방법 논문

EDTA 기반 탈회법을 이용한 공간 전사체 분석용 포르말린 고정 파라핀 임베딩 골수 시료 준비

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DOI:

10.3791/72474

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2026년 8월 28일

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1Hematology and Oncology Program, Center for Applied Medical Research (CIMA), Instituto de Investigaciones Sanitarias de Navarra (IdiSNA), Cancer Center Clínica Universidad de Navarra (CCUN), 2Centro de Investigación Biomédica en Red de Cáncer (CIBERONC), 3Hematology and Cell Therapy Department, Cancer Center Clínica Universidad de Navarra (CCUN), Instituto de Investigaciones Sanitarias de Navarra (IdiSNA), 4Bioscience Program, Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

이 논문에서

요약

공간 전사체 분석을 위한 포르말린 고정 파라핀 임베딩(FFPE) 골 조직 샘플 준비의 표준화된 워크플로우에는 RNA 무결성을 보존하기 위한 10일간의 EDTA 탈칼슘화 단계가 포함됩니다. 주요 품질 관리 체크포인트를 통해 샘플이 후속 공간 유전자 발현 분석 요구 사항을 충족하는지 판단할 수 있습니다.

초록

골수(BM)는 공간적 관계가 세포의 행동, 신호 전달 및 기능에 영향을 미치는 복잡하고 역동적인 구조입니다. 이 때문에 세포 상호작용의 전체적인 역동성을 이해하기 위해서는 세포 집단의 구조를 in situ에서 보존하고 매핑하는 상호 보완적인 공간 기술이 필요합니다. 건강한 골수 조직과 질환이 있는 골수 조직의 전사체 이질성을 이해하는 데 기여한 단일 세포 기술의 상당한 발전에도 불구하고, 서로 다른 세포 유형의 공간적 구성, 니치 특이적 조절 프로그램 및 이들의 상호작용은 여전히 추가적인 연구가 필요합니다. 최근 공간 전사체학의 발전으로 다양한 조직에 걸쳐 공간적 맥락을 유지하면서 편향되지 않은 유전자 발현 분석이 가능해졌으며, 이는 공간 해상도가 부족한 단일 세포 방법들을 보완하는 기술이 되고 있습니다. 공간 전사체학은 연조직에서 널리 사용되어 왔으나, 골조직 처리와 관련된 어려움으로 인해 골수와 같은 광물화 조직에서의 사용은 여전히 제한적입니다. 본 프로토콜은 건강하거나 질환이 있는 마우스 및 인간 조직의 포르말린 고정 파라핀 임베딩(FFPE) 샘플을 준비하는 데 사용되었습니다. RNA 무결성을 보존하고 장골 샘플에 공간 전사체학을 적용할 수 있도록 10일간의 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 기반 탈회 단계가 포함되어 있습니다. 이 프로토콜은 조직 처리, 보존 및 절편 제작을 포함한 공간 전사체 분석을 위한 골수 샘플 준비 과정과 절편 무결성, 조직 형태 및 RNA 품질 평가와 같은 필수적인 품질 평가 단계를 설명합니다. 또한, 이 워크플로우는 세포 유형 식별 및 단일 세포 전사체 데이터와의 통합을 지원하여 세포 구성을 특성화하고, 세포 간 상호작용을 정의하며, 건강한 상태와 질환 상태에서 전사적으로 이질적인 세포의 공간적 분포를 시각화할 수 있게 합니다. 종합적으로, 이 워크플로우는 골수의 구조를 보존하면서 완전히 광물화된 건강한 조직 및 악성 조직을 공간 전사체 분석이 가능하도록 준비합니다.

서론

골수(BM)는 조혈 작용과 면역 세포 성숙의 주요 장소 역할을 하는 매우 복잡하고 구획화된 기관입니다1,2. 이 이질적인 조직은 고도로 전문화되고 조직된 3차원 틈새(niche) 내에 공존하는 조혈, 중간엽, 내피 및 면역 세포 계통의 다양한 집합으로 구성됩니다3,4. 이 틈새 내에서 각 세포 집단은 서로 다른 해부학적 영역을 차지하며, 공간적 맥락은 세포 행동, 신호 전달 및 기능을 조절하는 데 근본적인 역할을 합니다4,5. 해면골이나 혈관 네트워크와 같은 특정 구조와의 물리적 근접성은 조혈모세포(HSC)의 정지 상태 유지 및 골 리모델링을 포함한 필수적인 생리적 과정을 제어합니다6,7. 결과적으로, 이러한 역동적인 미세환경과 세포 및 기질 구성 요소 간의 엄격하게 조절되는 상호작용은 항상성을 유지하고 혈액암의 진행에 영향을 미치는 조절 네트워크를 형성합니다8,9,10,11,12,13.

단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)의 발전은 골수(BM) 세포 다양성에 대한 이해를 혁신적으로 변화시켰으며, 이전에는 인식되지 않았던 세포 하위 유형과 니치(niche) 내에서의 예측된 상호작용을 발견할 수 있게 해주었습니다3,10,11,12,14,15,16. 그러나 단일 세포 전사체학은 조혈 니치의 개별 구성 요소에 대한 고해상도 정보를 제공하지만, 세포를 천연 환경에서 분리하여 원래의 상태를 잠재적으로 변화시키는 조직 소화 과정의 내재적 한계17와 뼈 조직의 구조를 정의하는 공간적 맥락의 부족이라는 한계가 있습니다4,18. 이러한 위치 맥락의 상실로 인해 전사적으로 뚜렷한 특정 세포군이 어디에 위치하는지 또는 인접 세포와 어떻게 상호작용하는지를 명확하게 매핑하는 것이 불가능합니다19. 또한, 조밀한 뼈 조직은 흔히 부분적으로만 분리되어 scRNA-seq 데이터 세트에서 골세포 및 지방세포와 같은 주요 세포군이 과소 대표되고 조직의 이질성이 편향되게 나타나는 결과를 초래합니다20,21. 공간 전사체학(Spatial transcriptomics)은 공간적으로 보존된 조직 절편 내에서 in situ로 유전자 발현을 연구할 수 있게 하여, 맥락 정보를 회복하고 단일 세포 기술의 한계를 해결합니다8,19,22,23,24,25,26. 이 기술은 BM을 구성하는 다양한 세포군의 정밀한 공간적 위치와 구조적 조직화를 가능하게 하여, 천연 미세환경 내에서의 상호작용과 기능적 역할을 이해하는 데 필수적인 핵심적 발전을 나타냅니다8,26. 더욱이, 질병의 맥락에서 공간 전사체학은 연구자와 임상의가 전통적인 병리학과 고처리량 유전체학 사이의 간극을 메워 분자 데이터를 형태학적 이미지 위에 겹쳐 볼 수 있게 합니다1,8. 공간 전사체학 기술은 크게 시퀀싱 기반 방법과 이미징 기반 방법의 두 그룹으로 분류할 수 있습니다17,24. Visium, Curio Seeker, GeoMx Digital Spatial Profiler (GeoMx DSP), Stereo-seq, Deterministic Barcoding in Tissue sequencing (DBiT-seq) 및 오픈 소스인 Open-ST와 같은 시퀀싱 기반 플랫폼은 차세대 시퀀싱 전에 공간적으로 바코딩된 어레이 또는 비드에 mRNA를 캡처합니다. Multiplexed Error-Robust Fluorescence in Situ Hybridization (MERFISH), Molecular Cartography, RNAscope, CosMX, Xenium을 포함하는 이미징 기반 방법은 다중 하이브리다이제이션 또는 패들락 프로브 화학을 통해 in situ로 전사체를 직접 시각화합니다27,28. 또는 프로브 기반 검출 필요 여부에 따라 타겟형(targeted) 또는 비타겟형(untargeted) 플랫폼으로 분류할 수 있습니다17,24.

공간 전사체학 방법은 뇌, 심장, 간과 같이 온전한 조직 절편 제작이 용이한 연조직에 널리 적용되어 왔습니다29,30,31. 반면, 뼈의 경우 광물화된 특성으로 인해 공간 전사체학을 구현하는 것이 상당히 더 까다로우며, 조직을 절편 제작 및 후속 조직학적 또는 분자 분석이 가능할 만큼 충분히 부드럽게 만들기 위해 인산칼슘을 조절하여 제거하는 탈회 과정이 필요합니다32,338,20,23,34. 임상 현장에서 일상적으로 사용되는 전통적인 탈회 방법은 일반적으로 염산, 질산, 개미산 또는 인산과 같은 강산성 용액에 의존하며, 이는 RNA의 무결성을 심각하게 저하시키고 세포 형태를 파괴합니다35,36. 이러한 분자적 분해는 공간 분석의 신호 대 잡음비를 낮추어, 연조직과 비교했을 때 유전자 검출률이 수용 불가능할 정도로 낮아지는 결과를 초래하는 경우가 많습니다8,10. 이러한 한계는 시퀀싱 기반의 공간 분석을 위해 광물화된 시료 내 mRNA 무결성을 안정적으로 보존하는 표준화된 탈회 워크플로우의 필요성을 강조합니다8,20.

본 프로토콜은 이전에 Muiños-Lopez 등에 의해 적용된 바 있는, 공간 전사체 분석을 위한 포르말린 고정 파라핀 임베딩(FFPE) 골수(BM) 샘플 준비의 표준화된 워크플로우를 제시합니다8. 이 워크플로우에는 조절된 pH에서 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 사용하는 10일간의 탈회 단계가 포함됩니다. 강한 산성과 달리, EDTA는 미세 구조를 보존하고 핵산의 품질을 유지하는 온화한 킬레이트제로 작용하여 분자 생물학적 응용 분야에서의 사용을 가능하게 합니다8,20,33,36,37. 개념 증명으로서, 본 프로토콜은 건강한 마우스 및 다발성 골수종(MM) 마우스 모델의 골 조직 샘플과 건강한 사람 및 환자의 인간 골수 표본에 적용되었으며, 이후 Visium Spatial Gene Expression 플랫폼을 통해 시퀀싱되었습니다38. 워크플로우에는 인간 및 마우스 골 샘플의 조직 획득, 고정, 탈회, 탈수, 파라핀 임베딩, 절편 제작에 대한 표준 절차가 포함되며, 이어서 절편 무결성 평가, 헤마톡실린-에오신(H&E) 염색, RNA 품질 평가(DV200), 그리고 세포 유형 검증을 위한 선택적 면역형광(IF) 분석을 포함하는 종합적인 품질 관리 파이프라인이 수행됩니다. 이러한 준비 단계는 조직 절편의 전처리, 라이브러리 구축, 시퀀싱, 그리고 후속 데이터 품질 관리 및 분석을 포함한 다운스트림 공간 전사체 워크플로우에 고품질의 절편만이 사용되도록 보장합니다.

본 표준 절차는 공간 전사체 분석을 위한 인간 및 마우스 골수(BM) 샘플의 준비와 품질 평가 과정을 지원합니다. 이는 혈액 및 골격 질환에서 니치 특이적 조절 프로그램에 대한 연구를 촉진하기 위해 고안되었습니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 과학적 목적으로 사용되는 동물의 보호에 관한 유럽 지침 2010/63/EU를 준수하여 수행되었으며, 나바라 대학교 동물 윤리 위원회(Comité de Ética para la Experimentación Animal; 프로토콜 CEEA082-20 및 CEEA039-20)의 승인을 받았습니다. 동물의 관리, 취급 및 안락사는 통증과 고통을 최소화하기 위해 스페인 법령에 따라 수행되었습니다.

본 인간 대상 연구는 나바라 대학교 의과대학 연구윤리위원회(Comisión de Ética de Investigación, CEI; 프로젝트 2022.100mod1 및 2023.172)와 나바라 보건 서비스 연구윤리위원회(CEIm–Departamento de Salud de Navarra; PI_2022/92 MS-1)의 승인을 받았습니다. 인간 참여자가 포함된 모든 절차는 헬싱키 선언의 윤리적 원칙에 따라 수행되었습니다. 개인 정보는 개인정보 보호 및 디지털 권리 보장에 관한 스페인 유기법 3/2018 및 생의학 연구에 관한 스페인 법 14/2007을 준수하여 비밀리에 처리되었습니다.

참고: 본 연구에 사용된 시약 및 장비의 상세 목록은 다음에서 제공됩니다. 재료 목록골 조직에 공간 전사체학을 구현하기 위한 종합적인 실험 파이프라인이 도식적으로 나타나 있습니다. 그림 1 그리고 세 가지 운영 단계인 시료 획득, 품질 관리(QC) 및 공간 전사체 프로파일링으로 구성됩니다. 시료 획득에는 인간 또는 생쥐의 뼈 조각 수집이 포함되며, 이후 고정, EDTA 탈회, 탈수, 파라핀 매립, 그리고 절편 제작 및 슬라이드 준비 과정이 이어집니다. QC 단계에서는 조직학적 무결성과 RNA 보존 상태를 평가합니다. 검증된 뼈 절편은 슬라이드 상에서 조직 투과화, 라이브러리 제작, 시퀀싱 및 데이터 분석 과정을 거칩니다.

골 조직 처리: 고정, 탈회, 탈수; 공간 전사체학 워크플로우 다이어그램.
그림 1: 생쥐 및 인간 골 조직의 시료 수집 및 EDTA 기반 준비 워크플로우. 생쥐 대퇴골과 인간 골 시료를 수집하여 고정하고, EDTA로 탈회한 뒤, 탈수, 파라핀 임베딩 및 섹셔닝을 수행합니다. H&E 염색과 RNA 무결성(DV200) 평가를 통해 시료 품질을 확인한 후, 공간 전사체 조직 전처리, 라이브러리 제작, 시퀀싱 및 데이터 품질 관리를 진행합니다. 약어: BM = 골수; DV200 = 200 뉴클레오타이드보다 긴 RNA 단편의 백분율; EDTA = ethylenediaminetetraacetic acid; H&E = hematoxylin and eosin; QC = 품질 관리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. 골 조직 샘플의 수집 및 처리

  1. 마우스 뼈 수집
    1. 5% isoflurane으로 동물을 마취하고 반사 작용의 소실을 확인한다.
    2. 완전히 마취되면, 기관 및 규제 지침에 따라 경추 탈구로 안락사를 수행한다.
      ​참고: 안락사는 교육을 받은 인원이 수행해야 하며, 조직 수집을 진행하기 전에 사망을 확인해야 한다.
    3. 마우스의 등 쪽에 70% ethanol을 분사하여 피부를 소독하고, 수술용 가위를 사용하여 작은 절개를 내어 피부를 조심스럽게 제거하고 뒷다리를 노출시킨다.
    4. 고관절 윗부분을 절단하여 뒷다리를 분리하고, 10 mL의 차가운 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)가 들어 있는 50 mL 튜브로 옮긴다. 튜브를 얼음 위에 둔다.
    5. 멸균 핀셋과 메스를 사용하여 부착된 근육과 결합 조직을 제거한다.
    6. 깨끗하고 차가운 DPBS가 미리 채워진 50 mL 멸균 용기에 뼈를 옮긴 후, 용기를 얼음 위에 둔다.
    7. 조직의 무결성을 보존하기 위해 즉시 샘플 조직 고정을 진행한다.
  2. 인체 뼈 샘플 취급
    1. 100 mL 멸균 용기에 담긴 뼈 코어 생검 조직 또는 수술적 뼈 파편을 수령한다.
    2. 뼈 파편을 차가운 DPBS가 미리 채워진 깨끗한 멸균 100 mL 용기로 옮긴 후, 얼음 위에 둔다.
    3. 조직의 무결성을 보존하기 위해 즉시 샘플 고정을 진행한다.
      주의: 인체 샘플은 BSL 2 조건 하에서 취급해야 한다.
  3. 뼈 조직 고정
    1. 뼈 샘플이 들어 있는 50 mL 또는 100 mL 용기를 준비하고 DPBS를 버린다.
    2. 플라스틱 카세트에 라벨을 붙이고 뼈 샘플을 개별 카세트에 넣는다. 이후 처리 과정에서 조직이 손실되지 않도록 뚜껑을 단단히 닫는다.
      ​참고: 마우스 샘플의 경우, 카세트당 뼈 하나를 넣는다. 인체 뼈 샘플의 경우, 필요한 경우 멸균 메스를 사용하여 조직을 표준 카세트에 들어갈 만큼 작은 파편으로 자르고, 카세트당 파편 하나를 넣는다. 이 단계에서 인체 뼈 샘플을 절단하기에 너무 단단한 경우, 그대로 두어 탈칼슘 용액으로 옮길 수 있다. 탈칼슘화되어 조직이 부드러워지면, 적절한 크기의 파편으로 잘라 라벨이 붙은 카세트에 넣을 수 있다.
    3. 샘플과 고정액의 비율을 1:20으로 하여 4% buffered formaldehyde solution을 첨가하고, 4 °C에서 24시간 동안 배양한다.
      주의: 고정액은 독성과 휘발성 흄이 있으므로 화학 흄 후드 내에서 취급한다.
      참고: 과고정(>48시간)은 FFPE 워크플로우에서 RNA 무결성을 저하시키므로 피해야 한다39.
  4. 광화된 뼈 조직의 탈칼슘화
    1. 포르말린을 버리고 초순수로 뼈 샘플을 세척한다. 물로 헹구고 짧게 흔든 뒤 버려서 남아 있는 포르말린 잔류물을 제거한다.
    2. 초순수로 0.25 M EDTA 용액을 준비하고 pH를 6.95로 조정한다.
      참고: 전통적인 탈칼슘화 프로토콜에서는 EDTA의 pH를 8.0으로 조정하는 경우가 많지만, 본 워크플로우에서는 조직의 형태와 RNA 품질을 보존하면서 효율적인 킬레이션을 지원하기 위해 약 pH 6.95의 EDTA를 사용한다8.
    3. 뼈 샘플이 들어 있는 용기에 EDTA 용액을 넣고 4 °C에서 완만하게 흔들며 10일 동안 배양한다.
      ​참고: 마우스 샘플의 경우 일반적으로 약 50 mL의 EDTA 용액이면 충분하다. 인체 뼈 샘플의 경우 일반적으로 약 100 mL를 사용한다. 하지만 이 부피는 완전한 침전과 효과적인 탈칼슘화를 보장하기 위해 뼈 크기에 따라 조정될 수 있다.
    4. 탈칼슘화 5일 후, 시간이 지남에 따라 킬레이션 능력이 포화되므로 EDTA 용액을 버리고 동일한 부피의 신선한 EDTA로 교체한다. 동일한 조건에서 배양을 계속한다.
    5. 10일간 배양 후, EDTA 용액을 버리고 탈칼슘화가 완료되었는지 평가한다.
      1. 멸균 메스로 작게 자르거나 멸균된 미세 바늘을 조직의 모서리 또는 주변 영역에 삽입한다. 이때 관심 영역의 변형을 피하기 위해 분석적 관련성이 낮은 영역을 선택한다. 절단이나 바늘 삽입 중에 샘플을 고정하기 위해 뼈를 멸균 페트리 접시 위에 둔다. 조직이 쉽게 잘리거나 바늘이 최소한의 저항으로 통과하면 샘플이 적절하게 탈칼슘화된 것이다.
      2. 마우스 대퇴골의 경우, 핀셋으로 뼈를 부드럽게 구부려 유연성을 평가하며, 이는 완전한 무기질 제거의 신뢰할 수 있는 지표가 된다.
        참고: 탈칼슘화 단계의 소요 시간은 뼈 샘플의 크기와 두께, 그리고 사용된 EDTA 부피에 따라 달라진다. 초기 배양 기간 후에도 뼈가 단단하게 유지된다면, 조직이 쉽게 잘릴 정도로 충분히 부드러워질 때까지 탈칼슘화를 계속한다. 과도한 기간 연장은 조직 품질과 RNA 무결성을 손상시킬 수 있으므로, 연장 시간은 적절한 연화를 달성하는 데 필요한 최소 시간으로 제한해야 한다20.
  5. 탈수
    1. 뼈 샘플이 들어 있는 용기에 초순수를 추가하여 세척한 후, 4 °C에서 흔들며 5분 동안 배양한다.
    2. 물을 버리고 70% ethanol 용액으로 교체한다. 4 °C에서 1시간 동안 배양한다.
      참고: 이 단계는 중단 지점으로 활용될 수 있다. 샘플은 다음 단계로 진행하기 전까지 4 °C의 70% ethanol에 보관할 수 있다. 본 프로토콜에서는 최대 보관 기간이 실험적으로 검증되지 않았으므로, 사용자는 실험실의 표준 관행에 따라 진행해야 한다.
    3. 에탄올 농도를 높여가며 순차적으로 샘플을 탈수하고(70%, 80%, 96%; 각각 4 °C에서 1시간), 이어서 100% ethanol에서 4 °C로 하룻밤 동안 배양한다.
    4. 100% ethanol을 버리고 xylene으로 교체한다. 상온(RT)에서 4시간 동안 배양한다.
    5. xylene을 버리고 샘플 카세트를 녹인 깨끗한 파라핀이 담긴 유리 용기에 넣는다. 60 °C에서 하룻밤 동안 녹은 파라핀 속에서 배양한다.
      참고: 진공 보조 처리 시스템을 사용할 수 있는 경우, 이러한 장치가 파라핀 침투를 더 효율적으로 촉진하므로 더 짧은 침투 시간을 사용할 수 있다40,41,42.
      주의: xylene 및 단계별 에탄올 용액이 포함된 모든 단계는 적절한 환기를 보장하고 독성 및 가연성 증기 노출을 최소화하기 위해 반드시 화학 흄 후드 내에서 수행해야 한다.
  6. 파라핀 포매
    ​참고: RNA 분해를 방지하기 위해 RNase 제거 용액으로 포매 스테이션의 표면을 세척한다.
    1. 포매 스테이션을 켜고 파라핀 저장소, 카세트 파라핀 배스, 몰드 파라핀 배스 및 몰드 워밍 플레이트를 60 °C로 예열한다. 포매 전에 콜드 플레이트를 활성화하여 냉각시킨다.
    2. 파라핀이 완전히 녹을 때까지 기다린 후, 파라핀이 침투된 샘플이 담긴 카세트를 카세트 파라핀 배스에 넣는다. 포매 전에 xylene이 완전히 제거되도록 2시간 동안 배양한다.
    3. 필요한 모든 몰드를 몰드 파라핀 배스에 넣는다.
      참고: 인체 샘플의 경우 표준 금속 포매 몰드를 사용한다. 마우스 샘플의 경우, Visium 슬라이드 위에 적절하게 섹션을 배치하기에 적합한 크기의 정사각형 공동이 포함된 Visium 플랫폼 호환 플라스틱 포매 몰드를 사용한다. 전체 마우스 뼈는 이러한 몰드의 정사각형 공동에 완전히 들어가지 않으므로, 포매 직전에 멸균 메스를 사용하여 적절한 크기의 파편으로 자른다. 크기에 따라 몰드당 하나 또는 두 개의 뼈 파편을 포매할 수 있다.
    4. 포매 스테이션의 중앙 배출구에서 녹은 파라핀을 분사하여 얇은 바닥층을 만든다.
    5. 카세트를 열고 따뜻한 핀셋을 사용하여 조직을 카세트에서 몰드로 조심스럽게 옮긴다.
    6. 파라핀이 채워진 몰드를 몰드 워밍 플레이트 위에 놓고, 파라핀이 액체 상태인 동안 따뜻한 핀셋으로 조직을 원하는 절단면 방향으로 조절한다.
    7. 포매 스테이션의 차가운 표면에 몰드를 놓아 뼈 파편의 위치를 잠시 고정한다.
    8. 디스펜서의 녹은 파라핀으로 몰드를 완전히 채워 조직이 완전히 덮이고 큰 기포가 남지 않도록 한다.
    9. 라벨이 붙은 카세트를 몰드 위에 올려 파라핀 블록의 바닥을 형성하게 한다.
    10. 카세트가 부착된 몰드를 포매 스테이션의 콜드 플레이트로 옮긴다. 블록이 불투명하고 단단해질 때까지 10분 동안 파라핀이 완전히 응고되도록 둔다.
    11. 응고되면 몰드에서 파라핀 블록을 제거하고 섹셔닝 전까지 4 °C에서 보관한다.
      참고: 이 단계는 중단 지점으로 활용될 수 있다. 파라핀 블록을 4 °C에 보관할 수 있으나, 보관 중 RNA 분해를 최소화하기 위해 가능한 한 포매 후 실질적으로 가능한 한 빨리 조직 섹셔닝 및 후속 공간 전사체 분석을 수행해야 한다43,44.
  7. 섹셔닝 및 슬라이드 준비
    참고: RNA 분해를 방지하기 위해 마이크로톰과 워터 배스를 RNase 제거 용액으로 세척한다.
    1. 워터 배스에 증류수를 채우고 42 °C로 예열한다. 마이크로톰을 켜고 새 칼날을 장착한다. 현미경 슬라이드에 연필로 라벨을 붙인다.
    2. 원하는 종단 절단면에 따라 카세트가 방향을 잡도록 하여 파라핀 블록을 시편 홀더에 장착한다.
      ​참고: 얼음으로 채운 플라스틱 백을 준비하고, 파라핀이 부드러워 절단이 어려울 때 마이크로톰에 장착된 상태의 블록 위에 얼음 백을 직접 올리고 고무줄로 몇 분 동안 고정하여 파라핀을 단단하게 만들어 섹션 품질을 높인다.
    3. 마이크로톰 두께를 20 µm로 설정하고 트리밍 절단을 수행한다.
    4. 마이크로톰 설정을 5 µm로 변경한다. 5 µm 섹션 4개를 라벨이 붙은 RNase-free 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 수집한다. 튜브를 드라이아이스 위에 두고 -80 °C에서 보관한다.
    5. 5 µm로 섹셔닝을 계속하고 리본을 워터 배스에 띄운다. 섹션이 완전히 펴지고 주름이 없으면 라벨이 붙은 슬라이드로 걷어낸다.
      1. 정해진 섹션 수마다(예: 조직 크기에 따라 매 5-10 리본마다), 5 µm 섹션 4개를 새로운 라벨 튜브(1.5 mL)에 추가로 수집한다. 5 µm 섹션이 담긴 1.5 mL 튜브를 총 3개 얻을 때까지 이 과정을 반복한다.
        참고: 조직에 균열이 생기거나 깨지거나 연속적인 섹션을 얻을 수 없는 경우, 샘플이 완전히 탈칼슘화되지 않은 것이므로 추가적인 탈칼슘화 시간이 필요하다. 탈칼슘화 단계에 도달할 때까지 워크플로우 단계를 역순으로 진행하여 샘플을 복구한다. 이를 위해 파라핀 블록을 60 °C에서 약 2시간 동안 녹이고, 시편을 xylene(2시간)으로 옮긴다. 단계별 에탄올 용액(100%, 96%, 80%, 70%)과 증류수를 통해 샘플을 재수화한다. 재수화된 샘플을 신선한 0.25 M EDTA (pH 6.95)로 되돌리고, 필요에 따라 탈칼슘화 기간을 연장한 후 탈수, 재포매 및 섹셔닝을 진행한다. FFPE 처리를 되돌리는 것은 RNA 무결성을 손상시킬 수 있으므로, 이 복구 절차는 엄격히 최후의 수단으로만 사용해야 한다.
    6. 슬라이드를 37 °C 오븐에 하룻밤 동안 넣어 잔류수를 증발시킨 후, 4 °C에서 보관한다.
    7. 조직 접착력을 높이려면, 선택적으로 37 °C에서 하룻밤 동안 배양하기 전에 42 °C에서 3시간 동안 슬라이드를 굽는다.
      참고: 재료 표(Table of Materials)에 나열된 유리 슬라이드를 사용하는 경우, 이 슬라이드들은 강력한 접착력을 제공하며 일반적으로 처리 과정 전반에 걸쳐 조직이 단단히 부착되어 있으므로 이 단계는 일반적으로 필요하지 않다. 이 단계는 중단 지점으로 활용될 수 있다. 슬라이드는 4 °C에 보관할 수 있으나, 가능한 한 포매 후 실질적으로 가능한 한 빨리 후속 공간 전사체 분석을 수행하여 보관 중 RNA 분해를 최소화해야 한다43,44.

2. 시료의 품질 평가

  1. 절편 품질 평가
    1. 표준 명시야 광학 현미경(4×–10×)으로 모든 절편을 하나씩 검사한다. 각 슬라이드를 확인하여 절편이 파손되지 않았는지 확인하고 각 절편의 품질을 기록한다.
      ​참고: 접힘, 주름, 압착 또는 채터 마크(chatter marks)가 있는지 확인한다. 이러한 현상은 파라핀 경도, 칼날의 날카로움 또는 불완전한 탈칼슘화의 문제일 수 있다. 절편 제작 중 또는 워터배스로 옮기는 과정에서 조직이 탈락하여 소실된 영역이 없는지 확인한다.
    2. 공간 전사체 분석을 위해 보존 상태가 가장 좋은 절편(가장 완전하고 형태가 가장 잘 유지된 것)을 선택한다.
    3. 선택한 절편에 인접한 연속 절편들을 식별하여 H&E 염색 및 IF용으로 보관하며, 염색된 이미지가 시퀀싱될 조직과 최대한 일치하도록 한다.
  2. 조직 무결성 확인을 위한 H&E 염색
    1. 슬라이드를 유리 슬라이드 염색 랙에 넣고 60 °C에서 15분 동안 배양한다.
    2. 랙을 xylene이 들어 있는 유리 염색 용기로 옮겨 15분 동안 둔다.
    3. 랙을 100%, 96%, 80%, 70% ethanol이 담긴 염색 용기에 순차적으로 옮겨 각 용액에서 5분씩 배양하여 절편을 재수화한다.
      ​주의: xylene 및 단계별 ethanol 용액을 사용하는 모든 단계는 적절한 환기를 보장하고 독성 및 가연성 증기에 대한 노출을 최소화하기 위해 화학 흄 후드 내에서 수행해야 한다.
    4. 물이 채워진 염색 용기에서 슬라이드를 5분 동안 헹군다.
    5. 랙을 hematoxylin에 10분 동안 담근 후, 세척수가 투명해질 때까지 흐르는 수돗물로 씻어낸다.
    6. 농축 염산을 다섯 방울 섞은 물에 랙을 담그고, 붉은색 톤이 나타날 때까지 부드럽게 흔들어준다.
    7. 안정적인 청색이 나타날 때까지 lithium carbonate로 포화된 물에 랙을 옮긴 후, 물로 짧게 헹군다.
    8. 1% (w/v) eosin으로 5분 동안 절편을 염색한 후, 다시 물로 헹군다.
    9. 랙을 물, 70%, 80%, 96% 및 100% ethanol이 담긴 염색 용기에 순차적으로 옮겨 각 용액에서 5분씩 배양하여 슬라이드를 탈수한다.
    10. xylene에서 15분 동안 슬라이드를 투명화한다.
    11. 각 슬라이드의 뒷면을 부드럽게 말리고, 커버슬립에 봉입제를 도포한 후 절편을 봉입한다. 이미징 전 RT에서 24시간 동안 슬라이드를 건조시킨다.
    12. 고해상도 현미경을 사용하여 20배 배율로 조직 이미징을 수행한다.
      참고: 공간 전사체 분석에 대한 샘플 적합성을 평가하기 위한 품질 관리 단계로, 먼저 인접 절편에 대해 H&E 염색을 수행한다. 선택 후, 재료 표(Table of Materials)에 기재된 공간 유전자 발현 플랫폼의 제조사 조직 준비 가이드라인에 따라 공간 전사체 분석 예정인 절편에 직접 두 번째 H&E 염색을 수행한다.
  3. RNA 무결성 평가 (DV200)
    ​참고: 공간 유전자 발현 프로토콜의 경우, 고정된 조직에서는 일반적으로 18S 및 28S 리보솜 RNA 피크가 나타나지 않기 때문에 전통적인 RNA 무결성 지수(RIN)는 효과적이지 않다. 따라서 200 뉴클레오타이드보다 큰 RNA 단편의 백분율로 정의되는 DV200 지표가 분해된 임상 샘플에서 RIN보다 더 유용한 품질 파라미터로 흔히 사용된다. Visium v2의 경우, 10x Genomics는 효율적인 프로브 하이브리드화와 최적의 분석 성능을 보장하기 위해 DV200 값이 30% 이상인 FFPE 블록 사용을 권장한다. 가능한 가장 높은 DV200 값을 가진 조직 블록을 선택하면 시퀀싱 드롭아웃을 방지하고 스팟 민감도를 극대화할 수 있다.
    1. 조직 절편 제작 단계에서 수집한 5 µm 절편이 들어 있는 1.5 mL 튜브를 꺼내 얼음 위에 두고 RNA를 추출한다.
    2. 총 RNA를 추출한다. 이 표준 절차에는 샘플 탈파라핀화, 포르말린 교차 결합을 되돌리기 위한 proteinase K 소화, DNase I 처리를 통한 게놈 DNA 제거, 그리고 정제된 RNA를 RNase-free water로 최종 용출하는 과정이 포함된다.
    3. 고감도 RNA 분석법이 적용된 모세관 전기영동 기반 시스템을 사용하여 RNA 무결성을 평가한다. 워크플로의 요약은 부록 파일 1(Supplementary File 1)42,45,46,47,48에 제공되어 있다.
  4. 세포 유형 검증을 위한 선택적 IF
    1. FFPE 슬라이드를 유리 슬라이드 염색 랙에 넣고 60 °C에서 15분 동안 배양한다.
    2. 랙을 xylene이 들어 있는 유리 염색 용기로 옮겨 15분 동안 둔다.
    3. 랙을 100%, 96%, 80%, 70% ethanol에 각각 2분씩, 이어서 물에서 5분, PBS-Tween(0.1% Tween-20이 첨가된 1x PBS)에서 5분 동안 처리하여 절편을 재수화한다.
      주의: xylene 및 ethanol을 사용하는 모든 단계는 화학 흄 후드 내에서 수행해야 한다.
    4. 1차 항체 제조사의 권장 사항에 따라 항원 회복을 수행하며, 회복 버퍼, pH 및 가열 조건이 항체 데이터시트와 일치하는지 확인한다. 참고: 본 워크플로에서 항원 회복은 10 mM Tris 및 1 mM EDTA, pH 9.0 용액을 사용하여 가열 시스템에서 95 °C로 30분 동안 수행한 후, RT에서 20분 동안 냉각시킨다.
    5. PBS-Tween으로 슬라이드를 10분씩 두 번 세척한다.
    6. 소수성 배리어 펜을 사용하여 조직 주변에 소수성 장벽을 그리고, 습윤 챔버 내 RT에서 최소 40분 동안 조직 절편에 1x DPBS 내 5% BSA를 처리하여 비특이적 결합을 차단한다.
      참고: 습윤 챔버는 플라스틱 슬라이드 염색 박스에 필터 페이퍼 한 장을 넣고 증류수로 충분히 적셔 항체 배양 동안 안정적인 습윤 환경을 유지하도록 준비한다.
    7. 각 항체에 대해 권장되는 희석 배수로 1x DPBS 내에 1차 항체 용액을 준비한다.
      참고: 본 워크플로에서는 제조사의 프로토콜에 따라 마우스 EC 및 MSC를 식별하기 위해 각각 Emcn (V.7C7) 및 Cd271 (ME20.4)에 대한 1차 항체를 사용하였으며, 인간의 대응 세포를 식별하기 위해 CD31 (JC70A) 또는 PRRX1 (polyclonal)에 대한 항체를 사용하였다.
    8. 슬라이드 가장자리를 흡수성 종이에 가볍게 두드려 잔여 방울을 제거함으로써 블로킹 용액을 제거한 후, 1차 항체 혼합물을 처리하고 습윤 챔버 내 4 °C에서 하룻밤 동안 슬라이드를 배양한다.
    9. PBS-Tween으로 슬라이드를 5분씩 두 번 세척하고, 형광체가 스펙트럼상 호환되고 겹치지 않는지 확인하며 제조사 권장 희석 배수로 2차 항체 용액을 준비한다.
      참고: 본 워크플로에서는 1:200 희석 배수의 Alexa Fluor 접합 2차 항체를 사용하였다.
    10. 2차 항체 혼합물을 처리하고 습윤 챔버 내에서 빛을 차단한 상태로 RT에서 30분 동안 배양한다.
    11. PBS-Tween으로 슬라이드를 5분씩 두 번 세척한다.
    12. 1:1 PBS-glycerol 용액으로 준비한 DAPI 함유 봉입제(재료 표 참조)를 1:10으로 희석하여 처리하고 샘플을 5분 동안 배양한다.
    13. 커버슬립으로 절편을 봉입하고 건조를 방지하기 위해 가장자리를 매니큐어로 밀봉한다.
    14. 다중 스펙트럼 이미징 플랫폼을 사용하여 염색된 조직을 시각화한다.

보충 파일 1: RNA 무결성 평가 및 Visium 공간 전사체 워크플로의 프로토콜 단계 요약. 이 보충 파일은 제조사의 지침에 따라 수행된 절차적 단계에 대한 상세 요약을 제공합니다. 여기에는 다음 내용이 포함됩니다: (i) 메인 프로토콜의 단계 2.3.3에 기술된 RNA 무결성(DV200) 평가를 위해 사용된 High Sensitivity RNA ScreenTape Assay, 그리고 (ii) 조직 전처리, 라이브러리 제작 및 시퀀싱을 포함하는 Visium CytAssist Spatial Gene Expression 워크플로의 개요(메인 프로토콜의 단계 3.1–3.3).여기를 클릭하여 이 파일을 다운로드하십시오.

3. 공간 전사체학

참고: 재료 표에 나열된 플랫폼과 시약을 사용하여 해당 사용자 가이드42,45,46에 따라 공간 전사체 분석 워크플로를 수행하십시오. 보충 파일 1에 주요 조직 전처리, 라이브러리 제작 및 시퀀싱 단계가 요약되어 있습니다.

  1. 공간 전사체 데이터 품질 관리
    1. Visium 데이터 세트용 표준 파이프라인을 사용하여 공간 전사체 데이터를 디멀티플렉싱합니다(재료 표 참조).
    2. 리드를 적절한 Ensembl 105 참조 게놈에 매핑합니다.
      참고: 인간 샘플에는 GRCh38, 마우스 샘플에는 mm10이 사용되었습니다.
    3. 동일한 파이프라인을 사용하여 필터링된 피처-바코드 행렬을 생성하고, 이를 후속 단일 세포/공간 분석 환경으로 가져옵니다(재료 표 참조).
    4. 공간 전사체 파이프라인에서 제공하는 시각화 인터페이스(재료 표 참조)에서 H&E 이미지를 검토하고, 데이터 세트에 따라 피질골 영역 또는 뼈 조직과 겹치는 스폿을 수동으로 제거합니다.
    5. 단일 세포 분석 워크플로우에서 일반적으로 적용되는 분산 안정화 변환 방법을 사용하여 데이터 세트를 정규화합니다(재료 표 참조).

결과

이 EDTA 기반 워크플로우의 종 및 질환 맥락에 따른 적용 가능성을 평가하기 위해, 건강한 상태와 다발성 골수종(MM) 상태를 나타내는 마우스 대퇴골 2개와 인간 골 표본 2개를 포함한 총 4개의 골수(BM) 샘플에 프로토콜을 적용하였다(표 1 및 그림 1).

시료 식별종성별연령질환
YFPcγ1마우스여성210일건강한
mMM마우스수컷314일MM
인간 뇌 오가노이드(hHBM)인간수컷76세건강한
hMM인간암컷50년MM

표 1: 연구에 포함된 마우스 및 인간 골 샘플. 각 샘플의 종, 성별, 연령 및 건강 상태가 제공됨. 약어: hHBM = 건강한 인간 골수; hMM = 인간 다발성 골수종; mMM = 마우스 다발성 골수종; MM = 다발성 골수종; YFPcγ1 = 건강한 대조군 마우스.

본 연구에 사용된 샘플 중 MM 마우스 샘플을 제외한 나머지 샘플들은 해당 연구 그룹의 이전 출판물, 구체적으로 Muiños-Lopez 등과 Cenzano 등의 연구에서 이미 특성이 분석되고 보고되었습니다. 이전에 보고된 표본들의 공간 전사체 데이터 및 결과는 해당 연구들8,10에 제시되어 있습니다. 따라서 여기에 포함된 자료는 새로운 생물학적 발견을 제시하기보다는, 공간 전사체 분석에 대한 본 프로토콜의 기술적 적합성을 평가하는 데 사용되었습니다.

다발성 골수종(MM) 환자의 임상 및 면역학적 특성을 재현하는 BIC (BIcγ1) 유전자 변형 MM 마우스 모델과 그에 대응하는 건강한 대조군 마우스 (YFPcγ1)로부터 마우스 대퇴골 샘플을 얻었습니다8,49. 각 동물에서 대퇴골 하나를 채취하여 세척한 후 표준 프로토콜에 따라 처리하였습니다(그림 2A). 대퇴골은 가용 골수가 풍부하고 니치(niche)의 품질이 우수하며 재현 가능한 처리가 용이하여 시퀀싱 기반의 공간 전사체 플랫폼에 매우 적합하기 때문에 본 분석에 사용되었습니다8,10. 대조군 마우스 대퇴골의 탈회 성공 여부는 핀셋으로 수동 조작 시 조직의 유연성이 눈에 띄게 증가하는 것을 통해 거시적으로 확인하였습니다(그림 2B). 이어서, 후속 분자 분석을 위해 RNA 무결성과 조직 구조를 보존할 수 있도록 공간 전사체 분석 전용 몰드를 사용하여 해당 뼈 조각을 파라핀에 효율적으로 매몰하였습니다(그림 2C).

서로 다른 처리 이력을 가진 두 개의 인간 골수(BM) 샘플 또한 분석되었습니다8,10. 혈액학적으로 건강한 신선한 인간 BM 샘플은 Hospital Universitario de Navarra에서 정형외과적 고관절 치환술 중 발생한 수술 폐기물로부터 얻었습니다(그림 2D–F). 본 프로토콜의 중개 연구적 유용성을 입증하기 위해, 이 샘플은 마우스 샘플과 동일한 방식으로 처리되었습니다. 마우스 조직에서 관찰된 결과와 일치하게, 인간 뼈의 성공적인 EDTA 탈회는 조직이 완전히 부드러워져 바늘이 힘들이지 않고 관통되는 것을 통해 거시적으로 확인되었습니다(그림 2E). 탈회된 인간 뼈 조각은 후속 처리를 위해 표준 금속 몰드를 사용하여 파라핀에 성공적으로 매립되었습니다(그림 2F). 두 번째 인간 샘플은 Clínica Universidad de Navarra (CUN) 병리학과의 다발성 골수종(MM) 환자의 장골능에서 채취하여 보관된 FFPE BM 생검 조직이었습니다. 특히, 이 보관된 MM 샘플은 이전에 강산을 사용하는 표준 임상 프로토콜을 통해 탈회되었습니다36. 이 샘플은 EDTA로 처리된 표본과 질적인 대조를 제공하지만, 조직의 출처, 고정 이력, 보관 및 탈회 방식의 차이로 인해 관찰된 차이가 오직 탈회제에 의해서만 발생했다고 볼 수는 없습니다.

조직학적 조직 처리: 자와 함께 놓인 6개의 조직 샘플; 연구 분석을 위한 이미징.
그림 2: EDTA 기반 전처리 과정 중의 마우스 및 인간 뼈 샘플. (A) 탈회 전의 온전한 대조군 마우스 대퇴골. (B) 유연성이 증가한 탈회된 대조군 마우스 대퇴골. (C) 파라핀에 매입된 대조군 마우스 뼈 조각. (D) 탈회 전 고관절 수술에서 얻은 건강한 인간 뼈 조각. (E) EDTA 탈회 후 바늘 침투가 확인되는 동일한 조각. (F) 파라핀에 매입된 EDTA 탈회된 건강한 인간 뼈. 스케일 바: (A, B) 5 mm; (C–F) 1 cm. 약어: EDTA = ethylenediaminetetraacetic acid. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

일반적인 조직 구조를 분석하기 위해 H&E 염색을 수행하였다(그림 3). 마우스 절편에서 관찰된 더 나은 형태학적 보존 상태는 내재적인 종 특이적 형질보다는 샘플 취급 및 처리 과정의 차이를 반영하는 것일 수 있다. 마우스 대퇴골은 공간 전사체 분석을 위해 특별히 수집되었으며, 온전한 뼈 상태로 즉시 처리되어 그 구조가 보존되었다(그림 3A, B). 반면, 인간 샘플은 고관절 치환술 중에 얻은 잔여물(그림 3C) 또는 진단용 MM 골 생검 조직(그림 3D)에서 유래하였으며, 이 두 경우 모두 분석 전 조직의 품질이 가변적일 수 있다. 결과적으로, EDTA 탈칼슘 처리된 인간 샘플과 산 탈칼슘 처리된 MM 생검 조직 간의 형태학적 차이는 미미한데, 이는 두 인간 시료 모두 탈칼슘 처리뿐만 아니라 일반적인 조직 처리 과정으로 인해 이미 기본적인 구조적 제한이 나타나기 때문이다(그림 3C, D). 따라서 공간 전사체 분석을 위한 샘플 품질을 종합적으로 평가하려면 여러 가지 서로 다른 매개변수를 평가해야 한다. 첫째, 구조적 보존 상태는 사용된 탈칼슘 산의 종류뿐만 아니라 특정 샘플 유형에 따라 크게 달라질 수 있으므로 조직 무결성을 주의 깊게 모니터링해야 한다. 둘째, 탈칼슘 처리 조건이 RNA 품질에 영향을 미칠 수 있으므로 RNA 품질 또한 평가해야 한다20,35,36.

현미경 하에서 조직 샘플의 조직학적 비교; 구조 분석을 위한 500μm 스케일.
그림 3: 조직 품질 평가에 사용된 H&E 염색 절편.연속 FFPE 절편은 (A) 건강한 대조군 마우스10, (B) MM가 있는 마우스, (C) 건강한 인간 뼈8,10, 그리고 (D) 인간 MM 생검 조직8에 해당함. 스케일 바 = 500 µm. 약어: FFPE = formalin-fixed, paraffin-embedded; H&E = hematoxylin and eosin; MM = multiple myeloma. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

조직학적 분석을 보완하기 위해 RNA 품질을 평가하였다. H&E 염색으로는 차이가 모호하게 나타났으나, RNA 무결성 분석을 통해 두 탈회 방법의 효과를 명확하게 구분할 수 있었다(표 2). 마우스 샘플과 건강한 인간 골 표본 모두에서 측정된 DV200 값은 Visium FFPE 분석에 권장되는 임계값을 초과하였으며, 이는 프로브 하이브리드화 및 라이브러리 구축에 충분한 RNA 단편 길이 분포를 갖추고 있음을 나타낸다. YFP 건강한 마우스 샘플의 DV200은 82.55%였고, 건강한 인간 골(hHBM) 샘플은 58%에 달했으며, 두 샘플 모두 10x Genomics에서 정의한 수용 가능 임계값인 30%를 훨씬 상회하였다. MM 마우스(mMM) 샘플의 DV200은 31.3%로 수용 가능 하한선에 근접했는데, 이는 다른 샘플 특이적 요인들과 더불어 절편 제작 전 파라핀 블록을 4 °C에서 장기간 보관한 결과일 수 있다. 이와 대조적으로, 산 탈회된 인간 MM 생검(hMM) 샘플은 DV200이 8%에 불과했으며, 이는 형태학적 손상이 덜 뚜렷한 경우에도 RNA 무결성이 현저히 낮음을 보여주었다. 요약하면, 하위 공간 분석을 위한 샘플 적합성을 평가하기 위해서는 구조적 평가와 분자적 평가를 모두 수행하는 것이 중요하다.

시료 식별DV200 (%)1
YFPcγ182.55
mMM31.3
인간 뇌 모방 오가노이드(hHBM)58
hMM28
1DV200: 전체 RNA 단편의 백분율 > 200 뉴클레오타이드.
2이 시료는 강산을 이용한 표준 임상 프로토콜을 통해 탈회되었습니다.

표 2: 연구 시료의 RNA 품질. DV200은 200 뉴클레오타이드보다 긴 RNA 단편의 백분율이며, 30% 이상의 값은 후속 공간 전사체 분석에 적합한 것으로 간주되었습니다. 약어: hHBM = 건강한 인간 골수; hMM = 인간 다발성 골수종; mMM = 마우스 다발성 골수종.

추가적인 품질 평가도 수행할 수 있습니다. 조직의 무결성을 더욱 검증하고 EDTA 탈칼슘화 후 특정 세포 구획의 보존을 확인하기 위해, 마우스 및 인간 조직의 인접 FFPE 절편에 대해 선택적인 IF 염색을 수행했습니다. MM 마우스 샘플에서 혈관 내피세포(EC)와 중간엽 세포(MSC)를 각각 시각화하기 위해 Endomucin (Emcn) 및 Cd271 항체를 사용했습니다(그림 4A). 이 염색 결과, EDTA로 처리된 조직은 연속적인 Emcn 염색을 동반한 명확한 혈관 구조와 보존된 기질 네트워크를 나타내어, 처리 후에도 테스트한 마커들이 검출 가능한 상태로 남아 있음을 보여주었습니다. 또한, 자동 다분광 이미징 시스템을 이용한 고해상도 이미징을 통해 테스트한 항원들이 세포 유형 확인을 위해 검출 가능한 상태로 유지된다는 추가적인 증거를 확보하였으며, 이는 공간 전사체 분석 전 추가적인 품질 관리 단계를 제공합니다. 나아가 이러한 결과는 건강한 고령의 인간 표본에서도 관찰되었으며, 이 표본들에서 CD31에 의해 EC 발현이, PRRX1 (Paired Related Homeobox 1) 항체에 의해 MSC가 각각 검출되어 EDTA 탈칼슘화 후에도 테스트한 니치 마커들이 식별 가능한 상태로 유지됨을 보여주었습니다(그림 4B). 반면, 다양한 산 기반 탈칼슘화 프로토콜을 적용한 인간 MM 생검 조직에서는 이러한 결과가 재현되지 않았습니다. 앞서 언급했듯이, 이 샘플들의 RNA 무결성은 낮아 후속 전사체 분석에 제한이 있었습니다. 이러한 인간 표본의 퇴화된 특성으로 인해, 후속 활용도는 기초 전사체 프로파일링8 및 악성 형질세포(PC)의 면역조직화학(IHC) 평가로 제한되었습니다(그림 4C).

조직 절편의 면역형광 현미경 관찰; 다색 염색; 세포 구조 분석.
그림 4: 세포 유형 확인을 위한 선택적 면역형광 및 면역조직화학 염색. (A) DAPI로 표지된 핵(청색), CD271 양성 MSC(녹색), EMCN 양성 EC(적색)를 보여주는 마우스 MM 조직. (B) DAPI로 표지된 핵(청색), PRRX1 양성 MSC(녹색), CD31 양성 EC(적색)를 보여주는 건강한 인간 골조직10. (C) CD138 양성 악성 PC를 보여주는 인간 MM 생검 조직8. 스케일 바: (A) 250 µm (개요), 20 µm (병합 확대 이미지), 50 µm (단일 채널 이미지); (B) 500 µm (개요) 및 20 µm (병합 및 단일 채널 확대 이미지); (C) 500 µm. 약어: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; EC = endothelial cell; MM = multiple myeloma; MSC = mesenchymal stromal cell; PC = plasma cell. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

종합적으로, 조직 형태와 DV200 결과는 EDTA로 처리된 시료가 후속 공간 전사체 분석에 적합함을 뒷받침합니다. 이러한 준비 워크플로우의 공간 전사체 응용 사례는 이전에 보고된 바 있습니다8,10.

토론

EDTA 기반의 조절된 탈칼슘화, 표준화된 FFPE 공정, 그리고 엄격한 품질 관리 체크포인트를 통합함으로써, 본 프로토콜은 공간 전사체학을 위한 골 조직 준비와 전통적으로 관련되었던 많은 제한점들, 특히 강산 기반 탈칼슘화 방법으로 인해 발생하는 RNA 분해 및 형태학적 손상과 관련된 문제들을 극복합니다8,10,20,33,36. 공간 전사체학을 위해 무기질화된 샘플을 처리할 때 가장 중요한 단계는 탈칼슘화입니다. 탈칼슘화가 불충분하면 뼈가 섹셔닝하기에 너무 단단한 상태로 남아, 공간 전사체학을 위한 고품질의 섹션을 얻는 것이 물리적으로 불가능해집니다8,20,23,37,50. 골 조직이 너무 단단하게 남아 있으면 마이크로톰 칼날에 부딪혀 뼈가 깨지거나 떨림 현상이 발생하며, 이로 인해 섹션이 찢어지거나 구멍이 생겨 원래의 BM 구조를 정확하게 나타내지 못하게 됩니다. 중요한 점은, 탈칼슘화의 성공 여부는 마이크로토미 단계 전까지는 완전히 확인할 수 없다는 것입니다. 겉보기에 부드러워진 샘플이라 하더라도, 얇은 FFPE 섹션을 절단하려고 시도할 때 비로소 잔류 무기질의 존재가 드러날 수 있습니다. 이러한 이유로, 재현 가능한 결과를 보장하기 위해서는 탈칼슘화 진행 과정을 세심하게 모니터링하는 것이 필수적입니다.

본 워크플로우에서는 pH 6.95의 0.25 M EDTA를 사용하여 10일 동안 지속적으로 교반하며, 5일째에 용액을 교체합니다8,10. 프로토콜 개발 과정에서 EDTA 단독 사용, polyvinylpyrrolidone가 첨가된 EDTA, 10% formic acid를 평가하였으며, 다양한 탈회 기간과 용액 교체 일정을 검토하였으나, 해당 비교 데이터는 여기에 제시하지 않았습니다. 10일보다 짧은 기간은 마우스 샘플의 섹셔닝 과정에서 조직 파손을 빈번하게 일으킨 반면, 인간 샘플은 샘플마다 다른 양상을 보였습니다. 따라서 마우스 대퇴골에는 10일의 기간을 적용하며, 인간 샘플은 밀도 및 골소주 함량에 따라 더 긴 탈회 기간이 필요할 수 있습니다. 파라핀 매립 전에는 물리적 품질 관리 체크포인트를 거쳐야 합니다. 마이크로토미 과정에서 탈회가 불충분한 것이 확인될 경우, 재처리 절차는 최후의 구제 수단으로만 사용하십시오. 추가적인 열 가함, 용매 노출 및 재수화는 RNA 품질을 저하시킬 수 있기 때문입니다.

이 방법의 주요 한계점은 처리 시간이 길다는 것이며, 이는 임상 병리에서 흔히 사용되는 신속한 산 기반 프로토콜과 극명하게 대조됩니다20,36. 연구 환경에서는 일반적으로 더 긴 처리 시간이 허용되지만, 24 h 이내에 탈칼슘화를 위해 Morse 용액(22.5% formic acid 및 10% sodium citrate)을 사용하는 Miao 등의 프로토콜과 같은 최근 연구들은 공간 분석을 위한 골 조직 준비 가속화에 대한 관심이 높아지고 있음을 보여줍니다20. 그러나 산 기반 방법은 역사적으로 RNA 분해 위험이 훨씬 더 높아 DV200 값을 감소시키며, 결과적으로 공간 전사체학과의 호환성을 제한합니다1,8,35,36. 이 EDTA 기반 접근 방식은 속도보다 RNA 보존을 우선시하여 Visium과 같은 시퀀싱 기반 공간 플랫폼과의 호환성을 보장합니다.

BM 공간 전사체 분석의 잠재적 한계는 PC에서 유래한 면역글로불린 전사체의 높은 풍부도로 인해 발현량이 적은 유전자의 검출률이 감소할 수 있다는 점입니다. 저품질 스팟 제거를 포함하여 해당 연구팀의 이전 연구에서 적용된 품질 관리 및 필터링 전략과 마찬가지로 (<200개의 UMI 및 <150개의 검출 유전자), 기여도가 낮은 세포 유형의 필터링(<디컨볼루션 분석 과정에서 (스팟당 20%) 및 공간 전사체 데이터셋에서 검출된 마커 유전자 선택 시, 하위 분석 단계에서 면역글로불린 전사체를 컴퓨터로 필터링하여 적절한 경우 그 영향을 최소화할 수 있습니다.8표적 공간 전사체 분석법을 활용하면 특정 응용 분야에서 저발현 전사체의 검출 능력을 더욱 향상시킬 수 있습니다.

이 방법의 잠재적 응용 분야는 매우 광범위합니다. 최근 공간 데이터와 단일 세포 데이터의 통합을 통해 특수화된 인간 골 형성 틈새(osteogenic niches)와 해면골에서 방사형으로 퍼지는 복잡한 신호 기울기가 밝혀졌습니다3,26. 또한, 공간 전사체 분석 결과, 노화가 혈관 내피세포(EC)의 공간적 조직과 통신을 변화시켜 골수(BM) 미세환경을 재구성하며, 이는 골 형성 지원의 손상과 노화된 틈새 내 염증성 신호 네트워크의 출현으로 이어진다는 것이 나타났습니다10. 멀티오믹 프로파일링을 통해 초기 골수구포생(myelopoiesis)을 지원하는 동맥-골내막 영역이나 조혈 줄기세포 및 전구세포가 풍부한 지방세포 주변 구역과 같은 뚜렷한 미세환경 이웃 구역들이 식별되기도 했습니다3. 다발성 골수종(MM)의 맥락에서, 이 프로토콜은 공간 및 단일 세포 전사체 프레임워크의 통합을 가능하게 하여 질환이 발생한 마우스 골수의 구성과 세포 간 상호작용을 특성화할 수 있게 합니다. 이전 연구에서는 악성 형질세포(PC)의 공간적으로 뚜렷한 분포가 밝혀졌으며, NETosis 및 IL-17 신호 전달과 같이 종양이 풍부한 영역과 역상관 관계에 있는 면역 및 염증 프로그램이 식별되었습니다. 또한, 악성 형질세포 밀도의 증가는 T세포 상태가 작동 세포(effector)에서 소진 상태(exhausted)로 전환되는 것과 상관관계가 있었습니다. 이러한 결과는 인간 FFPE 골수 샘플에서도 검증되어, 다양한 질병 부담에 걸친 중개 연구적 관련성을 입증하였습니다8. 궁극적으로, 이 전처리 워크플로우는 골수의 석회화된 구조 내에서 일어나는 복잡한 세포 상호작용을 탐구하기 위한 기술적 토대를 제공합니다.

고해상도 공간 유전자 발현 플랫폼은 단일 세포에 가까운 해상도로 전체 전사체 프로파일링을 제공할 수 있습니다38,51,52. 이러한 접근 방식은 준비 워크플로우의 활용 범위를 공간적으로 조직된 골수 및 혈액암의 고해상도 분석으로 확장할 수 있습니다. 따라서 이 워크플로우는 생리적 및 악성 조혈 작용에 관한 향후 연구를 위한 기술적 토대를 제공합니다.

공개 사항

저자들은 상충하는 이해관계가 없음을 밝힙니다. MM의 MIcγ1 마우스 모델의 노하우 및 실험적 사용에 관한 특허가 MIMO Biosciences에 라이선스되었습니다 (출원 번호 PCT/EP2023/071025).

감사의 글

본 연구는 Instituto de Salud Carlos III의 지원과 ERDF A way of making Europe (PI22/00983)의 공동 재정 지원, CIBERONC (CB16/12/00489), RICORS TERAV (RD21/0017/0009) 및 RICORS TERAV Plus (RD24/0014/0010), AGATA 0011-1411-2020- 000010/0011-1411-2020-000011, Departamento de Salud Gobierno de Navarra (GN2024/04), Cancer Research UK [C355/A26819], Accelerator Award Program에 따른 FC AECC 및 AIRC, 그리고 FP에게 지원된 International Myeloma Foundation (Brian van Novis) 및 Paula and Rodger Riney Foundation의 지원을 받아 수행되었습니다. IAC는 유럽 위원회(European Commission)의 Marie Curie grant (H2020- MSCA-IF-837491), AECC Talent grant (INVES258003CALV), 그리고 Departamento de Salud, Gobierno de Navarra (GN2023/03)의 지원을 받았습니다. MC는 Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades의 FPU fellowship (FPU22/03283) 지원을 받았습니다. 귀중한 기술적 및 지적 도움을 준 CIMA Universidad de Navarra의 Advanced Genomics Laboratory 및 Animal Facility 직원들에게 감사를 표합니다. 또한 BM 샘플을 제공하고 탁월한 협력을 보여준 Clínica Universidad de Navarra (CUN) 및 Hospital Universitario de Navarra의 병리과에 감사를 드립니다. MM 마우스 모델을 제공해 준 José Ángel Martínez-Climent와 Marta Larrayoz에게 특별한 감사를 전합니다. 공간 전사체 분석을 위한 마우스 및 인간 BM 샘플 처리 과정의 기술 최적화, 프로토콜 개발 및 문제 해결에 있어 훌륭한 지원을 해준 Patxi San Martín-Uriz, Tania López, Eduardo Larequi에게 감사드립니다. 또한 공간 전사체 분석에 관한 모든 계산 작업을 수행한 Beñat Ariceta와 Asier Ullate에게 감사드립니다. 마지막으로 본 연구에 너그럽게 참여해주신 환자분들과 건강한 기증자분들께 깊은 감사를 드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.5 mL 튜브Eppendorf15625367
100 mL 멸균 용기 deltalab723-510
4200 TapeStationAgilentG2991ARNA 무결성 평가를 위한 모세관 전기영동–기반 시스템
50 mL 멸균 용기 IberoMedREOR001
50 mL 튜브 FALCON352070
Advanced PAP PenTed Pella 22309Z377821-1EA소수성 배리어 펜 
토끼 유래 Anti-PRRX1 항체Sigma-AldrichHPA051084
BSA (소혈청 알부민)Sigma-AldrichA9418-50G
카세트 KartellLABWARE2921
CD271 (NGF 수용체) 단클론 항체 (ME20.4)Invitrogen14-9400-82
CD31, 혈관 내피 세포 (농축액) 클론 JC70AAligent DakoM0823
커버슬립Fisher Scientific12-544-EP50 mm x 24 mm
DAPI (DAPI 함유 VECTASHIELD 항퇴색 마운팅 용액)Vector LaboratoriesH-1200-10
탈파라핀 용액Qiagen19093
DPBSThermo Scientific AAJ67802APThermo Scientific Chemicals 인산염 완충 식염수 (DPBS, 1×), Dulbecco 공식, 칼슘 및 마그네슘 제외
조직학용 DPX 마운턴Sigma-Aldrich06522-500ML
EDTAThermo Scientific 15748687Ethylenediaminetetraacetic acid, (EDTA), 0.5 M 용액, 분자 생물학 등급, 초고순도
포매 스테이션 Leica Biosystems14 0388 81101Leica EG1150H
Emcn 항체 (V.7C7)Santa Cruz Biotechnologysc-65495
Ensembl 참조 게놈 (GRCh38 / mm10, release 105)EMBL-EBIN/A리드 정렬에 사용된 참조 게놈
에오신Millipore SigmaHT110116
에탄올Millipore SigmaE7023-500ML수술용 가위
Falc Instruments B-I 조직학용 항온수조Falc610.1030.00
포르말린 4% PanReac AppliChem2524311315임상 진단용 pH = 7로 완충되고 메탄올로 안정화된 3.7%–4.0% w/v 포름알데히드 (CE-IVD)
유리 슬라이드 염색 랙 WHEATONZ710970-3EA
유리 염색 용기 BRANDBR472200-10EAMastercycler  X50
글리세롤Sigma-AldrichC3H803
Goat anti-Mouse IgG (H+L) 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluo 568InvitrogenA11004
Goat anti-Mouse IgG (H+L) 고교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluo Plus 488InvitrogenA32723
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) 고교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 488InvitrogenA11034
헤마톡실린 Millipore SigmaMHS16
High Sensitivity RNA ScreenTapeAgilent5067-5579RNA 무결성 평가
High Sensitivity RNA ScreenTape LadderAgilent5067-5581RNA 무결성 평가
High Sensitivity RNA ScreenTape 샘플 버퍼Agilent5067-5580RNA 무결성 평가
고해상도 현미경 Leica BiosystemsN/AAperio CS2 스캐너
염산 (0.1 N HCl)Fisher ChemicalSA54-1
Illumina NextSeq 2000 플랫폼Illumina20038897
Invitroge Goat anti-Rat IgG (H+L) 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluo 568InvitrogenA11077
Iris 가위 - ToughCutF.S.T 14058-11
IsovetBRAUNBR3009Isoflurane
탄산리튬 Merck554-13-2
Loupe Browser (v6.0.0) 10x GenomicsN/AHE 이미지를 시각화하고 Visium 스팟을 큐레이팅하는 데 사용되는 소프트웨어; 분석 파이프라인에서 생성된 .cloupe 파일을 엽니다.
금속 포매 몰드Bio-Optica07-BM24256
현미경 슬라이드avantor631-0108Superfrost Plus 현미경 슬라이드
마이크로톰 칼날FEATHERFEAT207500006_U
마이크로톰 HM 340EEprediaN/AHM 340E 모델
바늘BD301156BD Microlanc 3 바늘 21 G 1 IN (25 MM)
Nikon Optiphot-2Nikon71052명시야 광학 현미경
파라핀 PanReac AppliChem256993임상 진단용 가소화된 Paraffin M.P. 55–58°C + DMSO 펠렛 (CE-IVD)
페트리 접시 CorningCLS430167-100EA
플라스틱 포매 몰드 Bio-Optica07-MP7070
Potts-Smith 포셉F.S.T 11012-18포셉
Qubit 3.0 형광계Invotrogen Q33216
Qubit 분석 튜브Invotrogen Q32856
Qubit RNA HS 분석 키트Invotrogen Q32855
RNase-free 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브Thermo Scientific AM12400
RNase-free 워터 MerkW4502
RNaseZap RnaseInvotrogen AM9780오염 제거 용액
RNeasy FFPE 키트 (50)Qiagen73504전체 RNA 추출
SCTransform (v0.3.5)Satija LabN/ASeurat에 구현된 분산 안정화 정규화 방법
Seurat (v4.3.0.1) Satija LabN/A단일 세포 및 공간 전사체 분석에 사용되는 R 패키지
Space Ranger (v2.0.1)10x GenomicsN/AVisium 데이터 세트의 디멀티플렉싱, 정렬 및 특징-바코드 행렬 생성에 사용되는 소프트웨어
Stlime 메스 Schreiber GmbH 51-11-030
STutility (v1.1.1)Bergen LabN/A공간 전사체 시각화 및 통합에 사용되는 R 패키지
수술용 메스 칼날 No.23Swann-Morton210수술용 메스 칼날
열 순환기 Eppendorf6313000018
Tween-200Sigma-AldrichP2287-500ML
Vectra Polaris PerkinElmerCLS143455IF 시각화를 위한 다중 스펙트럼 이미징 플랫폼
Visium 액세서리 키트 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000194
Visium CytAssist10x GenomicsPN-1000441
Visium Human Transcriptome Probe Kit Small 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000363
Visium Mouse Transcriptome Probe Kit Small 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000365
Visium Spatial Gene Expression Slide Kit 4 rxns 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000188
자일렌Panreac214736분석용 이성질체 혼합물 자일렌, ACS, ISO

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FFPE 시료EDTA 탈회조직 절편 제작RNA 무결성세포 유형 식별조직 형태학유전자 발현 분석단일 세포 통합

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