMSF 프로파일. (C) 회전 반경 프로파일. (D) SASA 프로파일. (E) 단백질-리간드 수소 결합 수. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 1620 ns 막 궤적 동안의 트립타민-Asp15 (D3.32) 이온 상호작용의 지속성. 트립타민 암모늄 질소와 Asp15 카복실레이트 산소 원자 사이의 최소 거리를 시간에 따라 도식화하였으며, 점선은 0.4 nm의 염교(salt-bridge) 접촉 임계값을 나타냅니다. 해당 접촉은 시뮬레이션 시간의 9.9% 동안 유지되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
| 유전자 기호 | 기원 대사물질 | 기능적 범주 | log2FC | FDR (보정 P-값) | 중요도 등급 |
| 글루카곤(GCG) | 프로피온산염 | 펩타이드 호르몬 관련 단백질 | −1.342 | 1.97e−7 | 허위 발견율(FDR) <0.001 & |logFC > 1 |
| HDAC3 | 낙산염 | 효소 | −1.234 | 2.4e−6 | 허위 발견율(FDR) <0.001 & |logFC| > 1 |
| CASP3 | 유롤리틴 A | 효소 | −1.198 | 6.6e−7 | 허위 발견율(FDR) <0.001 & |logFC| > 1 |
| GPR68 | 프로피오네이트 | 막 수용체 | −1.137 | 4.35e−6 | 허위발견율 <0.001 & |logFC| > 1 |
| GNAQ | 프로피온산염 | 세포 내 신호전달 단백질 | −1.122 | 1.05e−6 | 허위 발견율(FDR) <0.001 & |logFC| > 1 |
| GPHN | 프로피온산염 | 기타 세포 내 단백질 | −1.109 | 1.13e−6 | 허위 발견율(FDR) <0.001 & |logFC| > 1 |
| TBXA2R | 프로피온산염 | 막 수용체 | −1.104 | 4.04e−7 | 허위 발견율 (FDR) <0.001 & |logFC| > 1 |
| HTR6 | 트립타민 | 막 수용체 | −0.967 | 2.17e−5 | 허위 발견율(FDR) <0.001 |
| 비타민 D 수용체(VDR) | 리토콜산 | 핵수용체 | −0.942 | 5.73e−7 | 허위 발견율(FDR) <0.001 |
| HTR2A | 트립타민 | 막 수용체 | −0.937 | 4.9e−6 | 허위 발견율(FDR) <0.001 |
| FFAR2 | 프로피오네이트 | 막 수용체 | −0.889 | 1.4e−4 | 허위 발견율 (FDR) <0.001 |
| NR1H4 | 리토콜산 / 우르소데옥시콜산 | 핵 수용체 | −0.861 | 3.68e−6 | 허위 발견율(FDR) <0.001 |
| HTR2B | 트립타민 | 막 수용체 | −0.702 | 1.29e−4 | 허위 발견율(FDR) <0.001 |
| MLN | 프로피오네이트 | 펩타이드 호르몬 관련 단백질 | −0.605 | 7.39e−5 | 허위 발견율(FDR) <0.001 |
| KYAT1 | 인돌-3-젖산 / 인돌-3-프로피온산 | 효소 | −0.530 | 3.61e−4 | 허위 발견율 (FDR) <0.001 |
| 칼슘 감지 수용체 (CASR) | 프로피온산염 | 막 수용체 | −0.483 | 4.05e−4 | 허위 발견율(FDR) <0.001 |
| HTR1B | 트립타민 | 막 수용체 | −0.455 | 3.18e−2 | 허위 발견율 (FDR) <0.05 |
표 1: IBS-C 직장 점막 데이터셋의 차별 발현 유전자와 중복되는 대사물질 관련 예측 표적 유전자. 나열된 모든 중복 유전자는 하향 조절되었습니다. 표 1은 스프레드시트 표로 별도 제출되었으며, 각 표적에 대해 기원 대사물질, 기능 범주, 표적 예측 출처(화학물질-단백질 상호작용 표적 예측, 분자 도킹 프로그램 또는 둘 다), 화학물질-단백질 상호작용 표적 예측 결합 상호작용 점수, 그리고 가능한 경우 분자 도킹 프로그램 확률, 예측 티어, log2 fold change, 발현 유의성 티어를 포함한 FDR을 나타냅니다. 출처: 유전자 발현 값은 유전자가 통합된 GSE36701 차별 발현 표(유전자당 가장 낮은 FDR 프로브)에서 얻었습니다. 표적 예측 출처 및 신뢰도 값은 화학물질-단백질 상호작용 표적 예측 결합 상호작용 점수 ≥ 0.70 및 분자 도킹 프로그램 확률 ≥ 0.70 임계값을 사용하여 화학물질-단백질 상호작용 표적 예측 및 분자 도킹 프로그램의 결과물로부터 수집되었습니다. 화학물질-단백질 상호작용 표적 예측 점수는 0-1 척도의 결합 점수이며, STP는 분자 도킹 프로그램 확률을 의미합니다. Tier 1 = 화학물질-단백질 상호작용 표적 예측-엄격한 지지; Tier 1+ = 분자 도킹 프로그램에 의해 교차 지지되는 화학물질-단백질 상호작용 표적 예측-엄격한 지지.
| 복합체 | 단백질 (PDB ID) | 리간드 | Vina 점수 (kcal/mol) | 공동 크기 ($\text{\AA}^3$) | 그리드 중심 X,Y,Z (A) | 검색창 (A) |
| LCA-VDR | VDR (1DB1) | 리토콜산 | −10.0 | 2055 | 10, 19, 33 | 25 x 25 x 25 |
| LCA-NR1H4/FXR | NR1H4/FXR (3DCT) | 리토콜산 | −9.9 | 3395 | 137, 31, 78 | 25 x 25 x 25 |
| UDCA-NR1H4/FXR | NR1H4/FXR (3차원 세포 배양) | 우르소데옥시콜산 | −9.4 | 3395 | 137, 31, 78 | 25 x 25 x 25 |
| 유롤리틴 A-CASP3 | CASP3 (2DKO) | 유롤리틴 A | −7.1 | 233 | 37, 34, 32 | 25 x 25 x 25 |
| 트립타민-HTR2A | HTR2A (6A93) | 트립타민 | −7.1 | 3238 | 12, −1, 61 | 25 x 25 x 25 |
표 2: 분자 도킹 결과: 우선순위가 지정된 5가지 단백질-리간드 복합체에 대해 타겟 단백질에 대한 대사체 리간드의 분자 도킹 상위 랭킹 점수 및 캐비티 파라미터. 캐비티 크기는 Å3로 표시됨. 출처: Docking_Validation/Results/Docking_Validation_Results.xlsx, 'Original_Docking_Scores' 시트. 타겟 단백질에 대한 대사체 리간드의 분자 도킹; 모든 복합체에 대해 exhaustiveness = 8, seed = 42 (고정), num_modes = 9 적용; 상위 랭킹(mode 1) 포즈를 보고함.
| 상호작용 유형 | 잔기(s) | 거리 (A) | 참고 사항 |
| 전형적인 수소 결합 | Ser278 | 4.29 | LCA 카복실레이트 산소 |
| 소수성 / Pi-알킬 접촉 | Leu230, Val234, Trp286, Val30, His305, Tyr295, Leu23, His397 | - | |
| 반데르발스 접촉 | Met272, Leu313, Ile271, Ile268, Leu309, Phe422, Val418, Ala231, Ala303, Cys28, Ser275, Phe150 | - |
표 3: VDR (PDB ID: 1DB1)과 리토콜산 도킹을 통해 생성된 결합 모드. 출처: 원고 결과(분자 도킹)에 보고된 분자 시각화 및 2차원 상호작용 다이어그램 도구 2D 리간드-잔기 상호작용 다이어그램. '-'는 해당 접촉에 대해 거리 값이 개별적으로 보고되지 않았음을 나타냄.
| 상호작용 유형 | 잔기(s) | 거리 (A) | 비고 |
| 수소 결합 | His294 | - | |
| 수소 결합 | Ile35 | - | |
| Pi-Sigma 상호작용 | His294 | - | |
| Alkyl / Pi-Alkyl (소수성) | Met290, Met328, Ala291, Leu287, Ile352, His47 | - | |
| 반데르발스 접촉 | 추가 포켓 잔기 (소스에 개별적으로 명시되지 않음) | - | 스테로이드 골격 수용을 지원함 |
표 4: NR1H4/FXR (PDB ID: 3DCT)와 리토콜산(lithocholic acid) 도킹을 통해 생성된 결합 모드.
출처: 분자 시각화 및 2차원 상호작용 다이어그램 도구 2D 리간드-잔기 상호작용 다이어그램, 원고 결과(분자 도킹)에 보고된 내용. '-'는 해당 접촉에 대해 거리 값이 개별적으로 보고되지 않았음을 나타냅니다.
| 상호작용 유형 | 잔기 | 거리 (A) | 참고 사항 |
| 전형적인 수소 결합 | His47 | 3.66 | |
| 수소 결합 | Gly32 | 3.46 | |
| 파이-음이온 상호작용 | Val325 | 4.96 | |
| 탄소-수소 결합 | Trp469 | 4.51 | |
| 불리한 공여체-공여체 접촉 | Arg395 | 3.89 | |
| 불리한 공여자-공여자 접촉 | Gln396 | 3.40 |
표 5: NR1H4/FXR (PDB ID: 3DCT)와 ursodeoxycholic acid 도킹을 통해 생성된 결합 모드. 출처: 원고의 결과(분자 도킹) 섹션에 보고된 분자 시각화 및 2차원 상호작용 다이어그램 도구 2D 리간드-잔기 상호작용 다이어그램. '-'는 해당 접촉에 대해 거리 값이 개별적으로 보고되지 않았음을 나타냄.
| 상호작용 유형 | 잔기(들) | 거리 (A) | 참고 사항 |
| 전형적인 수소 결합 | Gln161 | 3.78 | |
| 전형적인 수소 결합 | Gln161 | 4.19 | 2차 접촉 |
| 전형적 수소 결합 | Ser120 | 3.95 | |
| 전형적인 수소 결합 | Arg207 | 3.05 | |
| 전형적인 수소 결합 | Arg207 | 3.77 | 2차 접촉 |
| 파이-양이온 상호작용 | Arg207 | - | |
| 파이-도너(Pi-Donor) 수소 결합 | Cys163 | - | |
| Pi-알킬 / 반데르발스 접촉 | Arg64, Ala162, His121, Ser205, Trp206 | - |
표 6: CASP3(PDB ID: 2DKO)와 urolithin A 도킹을 통해 생성된 결합 모드.출처: 원고의 결과(분자 도킹) 섹션에 보고된 분자 시각화 및 2차원 상호작용 다이어그램 도구 2D 리간드-잔기 상호작용 다이어그램. '-'는 해당 접촉에 대해 거리 값이 개별적으로 보고되지 않았음을 나타냄.
| 상호작용 유형 | 잔기 | 거리 (A) | 비고 |
| 정전기적 염교 | Asp15 (D3.32) | - | tryptamine의 양성자화된 아민 |
| 수소 결합 | Thr160 | - | |
| 수소 결합 | Ser159 | - | |
| 방향족 접촉 | Phe340, Trp36 | - | |
| Pi-Alkyl 상호작용 | Val156, Ile163 | - | |
| 반데르발스 접촉 | Tyr370, Phe39, Ser242, Phe243, Phe332, Leu123 | - |
표 7: HTR2A (PDB ID: 6A93)와 tryptamine 도킹을 통해 생성된 결합 모드. 출처: 원고 결과(분자 도킹)에 보고된 분자 시각화 및 2차원 상호작용 도표 도구인 2D 리간드-잔기 상호작용 도표. '-'는 해당 접촉에 대한 거리 값이 개별적으로 보고되지 않았음을 나타냄.
| (A) 리도킹 검증 (양성 대조군) | ||||||
| PDB ID | 단백질 | 공결정 리간드 | Vina 점수 (kcal/mol) | RMSD (Å) | 임계값 (A) | 결과 |
| 1DB1 | 비타민 D 수용체 (VDR) | VDX (비타민 D 유사체) | −13.0 | 0.87 | 2.0 | PASS |
| 3차원 컴퓨터 단층촬영(3DCT) | FXR | WAY-362450 (064) | −11.9 | 1.79 | 2.0 | PASS |
| (B) 교차-도킹 검증 (음성 대조군) | ||||||
| 리간드 | 동종 표적 (PDB) | 동족체 점수 (kcal/mol) | 비동종 표적 (PDB) | 비동족 점수 (kcal/mol) | 델타 (kcal/mol) | 선택성 |
| 리토콜산 | VDR (1DB1) | −10.0 | CASP3 (2DKO) | −8.3 | 1.7 | 확인됨 |
| 트립타민 | HTR2A (6A93) | −7.1 | VDR (1DB1) | −6.4 | 0.7 | 적당함 (Vina 불확실성 ±0.5–1.0 범위 내) |
표 8: 도킹 프로토콜 검증 결과: 재도킹 RMSD 값(양성 대조군) 및 교차 도킹 점수(음성 대조군).출처: Docking_Validation/Results/Docking_Validation_Results.xlsx 및 Docking_Validation/Logs/*.log (표적 단백질에 대한 대사체 리간드의 분자 도킹, exhaustiveness = 8, seed = 42, 25 Å × 25 Å × 25 Å 박스). RMSD는 중원자, 원자 이름 매칭(중첩 없음)으로 계산됨.
| 복합체 | RMSD (nm), 평균 ± 표준편차 (범위) | Rg (nm), 평균 + / – 표준편차 (범위) | SASA (nm^2), 평균 ± 표준편차 (범위) | 수소 결합, 평균 + / –표준편차 (범위) | RMSF (nm), 평균 (최대값) |
| LCA-VDR/1DB1 | 0.230 + / – 0.025 (0.167–0.296) | 1.889 + / − 0.009 (1.863–1.919) | 130.4 + / − 2.3 (122.3–137.4) | 1.9 + / − 0.9 (0–7) | 0.093 (잔기 120에서 최대 0.60) |
| LCA-NR1H4/FXR/3DCT | 0.190 + / – 0.020 (0.135–0.281) | 1.824 + / − 0.008 (1.804–1.849) | 129.7 + / − 2.3 (121.9–138.1) | 3.8 + / − 0.7 (1–6) | 0.13 (최대 0.298) |
| UDCA-NR1H4/FXR/3DCT | 0.190 + / – 0.020 (0.135–0.281) | 1.834 + / − 0.013 (1.809–1.921) | 131.0 + / −3.4 (121.6–143.5) | 1.1 + / − 1.1 (0–5) | 0.13 (최대 0.298) |
| Urolithin A-CASP3/2DKO | 0.521 + / – 0.058 (0.244–0.755) | 1.892 + / − 0.024 (1.839–1.984) | 134.9 + / − 3.0 (126.4–146.4) | 0.6 + / − 0.7 (0–3) | 1.172 (잔기 175에서 최대 2.532) |
| 트립타민-HTR2A/6A93 (세포막) | 0.177 + / –0.017 (0.131–0.227) | 2.089 + / − 0.007 (2.070–2.116) | 165.1 + / − 2.7 (156.–172.7) | 1.7 + / − 0.7 (0–4) | 0.090 (최대 0.319) |
표 9: 막-내장형 tryptamine-HTR2A 시스템을 포함하여 우선순위가 지정된 5종의 단백질-리간드 복합체에 대한 20 ns 분자 동역학 시뮬레이션 거동 요약.출처: 프로토콜 단계 8.8에 따라 각 20 ns 생산 실행의 마지막 150 ns(50–20 ns) 동안 계산된 분자 동역학 궤적 분석 유틸리티(.xvg) 파일 — gmx rms, gmx gyrate, gmx sasa, gmx hbond, gmx rmsf. RMSD/Rg는 백본 피팅 완료; SASA 프로브 반경 0.14 nm; H-결합 공여자-수용체 컷오프 0.35 nm / 30 °. LCA-3DCT와 UDCA-3DCT는 하나의 단백질 백본 궤적(RMSD, RMSF)을 공유하며 리간드별 Rg/SASA/H-결합 값을 가짐.
| Tryptamine-HTR2A/6A93 (세포막) — 잔기별 정량적 분해 분석 | ||
| 잔기 | 총 ddG 기여도(kcal/mol), 평균 ± 표준편차(SD) | 방향 |
| Asp15 (D3.32) | −89.94 + / − 6.81 | 안정화 (우성) |
| 트립타민 (리간드) | −13.01 + / − 6.22 | 안정화 |
| Tyr171 | 13.62 + / − 4.54 | 불안정화 |
| Val167 | 23.32 + / − 3.96 | 불안정화 |
| Val156 | 20.03 + / − 3.81 | 불안정화 |
| Thr160 | 4.86 + / − 3.64 | 불안정화 |
| Ser159 | 24.16 + / − 3.48 | 불안정화 |
| Ser86 | 24.48 + / − 3.65 | 불안정화 |
| Phe87 | 35.18 + / − 4.04 | 불안정화 |
| Phe13 | 32.80 + / −3.70 | 불안정화 |
| Phe140 | 30.63 + / − 3.84 | 불안정화 |
| Phe141 | 35.25 + / − 3.55 | 불안정화 |
| Ile163 | 27.64 + / − 3.71 | 불안정화 |
| Trp137 | 53.77 + / − 4.32 | 불안정화(가장 불리한) |
| 나머지 4개 복합체 — 잔기별 분해(정성적)에서 확인된 잔기들 | ||
| 복합체 | 잔기 | 지침 |
| LCA-VDR/1DB1 | 리간드 (LCA) | 유리한 |
| LCA-VDR/1DB1 | Gln317 | 유리한 |
| LCA-VDR/1DB1 | Trp286 | 불리한 |
| LCA-NR1H4/FXR/3DCT | Arg31 | 유리한 (우성) |
| UDCA-NR1H4/FXR/3DCT | Glu326 | 혼합/분산 네트워크 |
| UDCA-NR1H4/FXR/3DCT | Asp394 | 혼합/분산 네트워크 |
| UDCA-NR1H4/FXR/3DCT | Arg395 | 혼합/분산 네트워크 |
| UDCA-NR1H4/FXR/3DCT | Arg41 | 혼합/분산 네트워크 |
| UDCA-NR1H4/FXR/3DCT | Asp470 | 혼합/분산 네트워크 |
| Urolithin A-CASP3/2DKO | Arg64 | 매우 유리함 (극성/정전기적) |
| Urolithin A-CASP3/2DKO | Arg207 | 강한 호성 (극성/정전기적) |
표 10: 잔기별 MM-PBSA 분해 요약 초록: 막 내장형 tryptamine-HTR2A 시스템을 포함하여 우선순위가 지정된 5가지 단백질-리간드 복합체의 각각에 대한 안정화 및 불안정화 잔기 (절대 기여도 ≥ 0.5 kcal mol⁻1).출처: Membrane Simulation/03_MMPBSA/results/FINAL_DECOMP_MMPBSA.dat (분자 역학/연속체 용매 결합 에너지 계산 도구인 Generalized Born (GB) 잔기별 분해, 'Complex: Total Energy Decomposition'). 잔기 번호는 CHARMM-GUI로 구축된 시스템의 내부 번호(오프셋 +68)에서 본 원고의 다른 부분에 사용된 기존 6A93 PDB 번호로 변환됨.
출처: Previous_MD Simulation data/1DB1,2KD0, LCA & UDCA_3DCT}/mmpbsa_*/Decomposition_NORMAL_GB_Complex_TDC*.svg 및 원고 결과(MM-PBSA 결합 자유 에너지 및 잔기별 분해). 이 네 가지 복합체는 프로젝트 디렉토리에 수치화된 잔기별 .dat/.csv 출력값이 없으며(기계적 추출이 불가능한 벡터 경로 텍스트로 렌더링된 SVG 플롯만 존재함), 원고 텍스트에 명시된 대로 잔기 식별자와 유리/불리 방향만 보고되었습니다. 이 네 가지 복합체에 대한 정확한 kcal/mol 기여도는 소스 저장소에서 확인할 수 없습니다.
토론
본 탐색적 계산 연구는 미생물 대사물질 관련 호스트 유전자 및 단백질-리간드 복합체의 우선순위를 정하기 위한 통합적이고 재현 가능한 워크플로우를 제시하며, 이를 공개된 IBS-C 직장 점막 전사체 데이터셋에 적용하였습니다. 이 워크플로우를 통해 예측된 미생물 대사물질 관련 유전자의 일부가 데이터셋 내에서 일관되게 하향 조절된 유전자들과 중첩되었으며, 이들은 GPCR, 세로토닌성, 칼슘 신호 전달, 신경 활성 리간드-수용체 및 핵 수용체 관련 경로 내에서 클러스터링되었는데, 이러한 시스템들은 미생물군-호스트 간 통신에 점차 더 깊이 관여하는 것으로 알려져 있습니다48,49. 이러한 결과는 엄격히 가설 생성 단계로 해석되어야 합니다. 즉, 본 분석은 미생물 대사물질 농도, 수용체 단백질 풍부도, 리간드 결합, 수용체 활성화, 하위 신호 전달, 운동성, 분비, 통증 반응 또는 임상 결과를 측정하지 않았습니다. 뒷받침 가능한 가장 강력한 결론은 식별된 유전자와 경로가 확정된 질환 메커니즘이라기보다 실험적 검증을 위한 후보라는 점입니다.
개별 대사물질-수용체 쌍만을 독립적으로 조사한 이전 연구들과 비교했을 때, 이 프로토콜의 결정적인 중요성은 표적 예측, 공개 전사체학, 네트워크 분석, 검증 대조군을 포함한 도킹, 분자 동역학 및 MM-PBSA를 단일 순차적 우선순위 지정 파이프라인으로 통합했다는 점에 있습니다. 각 단계는 이전 단계에서 생성된 후보군 세트를 좁히고 맥락화하며, 이러한 순차적 필터링을 통해 최종 후보 목록을 실험적으로 다룰 수 있는 수준으로 만듭니다. 여기서 확인된 GNAQ 중심 GPCR 모듈과 세로토닌 수용체 관련 모듈은 포스포리파제 C 활성화, 이노시톨 1,4,5-트리스포스페이트 생성, 칼슘 동원, 분비 및 장내분비 기능에서 Gq 신호 전달의 역할, 그리고 점막 항상성에서 단쇄 지방산 및 트립토판 유래 신호 전달의 확립된 역할과 위장관 운동성, 분비, 내장 민감도 및 장-뇌 소통에서 세로토닌성 신호 전달의 역할에 비추어 생물학적으로 타당합니다10,18,50,51.
본 연구의 핵심 방법론적 특징은 막 내장 수용체인 HTR2A의 처리 방식입니다. 수용성 단계 시뮬레이션으로는 G 단백질 결합 수용체의 형태적 거동을 결정하는 지질 환경을 재현할 수 없으므로, 트립타민-HTR2A 복합체를 명시적 POPC 이중층에서 시뮬레이션하였습니다. 이러한 막 환경에서 수용체는 200 ns의 전체 궤적 동안 구조적으로 안정하게 유지되었으며, 트립타민 암모늄-Asp155 (D3.32) 염교는 시뮬레이션 전 기간 동안 거의 일정하게 유지되었습니다. 도킹 포즈, 궤적 전반에 걸친 지속적인 접촉 거리, 그리고 잔기당 지배적인 MM-PBSA 기여도라는 세 가지 독립적인 증거가 동일한 보존된 D3.32 상호작용으로 수렴한다는 점은 예측된 트립타민 결합 모드의 내부 일관성을 뒷받침하며, 이는 세로토닌 수용체에서 아민성 리간드의 전형적인 결합 기하 구조를 재현합니다.
이 워크플로우를 재현할 때 고려해야 할 몇 가지 방법론적 사항이 있습니다. 표준 구조의 오류나 Pan-assay interference compounds ((PAINS) 표지 화합물)의 오류는 타겟 예측 및 도킹을 통해 전파되므로, 정확한 대사체 선택과 화학 정보학적 큐레이션이 필요합니다. 신뢰도 기준을 일관되게 적용하여 노이즈로 인한 타겟 세트를 최소화하십시오(화학-단백질 상호작용 타겟 예측: ≥0.700; 분자 도킹 프로그램: ≥0.70; 단백질-단백질 상호작용 네트워크 구축 및 경로 농축: ≥0.700). 모든 대사체 관련 유전자를 수용체로 오인하는 것을 방지하기 위해 예측된 타겟을 기능적 범주별로 그룹화해야 합니다. PDB 구조의 정밀한 전처리, 리간드 에너지 최소화, 기지의 결합 잔기 주변 그리드 배치는 도킹의 필수적인 요소이며, 본 연구에서 도입한 리도킹(redocking) 및 크로스 도킹(cross-docking) 대조군은 도킹 방법론의 정확성에 대한 객관적인 척도를 제공합니다. 분자 역학의 재현성 범위는 포스 필드(force-field) 파라미터화, 적절한 용매화 또는 막 구축, 단계적 평형화, 그리고 충분한 프로덕션 샘플링의 조합으로 정의됩니다.
일반적인 조정 및 문제 해결 단계에는 대상 예측에서 히트가 나타나지 않을 때 임계값을 완화하는 것, 여러 개의 프로브가 있는 유전자에 대해 프로브 수준에서 방향성 일관성을 확인하는 것, 그리고 개별적인 단백질-단백질 상호작용 네트워크 구축 및 경로 농축 노드를 생물학적으로 무관한 것이 아니라 임계값에 의존적인 것으로 해석하는 것이 포함됩니다. 막 수용체의 경우, 여기에서 설명하는 HTR2A 방법에 예시된 바와 같이 수성 시뮬레이션보다는 명시적인 지질 이중층 시뮬레이션을 사용해야 합니다. 잔기별 에너지 분해가 필요한 경우, 분해 기능이 있는 엔진으로 계산을 수행해야 하며, 보고된 잔기 번호는 모호함을 피하기 위해 고유 수용체 번호와 일치시켜야 합니다. 경로 농축 결과는 경로 수준의 검증보다는 후보 목록을 위한 조직적 맥락으로 처리하는 것이 가장 바람직합니다. 기계적으로, 유전자 목록에 여러 세로토닌 수용체 유전자가 포함되어 있다면 단백질 수준의 공동 조절 여부와 관계없이 GPCR, 세로토닌성 또는 칼슘 신호 전달 용어의 농축이 발생하게 됩니다. 막에 매몰된 HTR2A 시스템의 RMSD, Rg 및 RMSF 값은 지질 이중층을 고려하여 해석해야 합니다. 즉, 후기 궤적에서 Rg의 감소는 전반적인 풀림(unfolding)보다는 이중층으로 인한 transmembrane bundle의 형태적 적응을 반영할 수 있으며, 지속적인 리간드-단백질 수소 결합은 전반적인 RMSD 안정성과 함께 해석되어야 합니다.
본 연구의 제한점은 상당히 많으며 이는 결과 해석에 제약을 줍니다. 본 연구는 상대적으로 규모가 작은 하나의 공공 데이터셋을 기반으로 하였으며, 주요 공공 전사체 저장소(웹 기반 차등 유전자 발현 분석 도구 및 ArrayExpress)를 탐색하였으나 분석 당시 복제 코호트로 활용할 수 있는 유사한 설계 및 플랫폼의 독립적인 IBS-C 직장 점막 전사체 데이터셋을 찾을 수 없었습니다. 독립적인 전사체 복제 데이터의 부재는 주요한 제한점이며, 본 논문의 어떤 진술도 단일 데이터셋 결과에 대한 외부 검증으로 해석되어서는 안 됩니다. 해당 데이터셋은 거의 보편적인 차등 발현(유전자의 약 94.5%가 유의미하며, 이 중 대다수가 하향 조절됨)을 보이는데, 이러한 특성은 일반적인 농축 통계를 무의미하게 만들며 게놈 배경 대비 표적 유전자 하향 조절의 특이성에 관한 결론 도출을 어렵게 합니다. 따라서 중첩 결과는 통계적 농축이 아닌 기술적인 방향성 패턴으로 보고되었습니다. 벌크 점막 전사체 분석으로는 실제 유전자 조절과 세포 구성의 변화를 구분할 수 없습니다. mRNA 발현이 단백질 풍부도나 기능적 반응을 결정하지는 않습니다. 표적 예측 데이터베이스는 어노테이션 편향의 문제를 안고 있으며, 도킹(docking), MD 및 MM-PBSA 결과는 포스 필드(force field)의 선택, 리간드 파라미터화, 시작 위치, 시뮬레이션 시간 및 샘플링의 적절성에 따라 달라집니다. CHARMM 호환 리간드 파라미터화 서비스, CHARMM-GUI, 통계 컴퓨팅 환경을 포함한 일부 웹 서버 및 패키지 구성 요소의 정확한 마이너/빌드 식별자는 다음과 같습니다.
패키지 빌드 및 분자 역학/연속체 용매 결합 에너지 계산 도구의 하위 버전은 보관된 프로젝트 기록에서 완전히 복구할 수 없었으므로, 별도의 재료 표(Table of Materials)에 기재된 대로 보고되어야 합니다. MM-PBSA 값은 상대적 추정치이며, 명시적인 구성 엔트로피 항을 포함하지 않으므로 실험적 친화도로 해석해서는 안 됩니다. 본 연구에는 대사체 데이터가 부족하여, IBS-C에서 리간드 가용성이 변경되었는지, 또는 관찰된 발현 변화가 원인인지, 결과인지, 보상적 반응인지, 아니면 무관한 상관관계인지 판단할 수 없습니다.
본 방법의 향후 응용 분야에는 독립적인 전사체 복제, 정량적 중합효소 연쇄반응(qPCR) 및 단백질 수준의 검증, 단일 세포 또는 공간 전사체학을 이용한 세포 유형 국소화, 관련 대사체 클래스의 대사체 프로파일링, 그리고 환자 유래 콜로노이드, 점막 외식편 또는 유사 모델에서의 기능적 리간드 반응 분석이 포함되어야 합니다. 설사형 IBS, 혼합형 IBS, 염증성 장질환 및 IBS가 아닌 변비 코호트와의 비교1,2는 질병 특이성을 확립하는 데 도움이 될 것입니다. 구조적 구성 요소의 경우, MD 궤적의 복제, 대안적 시작 포즈를 이용한 민감도 분석 수행, 그리고 토폴로지, 궤적, MM-PBSA 입력 및 출력 파일의 저장 내용을 완전히 문서화함으로써 재현성을 더욱 강화할 수 있을 것입니다. 우선순위가 지정된 복합체가 기능적으로 관련이 있는지 결정하기 위해서는 실험적 리간드 반응 분석이 여전히 필요하며, 본 결과는 임상적 또는 치료적 주장을 뒷받침하지 않습니다.
공개 사항
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
No external funding was received for this study. The public availability of the GSE36701 dataset and the STITCH, SwissTargetPrediction, SwissADME, STRING, RCSB Protein Data Bank, Gene Expression Omnibus, CHARMM-GUI, and Orientations of Proteins in Membranes (OPM) resources, as well as the AutoDock Vina, GROMACS, CHARMM36m, CGenFF, gmx_MMPBSA, Open Babel, PyMOL, and Discovery Studio Visualizer software, is gratefully acknowledged.
재료
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