방법 논문

고처리량 항바이러스 스크리닝을 위한 무표지 실시간 임피던스 기반 방법

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DOI:

10.3791/72539

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2026년 9월 3일

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1Vanderbilt Center for Antibody Therapeutics, Vanderbilt University Medical Center, 2Agilent Technologies, Inc., 11011 N Torry Pines, 3Department of Pathology, Microbiology and Immunology, 4Department of Pediatrics, Vanderbilt University Medical Center

이 논문에서

요약

임피던스 기반의 실시간 세포 분석(RTCA) 방식은 바이러스로 인한 세포병성 효과를 실시간으로 표지 없이 정량화할 수 있게 하여, 통합된 소프트웨어 구동 분석 워크플로우를 통해 항바이러스 화합물 및 단일클론 항체를 신속하게 평가하는 방법을 제공합니다.

초록

임피던스 기반 기술은 전통적인 엔드포인트 분석이나 시각적 주관적 분석의 한계를 극복하여, 세포 배양 단층에서 세포 변성 효과(CPE)를 정량화할 수 있는 강력하고 객관적인 수단을 제공합니다. 세포 용해성 바이러스는 일반적으로 감염된 배양 세포에 뚜렷한 형태학적 변화와 세포 사멸을 유도하므로, 세포 부착, 형태 및 생존율의 변화를 반영하는 임피던스 측정은 바이러스 감염과 진행을 나타내는 민감하고 역동적인 지표가 됩니다. 결과적으로 임피던스 기반 판독법은 항바이러스 중재의 보호 효과를 평가하는 강력하고 효율적인 접근 방식을 제공합니다. 본 연구에서는 고급 임피던스 측정 시스템을 활용하여 바이러스로 유도된 CPE를 지속적으로 모니터링하는 실시간 무표지 스크리닝 플랫폼을 제시합니다. 이 접근 방식은 추가적인 표지나 염색 단계 없이도 저분자 화합물 약물과 단클론 항체 모두에 대해 항바이러스 효능을 신속하고 정량적으로 평가할 수 있게 합니다. 본 프로토콜은 세포 파종 및 바이러스 감염부터 데이터 획득 및 분석에 이르기까지 전체 분석 워크플로우를 상세히 설명합니다. 또한, 바이러스학 응용 분야에 특화되어 시스템에 통합된 소프트웨어는 데이터 처리 및 해석 과정을 효율화하여, 단클론 항체의 중화 효능과 항바이러스 화합물의 활성 결정을 용이하게 합니다.

서론

바이러스성 질환의 발생 위협에 직면했을 때, 백신과 항바이러스 치료제는 바이러스 전파를 제한하고 감염된 환자를 치료하기 위한 주요 전략이 됩니다1. 백신은 면역 체계가 병원체를 인식하도록 유도하여 감염을 예방하며, 선제적이고 장기적인 보호를 제공합니다. 항바이러스 치료제는 약물의 양상과 설계에 따라 다양하게 활용됩니다. 백신과 마찬가지로, 단클론 항체는 선제적이고 지속적인 보호(수주에서 수개월)를 제공할 수 있으며, 노출 후 제어 도구로도 사용할 수 있습니다. 단클론 항체와 항바이러스 소분자 치료제 모두 바이러스 구성 성분을 직접 표적하거나 억제함으로써 기성 감염을 치료하는 데 사용되며, 이를 통해 질병의 중증도를 낮추고 반응적이며 단기적인 개입 수단으로 작용합니다.

생물학적 시스템에서 항바이러스 활성을 기능적으로 평가하는 전통적인 방법은 바이러스 감소 중화 시험(VRNT)으로, 이는 플라크 감소 중화 시험(PRNT)에서의 플라크 형성 감소, 초점 감소 중화 시험(FRNT)에서 면역 염색을 통한 초점 via 감소, 또는 세포 생존력 기반 분석을 이용한 세포병성 효과(CPE)를 정량화합니다. PRNT는 광범위한 바이러스 감염에 대한 항바이러스제의 억제 활성을 결정하는 표준 표현형 방법으로 간주됩니다2. 하지만 PRNT는 시간이 많이 소요되고 노동 집약적이며, 특히 장시간 배양 동안 플라크의 과성장이나 융합이 발생할 때 결과 해석이 주관적일 수 있습니다. 분석 판독의 객관성은 바이러스 특이적 항원 또는 리포터 유전자 발현 검출에 의존하는 FRNT를 사용하여 개선될 수 있습니다. 그러나 이 방법은 고품질 항체나 검출 효소의 가용성 및 성능에 의해 제한될 수 있습니다. CPE의 특정 측면을 측정하는 세포 생존력 평가를 위해 여러 시약과 분석 프로토콜이 잘 확립되어 널리 사용되고 있습니다. 살아있는 세포 내 미토콘드리아 탈수소효소에 의한 모노-테트라졸륨 염 MTT 비색 시약(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide)의 효소적 환원은 유색 포르마잔 생성물에 의한 정량 가능한 비색 신호를 생성합니다. 생존력 분석 시약(세포를 용해하고 세포 내 ATP를 방출하여 루시페라아제 촉매 반응을 유도함으로써 기질인 루시페린을 옥시루시페린으로 전환함)은 균질 발광 분석법입니다. 이러한 세포 생존력 분석은 항바이러스제 스크리닝 과정에서 CPE의 감소를 정량화하는 데 사용될 수 있습니다3. 그러나 이러한 방법들 또한 여러 번의 세척 및 염색 단계가 필요하며, PRNT 및 FRNT 분석과 마찬가지로 종말점 분석입니다. 결과적으로, 바이러스 감염에 대해 지연된 효과를 나타내는 부분적으로 효과적인 항바이러스제의 경우, 항바이러스 분석이 최적이 아닌 시점에 종료되면 간과될 수 있습니다. 따라서 바이러스 감염에 대한 세포 반응을 실시간으로 모니터링할 수 있는 자동화된 중-고처리량 분석법에 대한 강력한 필요성이 있습니다.

실시간 세포 분석(RTCA) 시스템은 라벨이 필요 없는 비침습적 임피던스 기반 판독법을 통해 허용성 세포 모델에서 CPE 발달과 항바이러스 반응을 지속적으로 모니터링할 수 있게 해줍니다. 바이러스로 유도된 CPE는 세포 사멸뿐만 아니라 세포 형태 및 부착의 변화를 포함하며, 이러한 모든 변화는 전기적 임피던스의 변화를 통해 민감하게 검출될 수 있습니다4,5. 이러한 임피던스 측정은 특수 제작된 96-well 세포 배양 플레이트에 내장된 금 미세전극 센서를 사용하여 이루어지며, 라벨이나 리포터 유전자 발현 없이도 역동적인 세포 반응을 정량적으로 평가할 수 있게 합니다. RTCA 기술은 다양한 가족군에 속하는 바이러스에 감염된 여러 세포 모델에서의 CPE 검출과 항체 중화 활성 평가에 널리 보고되었습니다6–10.

본 연구에서는 실시간 및 무표지(label-free) 임피던스 기반의 이 방법의 핵심 단계들을... 체외(in vitro) 항바이러스 분석법이 정의되었습니다. 이러한 접근 방식은 아데노바이러스 5(adenovirus 5)에 감염된 HEK293A 세포에서 항바이러스 화합물을 스크리닝하고, Vero CCL-81 세포에서 라사 당단백질을 발현하는 복제 가능 재조합 수포성 구내염 바이러스(rVSV-LASV(Lin IV))를 사용하여 중화 항체를 평가한 이전 연구들을 바탕으로 설정되었습니다.11이 모든 실험은 최대 6개의 실험을 동시에 수행할 수 있는 RTCA MP 시스템에서 진행되었습니다.× 96-웰 플레이트를 동시에 처리할 수 있습니다. 본 연구의 목적은 임피던스 기반의 항바이러스 스크리닝을 위한 기초를 확립하는 것이었습니다. 본 프로토콜을 통해 최적의 분석 조건이 정의되면, 이 방법은 광범위한 바이러스-세포 모델로 쉽게 확장 적용될 수 있습니다.

프로토콜

사용된 시약 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 허용성 세포 배양 및 계대 배양

참고: 본 프로토콜에서는 항체 중화를 위해 Vero CCL-81 세포를 사용하며, 항바이러스 화합물 스크리닝에는 HEK293A 세포를 사용합니다. 실험 간 편차를 줄이기 위해, 동일한 계代的 수준의 허용성 세포(permissive cells)로 세포 은행을 구축하여 분석에 사용하는 것을 강력히 권장합니다.

  1. 사용 전 10% fetal bovine serum (FBS)와 1% penicillin–streptomycin이 첨가된 세포 성장 배지인 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)을 37°C 항온수조에서 예열한다.
  2. 동결 보존된 허용성 세포(permissive cells) 바이알을 37°C 항온수조에서 작은 얼음 결정만 남을 때까지 해동한다. 이때 바이알 캡이 물에 잠기지 않도록 주의한다. 
  3. 해동된 세포가 들어있는 바이알의 외부를 70% 에탄올로 닦아낸 후 생물안전작업대(BSC) 내로 옮긴다.
  4. 세포를 새로운 50 mL 원심분리관으로 조심스럽게 옮기고, 따뜻한 성장 배지 9 mL를 방울방울 떨어뜨려 추가한다. 가볍게 혼합한다.
  5. 세포 현탁액을 실온(RT)에서 200 × g로 5분 동안 원심분리한다.
  6. 재현탁된 세포를 예열된 성장 배지 5 mL와 함께 새로운 T-25 플라스크로 옮긴다.
  7. 다음 세포 계대 배양 전까지 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 세포를 80%–90% 밀집도(confluency)까지 배양한다. 
  8. 세포를 계대 배양한다.
    1. 배지를 흡입하여 제거하고, 잔류 성장 배지를 제거하기 위해 1× calcium- and magnesium-free Phosphate-Buffered Saline (PBS) 3 mL로 세포 단층을 두 번 부드럽게 세척한다.
    2. 세포가 충분히 덮이도록 0.25% trypsin-EDTA 2 mL를 플라스크에 첨가한다.
    3. 37°C에서 2~5분 동안 배양한 후, 예열된 성장 배지를 5배 부피로 첨가하여 트립신을 중화시킨다.
    4. 플라스크 벽면을 따라 세포 현탁액을 피펫으로 부드럽게 상하로 섞어 세포를 재현탁한다.
    5. 새 배지를 사용하여 원하는 세포 파종 밀도 또는 분할 비율로 세포를 파종한다. 
      참고: 원하는 세포 파종 밀도는 세포 성장률, 계대 빈도 및 계대 시점의 목표 밀집도에 따라 경험적으로 결정한다. 예를 들어, Vero CCL-81 세포를 최소 0.4 × 104 cells/cm2 밀도로 파종하면 90% 밀집도에 도달하기 전인 3일마다 계대 배양할 수 있다.

2. 항바이러스제 스크리닝

참고: 그림 1 임피던스 기반 항바이러스 스크리닝 분석의 워크플로를 보여줍니다. 간단히 설명하면, 허용 세포(permissive cells)를 미세전극이 통합된 96-웰 마이크로플레이트에 분주하고, 분석 전 약 24시간 동안 세포의 상태를 모니터링합니다. 항체 중화 시험의 경우, 고정된 감염 다중도(MOI)의 바이러스를 항체와 혼합하여 1시간 동안 사전 배양한 후 세포에 첨가합니다. 반면, 항바이러스 화합물 스크리닝의 경우, 고정된 MOI의 바이러스와 화합물을 세포에 동시에 첨가합니다. 바이러스로 유도된 세포병변효과(CPE)는 임피던스 기반 판독값으로 지속적으로 모니터링하며, 데이터 분석은 분석 진행 중 또는 완료 후에 수행할 수 있습니다.

  1. 0일 차: 플레이트 배경값 측정 및 허용 세포 파종
    1. 실험을 시작하려면 기기 소프트웨어를 엽니다(RTCA Pro)에서 분석에 사용할 원하는 크래들을 선택하십시오. 다음으로, 바이러스학 실험을 시작하기 전 모듈을 준비하십시오.
    2. 관련 참고 사항을 입력하십시오. 실험 노트 탭 (예: 실험 이름, 기기 일련번호, 장치 유형, 또는 기타 관련 세부 사항). 이 필드들은 선택 사항이며 해당 사항이 없는 경우 빈칸으로 둘 수 있습니다.
    3. ~로 이동하십시오. 레이아웃 실험에 사용할 웰을 탭하고 정의하십시오. 사용하지 않을 특정 웰이 있는 경우, 해당 미사용 웰을 선택하고 플레이트 레이아웃 인터페이스 내에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭한 후 선택하십시오. 웰 끄기 드롭다운 메뉴에서 해당 항목을 선택하여 분석에서 제외하십시오.
    4. 마이크로전극 통합 96-웰 마이크로플레이트 배경 측정
      1. 분주하십시오 50 µL 기포 형성을 최소화하기 위해 멀티채널 피펫의 역피펫팅(reverse pipetting) 모드를 사용하여 플레이트의 각 웰에 분석 매질을 분주합니다.
        참고: 분석 민감도에 대한 간섭을 최소화하고 치료 효능을 정확하게 평가하기 위해 스크리닝 전 분석 배지 선택을 최적화해야 합니다. 예를 들어, 항체 중화 분석은 2% FBS와 1% penicillin–streptomycin이 함유된 DMEM에서 수행한 반면, 항바이러스 화합물 스크리닝 분석에는 세포 성장 배지인 10% FBS와 1% penicillin–streptomycin 함유 DMEM을 사용하였습니다.
      2. 플레이트를 기기 내부의 플레이트 거치대에 놓으십시오. 37 °C 5% CO2 인큐베이터2플레이트의 A1 웰이 표시된 위치에 오도록 정확하게 배치하십시오. 그다음, 메시지(Message) 탭에서 오류 알림이 있는지 확인하십시오.
        참고: 플레이트를 크래들에 배치할 때마다 "Plate scanned. Connections okay"라는 메시지가 표시되는지 확인하십시오. 오류가 발생하면 플레이트를 제거한 후 크래들에 다시 안착시키십시오.
      3. ~로 이동하십시오. 일정 탭; 플레이트 배경 측정에 필수적인 단계이므로 기본적으로 1단계가 표시됩니다. 다음을 클릭하십시오. 시작 웰에서 기록을 시작하는 버튼입니다. 단일 배경 임피던스 측정값이 기록되면 해당 단계가 자동으로 종료됩니다.
        참고: 이 배경 단계는 각 실험 전에 반드시 수행되어야 합니다. 실험에 사용되는 모든 웰에는 분석 배지만 포함되어 있어야 합니다(즉, 세포 파종 전).
    5. 미세전극 통합 96-웰 플레이트로의 허용적 세포 시딩
      1. 허용 세포 계대 배양 섹션에 기술된 단계에 따라 T25 플라스크 내의 허용 세포를 트립신 처리하십시오.
      2. 분석 배지에 재현탁된 세포 수를 측정하고 다음 계산을 수행하십시오.
        1. 생존 세포 밀도를 사용하여 현탁액 내의 총 생존 세포 수를 계산하십시오: 총 생존 세포 수 = 생존 세포 밀도 × 현탁액 부피
        2. 세포 현탁액을 최종 밀도(예: 0.30–0.35)로 조정하십시오. × 106 Vero CCL-81의 mL당 세포 수로, 이는 mL당 약 15,000–18,000개의 세포에 해당함 50 µL또는 0.12 × 106 HEK293A의 경우 mL당 cells, 이는 mL당 6,000 cells에 해당함 50 µL).
          참고: 이러한 세포 파종 밀도는 각 바이러스-세포 모델에 대해 최적임이 이전에 결정되었습니다. 세포를 너무 많이 또는 너무 적게 사용하면 분석 민감도에 영향을 줄 수 있으므로, 적절한 세포 파종 밀도를 유지하는 것이 중요합니다.
      3. ~이 포함된 마이크로플레이트를 제거하십시오. 50 µL 기기에서 분석 배지를 꺼내 세포 파종을 위해 생물안전작업대(BSC)로 옮깁니다.
      4. 분주하십시오 50 µL 기포 발생을 최소화하기 위해 멀티채널 피펫의 역피펫팅(reverse pipetting) 모드를 사용하여 각 웰에 세포 현탁액을 분주하여, 각 웰의 최종 부피를 다음과 같이 맞춥니다. 100 µL.
    6. 세포를 첨가한 후, 각 웰의 바닥에 세포가 균일하게 분포될 수 있도록 플레이트를 생물안전작업대(BSC) 내 실온(RT)에 30분 동안 둡니다.
    7. 플레이트를 장비 내부의 크래들에 다시 넣으십시오. 37 °C 5% $\text{CO}_2$ 배양기2.
      참고: 여러 개의 플레이트를 사용하는 경우, 각 플레이트에 명확하게 라벨을 부착하고 배경 측정 시 사용했던 것과 동일한 크래들에 다시 배치하십시오.
    8. ~로 이동하십시오. 레이아웃 탭을 클릭하여 다음을 엽니다. 세포 하위 탭. 적절한 웰을 선택하고, 허용 세포(permissive cell)를 입력하십시오. 이름 그리고 번호, 그리고 클릭하십시오 적용하십시오 정보를 저장하십시오. 세포 정보는 실험 중 어느 시점에서든 입력하거나 업데이트할 수 있습니다.
    9. ~에 단계 2를 추가하십시오. 일정 기본 기록 설정(100회 스윕 및 15분 간격)을 사용하여 탭한 다음, 클릭하십시오. 시작 세포 부착 및 증식의 연속적인 야간 모니터링을 시작하기 위해.
      참고: 이 단계는 바이러스 접종 전 세포 품질 관리(QC) 조치로 활용됩니다. 세포 지수(Cell Index, CI)는 세포의 부착 및 증식을 반영하므로, 세포 파종 후 18~24시간 동안 얻은 CI 값이 핵심 QC 지표로 사용됩니다. 분석의 재현성을 최적화하기 위해서는 실험 전반에 걸쳐 세포 거동이 일관되게 나타나는 것이 필수적입니다. 특히 CI의 진폭과 역학 프로필은 세포 유형에 따라 다릅니다. 예를 들어, 18,000 cells/well의 밀도로 파종하여 하룻밤 동안 배양한 건강한 Vero CCL-81 세포는 일반적으로 6~8의 세포 지수를 나타내며, 6,000 cells/well의 밀도로 파종한 건강한 HEK293A 세포는 일반적으로 0.8~1.2의 세포 지수를 나타냅니다.
  2. 1일 차: 임피던스 기반 항바이러스제 스크리닝
    참고: 스크리닝 분석을 수행하기 전, 최적의 작동 희석 배수를 결정하기 위해 바이러스의 역가를 적절히 측정해야 합니다. 이 단계는 사용자가 정의한 요구 사항(예: 원하는 분석 소요 시간)을 충족하면서도, 견고하고 재현 가능한 분석 성능을 뒷받침하는 바이러스 농도를 설정하는 과정입니다. 예를 들어, 항체 중화 프로토콜에서...11중화 시험에서는 접종 후 40시간 이내에 완전한(100%) 세포병변효과(CPE)가 나타났으므로, 감염다중도(MOI)를 0.01로 설정하였다. 임피던스 기반 시험에서 완전한 CPE는 세포 지수(Cell Index) 또는 정규화된 세포 지수(Normalized Cell Index)가 0으로 감소하는 것으로 나타난다. 항바이러스 화합물 스크리닝 중에는 MOI를 1로 사용하였으며, 접종 후 70시간 이내에 100%의 CPE가 관찰되었다. 바이러스 역가 측정 프로토콜은 이전 보고서에 기술된 확립된 절차를 따랐다.12분석에 감염성 바이러스가 사용되는 경우, 모든 해당 안전 예방 조치를 준수하십시오. 감염성 바이러스 취급 안전 지침 섹션을 참조하십시오.
    1. 바이러스를 미리 결정된 농도로 준비하고, 분석 배지 내에서 항체 또는 항바이러스 화합물의 연속 희석액을 준비하십시오.
    2. 단클론 항체 중화 분석을 위해 다음을 혼합하십시오. 60 µL 4에서의 바이러스× ~를 포함한 최종 분석 농도 60 µL 4°C에서 항체(의)× 최종 분석 농도로 맞춘 후 다음 조건에서 배양하십시오. 37 °C 허용 세포(permissive cells)에 첨가하기 전 1시간 동안 유지합니다. 혼합 후, 바이러스와 항체는 2에 존재합니다.× 최종 분석 농도입니다. 이와 대조적으로, 항바이러스 화합물 스크리닝 분석에서는 바이러스와 화합물의 사전 배양이 필요하지 않습니다.
    3. ~로 이동하십시오. 레이아웃 탭하여 다음을 선택하십시오. 처치 적절한 웰(well)에 항바이러스제 처리 정보를 입력하기 위한 하위 탭.
    4. 동일한 처리군의 웰을 선택한 후, 다음을 입력하십시오. 이름 시약의 양을 입력하고 시작을 누르십시오. 희석 또는 농도예를 들어, 시작 농도가 10 µg/mL, 입력 10 그리고 선택하십시오 µg/mL ~로서단위”. 입력하십시오. 3 ~로서 희석 배수 그리고 ~을 명시하십시오. 방향 희석 방식 (예: 상단에서 하단으로).
      참고: 클릭 후 적용하십시오항바이러스제 농도 또는 희석 배수는 입력된 플레이트 레이아웃을 기반으로 자동 계산 및 저장되며, 해당 웰에 표시됩니다. 계산된 값은 이후 데이터 분석을 위해 저장됩니다. 바이러스 정보(예: 성명 및 희석)는 선택 사항입니다. 본 분석에서는 모든 바이러스 처리 웰에 대해 단일 고정 MOI를 사용하기 때문입니다.
    5. 적절한 웰을 선택하고 지정하여 바이러스만 처리한 웰을 양성 대조군으로 설정하십시오. 양성 대조군 하단에 웰 유형.
    6. 위의 설명된 단계에 따라 비감염 웰을 음성 대조군으로 지정하고 확인하십시오. 음성 대조군 하단에 웰 유형.
      참고: 바이러스 전용 웰과 비감염 웰의 정확한 지정은 양성 대조군 및 음성 대조군각각, 다음을 이용하여 웰 유형 설정은 매우 중요합니다. 이 웰(well)에서 얻은 CI 값은 모든 중화 관련 계산(예: %중화)에 사용되기 때문입니다. CPE 관련 계산(예: %CPE)의 경우에는 명시적으로 지정된 음성 대조군 웰이 필요합니다. 항체 중화 분석의 경우, 정확한 데이터 해석을 위해 동일한 플레이트에 양성 및 음성 대조군 항체를 모두 포함시키는 것을 강력히 권장합니다. 다만, 이러한 대조군 항체는 다음과 같이 지정되어야 합니다. 시료 하단에 웰 유형.
    7. 항바이러스제 첨가 준비가 완료되면, 다음을 누르십시오. 현재 단계 중단 2단계의 남은 스윕을 건너뛰고 다음 단계로 진행하는 버튼입니다.
    8. 다음을 클릭하십시오. 플레이트 잠금 해제 버튼을 누른 후, 크래들에서 플레이트를 꺼내 BSC(생물안전작업대)에 놓습니다.
    9. 천천히 분주하십시오 100 µL 멀티채널 피펫을 사용하여 바이러스-항체 혼합물 또는 바이러스-항바이러스 화합물 혼합물을 각 웰에 분주하며, 최종 웰 부피는 다음과 같습니다. 200 µL접종물은 바이러스와 항체 또는 항바이러스 화합물을 2의 비율로 포함합니다.× 최종 분석 농도로, 세포에 첨가 시 최종 작동 농도로 희석됩니다.
    10. 플레이트를 크래들에 다시 넣은 후, 다음으로 이동하십시오. 일정 탭을 누르고 단계 3을 추가하십시오. 다음의 수를 지정하십시오. 스윕(Sweeps) 그리고 그 인터발(Interva)스윕 간. 총 스윕 시간(스윕 횟수 × (간격이) 예상 치료 기간을 초과합니다. 클릭하십시오. 제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 소스 텍스트를 입력해 주세요. 데이터 수집을 재개하고 분석을 계속합니다.
      참고: 항바이러스제 투여 후 별도의 단계(예: 단계 3)를 지정하면 처리 후 모니터링 기간을 쉽게 식별할 수 있습니다. 각 단계(단계 1 제외)의 실행 시간은 예상 분석 시간보다 길게 설정하십시오. 설정된 실행 시간에 도달하면 기기가 측정을 중단하여 데이터 포인트가 누락될 수 있습니다.
  3. 1일 차 및 그 이후: 데이터 분석
    1. 데이터 수집 중 세포 반응의 실시간 기록 및/또는 분석을 검토하려면 다음으로 이동하십시오. 데이터 분석 탭에서 특정 시점 또는 시간 간격을 선택한 다음, 분석에 포함하여 플롯 차트에 표시할 웰을 선택하여 추가하십시오.
    2. 다음에서 파라미터를 선택하십시오. Y축 드롭다운 메뉴. ~할 때 정규화된 세포 지수 (NCI)가 선택된 경우, 다음을 지정하십시오. 정규화 시간시간 드롭다운 목록에서 처리 직전의 시점을 선택하십시오. %CPE 또는 %중화 Y축 드롭다운 메뉴에서 해당 옵션을 선택하여 표시할 수도 있습니다.
      참고: 해당 기기는 임피던스를 나타내기 위해 단위가 없는 파라미터인 세포 지수(Cell Index, CI)를 사용합니다. 웰 간의 고유한 편차로 인한 영향을 최소화하면서 처리 조건 간의 차이를 평가하기 위해서는 정규화된 세포 지수(Normalized Cell Index, NCI)를 사용할 것을 권장합니다.
    3. ~로 이동하십시오. 매개변수 ~에 관한 섹션 데이터 분석 특정 시점(예: 분석의 중간 지점 또는 최종 지점)에서 막대 그래프 및 4-매개변수 로지스틱(4PL, 가변 기울기) 회귀 용량-반응 곡선과 같은 다양한 유형의 수치를 계산하고 생성하는 탭. 또는 IC₅₀ 처리 후 Cell Index 또는 Normalized Cell Index의 곡선 아래 면적(AUC)으로부터 도출된 값은 처리 기간 동안 항바이러스제의 전반적인 용량-반응 측정치를 제공합니다.
    4. 테스트가 끝나면, 다음을 클릭하십시오. 일시 정지그런 다음, 다음을 누르십시오. 플레이트 잠금 해제 버튼. 플레이트를 크래들에서 제거하고 전자식으로 방출 이것 ~을 통해 그 플레이트 메뉴

3. 감염성 바이러스 취급을 위한 안전 지침

  1. 이중 장갑, 안면 보호구 및 실험복을 착용하여 적절한 개인 보호 장구(PPE)를 갖춥니다. 이는 바이러스를 취급할 때 강력히 권장됩니다.
  2. 바이러스 함유 물질의 취급 및 플레이트 첨가는 반드시 가동 중인 생물안전작업대(BSC) 내부에서만 수행합니다.
  3. 바이러스 바이알과 바이러스를 포함하는 모든 플레이트는 밀폐된 생물안전 운반 용기를 사용하여 BSC로 이동하거나 BSC에서 반출합니다.
  4. BSC 내에서 바이러스 함유 물질을 취급하기 전후로 모든 내부 표면에 소독제를 충분히 분사하고, 완전한 바이러스 불활성화를 위해 5 min 동안 접촉 시간을 둡니다. 표면을 깨끗이 닦아낸 후 70% ethanol로 소독하여 잔류 소독제를 제거합니다.
  5. 임피던스 기반 항바이러스 스크리닝 분석이 완료되면, 기기에서 모든 플레이트를 제거하여 밀폐된 생물안전 운반 용기에 담아 깨끗한 BSC로 직접 이동시킵니다.
  6. 신선한 20% 표백제 용액을 준비하여 분석 플레이트의 모든 웰에 첨가합니다. 모든 웰에서 흡입하여 제거하고 플레이트를 폐기하기 전, 표백제 상태로 10 min 동안 둡니다.
  7. 바이러스와 접촉했을 가능성이 있는 모든 분석 플레이트, 혈청학적 피펫, 피펫 팁, 튜브 및 기타 일회용 플라스틱 제품을 표백제로 오염 제거한 후, 지정된 생물학적 위험 폐기물 봉투에 폐기합니다.
  8. 튜브 랙 및 피펫과 같은 비일회용 플라스틱 제품은 소독제를 분사한 후 닦아냅니다.

결과

무표지 실시간 임피던스 리드아웃을 통한 바이러스 유도 CPE 및 항바이러스 보호 효과 확인
그림 2A에 나타낸 바와 같이, HEK293A 숙주 세포를 마이크로전극 통합 96-웰 플레이트에 웰당 6,000 cells의 밀도로 분주하였습니다13. 24시간 배양 후, 항바이러스 화합물의 존재 또는 부재 하에 MOI 1로 아데노바이러스 5형을 첨가하였습니다. 바이러스 감염 및 항바이러스 처리에 대한 세포 반응을 실시간 무표지 임피던스 측정을 통해 지속적으로 모니터링하였습니다. 바이러스가 없는 경우, 세포는 80시간의 모니터링 기간 동안 지속적으로 증식하였으며, 임피던스의 꾸준한 증가 후 고점에 도달함으로써 합류(confluence) 상태에 이르렀음을 나타냈습니다. 아데노바이러스 감염 시 초기 약 20시간 동안은 세포 성장이 허용되었으나, 이후 뚜렷한 CPE가 관찰되었으며, 이로 인해 감염 후 약 65시간까지 임피던스 신호가 기저선까지 급격히 감소하였습니다. stavudine (50 µM) 또는 ribavirin (20 µM) 처리는 바이러스 유도 CPE에 미치는 영향이 미미했으며, 임피던스 트레이스는 바이러스만 감염된 세포의 결과와 매우 유사했습니다. Ganciclovir (50 µM)는 정규화된 세포 지수(Normalized Cell Index)의 부분적인 회복을 통해 알 수 있듯이 완만한 항바이러스 활성을 보였습니다. 반면, cidofovir (50 µM)와 brincidofovir (1 µM)는 CPE를 현저히 감소시켰으며, 감염되지 않은 음성 대조군 세포에서 관찰된 것과 유사한 임피던스 프로파일을 생성하였습니다. 특히, 예비 연구에서 테스트된 농도 범위 내의 어떤 화합물도 용매 처리 대조군과 비교하여 세포 지수에 유의미한 영향을 주지 않았습니다(데이터 미제시).

임피던스 기반의 항체 중화 분석법에서, Vero CCL-81 세포를 마이크로전극 통합 96-웰 플레이트에 웰당 18,000 cells의 밀도로 분주하고 감염 전 24시간 동안 배양하였습니다. 분석 당일, 단클론 항체를 MOI 0.01의 rVSV–LASV와 1시간 동안 사전 배양한 후 세포에 첨가하였습니다. 테스트한 단클론 항체(mAbs) 전반에서 서로 다른 중화 프로파일이 관찰되었습니다. 명확한 이해를 돕기 위해, 그림 2B는 강력한, 부분적인 또는 중화 활성이 없는 항체의 대표적인 결과를 보여줍니다. 비중화 항체는 완전한 CPE를 유도하였으며, 임피던스 추적선이 바이러스 단독 대조군과 겹쳤습니다. 중간 정도의 중화 활성을 가진 항체는 바이러스로 인한 세포 독성을 부분적으로 감소시켜, 감소되었으나 감지 가능한 CPE를 나타냈습니다. 반면, 완전 중화 항체는 CPE를 완전히 억제하여 비감염 세포 대조군과 유사한 임피던스 신호를 유지하였습니다. 종합적으로, 이러한 임피던스 프로파일을 통해 비중화, 부분 중화 및 완전 중화 단클론 항체를 명확하게 구분할 수 있었습니다.

항바이러스 활성의 정량화 및 특성 분석
임피던스 기반 RTCA 어세이가 약물 및 mAb 라이브러리에서 "히트(hits)"를 식별할 수 있음을 입증한 후, 본 연구는 다음으로 리드 화합물과 항체의 효능을 특성화하고자 하였다. 항바이러스제인 brincidofovir의 농도를 15.6 nM에서 1,000 nM까지 점진적으로 증가시키면 임피던스 신호가 단계적으로 증가하며, 약물 농도가 높을수록 세포가 비감염 대조군과 유사하게 거동한다(그림 3A). 또한, brincidofovir 단독 처리 시 테스트한 가장 높은 농도(1100 nM)에서만 NCI가 미미하게 증가했다. 그러나 1100 nM 미만의 농도에서는 NCI가 완만하게 감소했으며, 이러한 효과는 용량 의존적이지 않았다. 이 결과는 Cell Index의 회복이 세포 증식이나 부착의 직접적인 강화가 아니라 오직 약물의 항바이러스 활성에 기인함을 나타낸다(그림 3B). 정규화된 Cell Index의 곡선 아래 면적(AUC)을 brincidofovir 농도의 함수로 도식화하여 용량-반응 곡선을 얻었으며, 이는 우수한 적합도(R2 = 0.99)를 보이고 IC50 값이 265 nM임을 나타낸다(그림 3C). 항체 중화 어세이에서는 어세이 종료 시점(처리 후 약 50시간)에 시스템 소프트웨어가 각 mAb 농도에서의 중화 백분율을 자동으로 계산하였으며, 이후 IC50 값을 도출하였다. 그림 3D에 나타난 바와 같이, 음성 대조군 항체인 rANDV-5와 달리 다른 세 가지 mAb인 r37.2D, r25.1C, r12.1F는 각각 4,315 ng/mL, 83 ng/mL, 232 ng/mL의 IC₅₀ 값을 가지며 높은 항바이러스 효능을 입증하였다14,15.

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그림 1: 임피던스 기반 항바이러스 스크리닝 분석법의 워크플로우 모식도. 0일차, 단계 1: 허용 세포를 마이크로플레이트에 분주하고, 5% CO2가 포함된 37 °C 인큐베이터 내의 기기 크래들에서 약 24시간 동안 세포 성장을 모니터링함. 1일차, 단계 2: 고정된 MOI의 바이러스와 항바이러스제의 연속 희석액을 준비함. 항체 중화 분석의 경우, 혼합물을 세포에 첨가하기 전 37 °C에서 바이러스와 항체를 1시간 동안 사전 배양함. 단계 3: 바이러스-항바이러스제 혼합물을 세포에 첨가함. 1일차 및 그 이후, 단계 4: 임피던스 기반 측정을 통해 바이러스로 유도된 CPE를 며칠 동안 지속적으로 모니터링함. 단계 5: 데이터를 실시간으로 또는 분석 완료 후 분석함. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 임피던스 기반 Cell Index 측정을 이용한 항바이러스 활성의 실시간 모니터링. (A) 임피던스 분석을 통해 평가한 항바이러스 약물 스크리닝. 모든 화합물은 MOI 1의 아데노바이러스 5형 존재 하에서 리바비린(20 µM)과 브린시도포비르(1 µM)를 제외하고 50 µM 농도로 테스트되었다. 데이터는 3개의 반복 웰의 평균 ± SD로 표시되었다. 이 그림은 Zhang 외 연구13에서 인용되었다. (B) 임피던스 기반 단클론 항체 중화 분석. 중화 능력이 없는(완전한 CPE, 빨간색), 부분적 중화 능력이 있는(부분적 CPE, 주황색), 또는 강력한 중화 능력이 있는(CPE 검출 안 됨, 검은색) 단클론 항체의 대표적인 Cell Index 프로파일이 표시되어 있다. 여기에서 이 그림의 확대 버전을 확인하십시오.

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그림 3: 임피던스를 이용한 항바이러스 활성 정량화. (A) MOI 1로 adenovirus type 5를 감염시킨 후 brincidofovir의 농도를 증가시키며 처리했을 때 실시간 정규화된 세포 지수(Normalized Cell Index)의 동적 변화. (B) brincidofovir 단독 처리 시 농도 증가에 따른 실시간 정규화된 세포 지수의 동적 변화. (C) 용량-반응 곡선을 얻기 위해 임피던스 추적선의 하단 면적을 brincidofovir의 함수로 도식화함. (A)와 (C)는 Zhang et al.13에서 인용 및 수정됨. (D) 단클론 항체 r37.2D, r25.1C, r12.1F 및 음성 대조군으로 포함된 rANDV-5에 대한 대표적인 rVSV–LASV Lineage IV (Josiah) 중화 곡선. 단클론 항체 37.2D, 25.1C, 12.1F 및 ANDV-5는 기존 문헌을 바탕으로 재조합 생산되었음(결과 섹션 참조). 제시된 데이터는 두 번의 독립적인 실험에서 얻은 대표적인 곡선이며, 세 개의 반복 웰(well)에 대한 평균 ± SD로 표시됨. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

모든 세포 기반 분석법과 마찬가지로, RTCA 항바이러스 스크리닝 분석은 각 바이러스-세포 시스템에 대한 최적화가 필요합니다. 이 분석법은 임피던스 변화를 통해 바이러스로 유도된 세포변성효과(CPE)를 검출하므로, 바이러스 복제와 측정 가능한 CPE를 지원하는 허용성 세포 모델에 의존합니다. 임피던스로 검출 가능한 CPE를 생성하지 않는 바이러스는 이 접근 방식에 적합하지 않을 수 있으며, 이러한 경우에는 바이러스 특이적 항체가 있을 때 FRNT와 같은 대안적인 방법을 사용할 수 있습니다. 또 다른 중요한 고려 사항은 세포 지수(Cell Index)의 변화가 오직 바이러스로 유도된 세포 용해에 의해서만 발생하는 것은 아니라는 점입니다. 세포 형태, 부착, 증식 및 결합의 변화 또한 임피던스 신호에 영향을 미칠 수 있으며, 잠재적으로 항바이러스 활성 평가를 방해할 수 있습니다. 따라서 항바이러스 제제가 세포 지수에 미치는 영향은 예비 연구나 적절한 제제 단독 대조군을 통해 평가해야 합니다. 본 연구에서는 플레이트당 평가하는 제제 수를 최대화하기 위해, 바이러스 감염이 없는 상태에서 각 후보 물질의 기저 효과를 확립하고자 스크리닝 분석 전에 항바이러스 제제 단독 대조군을 테스트하였습니다. 분석 성능은 세포 파종 밀도, 바이러스 접종 타이밍, 배지 조건과 같은 요인에 의해서도 영향을 받으며, 이는 세포 성장, 바이러스 복제, CPE 발달 및 분석 재현성에 영향을 줄 수 있습니다7,10,16. 결과적으로, 견고하고 신뢰할 수 있는 RTCA 기반 항바이러스 스크리닝을 위해서는 체계적인 최적화가 필수적입니다.

최적의 분석 조건이 설정된 후, 임피던스 기반 실시간 항바이러스 분석을 성공적으로 구현하려면 일관된 세포 시딩, 건강한 세포 상태 및 안정적인 분석 조건이 필요합니다. 웰 간의 높은 변동성은 대개 불균일한 세포 분포나 부정확한 피펫팅으로 인해 발생합니다. 따라서 세포 현탁액은 시딩 전 충분히 혼합해야 하며, 세포의 균일한 침강을 촉진하고 가장자리 효과를 줄이기 위해 시딩 후 플레이트를 RT에서 30분 동안 방치해야 합니다. 처리군당 최소 3회 이상의 반복 실험을 권장하며, 음성 대조군(비감염)과 양성 대조군(바이러스 단독)에 대한 추가 반복 실험을 강력히 권장합니다. 이러한 값들은 모든 처리 조건에서 %CPE 및 %Neutralization 계산의 기준점이 됩니다. 바이러스로 유도된 CPE가 약하거나 일관되지 않은 경우, 바이러스 스톡의 품질과 허용 세포주의 건강 상태를 확인하십시오. 바이러스의 감염력을 유지하기 위해, 각 실험에 사용할 1회분 바이러스 분주액(aliquot)을 준비하여 반복적인 동결-해동 사이클을 피하십시오. 마지막으로, 실험적 변동성을 최소화하고 분석 재현성을 높이기 위해 일관된 계대 번호의 허용 세포를 포함하는 세포 뱅크를 사용할 것을 적극 권장합니다. 감염 직전(통상 시딩 후 약 24 h)에 측정된 Cell Index가 허용 세포주의 설정 기준치보다 낮아 세포의 건강 상태나 성장이 최적이 아님이 나타나면 실험을 중단해야 합니다. 이 경우, 냉동 보존된 세포의 새 바이알을 해동하여 항바이러스 스크리닝 분석을 반복해야 합니다.

여기에 제시된 스크리닝 데이터에서 입증된 바와 같이, 잘 제어되고 최적화된 조건 하에 항바이러스 스크리닝 분석을 수행하면 임피던스 기반 분석을 통해 항바이러스제에 의한 CPE의 실시간 감소를 정확하게 정량화할 수 있습니다. 노동 집약적인 엔드포인트 측정에 의존하는 전통적인 접근 방식과 달리, 지속적이고 비침습적인 임피던스 판독은 바이러스로 인한 세포 손상의 전체 스펙트럼과 항바이러스 반응의 동역학적 프로파일에 대한 종단적 모니터링을 가능하게 합니다. 이러한 실시간 측정 능력은 초기 작용뿐만 아니라 기존의 엔드포인트 분석으로는 놓칠 수 있는 지연된 항바이러스 효과를 감지하기 위한 최적의 시간적 창을 식별하는 데 도움을 줍니다.

또한, 여기서 설명하는 RTCA 프로토콜은 기존 방법과 비교하여 항바이러스 스크리닝을 위한 더 빠르고 상당히 간소화된 워크플로우를 제공합니다. 이 분석법은 초기 세포 파종 단계와 이후 항바이러스제 존재 또는 부재 하에서의 바이러스 첨가 단계만 필요로 합니다. 추가적인 핸들링이나 분석 후 처리 과정은 필요하지 않습니다. 실험 설정 및 데이터 분석은 시스템의 맞춤형 Virology 소프트웨어 모듈을 통해 더욱 간소화되며, 이를 통해 %CPE, %neutralization 및 사용자가 정의한 중화 수준을 달성하는 항바이러스제의 최고 희석 배수 또는 최저 농도를 포함하여 VRNT에서 일반적으로 사용되는 파라미터의 자동 계산이 가능합니다. 종합적으로, 이러한 장점들을 통해 기존 방법으로는 일반적으로 불가능했던 훨씬 더 많은 분석 조건(약물 비교, 희석 범위 확장 등)을 신속하고 병렬적으로 스크리닝할 수 있습니다.

여기서 설명한 분석법은 위에서 서술한 적절한 분석 조건과 함께 96-well 플레이트 형식으로 개발되었으나, 384-well 플레이트 형식으로 조정하여 적용할 수 있습니다. 이러한 고처리량 임피던스 기반 분석을 지원하기 위해 자동화된 임피던스 기반 RTCA 시스템을 사용할 수 있으며, 이를 통해 최대 4개의 384-well 플레이트를 동시에 처리할 수 있습니다.

항바이러스 스크리닝 외에도, 이 RTCA 방법은 병용 요법 연구, 혈청학 및 바이러스 면역 회피 조사에 적용될 수 있습니다. 치료용 항체나 면역 혈청이 바이러스로 인한 CPE를 예방하는 능력을 측정함으로써, 이 분석법은 감염 또는 백신 접종 후 중화 활성 및 보호 면역 반응에 대한 무표지 실시간 평가를 제공합니다. 또한, 다양한 바이러스 변이체 간의 중화 프로필을 비교하면 면역 회피와 관련된 감수성 변화를 밝혀낼 수 있습니다. 게놈 시퀀싱과 결합할 때, 이 접근 방식은 항체 내성 변이체의 식별을 용이하게 하며 차세대 백신, 항체 치료제 및 항바이러스 전략의 개발을 지원할 수 있습니다.

공개 사항

J.E.C.는 Moderna와 Merck의 컨설턴트로 활동했으며, IDBiologics의 설립자이며, UpToDate로부터 로열티를 받고 있습니다. J.E.C.의 연구실은 해당 연구 수행 기간 동안 IDBiologics로부터 연구 내용과 무관한 후원 연구 계약을 체결하였습니다.

감사의 글

본 연구는 미국 국립보건원(NIH) 산하 국립알레르기 및 전염성질환연구소(NIAID)의 보조금 U19 AI181979 및 U19AI181930의 지원을 일부 받아 수행되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Adenovirus-GFPVector Biolabs 1060
Brincidofovir (CMX001)AdooQA13326
CaviCideMetrex13-5024소독제 
CidofovirSelleck S1516
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)ATCC30-2002
E-Plate 96Agilent5232368001미세전극 통합 96-웰 플레이트
Fetal bovine serumAvantor97068-085
Ganciclovir Sodium Selleck S5065
HEK293A 세포Thermo Fisher Scientific  R70507
Multichannel ViafloINTEGRAVIAFLO 96
Penicillin-Streptomycin 용액Gibco10378016
Phosphate buffer saline (1x)HyCloneSH30256.01
재조합 mAbsCrowe LabN/A
RibavirinSelleck S2504
rVSV-LASV (Lin IV)Crowe LabN/A
Stavudine Selleck S1398
0.25% Trypsin 0.53 mM EDTA  (1x )ATCC30-2101
12 채널 시약 저장조VistaLab Technologies3054-1011
Vero CCL-81ATCCCCL-81
Virology ModuleAgilentS2807-90089
xCELLigence RTCA MP 시스템Agilent380601040

참고문헌

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