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연구 논문

만성 예측 불가능 가벼운 스트레스 마우스 모델에서 가감소요산이 우울 유사 행동 및 신경세포 네크롭토시스를 개선함

82 조회수

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DOI:

10.3791/72522

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2026년 8월 21일

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1Collaborative Innovation Center of Research and Development on the Whole Industry Chain of Yu-Yao, Henan Province, Henan University of Chinese Medicine, 2Academy of Chinese Medical Sciences, Henan University of Chinese Medicine, 3Shanghai Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 4Department of Traditional Chinese Medicine, Shanghai Tenth People's Hospital, 5College of Chinese Medicine, Henan University of Chinese Medicine

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 행동 분석, 조직학적 분석 및 신경세포 네크롭토시스(necroptosis)의 분자적 평가를 포함하여, 만성 예측 불가능 가벼운 스트레스로 유도된 우울증 마우스 모델에서 가미소요산(Modified Xiaoyao San)의 효능 평가 방법을 설명합니다.

초록

신경세포 손실과 손상은 우울증의 중요한 병리적 특징이며, 네크롭토시스(necroptosis)가 신경세포 사멸의 잠재적 기전으로 제시되어 왔습니다. Gene Expression Omnibus (GEO) 데이터 세트(GSE54565, GSE54566, GSE54568) 분석 결과, 우울증과 네크롭토시스 사이의 연관성이 확인되었으며, 이는 해당 경로의 억제가 잠재적인 치료 전략이 될 수 있음을 시사합니다. 전통 중약인 소요산(Xiaoyao San)의 변형 처방인 가감소요산(MXYS)은 치료 효능을 높이기 위해 청열, 양혈, 인지 기능 향상 및 소생 촉진 약재를 통합하여 개발되었습니다. 그러나 신경세포 네크롭토시스에 미치는 영향과 뇌 조직에 도달하는 활성 성분은 여전히 불분명합니다. 초고성능 액체 크로마토그래피-고해상도 질량 분석법(UHPLC-HRMS)을 사용하여 뇌 조직에서 검출된 MXYS 성분을 잠정적으로 식별하였습니다. 치료 효능은 행동 평가, 조직학적 검사, 면역형광 염색, 웨스턴 블로팅 및 생물정보학 분석을 통해 만성 예측 불가능 가벼운 스트레스(CUMS) 우울증 마우스 모델에서 평가되었습니다. MXYS 투여는 우울증 유사 행동의 개선, 병리적 뇌 손상의 완화, 그리고 receptor-interacting protein kinase 3 (RIPK3) 및 mixed lineage kinase domain-like protein (MLKL)의 인산화 감소와 연관이 있었습니다. 이러한 결과는 MXYS가 신경세포 네크롭토시스 표지자의 감소와 관련된 항우울 유사 효과를 나타냄을 시사하며, 우울증의 잠재적 치료 전략으로서 MXYS에 대한 추가 연구의 실험적 근거를 제공합니다.

서론

기분 장애 범주에 속하는 심각한 정신 질환인 우울증은 주로 지속적인 저하된 기분으로 특징지어지며, 여러 요인의 영향을 받습니다1. 임상적으로 우울증 환자들은 일반적으로 우울한 기분, 인지 기능 저하, 언어 소통 및 신체 활동 감소를 보이며, 심한 경우 자해 행동 및 자살 생각과 같은 증상을 나타냅니다2. 높은 유병률, 재발률, 장애 발생률 및 자살률로 인해 우울증은 전 세계적으로 장애의 주요 원인이 되고 있으며 상당한 사회적, 경제적 부담을 초래합니다3. 세계보건기구에 따르면, 우울증은 2030년까지 암, 심혈관 및 뇌혈관 질환을 제치고 전 세계 질병 부담의 가장 큰 요인이 될 것으로 예상됩니다3. 또한, 코로나바이러스감염증-19 (COVID-19) 팬데믹은 전 세계 주요 우울 장애 유병률의 27.6% 증가와 관련이 있었습니다4. 중국의 경우 우울증의 연간 유병률은 3.6%이며, 평생 유병률은 6.8%입니다5. 우울증의 발병 기전은 복잡한 병인과 다양한 기여 요인으로 인해 여전히 완전히 이해되지 않고 있습니다. 결과적으로 치료 옵션은 제한적이며, 현재 사용 가능한 항우울제에 대한 반응이 불충분하여 환자의 약 30%–40%가 치료 저항성 우울증으로 발전합니다6. 나아가 기존 항우울제와 관련된 느린 약효 발현, 잔류 증상, 신경 독성 및 부작용은 계속해서 중요한 치료적 과제로 남아 있습니다7.

프로그램된 세포사(Programmed cell death)는 오랫동안 생의학 연구의 주요 초점이 되어 왔습니다. 점차 많은 증거들이 우울증이 네크롭토시스(necroptosis)8,9,10,11와 연관되어 있음을 시사하고 있습니다. 네크롭토시스는 아포토시스(apoptosis)와 마찬가지로 프로그램된 세포사의 한 형태이지만, 아포토시스와는 달리 뚜렷한 면역 및 염증 반응을 유발합니다12. caspase-8 활성이 없는 상태에서, tumor necrosis factor-α (TNF-α)가 tumor necrosis factor receptor 1 (TNFR1)에 결합하여 receptor-interacting protein kinase 1 (RIPK1)을 활성화합니다13. 활성화된 RIPK1은 receptor-interacting protein kinase 3 (RIPK3)와 상호작용하여 네크로솜(necrosome) 복합체를 형성하며, 이는 이어서 mixed lineage kinase domain-like protein (MLKL)을 활성화합니다14. 올리고머화 이후 MLKL은 세포질에서 형질막으로 전이되어 소기관 팽창15,16, 세포막 무결성 파괴 및 damage-associated molecular patterns (DAMPs)와 TNF-α, interleukin (IL)-1, IL-6와 같은 염증 매개체를 포함한 세포 내 물질의 방출을 유도함으로써 염증 반응을 악화시킵니다17. 네크롭토시스는 다발성 경화증, 우울증, 근위축성 측삭 경화증, 파킨슨병, 알츠하이머병을 포함한 수많은 염증성 및 신경퇴행성 질환에 관여하는 것으로 알려져 있습니다18,19,20. 단백질체 분석 결과, 만성 예측 불가능 가벼운 스트레스(CUMS)로 유도된 우울증은 RIPK3 및 MLKL의 발현 증가와 네크롭토시스 경로의 활성화와 연관이 있음이 밝혀졌습니다2. 또 다른 CUMS 우울증 마우스 모델에서 fluoxetine은 RIPK1 매개 네크롭토시스의 억제와 연관된 항우울 유사 효과를 나타냈습니다10. 또한 네크롭토시스 억제제인 Nec-1s가 lipopolysaccharide (LPS)로 유도된 우울 유사 행동을 개선하는 것으로 나타났습니다21. 신경 손상은 우울증의 중요한 병리적 특징이므로, 네크롭토시스를 표적으로 하는 것은 우울증 치료를 위한 유망한 치료 전략이 될 수 있습니다.

전통 중의학(TCM)은 우울증 치료에 오랜 역사를 가지고 있습니다. 중의학 이론에 따르면 간은 기의 원활한 흐름을 주관하므로, 우울증은 주로 정서적 고통으로 인한 간기울결(liver qi stagnation)에 기인합니다. 따라서 주요 치료 전략은 간을 소통시키고 우울함을 해소하는 것입니다. 소요산(Xiaoyao San, XYS)은 이러한 목적으로 널리 사용되는 고전적인 한약 처방이며, 우울증 치료에 대한 적용은 광범위한 근거에 의해 뒷받침됩니다22. 또한, XYS는 네크롭토시스 억제 특성을 가진 것으로 보고되었습니다23,24. “간울화화(liver depression transforming into fire)” 및 “청양상승(clear yang ascending to the brain)”이라는 중의학 개념을 바탕으로, 열을 내리고 혈액을 식히기 위해 목단피(Moutan Cortex)와 치자(Gardeniae Fructus)를 추가하고, 인지 기능 촉진 및 회복을 위해 석창포(Acori Tatarinowii Rhizoma)와 원지(Polygalae Radix)를 추가하여 XYS를 수정하였습니다. 이렇게 만들어진 처방을 가감소요산(Modified Xiaoyao San, MXYS)이라 명명하였으며, 이는 중의학 원리에 기반하여 향상된 치료 효과를 제공하기 위해 개발되었습니다. 다만, 본 연구에서는 기존 XYS 처방과의 직접적인 비교는 수행하지 않았습니다25. 임상 연구를 통해 MXYS의 항우울 효능이 입증되었으며26,27,28, 그 치료 효과는 시상하부-뇌하수체-부신(HPA) 축의 조절 및 신경 염증 억제와 관련이 있을 수 있습니다29,30,31. 그럼에도 불구하고, MXYS가 신경세포의 네크롭토시스 감소와 관련이 있는지는 여전히 불분명합니다.

본 연구에서는 뇌 조직에서 검출된 MXYS 유래 화합물을 잠정적으로 식별하기 위해 고해상도 질량 분석법과 결합된 초고성능 액체 크로마토그래피(UHPLC-HRMS)를 사용하였습니다. MXYS, 우울증 및 네크롭토시스(necroptosis) 간의 연관성을 조사하기 위해 공개적으로 이용 가능한 Gene Expression Omnibus(GEO) 데이터 세트와 가중 유전자 공발현 네트워크 분석(WGCNA), 차등 발현 분석 및 농축 분석을 포함한 생물정보학적 분석을 수행하였습니다. 이러한 결과를 바탕으로, 당사는 MXYS가 뉴런의 네크롭토시스 마커 감소와 관련된 항우울 유사 효과를 나타낼 수 있으며, 활성 전사 인자 4(ATF4)/cAMP 응답 요소 결합 단백질(CREB)/뇌 유래 신경영양인자(BDNF) 경로가 후보 상관 기전임을 가설로 세웠습니다. 이 가설을 평가하기 위해, UHPLC-HRMS를 사용하여 뇌 조직에서 검출된 화합물을 잠정적으로 식별하고, 잠재적 치료 표적을 찾기 위해 생물정보학적 분석을 수행하였으며, MXYS 처리가 네크롭토시스 마커 및 ATF4/CREB/BDNF 경로의 변화와 관련이 있는지 확인하기 위해 in vivo 실험을 진행하였습니다. 이러한 결과는 기존 XYS 제형과의 비교 연구 및 용량-반응 검증이 여전히 필요함을 인정하면서도, 우울증에 대한 MXYS의 잠재적 치료 적용을 뒷받침하는 예비 증거를 제공합니다.

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프로토콜

동물 실험은 Henan University of Chinese Medicine의 동물윤리위원회의 승인을 받았습니다 (승인 번호 DWLLGZR202200023). 모든 절차는 기관 및 국가의 동물 복지 지침에 따라 수행되었으며 ARRIVE 지침을 준수하였습니다. 수컷 Sprague–Dawley (SD) 쥐는 허가된 실험 동물 공급업체로부터 분양받았습니다. 동물들은 온도와 습도가 조절되는 환경에서 12시간 명/암 주기로 사육되었으며, 표준 사료와 물을 자유롭게 섭취할 수 있도록 제공하였습니다.

MXYS의 뇌 조직 함유 성분 확인
동결건조 MXYS 분말의 조제:
MXYS의 11가지 약재를 증류수 10배 용량에 2시간 동안 침전시킨 후 40분 동안 끓였다. 박하는 전탕 마지막 5분 전에 첨가하였다. 동일한 방법으로 증류수 8배 용량을 사용하여 2차 전탕액을 조제하였다. 두 전탕액을 혼합하고 거즈로 여과한 후, 감압 농축하여 1 g/mL(조약재 당량) 농도로 만들었으며, 진공 상태에서 48시간 동안 동결건조하여 동결건조 MXYS 분말을 얻었다. 추출 수율은 21.7% (w/w)25,29,31였다.

동물 및 MXYS 투여:
12마리의 수컷 SD 랫트를 무작위로 두 그룹으로 나누어 MXYS 또는 정제수를 1일 2회 경구 투여하였다. 투여는 오전 8시와 오후 8시(12시간 간격)에 수행되었다. MXYS 분말을 정제수에 용해하여 24.4 g/kg(랫트 대상 임상 용량의 약 2배)으로 투여하였다25. 대조군에는 동일한 부피(10 mL/kg)의 정제수를 투여하였다.

MXYS 포함 뇌 조직의 준비:
14일 후, 마지막 MXYS 투여 2시간 뒤에 모든 쥐를 소듐 펜토바르비탈(sodium pentobarbital, 40 mg/kg, 복강 내 투여)로 마취시켰습니다. 생리식염수로 관류 후 뇌 조직을 채취하였습니다. 공백 뇌 조직 및 MXYS 처리 뇌 조직 샘플을 얻기 위해 전뇌를 즉시 적출하여 얼음 위에 놓았습니다.

크로마토그래피/질량 분석 조건 및 데이터베이스:
동결 건조된 MXYS 분말, MXYS 분말을 첨가한 공백 뇌 조직, 공백 뇌 조직 및 MXYS 함유 뇌 조직 추출물을 35°C로 유지되는 HSS-T3 컬럼(100 × 2.1 mm, 1.8 μm)이 장착된 초고성능 액체 크로마토그래피 시스템을 사용하여 분석하였다. 이동상은 0.1% formic acid를 함유한 물(이동상 A)과 0.1% formic acid를 함유한 acetonitrile(이동상 B)로 구성되었다. 시료는 0.3 mL/min의 유속에서 1분 동안 5% B, 16분에 걸쳐 98% B까지 증가, 0.5분 만에 5% B로 복귀, 그리고 2.5분 동안 5% B로 유지하는 기울기 용리(gradient)를 사용하여 분리하였다.

질량 분석 스펙트럼은 90–1,300의 m/z 범위에서 데이터 의존적 획득 방식을 사용하여 양이온 및 음이온 전기분무 이온화 모드 모두에서 얻었습니다. MS/MS 스펙트럼은 20, 40, 60 eV의 단계적 고에너지 충돌 유도 해리 충돌 에너지를 사용하여 가장 강도가 높은 10개의 전구 이온으로부터 생성되었습니다. 모세관 온도는 320°C로 유지되었으며, 프로브 히터 온도는 350°C로 설정되었습니다.

화합물 주석 처리는 정확한 질량, 동위원소 분포 및 MS/MS 스펙트럼을 자체 구축한 전통 중약 데이터베이스 및 공개 GNPS와 대조하여 수행되었다.32, ReSpect33, 그리고 MassBank34 데이터베이스를 활용하였습니다. 신뢰할 수 있는 MS/MS 매칭 결과와 일관된 크로마토그래피 피크 모양을 보이는 화합물들을 선별하였습니다. 잠정적으로 확인된 화합물의 전체 목록은 다음에서 제공됩니다. 보충 표 1.

생물정보학
GEO 데이터베이스의 데이터 세트 선택 및 전처리:
우울증의 병리 기전에 있어 네크롭토시스(necroptosis)의 잠재적 관여도를 조사하기 위해 “depression”이라는 키워드로 GEO 데이터베이스를 검색하였다. 선택 기준에 따라, 추가 분석을 위해 세 개의 데이터 세트(GSE54566, GSE54565, GSE54568)를 선정하였다. 해당 데이터 세트는 서로 다른 뇌 영역에서 유래되었으며, 각각 GSE54565(전대대상피질), GSE54566(편도체), GSE54568(배외측 전전두엽 피질, BA9)이다. 모든 데이터 세트는 Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array 플랫폼(GPL570)을 사용하여 생성되었으며, 주요 우울 장애(MDD) 환자와 비정신과 대조군의 사후 뇌 조직 샘플로 구성되었다. 각 데이터 세트의 상세한 샘플 특성은 부록 표 2에 요약되어 있다. 이 데이터 세트들은 우울증과 연관된 세 가지 뇌 영역의 전사체 데이터로 구성되었다. 각 데이터 세트의 MDD 군과 대조군 간의 차등 유전자 발현 분석을 수행하였으며, 일관되게 상향 조절 및 하향 조절된 유전자들을 Robust Rank Aggregation (RRA) R 패키지를 사용하여 통합하였다.

모든 데이터세트는 배경 보정 및 정규화를 위해 robust multi-array average (RMA) 알고리즘을 사용하여 전처리되었습니다. RMA 정규화 후, 데이터세트 간의 배치 효과를 조정하기 위해 sva R 패키지에 구현된 ComBat 알고리즘을 적용하였으며, 이때 데이터세트 출처를 배치 공변량으로 처리하였습니다. 이 절차를 통해 데이터세트 간의 기술적 변동을 줄이고 후속 분석을 위한 비교 가능성을 향상시켰습니다.

생물정보학 분석은 R 소프트웨어(version 4.2.1)를 사용하여 수행되었습니다. 주요 R 패키지로는 Gene Ontology (GO) 및 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) 풍부성 분석을 위한 ClusterProfiler(version 4.8.2), 가중 유전자 공발현 네트워크 분석을 위한 WGCNA(version 1.72), 차등 발현 유전자 통합을 위한 RRA, 그리고 ComBat 배치 교정을 위한 sva(version 3.48.0)가 포함되었습니다. 분석 워크플로우는 데이터 획득, RMA 정규화, ComBat 배치 교정, RRA 통합을 이용한 차등 발현 분석, WGCNA 모듈 구축, FDR < 0.05 기준의 GO 및 KEGG 풍부성 분석, 그리고 단백질-단백질 상호작용 (PPI) 네트워크 분석을 통한 타겟 예측으로 구성되었습니다.

WGCNA를 이용한 공발현 유전자 네트워크 구축 및 우울증 및 네크롭토시스와 유의하게 연관된 모듈 식별:
WGCNA는 척도 없는 위상(scale-free topology)에 근접시키기 위해 소프트 임계값 거듭제곱(β 값)을 적용하여 가중 유전자 공발현 네트워크를 구축합니다. log(k)와 log(p(k)) 사이의 상관계수가 최소 0.9에 도달했을 때 β 값을 선택했습니다. β 값을 선택한 후, 동적 트리 컷(dynamic tree cut) 방법을 사용하여 유전자 모듈을 식별했습니다. 추가 매개변수는 minModuleSize = 30, cutHeight = 0.25, deepSplit = 2로 설정했습니다. log(k)와 log(p(k)) 사이의 상관계수가 최소 0.9에 도달했을 때 β 값을 선택했습니다. 네트워크 구축에는 β = 7의 소프트 임계값 거듭제곱이 사용되었습니다. 각 모듈에 대해 모듈 고유유전자(Module Eigengene, ME)를 계산하여 유전자 발현 패턴을 요약하고 생물학적 특성과의 연관성을 평가했습니다. 이후 유전자 유의성(Gene Significance, GS)과 모듈 멤버십(Module Membership, MM)을 계산했으며, 상관계수(cor)와 그에 해당하는 p-value를 사용하여 모듈-특성 관계를 평가했습니다. 상관계수가 높고 p-value가 낮을수록 유전자 모듈과 생물학적 특성 사이의 연관성이 더 강함을 나타냅니다.

기능적 농축 분석 및 PPI 네트워크 구축:
KEGG 경로 농축 분석을 수행하기 위해 ClusterProfiler를 사용하였다. 다중 검정 보정을 위해 Benjamini–Hochberg FDR 방법을 적용하였으며, 보정된 p-값(FDR) < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 표적 모듈을 식별한 후, 해당 모듈 내의 핵심 유전자를 MXYS 및 네크롭토시스(necroptosis) 관련 유전자와 교차 분석하였다. 이후 STRING 데이터베이스를 사용하여 PPI 네트워크를 구축하였다.

뇌 조직에서 검출된 화합물의 표적 예측:
MXYS 투여 후 쥐 뇌 조직에서 잠정적으로 확인된 143종의 화합물을 표적 예측에 사용하였다. 각 화합물에 대하여, 관련 표적(Related Targets) 기능을 통해 관련성 점수와 함께 GeneCards 데이터베이스에서 잠재적 표적을 검색하였다. > 5. 중복된 타겟은 병합하였으며, 공식 유전자 기호가 있는 인간 유전자만을 유지하여 총 3,164개의 고유 타겟을 도출하였다. 이 타겟들을 대상으로 ClusterProfiler R 패키지를 사용하여 GO 및 KEGG 풍부성 분석을 수행하였으며, FDR을 통해 < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 배경 유전자 세트는 KEGG 데이터베이스에 주석이 달린 모든 인간 단백질 코딩 유전자로 구성되었다.

실험적 검증
세포 배양:
HT-22 세포는 Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (CL-0697, RRID: CVCL_0321)에서 구입하여 10% fetal bovine serum (FBS) 및 100 U/mL penicillin/streptomycin이 첨가된 성장 배지에서 배양하였다. 세포는 5% CO₂가 포함된 가습 배양기 내 37°C에서 유지하였다.

MXYS의 항네크롭토시스 활성:
동결 건조된 MXYS 분말을 세포 성장 배지에 재구성하여 1.0 g/mL 농도로 조절한 후, 다음을 통해 멸균하였다. 0.22 μm 멤브레인 필터로 여과하여 −에서 보관하고20°C 사용 전까지 보관하였다. HT-22 세포를 96-웰 플레이트의 웰당 8,000개의 밀도로 분주하였으며, 그룹당 3개의 웰을 사용하였다. MXYS를 성장 배지에 희석하여 최종 농도가 2, 4, 6 mg/mL가 되도록 하였다. 12시간 동안 배양한 후, 세포에 SM-164 hydrochloride (10 nM)와 caspase 억제제 z-VAD-fmk (20 μM)로 30분간 처리한 후, 인간 종양괴사인자-α(h-TNF-α; 20 ng/mL)로 12시간 동안 추가로 자극하였다. 세포 생존율은 제조사의 지침에 따라 발광 세포 생존율 분석법을 사용하여 평가하였다. 발광도는 마이크로플레이트 리더를 사용하여 측정하였다. 세포 형태는 도립 현미경으로 관찰하였으며, 분석을 위해 대표 이미지를 획득하였다.

동물:
동물 실험은 정주중의약대학교 동물윤리위원회의 승인을 받았습니다(승인 번호: DWLLGZR202200023). 모든 절차는 동물 복지에 관한 기관 및 국가 가이드라인에 따라 수행되었으며, ARRIVE 가이드라인을 준수하였습니다. CUMS 모델 구축에는 6–8주령의 수컷 BALB/c 마우스만을 사용하였습니다. 동물은 온도와 습도가 제어된 환경에서 12시간 명/암 주기로 사육되었으며, 표준 사료와 물을 자유롭게 섭취하도록 제공하였습니다.

CUMS 유도 우울증 모델:
마우스를 대조군 또는 CUMS군으로 무작위 배정하였다. 1주일간의 적응 기간 후, CUMS군 마우스에는 간헐적이고 예측 불가능한 가벼운 스트레스를 가하였으며, 대조군 마우스는 그대로 두었다. 스트레스 패러다임은 케이지 기울이기, 케이지 흔들기, 케이지 교체, 젖은 깔짚, 수분 제한, 스트로보 조명, 소음 노출, 지속적인 빛 노출, 지속적인 어둠 노출, 간헐적 조명, 냉수 수영(4°C), 온수 수영(40°C), 구속 스트레스 및 기타 가벼운 스트레스를 포함한 13가지의 서로 다른 스트레스 요인으로 구성되었다. 예측 불가능성을 유지하기 위해 각 스트레스 요인은 무작위 순서로 세션당 2~6 h 동안 적용되었다. 마우스는 무작위 일정에 따라 매일 한 가지 또는 두 가지의 서로 다른 스트레스 요인에 노출되었다.

그룹 및 약물 처리:
6주간의 CUMS 노출 후, 마우스를 CUMS, MXYS, paroxetine 또는 Nec-1 처리군으로 무작위 배정하였다. MXYS군은 동결 건조된 MXYS 분말을 35.2 g/kg/day의 용량으로 경구 투여받았다. paroxetine군은 paroxetine(20 mg/kg)을 경구 투여받았으며, Nec-1군은 Nec-1(10 mg/kg)을 4주 연속으로 복강 투여받았다. 동일한 기간 동안 대조군과 CUMS군은 동일한 부피의 생리식염수를 경구 투여받았다.

행동 실험:
약물 투여 시작 전, 컴퓨터로 생성된 난수 서열을 사용하여 마우스를 실험군에 무작위로 배정하였다. 무작위 배정 서열은 이후의 실험이나 데이터 분석에 참여하지 않은 독립적인 연구자에 의해 생성되었다.

행동 테스트는 처치 그룹을 알지 못하는 연구자에 의해 수행되었습니다. 주관적 편향을 최소화하기 위해 동일한 연구자가 자동 추적 소프트웨어를 사용하여 비디오 기반 행동 평가(부동 시간, 이동 거리 및 중앙 체류 시간)를 실시하였습니다. 블라인드 처리된 연구자는 모든 행동 데이터가 수집되고 기록될 때까지 그룹 할당 코드를 확인할 수 없었습니다.

면역형광 분석은 실험군에 대해 눈가림 처리된 별도의 연구자에 의해 수행되었습니다. 샘플은 암호화된 식별자를 사용하여 라벨링되었으며, 밀도 측정 또는 형광 강도 측정이 완료된 후에만 그룹 할당 내용이 공개되었습니다. 통계 분석은 모든 정량적 데이터가 수집될 때까지 그룹 할당과 그에 따른 실험 결과 모두에 대해 눈가림 처리된 제3의 연구자에 의해 수행되었습니다.

설탕물 선호도 검사(Sucrose Preference Test, SPT): 행동 테스트는 마지막 약물 투여 후에 수행되었다. 테스트 전, 마우스에게 1% 설탕물을 담은 병 두 개를 12시간 동안 제공하고, 이어서 1% 설탕물을 담은 병 하나와 식수가 담긴 병 하나를 추가로 12시간 동안 제공하여 1% 설탕물에 적응시켰다. 그 후, 정식 테스트 전까지 12시간 동안 마우스의 음식과 물 섭취를 제한했다. 테스트 동안 각 마우스에게 1% 설탕물을 담은 병 하나와 식수가 담긴 병 하나를 제공했다. 12시간 후, 각 병에서 소비된 부피를 측정했다. 설탕 선호도는 다음과 같이 계산되었다:

설탕 선호도 방정식, 식이 선호도 지표; 공식: 설탕 대 물 섭취 비율 차트.

꼬리 매달기 시험(Tail Suspension Test, TST): 각 마우스의 꼬리를 접착 테이프를 사용하여 테스트 장치 상단에 고정했다. 행동 비디오 녹화 및 분석 소프트웨어를 사용하여 6분 동안 마우스의 행동을 기록했다. 테스트 마지막 4분 동안의 부동 시간을 정량화했다.

오픈 필드 테스트 (OFT): 각 마우스를 오픈 필드 장치의 중앙에 개별적으로 배치하였다. 행동 추적 소프트웨어를 사용하여 이동 거리와 운동 활동을 포함한 행동 활성도를 5분 동안 기록하고 분석하였다. 각 테스트 후, 장치를 75% 에탄올로 세척하였다.

시료 수집:
CUMS 절차 도중 사망하거나 심각한 질환 징후(예: >(체중의 20% 감소, 육안으로 확인 가능한 감염 또는 거동 불가 등)은 연구에서 제외되었다. 안락사는 인증된 인력이 소듐 펜토바르비탈(sodium pentobarbital, 150 mg/kg, 복강 내 투여)을 과량 투여하여 수행하였다. 의식 소실 후, 사망을 확실히 하기 위해 보조 방법으로 경추 탈구를 실시하였다. Nissl 염색 및 면역형광 분석을 위해 각 군에서 생쥐 3마리를 무작위로 선정하였다. 웨스턴 블롯 분석용 해마 조직은 즉시 얼음 위에서 적출하여 액체 질소에 급속 냉동하였다.

니슬 염색(Nissl Staining):
니슬 염색 및 면역형광 분석을 위해, 마우스에 소듐 펜토바르비탈(sodium pentobarbital, 150 mg/kg, 복강 내 투여)을 투여하여 깊게 마취시킨 후 심장 관류 없이 참수하였다. 뇌를 신속하게 적출하여 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)에 24–48시간 동안 고정시킨 후 파라핀 포매를 진행하였다. 파라핀 절편은 3 μm 두께로 제작하였다. 파라핀 절편은 흐르는 물로 헹구기 전, 탈파라핀 용액, 절대 에탄올, 75% 에탄올 순으로 순차적으로 처리하여 탈파라핀화하였다. 동결 절편의 경우, 해당되는 경우에 한해 실온으로 가져온 뒤 조직 고정액으로 15분간 고정하고 흐르는 물로 헹구어 냈다. 조직 절편을 니슬 염색액으로 2–5분간 염색하고, 물로 헹군 뒤 0.1% 빙초산(glacial acetic acid)으로 분별 염색하였다. 반응을 종료시키기 위해 세척하고, 현미경으로 분별 염색 정도를 관찰하며 조절한 후 건조시켰다. 이어 자일렌(xylene)에서 10분간 투명화 과정을 거친 후 중성 마운팅 매질을 사용하여 봉입하였다.

면역형광법:
면역형광 염색 절차는 표준 방법으로 수행되었습니다. 뇌 조직은 4% 파라포름알데히드로 고정하고 면역형광 염색을 위해 파라핀에 매립하였습니다. 조직 절편을 다음 조건에서 하룻밤 동안 배양하였습니다. 4°C NeuN (1:200), MLKL (1:300), ATF4 (1:5000) 및 CREB (1:1000)에 대한 1차 항체를 처리하였다. 1차 항체 반응 후, 절편을 PBS로 4회 세척하고 다음과 같은 해당 형광 2차 항체와 함께 암실에서 1시간 동안 반응시켰다: mouse anti-ATF4에는 CY3-conjugated goat anti-mouse IgG (1:300, Servicebio, GB21301), mouse anti-MLKL에는 Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (1:400, Servicebio, GB25301), rabbit anti-NeuN에는 CY3-conjugated goat anti-rabbit IgG (1:300, Servicebio, GB21303), rabbit anti-CREB에는 Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (1:400, Servicebio, GB25303)를 사용하였다. 이후 절편을 실온에서 10분 동안 DAPI로 염색하고 PBS로 세척한 뒤, antifade mounting medium으로 마운팅하였으며, 공초점 현미경을 사용하여 형광 이미지를 획득하였다.

웨스턴 블롯(Western Blot):
뇌 조직을 RIPA(radioimmunoprecipitation assay) 용해 버퍼로 균질화하였다. 단백질 농도를 측정하고, 레인당 20 μg의 총 단백질을 10% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리한 후 PVDF(polyvinylidene fluoride) 막으로 전이시켰다. 블로킹 후, 막을 1차 항체(1:1000)와 함께 4°C에서 하룻밤 동안 반응시켰으며, 이어서 HRP(horseradish peroxidase) 접합 2차 항체와 1시간 동안 반응시켰다. 단백질 밴드는 화학발광 이미지 시스템을 사용하여 시각화하였고, 밴드 강도는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다. 해마 조직의 웨스턴 블롯 분석을 위해 그룹당 두 마리의 마우스를 분석하였으며, 대표적인 면역블롯 결과를 나타내었다. HT-22 세포 실험의 경우, 웨스턴 블롯 분석을 대표 실험으로 1회 수행하였다. 이 데이터는 통계적으로 정량화된 결과가 아닌 질적인 경향성 관찰 결과로 제시되었다.

통계 분석:
그룹 간의 차이는 일원 분산 분석(one-way ANOVA) 후 Tukey의 다중 비교 검정을 사용하여 분석하였다. 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 나타내었다. A p 값 < 0.05를 통계적으로 유의한 수치로 간주하였다.

데이터 가용성:
본 연구 과정에서 생성 및 분석된 데이터 세트는 본 논문 및 보충 자료에 포함되어 있습니다. UHPLC-HRMS 화합물 식별 결과는 보충 표 1에 제공되어 있으며, 생물정보학 분석에 사용된 GEO 데이터 세트의 특성은 보충 표 2에 요약되어 있습니다. GFAP 면역형광(보충 그림 1), p-RIPK3 및 p-MLKL의 면역형광 염색(보충 그림 2), 실험 설계 및 동물 배정 일정(보충 그림 3), 그리고 원본 자르지 않은 웨스턴 블롯 이미지(보충 그림 4)를 포함한 추가 지원 데이터는 보충 자료에서 확인할 수 있습니다.

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결과

WGCNA를 통한 네크롭토시스 경로가 농축된 우울증 관련 유전자 모듈 식별
GSE54566, GSE54565 및 GSE54568 데이터셋 전체에서 일관되게 상향 조절 및 하향 조절된 차등 발현 유전자를 통합하기 위해 RRA 패키지를 사용하였으며, 그 결과 2,513개의 유전자를 식별하였습니다. 이 유전자들의 히트맵은 그림 1A에 나타나 있습니다. 세 데이터셋은 전대대상피질, 편도체, 등외측 전전두엽 피질이라는 서로 다른 뇌 영역에서 유래되었으며, MDD 환자와 비정신과 대조군의 샘플이 포함되었습니다. RRA 방법은 독립적인 데이터셋 전반에서 가장 차등 발현된 유전자들 사이에 일관되게 순위가 매겨진 유전자들을 식별함으로써 데이터셋 특이적 변이를 줄였습니다. 이후 통합된 유전자 프로파일을 WGCNA를 사용하여 분석하였습니다.

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토론

비정상적인 신경세포 사멸은 우울증의 발병 기전에 중요한 역할을 합니다8. 프로그램된 세포 사멸의 한 형태인 네크롭토시스(Necroptosis)에 대해 광범위한 연구가 수행되었으며, 이는 해당 경로를 표적으로 하는 억제제 개발의 상당한 진전으로 이어졌습니다39. 2005년에 네크롭토시스 억제제인 Nec-1이 확인된 이후40, 네크롭토시스 신호 전달 경로의 핵심 구성 요소를 표적으로 하는 화합물 개발에 상당한 진전이 있었습니다. Nec-1은 신경계, 심혈관계 및 신장 질환 모델에서 네크롭토시스에 대한 보호 효과를 입증했습니다41. 또한, 중추신경계를 표적으로 하는 네크롭토시스 억제제인 SAR443060이 임상 시험에 진입했습니다42. 그러나 이 시험들은 개발 과정에서 관찰된 전임상 독성으로 인해 중단되었습니다

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공개 사항

이해관계 충돌:
저자들은 공개할 사항이 없습니다.

감사의 글

본 연구는 중국 허난 고등교육기관 핵심 과학 연구 프로젝트(No. 26A360008), 허난성 중의학 과학 연구 프로젝트(No. 2025ZY3152), 중국 국가 자연 과학 재단(No. 82274496), 허난성 과학 기술 연구 프로젝트(No. 232301420018) 및 국가 중의약 관리국 과학 기술부의 Zhang Zhongjing 계승 및 혁신 프로젝트(No. GZY-KJS-2022-044-1)의 지원을 받아 수행되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Acori Tatarinowii Rhizoma (Acorus tatarinowii Schott; 시창푸)Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China231001약재 성분 (12 g)
점착 테이프해당 없음해당 없음꼬리 매달기 시험
Angelicae Sinensis Radix (Angelica sinensis (Oliv.) Diels; 당귀)Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, ChinaG01230507-16약재 성분 (10 g)
Anti-ATF4 항체 (면역형광법)ServicebioGB1111371차 항체
Anti-ATF4 항체 (웨스턴 블롯)MedChemExpressHY-P804861차 항체
Anti-BDNF 항체MedChemExpressHY-P80567웨스턴 블롯용 1차 항체
Anti-CREB 항체BeyotimeAF1018웨스턴 블롯 및 면역형광법용 1차 항체
Anti-GAPDH 항체Abcamab181602로딩 컨트롤
Anti-MLKL 항체Proteintech66675-1-Ig웨스턴 블롯 및 면역형광법용 1차 항체
Anti-NeuN 항체ServicebioGB11138면역형광법용 1차 항체
Anti-phospho-CREB 항체BeyotimeAF57851차 항체
Anti-phospho-MLKL 항체Biossbsm-54104R1차 항체
Anti-phospho-RIPK1 항체BiolynxBX600081차 항체
Anti-phospho-RIPK3 항체Abcamab1951171차 항체
Anti-RIPK1 항체Cell Signaling Technology3493S1차 항체
Anti-RIPK3 항체Proteintech17563-1-AP1차 항체
Atractylodes macrocephala (Atractylodes macrocephala Koidz.; 백출)Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China230801약재 성분 (10 g)
자동 행동 추적 소프트웨어Panlab (Harvard Apparatus)N/A오픈 필드 및 꼬리 매달기 시험용 SMART 3.0 비디오 추적 소프트웨어
BCA 단백질 분석 키트CWBIOCW0014S단백질 정량
행동 기록 시스템Panlab (Harvard Apparatus)SMART V3.0오픈 필드 및 꼬리 매달기 시험
Bio-Rad 화학발광 이미징 시스템Bio-Rad12003154화학발광 웨스턴 블롯 검출용 ChemiDoc MP 이미징 시스템
CellTiter-Lumi II 발광 세포 생존력 분석 키트BeyotimeC0056XL세포 생존력 분석
공초점 현미경Nikon Eclipse C1N/A면역형광 이미징
DAPIServicebioG1012핵 염색제
환경 탈랍제ServicebioG1128파라핀 탈파라핀화
소태아 혈청 (FBS)BIC04001-500세포 배양 보충제
Gardeniae Fructus (Gardenia jasminoides J. Ellis; 치자)Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China22102109약재 성분 (12 g)
Glycyrrhizae Radix (Glycyrrhiza uralensis Fisch.; 감초)Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China230301약재 성분 (3 g)
CY3-접합 염소 항-마우스 IgGServicebioGB21301마우스 anti-ATF4용 형광 2차 항체 (IF, CY3, 1:300)
Alexa Fluor 488-접합 염소 항-마우스 IgGServicebioGB25301마우스 anti-MLKL용 형광 2차 항체 (IF, Alexa Fluor 488, 1:400)
CY3-접합 염소 항-토끼 IgGServicebioGB21303토끼 anti-NeuN용 형광 2차 항체 (IF, CY3, 1:300)
Alexa Fluor 488-접합 염소 항-토끼 IgGServicebioGB25303토끼 anti-CREB용 형광 2차 항체 (IF, Alexa Fluor 488, 1:400)
HRP 염소 항-토끼 IgGAbsinabs20040웨스턴 블롯용 2차 항체
HRP-접합 마우스 항-토끼 IgG 경쇄ABclonalAS061웨스턴 블롯용 2차 항체
Human TNF-αNovoproteinC008네크로토시스 유도제
HT-22 세포ProcellCL-0697RRID: CVCL_0321
HyClone 성장 배지Cytiva (HyClone)SH30022.01세포 배양 배지
ImageJNIHFree software밴드 정량 분석
도립 현미경NikonEclipse Ti-SR세포 형태 관찰
액체 질소Henan Jilai New Energy Technology Co., Ltd.N/A조직 보존
Molecular Devices 마이크로플레이트 리더Molecular DevicesSpectraMax M5발광 측정
Moutan Cortex (Paeonia suffruticosa Andr.; 목단피)Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China22121714약재 성분 (12 g)
Necrostatin-1 (Nec-1)SelleckS8037RIPK1 억제제
파라포름알데히드ServicebioG1101-500ML조직 고정
Paroxetine hydrochloride hemihydrateAladdinP129711양성 대조군
PBSServicebioG4202-500ML세척 완충액
Peppermint (Mentha haplocalyx Briq.; 박하)Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China230101약재 성분 (6 g)
Penicillin–streptomycinGibco15140-122세포 배양용 항생제
Polygalae Radix (Polygala tenuifolia Willd.; 원지)Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China20221101약재 성분 (12 g)
폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 막Merck MilliporeISEQ00010웨스턴 블롯
Poria (Wolfiporia cocos; 복령)Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, ChinaD23070601약재 성분 (15 g)
방사면역침전 분석 (RIPA) 용해 완충액CWBIO (Jiangsu Cowin Biotech Co., Ltd.)CW2333S단백질 추출
Radix Bupleuri (Bupleurum chinense DC.; 시호)Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China230801약재 성분 (12 g)
SDS-PAGE 시약Solarbio; Servicebio; Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.해당 없음자체 조제한 Acrylamide, bis-acrylamide, Tris, SDS, APS 및 TEMED
Sodium pentobarbitalSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.69020181마취제
초고성능 액체 크로마토그래피 시스템Thermo Fisher ScientificVanquish UHPLC SystemLC-MS 분석
UHPLC HSS-T3 컬럼 (100 × 2.1 mm, 1.8 μm)Waters186003539크로마토그래피 분리
z-VAD-fmkTargetMolT6013범-카스파제 억제제

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