본 프로토콜은 용적 흡수 마이크로샘플링(Volumetric Absorptive Microsampling, VAMS) 장치를 이용한 포괄적인 엔드투엔드 비표적 대사체학 워크플로우를 제시합니다. 목표는 단일 추출 과정을 통해 두 가지 상호 보완적인 분석 플랫폼(RP-LC-MS 및 GC-MS)에서 샘플을 효율적으로 분석함으로써, 대규모 분산형 임상 연구를 위한 견고한 프레임워크를 구축하는 것입니다.
이 논문에서
요약
초록
혈액 미세샘플링(BµS)은 기존의 정맥 천자를 대체하는 강력하고 최소 침습적인 대안으로 부상하였으며, 일반적인 임상 환경 외에서도 소량의 검체를 수집할 수 있게 해줍니다. 이러한 장치들은 분산형 샘플링을 지원하고 환자의 순응도를 높임으로써, 첨단 오믹스 기술과 통합되어 대규모 및 종단적 연구 설계를 용이하게 할 수 있습니다. 하지만 이를 성공적으로 구현하려면 샘플 수집 및 보관부터 추출 및 분석 준비에 이르기까지 여러 핵심 단계의 최적화가 필요합니다. 본 연구에서는 샘플 준비와 분석 성능을 결정하는 주요 매개변수에 중점을 둔, BµS를 위한 포괄적인 엔드-투-엔드 비표적 대사체학 워크플로우를 제안합니다. 체적 흡수 미세샘플링(VAMS) 장치는 역상 액체 크로마토그래피-질량분석법 및 가스 크로마토그래피-질량분석법이라는 두 가지 상호 보완적인 플랫폼을 사용하여 평가되었습니다. 최적화된 워크플로우를 적용한 결과, 다양한 화학 계열에 걸쳐 광범위한 대사체 커버리지가 입증되었으며, 이는 VAMS 기반 샘플링이 분석적 견고성, 재현성 및 생물학적 관련성을 유지하면서 확장 가능한 분산형 대사체학 연구를 지원할 수 있는 잠재력이 있음을 보여줍니다.
서론
생물학적 매트릭스 내의 저분자 화합물을 체계적으로 연구하는 대사체학(Metabolomics)은 세포 표현형과 동적인 대사 상태를 규명하는 중요한 도구로서 상당한 주목을 받아왔습니다1,2. 임상 환경에서 혈액 대사체학은 진단 효율을 높이고 더욱 포괄적인 질병 위험 평가를 가능하게 함으로써, 기존 진단법의 공백을 메울 수 있는 큰 가능성을 가지고 있습니다. 하지만 전체 대사체(metabolome)를 포착하는 것은 본질적으로 매우 어렵습니다. 내인성 대사체의 방대한 화학적 복잡성과 다양한 농도 범위를 고려할 때, 단일 분석 플랫폼만으로는 완전한 커버리지를 달성할 수 없으므로 대사 전반에 대한 개요를 최대화하기 위해서는 상호 보완적인 분석 기술의 운용이 필수적입니다.
혈액 미세샘플링(BµS)은 수 µL의 혈액을 채취하는 최소 침습적 시료 수집 기술입니다. 단순화된 시료 획득 방식으로 채혈 전문가의 도움이 필요 없으며, 가정 내 채취가 가능하여 환자의 편의성을 높여줍니다. 또한, 액체 매질에서 건조 매질로 전환함으로써 저온 보관이 필요하지 않아 다양한 불안정 대사물질의 안정성을 높이고 운송 및 보관 물류를 단순화할 수 있는 것으로 나타났습니다3,4,5. BµS는 수십 년 동안 주로 선천성 대사 이상 진단을 위한 건조혈반(DBS) 형태로 사용되어 왔으나, 이 고전적인 기술은 몇 가지 분석적 단점이 있습니다. 채취 과정에서 정량적인 시료 수집이 불가능하여 혈액 점도의 변화가 혈액 분포를 변화시키고 결과적으로 정량적 정확성을 떨어뜨리는 "헤마토크릿 효과(hematocrit effect)"에 취약합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 정량적 BµS 장치들이 개발되었습니다. 체적 흡수 미세샘플링(VAMS)은 정확한 부피의 혈액을 샘플링하도록 설계된 고분자 팁을 활용하여 기존 DBS의 한계를 극복한 최신 BµS 기술입니다6,7,8.
결과적으로, BµS의 전반적인 대사 프로파일은 최근 몇 년 동안 점점 더 많은 관심을 끌고 있습니다9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. BµS를 전통적인 매트릭스와 비교한 기발표 논문들은 극성 물질을 위한 질량 분석법(MS) 결합 모세관 전기영동법17(CE) 및 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피18,19(HILIC)부터, 중간 극성 대사체 및 지질을 위한 역상 질량 분석법18,19,21(RP-MS)에 이르기까지 광범위한 극성을 다루는 여러 분석 기술을 사용합니다. 전통적인 추출 방법은 근본적인 병목 현상에 직면해 있습니다. 즉, 단일 기기에 최적화하는 것은 종종 중요한 화학적 분획을 버리고 대사 데이터를 손실하는 것을 의미합니다. 시료 부피가 매우 제한적인 경우, 여러 번의 별도 분석을 수행하는 것은 어렵습니다. 따라서 여러 분석 플랫폼과 호환되는 단일 추출 프로토콜을 개발하는 것은 여전히 중요한 과제로 남아 있습니다.
본 워크플로우에서는 VAMS 장치의 RP-LC-MS 및 가스크로마토그래피(GC) 이중 분석 절차를 상세히 설명합니다. 저희가 알고 있는 한, 이는 단일 시료 추출 절차를 통해 이 두 가지 직교 플랫폼을 결합하여 BµS의 비표적 대사 프로파일링을 수행하는 최초의 워크플로우입니다. 또한, 포괄적인 비표적 대사 프로파일을 신뢰성 있고 재현성 있게 획득하는 데 필요한 가장 중요한 단계들을 강조합니다.
프로토콜
모든 참여자는 참여에 대한 서면 동의서를 제출하였습니다. 본 연구는 테살로니키 아리스토텔레스 대학교 연구윤리위원회(#306272/2022)의 승인을 받았습니다.
1. 시료 수집
- 잠재적 오염 물질을 제거하고 혈류량을 증가시키기 위해 피험자의 손을 따뜻한 물로 씻습니다.
- 70% 에탄올 용액을 사용하여 손가락을 소독합니다. 용액이 자연적으로 증발할 때까지 기다립니다.
참고: 요오드 기반 소독제나 비누를 사용하면 LC-MS 분석에 방해가 될 수 있습니다. - 멸균된 일회용 접촉 활성 란셋(깊이 1.5 mm)의 캡을 돌려서 제거합니다. 손가락 끝 중앙에 대고 누릅니다.
- 첫 번째 혈액 방울은 닦아내고 새로운 방울이 맺힐 때까지 기다립니다.
참고: 국소 세포외액에 의한 오염 가능성으로 인해, 첫 번째 방울은 전신 순환 수치를 반영하지 않을 수 있습니다. - 장치를 홀더에서 분리하지 않은 상태에서 VAMS 장치의 20 µL 팁을 혈액 방울에 접촉시킵니다. 장치는 샘플 위로 수직으로 위치해야 합니다. 팁을 혈액에 완전히 담그면 과다 샘플링이 발생할 수 있으므로 주의하십시오.
참고: 실험실 환경에서 필요할 수 있는 정맥혈이 담긴 튜브에서 샘플링할 때는, 과다 샘플링을 피하기 위해 팁이 액체 표면에만 닿고 잠기지 않도록 하십시오. - 팁이 완전히 붉게 변하여 포화 상태가 되면 2초 더 유지한 후 혈액 샘플에서 제거합니다.
- 팁이 외부 물체에 닿지 않도록 주의하며 샘플을 원래의 상자에 담아 직사광선이나 열원이 없는 평평하고 깨끗한 표면에 둡니다. 실온 및 주변 습도 조건에서 2 h 동안 건조시킵니다.
- 분석 전까지 샘플을 건조제와 함께 봉투에 넣어 −80 °C에서 보관합니다. 운송은 드라이아이스 상태로 이루어져야 합니다.
참고: 분석 물질의 안정성이 이미 조사된 BµS의 표적 분석(targeted analysis)의 경우, 제안된 시간 동안 샘플을 실온에서 보관할 수 있습니다. 그러나 비표적 분석(untargeted analysis)의 경우 일부 분석 물질이 건조된 매트릭스 내에서도 분해되기 쉬우므로 –80 °C 보관을 권장합니다. 샘플 수집 시 발생하는 가장 일반적인 문제에 대한 문제 해결 표는 Table 1에 나와 있습니다.
2. 대사체 추출 절차
- 플라스틱 핸들러에서 팁 전체를 분리하여 라운드 바텀 마이크로원심분리기 튜브에 넣습니다 (마이크로원심분리기 튜브의 캡을 사용하여 팁을 핸들에서 분리하십시오).
- 팁 위에 초순수 50 µL를 직접 가하여 재수화합니다.
- 대사물을 추출하고 단백질 침전을 촉진하기 위해 IS 혼합물(예: 동위원소 표지된 D-Myristic acid)이 포함된 메탄올 400 µL를 첨가합니다.
참고: 주의: 메탄올은 독성이 있고 매우 가연성입니다. 반드시 흄 후드 내에서 취급해야 합니다. - 얼음조(ice bath)에서 샘플을 10분 동안 연속 작동 모드로 초음파 처리합니다 (권장 출력 215/860 W, 주파수 35 kHz).
- 핀셋으로 팁을 조심스럽게 제거하며, 샘플 간에 핀셋을 메탄올로 세척합니다.
- 4 °C에서 6720 x g로 10분 동안 원심분리합니다.
- 상층액 150 µL를 새 튜브로 옮깁니다. 모든 샘플에 동일한 부피를 사용하십시오. RPLC 분석에는 새 마이크로원심분리기 튜브를 사용하고, GC 분석에는 새 1.5 mL 유리 바이알을 사용합니다.
- 각 샘플 상층액에서 50 µL를 하나의 바이알로 옮겨 통합 내부 연구 QC 샘플을 준비합니다.
- 완전한 균질화를 위해 짧게 볼텍싱한 후, 연구 샘플과 동일한 부피의 여러 분주액으로 나눕니다. RPLC 분석에는 새 마이크로원심분리기 튜브를 사용하고, GC 분석에는 새 1.5 mL 유리 바이알을 사용합니다.
- 진공 농축기를 사용하여 수성 증발 모드, 진공도 −600 mmHg (−800 mbar), 회전수 1400 rpm, 실온 조건에서 상층액을 완전히 증발시켜 건조합니다. 샘플은 약 2시간 후에 건조됩니다.
참고: 증발 과정을 주의 깊게 모니터링하고, 용매가 완전히 증발하면 휘발성 화합물의 손실을 방지하기 위해 바이알을 농축기에서 제거하십시오. 일시 중단 지점: 샘플은 분석 전까지 건조된 상태로 −80 °C에서 하룻밤 동안 냉동 보관할 수 있습니다.
3. LC-MS 분석 전 처리 과정
- 건조된 잔류물을 초기 이동상(예: 물 내 5–10% methanol)과 같은 재구성 용매 100 µL에 녹여 재구성합니다.
참고: 부피와 재구성 용매는 크로마토그래피 조건에 따라 조정될 수 있습니다. - QC를 연구 시료와 동일한 용매 및 부피로 재구성합니다(시료 대비 용매 부피 비율을 항상 동일하게 유지하십시오).
- 잠시 볼텍싱한 후 원심분리기로 옮겨 4 °C에서 6720 x g 로 10분 동안 원심분리합니다.
- 상층액을 인서트가 포함된 오토샘플러 바이알로 옮깁니다.
4. GC-MS 분석 전 전처리 절차
참고: 다음의 모든 단계는 흄 후드 내에서 수행해야 합니다.
- 40 mg의 methoxyamine hydrochloride를 1 mL의 pyridine에 녹여 methoxyamination 시약을 준비합니다.
참고: 주의: Pyridine은 독성이 있습니다. 반드시 흄 후드 내에서 취급해야 합니다. - 1 mL의 N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide (MSTFA)에 10 µL의 trimethylchlorosilane (TMCS)를 첨가하여 유도체화 시약을 준비합니다.
참고: 주의: TMCS와 MSTFA는 모두 독성이 있습니다. 반드시 흄 후드 내에서 취급해야 합니다. - 테스트 샘플 및 QC 샘플의 건조 잔류물에 methoxyamination 시약(pyridine 내 40 mg/mL methoxyamine hydrochloride) 10 µL를 첨가합니다.
- 샘플을 짧게 볼텍싱하여 시약이 충분히 혼합되도록 합니다.
- 샘플을 30 °C에서 90분 동안 배양합니다. 배양은 정지 상태에서 수행합니다.
- 샘플이 상온으로 식을 때까지 기다린 후, 유도체화 시약(MSTFA 1% TMCS) 90 µL를 첨가합니다.
- 바이알 캡을 새것으로 교체하고 샘플을 30초 동안 볼텍싱하여 균질하게 혼합합니다.
- 혼합물을 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 배양은 정지 상태에서 수행합니다.
- 샘플이 상온으로 식을 때까지 기다린 후, 각 샘플에 주입 표준물질(예: pyridine 내 6.25 mg/L pentadecane) 10 µL를 첨가합니다.
- 바이알 캡을 새것으로 교체하고 짧게 볼텍싱한 후, 최종 혼합물을 마이크로 인서트가 포함된 유리 크로마토그래피 바이알로 옮깁니다.
- 바이알을 오토샘플러 트레이에 로딩합니다.
- 첫 주입 전, 오토샘플러 내에서 샘플을 상온에서 4시간 동안 평형화합니다.
참고: 유도체화는 4시간 후에 완료되며, 대사체는 완전한 유도체화 후 상온에서 최대 24시간까지 안정적입니다. 샘플이 오토샘플러에 28시간 이상(MSTFA 1% TMCS 첨가 후 기준) 방치되지 않도록 각 배치당 샘플 수를 적절히 조정하십시오. 샘플 준비 방법의 모식도는 그림 1A–C에 나와 있습니다.
5. RP-LC-MS 구성
- 다음에 따라 역상(RP) 용리액 및 세척 용액을 준비하십시오. 표 2.
참고: 주의: 포름산과 이소프로판올은 인화성 물질입니다. 또한 포름산은 독성이 있습니다. 두 물질 모두 흄 후드 내에서 취급해야 합니다. - HSS T3 C18(100 mm x 2.1 mm, 1.7 µm컬럼 오븐 내의 컬럼)
- 모든 라인을 해당 채널에 연결하고 각 채널을 적절하게 퍼지(purge)하십시오.
- 컬럼 온도를 다음으로 설정하십시오. 40 °C.
- 0.1 mL/min의 유속으로 100% A:0% B 용액을 사용하여 컬럼 세척을 시작하십시오.
- 유속을 0.1 mL/min 단계로 높이며, 각 단계 사이에서 컬럼 압력이 안정될 때까지 대기하여 유속이 0.35 mL/min에 도달하도록 합니다. 누출 여부를 확인하십시오.
- 그라디언트 초기 조건(0% B)에서 약 30분 동안 컬럼을 평형화합니다.
참고: 컬럼 압력을 모니터링하여 예상 범위(5000–6000 psi) 내로 유지되는지 확인하십시오. - 샘플 시퀀스를 시작하십시오.
6. GC-MS 구성
- DB-5 모세관 컬럼(5% – phenyl-methyl-polysiloxane)을 컬럼 오븐에 설치합니다.
- 컬럼의 초기 온도를 60 °C로 설정합니다.
- PTV 주입기의 초기 온도를 110 °C로 설정합니다.
- 시료 분석 시퀀스를 시작합니다.
결과
위에서 설명한 절차에 따라 VAMS 장치를 비표적 분석한 대표적인 결과가 여기에 제시되어 있습니다.
VAMS로 채취한 10명의 정맥혈로 준비된 혼합 샘플의 3회 반복 분석 데이터를 평가하였으며, 그 결과로 얻은 대사 핑거프린트의 특성을 나타내었습니다. 데이터의 품질과 VAMS 장치에서 캡처된 정보는 두 가지 주요 기준인 검출된 화학적 특성(feature)의 총 개수와 상대 표준 편차(%RSD)로 표시된 특성의 재현성(n = 3)을 사용하여 평가되었습니다. 특성의 총 개수는 용매의 추출 범위와 화학적 커버리지를 평가하는 데 사용되었으며, %RSD는 방법의 기술적 정밀도와 견고성을 보장하기 위해 모니터링되었습니다. %RSD가 낮을수록 분석 노이즈를 최소화하는 재현성이 높은 추출 과정임을 나타냅니다.
원시 데이터 추출 및 처리 후, 강도를 포함한 m/z-머무름 시간(RT) 특성 행렬을 얻었습니다. 적절한 전처리 및 블랭크 필터링 단계를 거친 후, 3회 반복 실험 중 2회에서 검출 가능한 신호가 나타난 특성만 고려하였습니다. 그림 2A,B는 LC-MS 및 GC-MS 모두에 대해 설명된 프로토콜에 따라 분석한 동일 샘플의 m/z-RT 도표를 보여줍니다.
RPLC 분석 초기에 용출되는 특성(feature)의 수가 많은 것은 적용된 프로토콜에 의해 추출되었으나 역상 컬럼에서 유지력이 낮은 고친수성 대사물질 때문인 것으로 보입니다. 조기 용출되는 대사물질은 식별에 어려움이 따르지만, MS/MS 파편화 데이터와 스펙트럼 데이터베이스 및 자체 표준물질과의 비교를 통해 정확한 주석 달기가 가능합니다. 또한, 이러한 친수성 분획의 상당 부분은 GC-MS 분석을 통해 포착될 것으로 예상됩니다. 궁극적으로, 이는 대사체(metabolome)의 극심한 복잡성으로 인해 여러 분석 플랫폼의 사용이 필수적이라는 해당 분야의 내재적인 한계를 나타냅니다.
메탄올 추출물에 대한 다중 플랫폼 평가 결과, LC 및 GC 분석 워크플로우의 매우 상호 보완적인 특성이 명확히 입증되었으며, 성능 지표는 종합적인 메타볼로믹스 프로파일링의 예상 범위 내에 있었습니다. 그림 3A,B는 각 플랫폼의 전체 피처 수와 RSD% 분포를 보여줍니다. LC 플랫폼은 4,169개의 피처를 분해하여 광범위한 화학적 커버리지를 제공했으며, 이는 극성, 준극성 및 비휘발성 화합물의 방대한 배열을 캡처할 수 있는 입증된 능력과 일치합니다. 동시에 GC 플랫폼은 187개라는 더 작은 피처 서브셋을 나타냈습니다. 이는 GC가 유도체화가 가능한 휘발성 화합물만을 검출할 수 있기 때문에 예상된 결과였습니다.
재현성과 관련하여, 바이올린 도표(violin plot)에서 보는 바와 같이 RSD% 값의 전반적인 분포와 확산은 LC-MS와 GC-MS 간에 매우 유사하게 나타납니다. 평균 %RSD는 두 플랫폼 모두에서 전형적인 수치를 보였으며, LC의 경우 약 29.7%(4,169개 중 2,655개가 %RSD 30% 미만), GC의 경우 32.3%(187개 중 114개가 %RSD 30% 미만)였습니다. 소수의 피처(feature)에서 두 방식 모두 더 높은 RSD 값을 보였으나, 이러한 변동은 비표적 대사체학(untargeted metabolomics)에서 흔히 발생하며 예상 가능한 수준입니다. 이러한 높은 값들은 일반적으로 기기의 검출 한계에 가까운 저함량 대사체에서 기인합니다. 종합적으로, 좁은 분포 프로파일은 두 분석 설정 모두에서 만족스러운 재현성이 확보되었음을 확인시켜 줍니다.
본 프로토콜을 통해 캡처된 대사물질의 화학적 공간은 대사물질의 주석(annotation)을 통해 살펴볼 수 있습니다. 두 플랫폼의 내재적인 상보성을 고려할 때 예상대로 LC-MS 및 GC-MS에 의해 다양한 화합물이 검출되었습니다. VAMS 장치에 대한 대사물질 주석의 전체 목록은 Supplementary Table 1 및 Supplementary Table 2에 제공되어 있습니다. 결과적으로, 본 프로토콜의 두 가지 기술을 통해 총 97개의 대사물질이 검출 및 주석 처리되었으며(Sumner 등(2007)22이 제안한 레벨 1 및 2 기준), 이 외에도 레벨 3으로 추정되는 특성 분석 화합물들이 검출되었습니다. GC 주석은 FAMES와의 비교를 통해 얻은 실험적 머무름 지수(retention index)를 기재된 값과 비교함으로써 추가로 확인되었습니다23. Figure 4A,B는 두 방법으로 주석 처리된 대사물질의 하위 클래스 분포를 보여주며, Figure 4C는 두 기술 간의 중첩 영역을 보여주어 상보성을 강조합니다. 몇 가지 핵심 중간 대사물질은 두 기술 모두로 교차 검증이 가능하며, 구조적으로 독특하거나 플랫폼 특이적인 특징들은 중심 탄소 및 2차 대사 경로의 공백을 메울 수 있습니다. 아미노산과 펩타이드가 두 분석 모두에서 주요 화학 클래스이지만, 두 기술 간에 중첩되는 대사물질은 소수에 불과합니다. LC-MS의 acyl carnitines 및 GC-MS의 hexoses와 같이 많은 대사물질 클래스가 기기 특이적입니다.
두 기술 모두에 대해 추출 용매로서 메탄올의 효율성을 입증하기 위해, 다양한 용매 시스템을 사용하여 VAMS 샘플에 대해 비교 시험을 수행한 후 LC-MS 및 GC-MS 분석을 실시하였습니다. 순수 아세토니트릴(ACN), 메탄올-물 혼합물(60:40, v/v), 그리고 아세토니트릴-메탄올 혼합물(70:30, v/v)의 세 가지 서로 다른 용매 시스템을 메탄올과 비교하여 3회 반복 측정하였습니다. 이러한 용매 및 혼합물의 선택은 저희 연구팀에서 수행한 예비 실험과 이전에 발표된 문헌13,14,24,25을 근거로 하였습니다. 각 시스템의 추출 효율은 검출된 피처의 총 수, 전체 피처 강도, 그리고 상대 표준 편차(RSD, %)로 표현된 피처 재현성이라는 세 가지 핵심 파라미터를 사용하여 평가되었습니다.
LC-MS 워크플로우의 경우, MeOH-H2O (60:40, v/v)를 사용했을 때 검출된 피처(feature) 수가 가장 많았으며, 3회 반복 실험 평균 4,514개의 피처가 확인되었습니다. 순수 MeOH가 그 뒤를 이어 4,169개의 피처가 확인되었습니다. ACN–MeOH (70:30, v/v) 혼합물은 평균 3,502개의 피처를 생성했으며, 순수 ACN은 평균 피처 수가 2,836개로 가장 낮았습니다. 반복 실험당 이러한 피처 수의 도식적 표현은 그림 5A에 나타나 있습니다.
각 추출 조건에 대한 정밀도 특성을 조사하기 위해, 3회 반복 주입된 시료의 피처 강도와 RSD(%)를 분석하였습니다. LC-MS에 대한 추출 용매별 총 피처 풍부도와 평균 %RSD의 비교 결과가 그림 5A에 제시되어 있습니다. log2 신호 분포는 모든 추출물에서 유사하게 나타났으며, MeOH-H2O 60:40 (v/v), ACN, MeOH가 ACN-MeOH 70:30 (v/v)보다 약간 더 높은 풍부도를 보였습니다. MeOH는 전체 평균 %RSD가 더 낮게 나타나, 해당 용매를 사용한 추출의 재현성이 더 높음을 시사하였습니다.
GC-MS 데이터에서도 추출 용매 시스템의 효율성에 대해 유사한 평가를 수행하였습니다. 특성(feature) 수의 평가를 위해, 다시 한번 세 번의 반복 실험 중 최소 두 번 이상 신호가 검출된 특성들만 고려하였습니다. 가장 많은 특성이 검출된 용매는 ACN-MeOH 70:30 (v/v) (216개 특성)였으며, MeOH (187개 특성)가 그 뒤를 이었습니다. 추출 용매 및 BµS별 검출된 특성 수에 대한 그래픽 도해는 그림 5B에 나와 있습니다.
검출된 피처(feature)의 전체적인 풍부도와 관련하여, 그림 5B에 나타난 바와 같이 MeOH가 가장 높은 풍부도를 보여 가장 효율적인 것으로 나타났다. MeOH-H₂O 60:40 (v/v)이 두 번째로 우수했으며, ACN-MeOH 70:30 (v/v)이 그 뒤를 이었다. ACN은 가장 효과가 낮은 용매였다. 피처 %RSD와 관련하여, MeOH-H₂O 60:40 (v/v)이 VAMS에 대해 가장 낮은 RSD(RSD = 38.57%)를 제공했으며, ACN (42.65%), MeOH (44.14%), ACN-MeOH 70:30 (v/v) (49.14%) 순으로 유사한 수치를 보였다. 이 값들은 그림 5B에 표시되어 있다.
이는 이전에 발표된 문헌들과 잘 일치합니다. Couacault et al. (2026)19 유사한 추출 용매 조성을 사용하여 DBS 및 VAMS의 RP-LC-MS 분석을 수행한 결과, 상응하는 수의 특성(feature)이 보고되었습니다(다음과 같이 재수화하여... 80 µL 의 물을 넣은 후, 다음으로 (물질)을 첨가한다. 320 µL MeOH). 마찬가지로, Cala 등(2017)은11 VAMS 팁의 GC-MS 분석을 통해 이와 유사한 피처 수(153개)가 검출되었습니다. 기존의 대부분의 연구에서는 이러한 장치 분석의 정밀도를 평가하지 않았으나, 본 연구의 전반적인 결과는 비표적 분석(untargeted analysis)에 대한 기대치와 일치합니다. 또한, LC 결과는 Bossi 등(2025)이 보고한 내용과 일치합니다.26 DBS 및 qDBS 마이크로샘플의 HILIC 분석에서, 검출된 대부분의 피처(feature)가 RSD를 나타냈으며 < 30%.
전반적으로, 이러한 결과는 메탄올 기반 추출이 VAMS 시료의 LC-MS 및 GC-MS 분석 모두에서 피처 수, 강도 및 정밀도(평균 RSD, %)의 견고한 균형을 제공한다는 것을 입증합니다. 따라서 단일 메탄올 추출 프로토콜을 통해 이중 시료 준비 과정을 효율화하고, 상호 보완적인 대사체 프로필의 병렬 획득을 촉진하며, 정보 출력물을 최대화할 수 있습니다.
그림 1: 다음을 나타내는 프로토콜 모식도: (A) 시료 추출 프로토콜, (B) LC-MS 재구성, (C) GC-MS/MS 유도체화. BioRender로 제작됨. Marques, D. (2026) https://BioRender.com/dprdv18, https://biorender.com/xu2qh34, https://biorender.com/7ztz2qv. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2~에 대한 대표 샘플의 m/z 및 rt 비교 (A) LC-MS 및 (B) GC-MS 분석. 각 점은 특성(feature)으로 그룹화되기 전의 단일 신호를 나타냅니다. 색상은 해당 특성의 MS1 신호 강도를 나타내며, 파란색에서 빨간색으로 갈수록 강도가 증가합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 분석 플랫폼 간의 피처 커버리지 및 재현성. (A) 피처 커버리지: LC (청록색) 및 GC (주황색)에 의해 검출된 고유 피처의 총 개수이며, 각 막대 위에 정확한 수치가 표시되어 있음. (B) 피처 재현성: 모든 피처에 대한 상대 표준 편차(RSD%)의 분포 밀도를 나타내는 바이올린 도표. 내장된 박스 플롯은 중앙값과 사분위 범위를 나타내며, 시각적 명확성을 위해 개별 데이터 포인트는 생략함. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4각 화학 분류별로 검출된 화합물 수를 나타내는 히스토그램 (A) LC-MS 및 (B가스크로마토그래피-질량분석법(GC-MS).C) 플랫폼 간 레벨 1 및 2로 주석이 달린 대사체들의 중첩. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5LC-MS 분석을 통한 추출 용매 결과 (A) 및 GC-MS (BVAMS 장치 분석. 그림 상단의 막대 그래프는 VAMS 장치에 적용된 각 추출 용매당 반복 실험별로 얻은 피처(feature)의 수를 나타냅니다. 그림 하단의 그래프는 VAMS 장치에 사용된 각 추출 용매의 강도 합계와 평균 상대 표준 편차(RSD, %)를 보여줍니다. 원의 크기는 log2 척도로 표시된 검출 피처의 총 강도 합계를 나타내며, 이는 추출 효율을 반영합니다. 색상 그라데이션은 분석 정밀도를 나타내는 상대 표준 편차(RSD)로 표시되며, 노란색은 높은 정밀도를, 빨간색은 더 큰 변동성을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 문제 해결 표. VAMS 장치를 이용한 샘플링 시 발생하는 일반적인 샘플링 문제, 원인 및 해결 방법 개요. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: RP 용리액 및 세척액. 크로마토그래피 분석에 사용된 이동상, 씰 세척액, 퍼지 용매 및 세척 용매 조성의 개요. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 추가 실험 세부 사항. LC-MS 및 GC-MS 파라미터. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: LC-MS 주석. LC-MS 플랫폼에서 현재 프로토콜로 확인된 화합물. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 2: GC-MS 주석. 현재 프로토콜을 통해 GC-MS 플랫폼에서 확인된 화합물들입니다. 여기를 클릭하여 파일을 다운로드하십시오.
토론
비표적 대사체학(Untargeted metabolomics)은 생물학적 시료의 화학적 조성에 대한 독특한 통찰력을 제공합니다. 하지만 대사체군의 화학적 다양성이 매우 크기 때문에, 혈액 내에 존재하는 소분자들을 완전히 특성화할 수 있는 단일 기술은 존재하지 않습니다. 따라서 대사체 분석 범위를 넓히고 연구의 전반적인 정보를 개선하기 위해서는 상보적인 기술의 사용이 필수적입니다. 그러나 VAMS와 같은 혈액 미량 시료의 적은 부피로 인해, 서로 다른 분석을 위한 시료 준비 과정에 어려움이 따릅니다.
본 프로토콜에서는 이중 추출법과 두 가지 상호 보완적인 분석 기법을 사용하여 VAMS 팁의 대사체 프로파일링을 수행하는 포괄적인 워크플로우를 제시합니다. VAMS 샘플에 대해 비표적 분석을 수행한 기존 연구들이 발표되었으나11,12,13,15,17,18,19,20,21,27, 각각은 단일 분석 기법에만 집중하고 있습니다. 본 프로토콜은 단일 워크플로우 내에서 LC 및 GC-MS 분석을 모두 지원하도록 VAMS 장치의 추출 과정을 최적화한 최초의 프로토콜입니다.
본 프로토콜은 제시된 결과를 얻기 위한 용매 및 추출물의 구체적인 부피를 제공하며, 장비의 민감도, 가능한 주입 부피 및 QC 샘플 요구 사항에 따라 개별 설정에 맞춰 약간의 수정이 가능합니다. 예를 들어, 팁이 완전히 젖도록 하기 위해 단계 2.2에서 추가하는 물의 재수화 부피를 50 µL에서 80 µL로 변경할 수 있습니다. 단계 2.3의 메탄올 부피는 더 많은 QC 샘플로 분주하기 위해 추출물 부피를 늘리고자 할 경우 400 µL에서 500 µL로 증가시킬 수 있습니다. 다만, 용매 부피를 늘리면 분석 대상 물질의 희석도가 높아진다는 점에 유의해야 합니다. 또한, 단계 2.7의 분석용 샘플과 단계 2.8의 QC 샘플로 분주하는 부피는 각 샘플에 필요한 원하는 부피에 맞춰 조정할 수 있습니다(단계 2.7에서는 150 µL에서 200 µL로, 단계 2.8에서는 20 µL에서 50 µL로 조정). 특히, 이러한 용매 부피는 비례적 스케일링 없이 자유롭게 조정할 수 있습니다. 일반적으로 완전한 추출을 위해 3:1의 표준 용매 대 샘플 비율이면 충분하지만, 이 방법에서는 BµS 장치 전체가 완전히 잠겨 있도록 용매를 충분히 과량으로 사용하여 모든 제안된 부피에서 프로토콜을 견고하게 적용할 수 있도록 하였습니다.
LC-MS 및 GC-MS 데이터 모두 다양한 오픈 소스 소프트웨어 도구를 사용하여 분석할 수 있습니다. 본 연구에서는 XCMS가 포함된 Metabonaut 워크플로우28를 사용하여 LC-MS 결과를 얻었습니다. GC-MS 시료의 경우, MSDial v. 5.5.260323을 사용하여 데이터 처리를 수행하였습니다. 튜토리얼은 (https://systemsomicslab.github.io/mtbinfo.github.io/MS-DIAL/tutorial.html)에서 확인할 수 있습니다. LC-MS 및 GC-MS 데이터 처리를 위한 상세 파라미터는 Supplementary File 1에 제공되어 있습니다.
각 데이터셋을 개별적으로 처리하고, 전체 데이터셋에 처리 파라미터를 적용하기 전에 별도의 배치로 QC 샘플을 사용하여 파라미터를 최적화하는 것이 권장됩니다. 정규화는 데이터 전처리 후에 수행해야 합니다. XCMS와 MSDial 모두 정규화를 위한 내장 도구를 제공합니다. 본 연구에서는 QC 응답 기반의 선형 모델을 사용하여 오픈 소스 소프트웨어인 QCMXP29로 정규화를 수행하였습니다.
결과물의 신뢰성을 보장하기 위해, 특히 시료 준비 단계에서의 몇 가지 중요한 과정을 강조해야 합니다.
본 프로토콜은 쿼드러폴 비행 시간형 질량 분석기(LC-QTOF-MS)가 결합된 LC 시스템 및 가스 크로마토그래피-질량 분석(GC-MS) 시스템을 사용하여 개발되었으며, 상세 파라미터는 Supplemental Material S1에 나열되어 있습니다. 다른 유형의 LC 또는 GC를 사용하는 경우, 해당 설정에 맞게 파라미터를 최적화해야 합니다. GC-MS 및 LC-MS 기반의 메타볼로믹스 분석에서는 분석 배치의 시작과 끝에 블랭크 주입을 계획해야 합니다. QC 샘플을 주입하기 전, 분석할 매트릭스로 컬럼을 컨디셔닝하기 위해 LC-MS 시스템에서는 컨디셔닝 QC를 10~15회, GC-MS 시스템에서는 5~10회 주입해야 합니다. 컨디셔닝 QC는 다른 QC와 동일한 절차에 따라 준비해야 합니다. 연구 내 QC 샘플은 주기적으로 주입해야 하며, 전체 주입 용액의 약 10%를 구성해야 합니다.
VAMS 팁을 다루는 것은 이 워크플로우에서 가장 중요한 단계 중 하나입니다. 분석물의 손실을 유발할 수 있으므로 팁이 마이크로 원심분리 튜브 내부 외의 다른 표면에 닿지 않도록 하는 것이 중요합니다. 또한, 적절한 분석물 추출을 위해서는 사전 하이드레이션 단계가 필수적입니다. 초기 재하이드레이션은 침전 전 분석물 방출을 용이하게 하여 회수율을 높이는 것으로 보이지만, 유기 용매를 직접 첨가하면 팁 구조 내에서 즉각적인 단백질 침전이 일어나 물리적 장벽이 형성되어 이후의 대사체 추출이 제한될 것이라는 가설이 있습니다.
또한, 원심분리 단계 전에 팁을 반드시 제거해야 합니다. 이 과정에서 용액의 소량이 손실될 수 있으나, 팁을 제거하지 않으면 상층액 회수에 영향을 줍니다. 팁이 침전물을 쉽게 재부유시켜 깨끗한 상층액을 수집하는 것이 불가능해질 수 있습니다.
최상의 결과를 얻기 위해 안정성과 관련된 몇 가지 일반적인 주의 사항을 고려해야 합니다. 우선, 샘플은 분석 시점까지 냉장 보관해야 하며, 가급적 −80 °C에서 보관하는 것이 좋습니다. 샘플의 해동은 얼음 수조(ice bath) 또는 냉장고에서 수행하는 것이 권장됩니다. 분해를 방지하기 위해, 샘플을 가능한 한 빨리 크로마토그래피 시스템에 주입하는 것이 좋습니다. 다만, 시간 제약으로 인해 즉시 주입이 불가능한 경우, 건조된 추출물을 하룻밤 동안 냉동 보관해도 안정성에 큰 손실 없이 보존할 수 있습니다.
GC-MS 워크플로우의 일부 단계 또한 강조되어야 합니다. 유도체화 과정은 두 단계로 구성됩니다. 첫 번째 단계는 메톡시아민화(methoxyamination)로, 보호되지 않은 상태에서 이산화탄소로 카르복실 손실이 일어나는 케톤 그룹을 보호합니다. 그 다음으로 트리메틸실릴화(trimethylsilylation)가 이어집니다. MSTFA는 카르복실, 히드록실, 아미노, 이미노 및 설포닐 그룹에서 흔히 볼 수 있는 산성 양성자를 포함하는 분자와 반응합니다. 이러한 반응은 분석물의 극성을 감소시키고 크고 방해되는 그룹을 도입하여 끓는점을 낮춥니다23. 물은 분석물 보호를 방해할 수 있으므로 메톡시아민을 추가하기 전에 샘플을 완전히 건조시키는 것이 매우 중요합니다. 또한 오븐에서 꺼낸 후 샘플을 실온에서 안정화시키는 것이 중요한데, 그전에 바이알을 열면 휘발성 대사물이 손실될 수 있기 때문입니다. 더욱이, 가열 시 GC 캡이 팽창하여 바이알의 밀봉이 부적절해지고 시간이 지남에 따라 분석물이 손실될 수 있습니다. 이러한 이유로 모든 배양 단계 후에 GC 캡을 교체하는 것이 권장됩니다.
그럼에도 불구하고, GC-MS 프로토콜과 관련하여 유도체화 시간에 대한 몇 가지 고려 사항이 있습니다. 대사물질은 오븐에서 꺼낸 후에도 계속 반응하며, 4 h 후에 농도가 정체기에 도달하는 것으로 나타났습니다. 이 정체기는 완전한 유도체화 후 최대 24 h 동안 안정적으로 유지됩니다30,31. 따라서 MSTFA와의 반응 후 유도체화된 샘플이 자동 시료 주입기(autosampler) 내에 28 h 이상 머물지 않도록 샘플 준비 과정을 구성하는 것이 매우 중요합니다. 분석 배치 규모가 큰 경우에는 샘플 준비의 일간 변동성을 줄이고 모든 샘플의 분획을 QC 믹스에 통합할 수 있도록 모든 샘플을 동시에 준비하는 것을 권장합니다. 샘플은 건조 잔류물 상태로 −80 °C에서 보관할 수 있으며, 향후 24 h 이내에 분석할 샘플만 해동하여 유도체화해야 합니다27. 또한, 냉동고 내에서 샘플이 수분을 흡수하는 것을 방지하기 위해 바이알을 실험실용 필름으로 덮는 것이 좋습니다. 마지막으로, 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위해 새로 조제한 유도체화 용액을 사용하고, 두 방법론 모두에서 대사체 분석의 품질 보증을 위한 일반 지침을 따를 것을 권장합니다32.
현재의 워크플로를 전통적인 혈장 분석과 비교하는 것은 본 연구의 범위를 벗어나지만, 이 주제는 문헌에서 광범위하게 연구되었습니다17,18,19,20,21,27. 일반적으로 VAMS 장치는 혈장과 비교 가능한 정성적 프로파일을 제공하지만, 동일한 부피(20 µL)에서도 분석물별로 매트릭스 간에 함량이 다르게 나타납니다. 이러한 차이는 BµS에 존재하는 세포 성분, 모세혈관혈과 정맥혈의 차이, 또는 분석 시 건조 매트릭스로 인한 간섭 때문일 가능성이 큽니다. 따라서 BµS 장치에서 얻은 결과물을 임상 실무에 적용하기 전 검증 과정이 반드시 필요합니다.
제안된 프로토콜을 일상적인 고처리량 실험실 워크플로우에 맞게 조정하려면 몇 가지 수정 사항과 문제 해결 전략을 적용할 수 있습니다. 우선, 특히 대량의 QC 샘플을 준비할 때 추출 용매의 부피를 늘릴 수 있습니다. 다만, 추출 부피를 늘리면 샘플이 본질적으로 희석되어, 이후의 재구성 부피를 비례적으로 조정하지 않을 경우 강도가 감소할 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 또한, 액체 크로마토그래피를 위한 재구성 용매 조성은 특정 기기 구성의 초기 이동상 기울기에 맞게 최적화할 수 있습니다.
이 프로토콜의 주요 제한점은 시료 크기가 작다는 것입니다. 단일 20 µL 시료를 두 개의 서로 다른 시스템에서 분석하기 위해 분할하므로, 함량이 낮은 화합물은 민감도가 낮은 기기에서 검출 한계 미만으로 떨어질 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 단점보다는 BµS가 제공하는 시료 채취의 편의성과 상호 보완적인 기술을 통해 얻을 수 있는 더 넓은 화학적 커버리지가 더 큰 이점을 제공합니다. 또한, 프로토콜의 증발 단계가 이론적으로 휘발성 화합물의 손실을 유발할 수 있지만, 휘발성 물질에 미치는 실제 영향은 평가되지 않았습니다. 하지만 증발 과정은 시료 유도체화에 필수적이며, 더 적은 부피로 재구성하여 LC 민감도를 높일 수 있으므로, 실질적인 이점이 잠재적인 신호 손실보다 더 큽니다. 이전 연구들에서 비표적 마이크로시료 분석을 다루었으나7,11,12,13,15,17,18,19,20,27 저자들이 알기로 이 프로토콜은 단일 추출물로부터 LC 및 GC-MS 분석 전체를 통해 체적 흡수 마이크로샘플링(VAMS) 장치를 분석하는 최초의 완전한 워크플로우입니다.
또한, 추가적인 지표를 평가한다면 이러한 결과들을 더욱 강화할 수 있을 것입니다. 우선, 완전히 동일한 이중 플랫폼 프로토콜을 사용한 다기관 비교를 통해 결과를 검증함으로써 방법의 강건성을 확인하고, 서로 다른 LC-MS 및 GC-MS 기기 간의 성능을 평가할 수 있을 것입니다. 아울러, 본 연구에서는 시료 조제 또는 시료 수집 과정에서의 분석자 간 변동성을 평가하지 않았습니다. 마지막으로, 시료의 무결성에 미치는 저장 효과와 헤마토크리트 효과를 탐색하는 추가 분석은 본 연구가 확장될 수 있는 핵심 분야입니다. 비표적 분석에서는 대사체 커버리지의 폭과 시료 간의 상대적 비교를 우선시하므로, 다양한 화학적 분류에 걸친 특정 대사체의 개별적 차이가 데이터의 타당성을 훼손하지는 않습니다. 따라서 헤마토크리트 및 저장 효과는 이러한 관점에서 연구되어야 합니다. VAMS 장치가 −80 °C에서 6개월 동안 안정적으로 유지됨을 보여준 Volani 등(2023)의 연구24 외에는 관련 데이터가 부족한 실정입니다.
공개 사항
저자들은 이 논문의 내용과 관련하여 선언할 이해관계 충돌이 없음을 밝힙니다.
감사의 글
본 연구는 HUMAN-HORIZON-MSCA-2021-DN-01의 지원을 받았습니다. 이 프로젝트는 유럽 연합 Horizon 2020, Marie Curie Actions의 지원금(그랜트 번호 101073062)을 통해 수행되었습니다. 저자들은 영상 촬영 기간 동안 도움을 준 Dominiki Gallou에게 감사의 뜻을 전합니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 유리 바이알 | 실험실 솔루션 | ACSV0902A | GC 분획의 이송 및 증발, 유도체화 반응 수행, 그리고 최종 GC 주입에 사용됩니다. |
| 아세토니트릴 (AcN) | VWR BDA Chemicals | BDH92497.320 | LC-MS 등급. 추출 용매 성분으로 평가됨. |
| D27-미리스틱산 | Sigma Aldrich | 366889 | 추출 효율과 분석 성능을 모니터링하기 위해 메탄올 추출 용매에 첨가되었습니다. |
| DBS-5 모세관 컬럼 (5% - 페닐-메틸-폴리실록산) | Agilent Technologies | 122-5332UI | GC-MS 분석을 위해 GC 오븐에 장착된 가스 크로마토그래피 모세관 칼럼. |
| Eppendorf Concentrator plus | Eppendorf | 5.3E+09 | 보관 또는 재구성/유도체화 전, 시료 상층액을 완전히 건조시키기 위해 사용한다. |
| 지방산 메틸 에스테르 표준 혼합물 | Sigma Aldrich | SMB00937-1ML | GC 주석 처리를 위한 대사체들의 머무름 지수(retention indexes)를 얻는 데 사용됩니다. |
| 포름산 | VWR BDA Chemicals | PI85178 | LC-MS 등급. RP-LC-MS의 이동상 A 및 B에 0.1% 첨가제로 사용됨. |
| HSS T3 C18 컬럼 (100 mm x 2.1 mm, 1.7 µm) | Waters Corporation | 1.9E+08 | RP-LC-MS/MS 분석을 위해 컬럼 오븐에 설치된 역상 액체 크로마토그래피 컬럼. |
| 이소프로판올 | 화학 실험실 | CL00.0926.2500 | LC-MS 등급. 씰 세척액(seal wash solution)의 성분(H2O:이소프로판올 80:20 v/v). |
| 랩필름 | 파라필름 | PM-996 | -도에서 보관하는 동안 바이알을 감싸고 덮는 데 사용됨80°C 습기 유입을 방지하기 위해. |
| 메탄올(MeOH) | VWR BDA Chemicals | AA47192-K2 | LC-MS 또는 GC-MS 등급. 추출 용매 최적화, 내부 표준물질 조제 및 이동상으로 사용됨. |
| 메톡시아민 염산염 | Sigma Aldrich | 89803 | 케톤/카르보닐기를 보호하기 위한 메톡시아민화 제제(피리딘 내 40 mg/mL)를 준비하는 데 사용됨. |
| 마이크로 인서트 | 실험실 솔루션 | ACIV300IC | 주입 전 용액을 담아두는 데 사용됩니다. |
| Mitra 혈액 미세샘플링 (BµS) 장치 20 µL | Neoteryx / Trajan Scientific and Medical | 200004 | 정확한 소량 혈액 검체 수집에 사용되는 부피 측정 흡수식 미세 샘플링(VAMS) 폴리머 팁. |
| N-메틸-N-(트리메틸실릴)트리플루오로아세트아미드 (MSTFA) | Restek | 35601 | 산성 양성자와 반응하여 분석물의 극성과 끓는점을 낮추는 데 사용되는 실릴화 시약. |
| 오븐 | Heraleus | 8.1E+09 | 유도체화 반응에 사용됨: 메톡시아민화(methoxyamination) 반응 시 30°C 90분 동안 처리하고, 다음 온도에서 트리메틸실릴화(trimethylsilylation)를 수행합니다. 37°C 30분 동안. |
| 펜타데칸 | Sigma Aldrich | K2015R | 6.25 mg/L 농도로 준비합니다. 주입 품질을 검증하기 위해 최종 GC 바이알로 옮기기 전 각 시료에 첨가합니다. |
| Pro-Research 냉장 원심분리기 | Centurion Scientific Lab | CL00.1688.2500 | ~까지 냉각 가능 4°C 최대 10,000 x g의 속도까지 도달하며. |
| 피리딘 | Sigma Aldrich | 23053 | 무수 등급. 1차 유도체화 단계에서 methoxyamine hydrochloride를 용해하는 데 사용되는 용매. |
| 라운드 바텀 마이크로원심분리 튜브 | FL 메디컬 | TS-88530 | 재수화, 추출 및 원심분리 과정 동안 VAMS 팁을 분리하고 보관하는 데 사용됩니다. |
| 트리메틸클로로실란 (TMCS) | Alfa Aesar | 제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요. | 유도체화 촉매. MSTFA에 1% v/v 비율로 첨가함. |
| 핀셋 | 제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요. | 제공된 소스 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요. | 튜브에서 VAMS 팁을 조심스럽게 제거하는 데 사용됩니다. 시료 간에 반드시 메탄올로 세척해야 합니다. |
| 초순수 (H2O)2O) | Hydrolab 탈이온수 제조장치 (Straszyn, 폴란드) | 해당 사항 없음 | 18.2 MΩ·cm 비저항. 팁 재수화, 추출 혼합물 및 이동상 A에 사용됨. |
| 초음파 세척기 Sonorex Digitec DT | 반델린 | 해당 사항 없음 | 30~60분 동안 교반기(agitation table)를 사용하는 대신, 얼음욕(ice bath)을 사용하여 10분 동안 추출하는 옵션에 사용됩니다. |
| 일회용 접촉 활성 란셋 (1.5 mm 깊이) | [회사 — 확인해 주십시오. | [카탈로그 번호 # — 확인 부탁드립니다] | 모세혈관 혈액 채취를 위한 손가락 천자 시 사용함(단계 1.3). |
| 에탄올 용액 (70%) | [회사 — 확인해 주십시오. | [카탈로그 번호 # — 확인해 주십시오. | 채취 전 손끝을 소독하는 데 사용함(단계 1.2). |
| LC-QTOF-MS 시스템 (Bruker Elute LC와 사중극자 비행시간형 질량 분석기가 결합된 시스템) | Bruker | [카탈로그 번호 # — 확인해 주십시오] | RP-LC-MS 분석(섹션 5)에 사용된 역상 LC-MS 시스템; 이전에 재료 표(Table of Materials) 항목 없이 고찰(Discussion) 본문에 직접 명시됨. |
| GC-MS 시스템 (Bruker EVOQ-456) | Bruker | [카탈로그 번호 # — 확인해 주십시오 | GC-MS 분석에 사용된 가스크로마토그래피-질량분석 시스템 (섹션 6); 이전에는 고찰 본문에서 별도의 명칭 없이 직접 언급됨 재료 항목의 bb. |
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