본 영상에서는 Four Cups 행동 실험 패러다임을 사용하여 새로운 관계, 단기 관계, 및 장기 관계 사이의 사회적 인지 능력을 측정하는 상세한 절차를 설명합니다. 또한 이 패러다임의 장점과 잠재적 활용 방안은 물론, 결과를 정확하게 해석하기 위해 필요한 중요 정보 를 함께 다룹니다.
이 논문에서
요약
초록
사회적 기억은 기억하고 인식하는 능력입니다. 동종 개체. 이는 포유류 행동의 기본적인 측면으로, 생쥐나 인간과 같이 사회성이 매우 높은 포유류에게서 생존상의 이점이 있음이 입증되었다. 설치류, 특히 생쥐는 사회적 기억과 그 기저 기전을 연구하는 데 광범위하게 사용되는 확립된 동물 모델입니다. 대부분의 기존 사회적 기억 패러다임은 주로 단기적 사회적 인식을 평가하며, 여기에는 관계 지속 기간과 친밀도 수준이 포함됩니다. 피험자와 약제 사이의 5~15분 사이입니다. 따라서 기존의 패러다임은 및 이전 연구들 장기적인 관계에서 형성된 사회적 기억은 포착하지 않으며, 새로움과 단기적 친숙함의 이분법적 대립에 집중한다. 남겨두고 사회적 기억의 기전에 대한 이해에는 여전히 큰 공백이 존재합니다. 이러한 공백을 메우기 위해, 우리는 친밀도의 다양한 수준에 대한 생쥐의 반응을 포착하여 복잡한 사회적 기억 회상 과정을 관찰 및 정량화 가능한 맥락으로 전환하는 단순한 분석법을 설계했습니다. 4개 컵 패러다임에서 피실험 생쥐는 자유롭게 탐색합니다 하나의 아레나 포함하는 각 모서리에 배치된 4개의 타공 컵. 이 컵들에는 3개의 시약 다양한 친밀도 수준의 생쥐(사회적 자극): 장기 친밀 개체(케이지 동거묘; 1개월간 공동 사육), 단기 친밀 개체(10분 전 노출), 낯선 동종 개체, 그리고 대조군으로서의 빈 컵. CD-1 수컷 생쥐는 낯선 생쥐와 장기 친밀 생쥐를 탐색하는 선호도를 보인다. 이 패러다임에서 단기 친숙 마우스를 과도하게 조사하는 것입니다. 이 과제는 시연합니다 친밀도 수준을 인식하고 공격적 행동을 최소화하면서도 여전히 ~을 통제하여 노출 이력. 이 새로운 분석법은 직접적인 비교를 위한 플랫폼을 제공합니다. 사회적 상호작용의 신경 기전 장기, 단기 및 신규 기억 개인들. 4개 컵 패러다임은 새로운 측정 ~을 위한 / ~용으로 기존의 단기 인식 분석법을 보완할 수 있는 장기 친숙도 인식 분석.
서론
사회적 기억은 포유류 사회적 행동의 핵심적인 특징이며, 생쥐나 인간과 같이 사회성이 높은 종에서 특히 잘 발달되어 있습니다. 설치류에서 타인에 대한 인식은 집단 응집력, 서열 구조, 짝짓기 행동 및 부모 돌봄을 포함하여 가족 및 동종 집단 내 생존에 결정적인 행동 역학의 기초가 됩니다1,2. 동물의 생존에 있어 진화론적 이점 외에도, 인간의 사회적 기억 장애는 자폐 스펙트럼 장애, 조현병 및 알츠하이머병을 포함한 여러 신경정신과적 및 신경학적 질환 전반에 걸쳐 나타나는 보편적인 특징입니다3,4,5,6. 사회적 인식은 사회적 종의 일상적인 기능에 필수적이며 임상적으로도 명확한 중요성을 가지므로, 그 다차원적 성격과 신경학적 기반을 정확하게 포착하는 행동 분석법을 개발하는 것이 매우 중요합니다. 기존의 패러다임들이 생쥐의 사회적 인식의 일부 측면을 측정하고는 있지만, 대부분의 분석법은 장기적인 사회적 관계의 인식을 정량화하기보다는 수 분 또는 수 시간 동안 형성된 단기 관계와 새로운 관계를 비교함으로써 신규성 선호도를 평가하도록 설계되어 있습니다.
3-챔버 패러다임이나 습관화-탈습관화 패러다임과 같은 기존의 접근 방식은 보통 5–15분으로 제한된 짧은 사전 노출 후에만 나타나는 새로움 선호도를 평가합니다7,8,9,10,11. 이러한 방법들은 생쥐의 이러한 단기 사회적 기억의 신경 기전에 대해 상당한 통찰을 제공해 왔습니다12,13. 하지만 자연스러운 사회적 기억과 사회적 기능은 공동 거주, 장기적인 사회적 서열 또는 교배 파트너를 통해 형성되는 장기적 관계에서 작용하는 뚜렷한 기전들을 포함해야 합니다 . 일부 연구에서는 한 배에서 난 새끼들14이나 대상 개체와 최대 72 h 동안 함께 사육한 친숙한 생쥐15,16를 대상으로 3-챔버 패러다임을 사용하기도 하지만, 이 패러다임의 주된 용도는 여전히 단순한 '새로운 개체 대 친숙한 개체'의 이분법에 집중되어 있습니다. 이는 여러 마리의 서로 다른 친숙한 생쥐들 간의 비교를 제한합니다. 기존의 사회적 인식 패러다임이 단기 관계 연구에 편향되어 있기 때문에, 장기적 관계의 사회적 인식의 기초가 되는 신경 기전에 대한 지식에는 분명한 공백이 있음을 확인하였습니다
이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 단순하고 유연한 분석법인 '포 컵 패러다임(four cups paradigm)'을 개발했습니다. 구분하도록 설계된 ~의 인식 단일 테스트 세션 내에서 여러 단계의 사회적 친숙도 수준을 측정합니다. 이 패러다임에서 실험 대상 쥐는 개방형 아레나의 네 모서리를 탐색하며, 각각의 포함하는 a 천공된 컵 보관 a 동종의 또는 대조군인 빈 컵을 사용합니다. 컵에는 장기간 함께 지낸 친숙한 동종 개체(케이지 메이트)가 들어 있으며, 단기 친숙화 동종의 사전 노출이 제한적인 상황에서 (10분), a 새로운 마우스 및 한 개의 입력된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 제공해 주시기 바랍니다. 대조군. 탐색 시간은 사회적 인식과 사회적 선호도의 정량적 지표로 활용된다. 이러한 구성은 직접적인 신체적 상호작용과 잠재적인 공격적 충돌을 최소화하면서 친밀도 수준에 따른 동시 비교를 가능하게 한다.
프로토콜
동물을 대상으로 하는 모든 절차는 기관 가이드라인을 준수하여 수행되어야 하며, 플로리다 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC) 의 승인을 받아야 합니다 .
1. 동물 준비 및 사육
- 성인 사용 동성 군집 사육 마우스 모든 실험에 대하여. 실험 테스트 전, 마우스가 핸들링에 익숙해지게 하고 불안을 감소시키기 위해 최소 2일 동안 핸들링을 실시하십시오.
- 마우스를 다음의 조건에서 사육합니다. 식품과 물을 자유롭게 섭취할 수 있는 역광주기 조건의 표준 실험실 케이지.
참고: 대표 실험에는 성체 CD-1 및 C57BL/6 마우스(3~4개월령)가 사용되었습니다. 마우스는 케이지당 3~4마리씩 그룹으로 사육되었습니다. 대표 데이터 세트에는 수컷 CD-1 마우스 10마리, 암컷 CD-1 마우스 12마리, 수컷 C57BL/6 마우스 31마리가 포함되었습니다. 행동 실험은 피험자의 활성기(암기)에 수행해야 합니다. 본 연구에 포함된 마우스는 오전 9시에서 오후 6시 사이에 실험을 진행하였으며, 역광주기(오전 8시~오후 8시 암기) 조건에서 사육되었습니다. - 장기 친숙 요인을 다음과 같이 정의합니다. 동일 계통 및 동일 성별의 케이지메이트(cagemate) 대상 마우스와 동일한 케이지에서 최소한 다음의 기간 동안 함께 생활한 테스트 3~4주 전.
- 단기 친숙 및 새로운 동종 개체 선택 시약 대상 마우스와 동일한 계통 및 성별의 마우스로부터.
- 새로운 마우스가 대상 마우스에 대해 이전에 신체적 또는 후각적 노출이 없었는지 확인하십시오.
- 두 개체에서 유사한 후각 자극이 발생하는 것을 방지하기 위해, 서로 다른 홈 케이지에서 새로운 개체 하나와 단기 친숙 개체 하나를 선택하십시오.
참고: 사용된 모든 동물의 대략적인 연령을 기록하고, 새로운 약제나 단기 약제를 하루에 여러 번 재사용하는 것을 최소화하십시오. 약제를 재사용해야 하는 경우, 다음을 제공하십시오. >스트레스 요인을 방지하기 위해 테스트 시험 사이에 홈케이지에서 2시간의 휴식 시간을 갖는다.
2. 아레나 설정
- ~을(를) 놓으십시오 세척, 정사각형 개방 구역 장치 (49.5 cm x 49.5 cm x 49.5 cm; 재료 목록) 조용한 행동 테스트실에서.
- 높거나 오버헤드 램프 하나를 사용하여 해당 구역을 조명하고, 이를 다음으로 조정하십시오. 약 8~20 lux.
- 동일한 무게의 구멍 뚫린 플라스틱 컵 4개를 아레나의 각 모서리에 배치합니다(그림 1A).
- 가능한 한 시각적으로 동일한 컵을 사용하십시오. 서로 다른 색상의 컵을 사용하는 경우, 시행 전반에 걸쳐 컵의 할당과 위치를 균형 있게 배치하십시오.
- 각 컵의 양측면을 누릅니다. 세척 접근을 제한하기 위해 아레나 벽면에 설치하여, 은폐 행동을 최소화하고 탐색 각도를 표준화합니다.
- 탈출을 방지할 수 있을 만큼 충분히 무겁고, 기어올라오는 것을 방지할 수 있을 만큼 충분히 높은 컵을 사용하십시오.
참고: 본 연구에서 대표 데이터 컵과 에이전트의 위치는 피험자 간에 가성 무작위화(pseudorandomized)되었으며, 이는 시행마다 색깔 있는 플라스틱 컵을 시계 방향으로 회전시키는 동시에 에이전트의 유형을 반시계 방향으로 이동시켜 수행되었습니다.
- 배치하십시오 카메라 ~할 만큼 충분히 높은 전체 분석법 행동 코딩 중 사각지대를 방지하기 위해 박스가 프레임 안에 들어오도록 합니다. 박스 바닥 전체에 걸쳐 최소한의 눈부심과 일정한 조도를 유지합니다.그림 1A).
- 각 시험 사이에 다음을 사용하여 경기장 바닥과 컵을 철저히 세척하십시오. 적절한 소독제, 이어서 잔류 냄새를 제거하기 위해 물로 헹굽니다.
- 재도입 전 아레나를 완전히 건조시키십시오. 동물
3. 0일차 아레나 적응
- 피험체와 케이지 동료들을 구멍이 뚫린 빈 컵 4개가 놓인 아레나에 넣고 20분 동안 자유롭게 탐색하게 한다.
참고: 테더링(tethered) 실험의 경우 피험체를 개별적으로 순응시킨다. 추가적인 순응 세션이 필요할 수 있다. 1일 후에도 생쥐가 아레나 전체를 충분히 탐색하지 않는다면 여러 날에 걸쳐 순응시키는 것을 권장한다. - 모든 생쥐를 아레나에서 꺼내 원래의 홈 케이지로 돌려보낸다.
- 모든 사회적 요인(social agents)을 10분 동안 컵 아래에 두어 구속 상태에 순응시킨다. 동일한 홈 케이지 출신의 요인들은 컵 하나당 한 마리씩 동시에 순응시킨다 (그림 1B).
- 새로운 홈 케이지의 생쥐를 투입하기 전에 아레나와 컵을 세척한다.
참고: 세션을 시작하기 전, 실험실로 이동한 생쥐가 최소 15분 동안 휴식할 수 있도록 한다.
4. 기저선
- 섹션 2에 따라 실험 장치를 준비하십시오 . 모든 실험일 동안 동일한 장치 구성을 유지하십시오 .
- 네 개의 빈 컵이 들어 있는 실험 장치 내에 피험체를 넣고 10분 동안 자유롭게 탐색하게 하십시오.
참고: 녹화를 중간에 일시 정지하지 말고, 현재 시행의 모든 단계 동안 연속적으로 녹화되도록 하십시오 .
5. 단기 획득
- 가중치가 적용된 타공 컵을 사용하여 피험체를 고정하는 동안 지정된 것을 배치하십시오. "단기 친숙화" 시약 또는, 깨끗한 케이지 내에서 대상물을 단기 노출제에 노출시키십시오.
- 아레나 노출을 선택한 경우, 지정된 단기 익숙해지기 구역에 가두십시오. 시약 아레나 내의 구멍 뚫린 컵 하나 아래에 두고, 나머지 세 개의 컵은 그대로 둡니다. 입력된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 제공해 주세요.
- 출시 피험자 및 10분 동안 자유롭게 탐색하도록 둡니다.그림 1B).
참고: 아레나에서 단기 요원에 노출시키는 방법을 사용하는 경우, 공간적 편향을 방지하기 위해 피험자마다 단기 친숙 요원에 사용하는 모서리를 교대로 변경하십시오.
6. 시행 간 간격 (ITI)
- 단기 친숙 대상 쥐를 회수하여 원래의 케이지로 옮깁니다. 실험 대상 쥐가 아레나 내에서 10분 동안 혼자 자유롭게 움직이도록 둡니다.
- 테스트 단계를 위해 새로운 대상 쥐와 장기 친숙 대상 쥐를 준비합니다.
참고: 단기 친숙 대상 쥐를 단기 습득(섹션 5) 단계에서 사용했던 동일한 컵에 넣으십시오. 이는 아레나에서 단기 습득을 진행할 때 공간적 위치로 인한 새로움(novelty)이 발생하는 것을 방지하기 위해 권장됩니다.
7. 사회적 인식 단계
- 대상 마우스 위에 가중치가 부여된 천공 컵을 추가로 배치하십시오.
- 세 개의 무게추가 달린 타공 컵 각각의 아래에 생쥐 한 마리씩을 배치하십시오. 장기간 친숙한 개체(케이지 메이트), 단기간 친숙한 개체, 그리고 새로운 동종 개체. 대조군으로 지정된 네 번째 컵은 비워 둡니다.
참고: 행동 평가 중 약제 위치를 식별할 수 있도록 컵 상단에 라벨을 부착하십시오. - 실험 쥐로부터 천공 컵을 제거하십시오. 아레나 중앙에 두고 10분 동안 자유롭게 탐색하도록 합니다 (그림 1A).
- 실험 종료 시 모든 마우스를 제거하십시오. 10분 간격을 설정하고 녹화를 중단하십시오.
- 모든 마우스를 원래의 케이지로 돌려보냅니다.
- 다음 실험 전까지 아레나와 컵을 철저히 세척하십시오.
참고: 손상될 경우를 대비해 교체용 컵을 준비해 두십시오.
8. 행동 평가 점수 측정
- Behavioral Observation Research Interactive Software (BORIS)와 같이 수동 어노테이션이 가능한 행동 분석 소프트웨어로 기록된 모든 비디오를 가져오십시오.
참고: 각 컵 위에 에이전트 ID가 표시된 라벨이 부착되어 비디오에 노출되었고 케이지 번호를 추론할 수 있었으므로, 행동 점수 산정 시 케이지 동료의 위치에 대한 블라인드 처리는 이루어지지 않았습니다. 점수 산정자는 노출된 라벨에 능동적으로 주의를 기울이지 않았으며, 새로운 에이전트와 단기 에이전트의 정체에 대해서는 블라인드 처리되었습니다. 모든 점수 산정자는 탐색 행동에 대해 사전 정의된 조작적 정의와 표준화된 점수 산정 기준을 따랐습니다. - 채점 전 행동 매트릭스를 정의하십시오.
- 조사 횟수(investigation bout)를 마우스가 코를 내부로 위치시키는 것으로 정의한다. 1 cm 컵의 일부를 ~하는 동안 나타내는 지속적인 조사 태세.
참고: 컵을 대상으로 한 씹기 및 갉기 행동을 탐색 행동(investigation bouts)에 포함하십시오. - 10분간의 사회적 인식 테스트 단계 동안 각 컵에 대한 총 탐색 시간을 수동으로 기록하십시오. 원하는 대로 베이스라인과 획득 단계의 점수를 측정하십시오.
참고: 각 컵을 둘러싼 1cm 반원형 관심 영역(region of interest)을 설정하여 자동 포즈 추적(automated pose tracking)을 사용할 수 있습니다. - 다음의 주석 처리된 데이터 내보내기 후속의 통계 분석.
결과
4-컵 패러다임 프로토콜에 따라, CD-1 수컷 마우스는 장기 친숙(케이지 메이트), 단기 친숙, 그리고 새로운 동종 개체에 대해 서로 다른 사회적 탐색 행동을 보였습니다(그림 2). 각 대상에 대해, 10분간의 사회적 인식 단계 동안 해당 대상과 빈 컵을 탐색하는 데 소비한 시간을 기준으로 식별 지수(DI)를 (대상 − 빈 컵)/(대상 + 빈 컵)으로 계산하였습니다. Shapiro-Wilk 검사 결과, 이 지수는 정규 분포를 따랐으며, 이에 따라 데이터의 정규성을 가정한 통계 검정을 사용하였습니다. 마우스는 단기 친숙 동종 개체에 비해 새로운 동종 개체에 대해 유의하게 더 높은 식별 능력을 보였습니다(그림 2; novel vs. short-term t(9) = 3.70, Bonferroni-Holm-adjusted p = 0.01). 또한 이 패러다임은 마우스가 단기 친숙 동종 개체에 비해 장기 친숙 케이지 메이트에 대해 유의하게 더 높은 식별 능력을 나타냈음을 보여주었습니다(그림 2; cagemate vs. short-term t(9) = 2.87, Bonferroni-Holm-adjusted p = 0.04). 새로운 동종 개체와 케이지 메이트 사이의 식별 능력에는 유의미한 차이가 없었으며(그림 2; novel vs. cagemate t(9) = -1.13, adjusted p = 0.29), 이는 마우스가 단기 친숙 마우스보다 새로운 동종 개체와 장기 친숙 동종 개체 모두를 우선적으로 탐색했음을 시사합니다. 빈 아레나 베이스라인 동안 각 컵 위치에서의 탐색 시간은 이후 어떤 사회적 대상이 해당 컵 위치에 배치될 것인지에 따라 차이가 없었으며, 이는 결과에 영향을 미친 사전 컵 선호도가 없었음을 확인시켜 줍니다(novel baseline vs. cagemate baseline t(9) = -1.99, p = 0.23; novel vs. short-term baseline t(9) = -1.97, p = 0.23; cagemate vs. short-term baseline t(9) = 0.54, p = 0.60).
이와 대조적으로, CD-1 암컷 생쥐는 새로운 개체, 단기 친숙 개체 및 장기 친숙 개체 간의 식별 지수에서 유의미한 차이를 보이지 않았습니다(그림 3). 새로운 개체와 단기 친숙 개체(p = 0.35), 새로운 개체와 케이지 동료(p = 0.69), 또는 단기 친숙 개체와 케이지 동료(p = 0.70) 사이에 유의미한 차이가 관찰되지 않았습니다. 암컷 생쥐는 빈 컵 위에 놓인 모든 대상 개체를 전반적으로 탐색하며 이 과제에서 뚜렷한 행동 패턴을 보였으며, 이는 수컷 생쥐에 비해 더 넓은 사회성을 반영하는 것일 수 있습니다.
마찬가지로 C57BL/6 수컷 생쥐에서도 동일한 방향의 경향이 나타났으며, 단기 친숙 개체보다 새로운 동종 개체에 대해 더 큰 변별력을 보였습니다. 이러한 차이는 Bonferroni-Holm 보정 후 유의성에 근접했으나 도달하지는 않았으며, 이는 CD-1 수컷보다 더 큰 규모의 C57BL/6 코호트(n = 31)에서 피험자 간 분산이 더 컸음을 시사합니다(그림 4; 보정된 p = 0.055). 새로운 개체와 케이지 메이트 사이(p = 0.62) 또는 단기 친숙 개체와 케이지 메이트 사이(p = 0.62)에는 유의미한 차이가 관찰되지 않았습니다. 이러한 결과는 CD-1 수컷에서 관찰된 케이지 메이트에 대한 강한 탐색 행동이 계통 및 성별에 따라 다름을 시사합니다.
사회적 우위가 케이지 동료 탐색에 기여했는지 확인하기 위해, 소변 표시 David 점수와 케이지 동료 식별 지수의 상관관계를 분석하였습니다. CD-1 수컷 마우스(Pearson's r = 0.28, p = 0.44)와 C57BL/6 수컷 마우스(Pearson's r = 0.10, p = 0.57) 모두에서 유의미한 상관관계가 관찰되지 않았으며, 이는 사회적 서열이 케이지 동료 식별 지수에 영향을 미치지 않았음을 시사합니다.
종합적으로, 이러한 결과는 4-컵 패러다임이 단일 행동 세션 내에서 장기 및 단기 친숙도와 사회적 새로움을 동시에 평가하면서, 차별적인 사회적 탐색을 감지할 수 있음을 입증합니다. 중요한 점은, 이 분석법에서 성별과 계통이 행동에 영향을 미칠 수 있다는 것입니다.
그림 1: 4-컵 패러다임의 설정 및 실험 과정. (A) 왼쪽, 구멍이 뚫린 빈 컵 4개가 있는 4-컵 패러다임 박스. 오른쪽, 사회적 요원이 배치된 구멍 뚫린 컵 4개가 있는 4-컵 패러다임 박스를 탐색하는 실험 대상. 레이블은 정확한 행동 점수 측정을 돕기 위해 사회적 요원의 정체성을 나타낸다. (B) 패러다임 1일 차의 행동 도식. 마우스 색상은 요원의 정체성을 나타낸다. 이미지는 카메라 플래시를 사용하여 촬영되었으므로, 실험에 사용된 8–20 lux 조명에 비해 아레나가 밝게 보인다는 점에 유의하십시오. 여기를 클릭하여 이 그림의 확대 버전을 확인하십시오.
그림 2: CD-1 수컷 생쥐의 4-컵 패러다임 내 사회적 선호도. 10분간의 사회적 인식 단계 동안 새로운 개체, 단기 익숙한 개체 및 장기 익숙한 개체(케이지 메이트) 동종 개체에 대한 조사의 판별 지수(DI). DI는 (대상 개체 – 빈 컵)/(대상 개체 + 빈 컵)으로 계산되었다. 생쥐는 단기 익숙한 개체에 비해 새로운 개체와 케이지 메이트 동종 개체에 대해 유의하게 더 높은 판별력을 보였으나(p < 0.05), 새로운 개체와 케이지 메이트 간의 판별력에는 유의미한 차이가 관찰되지 않았다. 데이터는 생쥐 10마리의 평균 ± 표준 오차로 표시되었다. 통계적 비교는 다중 비교에 대한 Bonferroni-Holm 보정을 적용한 대응표본 t-검정을 사용하여 수행되었다. *p < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: CD-1 암컷 생쥐의 4컵 패러다임 내 사회적 선호도. 10분간의 사회적 인식 단계 동안 새로운 개체, 단기 친숙 개체 및 장기 친숙 개체(케이지 메이트) 동종 개체에 대한 탐색의 판별 지수(DI). DI는 (대상 – 빈 컵)/(대상 + 빈 컵)으로 계산하였다. 세 가지 사회적 자극 간에 판별 지수에서 유의미한 차이가 관찰되지 않았다. 데이터는 12마리 생쥐의 평균 ± 표준 오차로 표시되었다. 통계적 비교는 다중 비교에 대한 Bonferroni-Holm 보정을 적용한 paired t-test를 사용하여 수행되었다. *p < 0.05. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: C57BL/6 수컷 생쥐의 4-컵 패러다임에서의 사회적 선호도. 10분간의 사회적 인지 단계 동안 새로운 개체, 단기 친숙 개체 및 장기 친숙 개체(케이지 동거 개체)에 대한 탐색의 판별 지수(DI). DI는 (개체 − 빈 컵)/(개체 + 빈 컵)으로 계산되었다. 단기 친숙 개체보다 새로운 개체를 더 많이 판별하는 경향이 관찰되었으나, Bonferroni-Holm 보정 후에는 유의미하지 않았다(p = 0.055). 새로운 개체와 케이지 동거 개체 사이, 또는 단기 친숙 개체와 케이지 동거 개체 사이에는 유의미한 차이가 관찰되지 않았다. 데이터는 생쥐 31마리에 대한 평균 ± 표준오차로 표시되었다. 통계적 비교는 다중 비교를 위한 Bonferroni-Holm 보정을 적용한 paired t-test를 사용하여 수행되었다. #p < 0.06. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
토론
다른 실험실 환경에서 이러한 사회적 역동성을 효과적이고 신뢰성 있게 측정하기 위해 4-컵 패러다임을 적용할 때 고려해야 할 핵심 사항들이 있습니다. 0일 차의 습관화는 경기장과 컵에 대한 비사회적인 새로움 기반의 탐색을 줄여주며, 이를 통해 테스트 중 사회적 조사가 가려지는 것을 방지할 수 있습니다7,8,9. 단기 친숙화 시간의 정밀한 제어 또한 필수적인데, 노출 시간의 작은 차이가 이후의 선호 패턴을 크게 변화시킬 수 있기 때문입니다8,9,10. 10분간의 친숙화 기간은 견고한 단기 사회적 기억을 형성하는 동시에, 짧은 노출 기간을 사용하여 친숙한 개체와 새로운 동종 개체를 구분하는 기존의 사회적 인식 패러다임과 일치하도록 설정되었습니다7,8,10. 또한, 반복적인 짧은 노출보다는 장기간의 공동 거주를 통해 안정적인 장기 사회적 친숙함을 형성하기 위해 3~4주의 공동 사육 기간을 설정하였습니다. 이 기간은 지속적인 사회적 상호작용과 케이지 메이트 간의 영구적인 친숙함 형성에 충분한 기회를 제공합니다10. 10분간의 친숙화 기간과 3~4주의 공동 사육 기간을 구분한 것은 동일한 행동 세션 내에서 질적으로 서로 다른 두 가지 수준의 친숙함(최근 및 장기)을 만들기 위해 의도적으로 설계된 것입니다. 실험 과정에서는 마우스의 내재적인 공간 편향을 제어하기 위해 시도별로 컵 위치에 따른 대상 마우스의 정체성을 균형 있게 배치(counterbalancing)하는 것이 필요합니다7,8. 대상 마우스를 여러 시도에 걸쳐 반복적으로 사용하면 대상 마우스의 스트레스 수준이 변할 수 있으며, 결과적으로 피험체의 조사 행동에 영향을 줄 수 있습니다. 이러한 잠재적 혼란 변수를 최소화하기 위해, 가능한 경우 단일 테스트일 내에 대상 마우스를 반복적으로 사용하지 않았으며, 대상의 정체성과 컵 위치를 피험체 간에 균형 있게 배치하였습니다. 또한 사회적 우위가 사회적 조사에 영향을 미칠 가능성이 있으므로, 영역 기반 우위 및 David 점수를 사용하여 우위 계층을 평가하였습니다. CD-1 수컷 마우스와 C57BL/6 수컷 마우스에서 David 점수와 케이지 메이트 식별 지수 사이에 유의미한 상관관계가 관찰되지 않았으며, 이는 장기 친숙 동종 개체에 대해 관찰된 선호도가 우위 상태로 설명되지 않음을 시사합니다. 분석 시에는 평가자와 실험 집단 간의 재현성을 보장하기 위해 조사 행동, 특히 조사 지속 시간에 대한 일관된 조작적 정의가 필요합니다. 모든 조사 기반 사회적 패러다임이 직면할 수 있는 잠재적 과제 중 하나는 비교를 불가능하게 만드는 조사 시간이 거의 0에 가까운 "바닥 효과(floor effects)"입니다. 사회적 조사 수준이 낮은 마우스 계통의 경우, 가시광선을 더 줄이고 적외선 비디오 추적을 사용하면 불안감을 낮추고 탐색 행동을 증가시킬 수 있습니다.
본 프로토콜은 실험 목적에 따라 유연하게 변경 및 수정이 가능하지만, 특정 조정 사항에 대해서는 신중한 고려가 필요합니다. 컵의 재질은 본 분석의 핵심 변수입니다. 본 프로토콜에서는 구멍이 뚫린 플라스틱 컵을 사용하지만, 구멍의 크기가 더 작은 금속제 가중치 컵을 사용하면 가벼운 플라스틱 컵에 비해 갉아먹기나 탈출 시도를 줄일 수 있습니다. 플라스틱 컵의 사용은 갉기나 기어오르기를 포함한 조작 행동을 증가시킬 수 있으므로, 채점 과정에서 이를 모니터링하고 기록해야 합니다. 대안적인 방법으로는 구멍 뚫린 컵 대신, 후각 및 제한적인 시각적 소통은 유지하면서 각 모서리를 중앙 경기장과 분리하는 높고 구멍 뚫린 수직 칸막이를 사용하는 것입니다. 이러한 설계는 기어오르는 행동을 더욱 줄일 수 있으나, 탈부착이 가능한 구멍 뚫린 컵을 사용하면 영구적인 수정 없이도 표준 오픈 필드 경기장을 4개 컵 패러다임으로 빠르게 전환할 수 있다는 실용적인 장점이 있습니다. 컵과의 과도한 상호작용은 컵의 무게를 늘리거나, 구멍 크기를 수정하고, 일관된 색상을 유지하여 편향 요인을 줄임으로써 완화할 수 있습니다. 또한, 의도치 않은 친숙도 효과를 줄이기 위해 에이전트 마우스는 균형을 맞추어 배치해야 하며, 단일 테스트일 내에 재사용해서는 안 됩니다.
4-컵 패러다임의 몇 가지 한계점을 인정해야 합니다. 타공 장벽으로 인해 사회적 상호작용이 제한되므로, 이 분석법은 직접적인 신체 접촉보다는 주로 후각 및 제한적인 시각적 단서에 기반한 피험자 주도의 비호혜적 탐색을 평가하게 됩니다8,9. 또한, 컵을 물리적 및 시각적 장벽으로 사용하는 것은 탐색 행동을 해석하는 데 있어 잠재적인 모호함을 유발합니다. 특히 CD-1 수컷에서 케이지 메이트에 대한 탐색 증가가 관찰되는 경우, 이것이 단순한 사회적 인식만을 반영하는 것인지, 아니면 익숙한 동종 개체에 대한 도움 관련 행동(예: 플라스틱 컵을 갉아 케이지 메이트의 탈출을 돕으려는 시도)을 포함하여 탐색과 친화적 동기가 결합된 결과인지가 불분명합니다. 이러한 고려 사항은 신중한 해석의 중요성과 가능할 때마다 보완적인 행동 분석법을 사용해야 함을 강조합니다. 지배 서열, 친화적 상호작용 및 이전의 사회적 경험을 포함하여 케이지 메이트 간의 기존 사회적 관계 또한 탐색 선호도에 영향을 줄 수 있습니다. 그러나 본 연구에서는 지배 서열과 케이지 메이트의 탐색 행동 사이에 뚜렷한 상관관계는 관찰되지 않았습니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 요인들은 계통, 사육 조건 및 실험 패러다임에 따라 다를 수 있으므로 장기적인 친숙도 선호도를 해석할 때 반드시 고려되어야 합니다.
기존의 사회적 인식 분석법과 비교하여, 4-컵 패러다임(four cups paradigm)은 단일 행동 세션 내에서 장기 친숙 개체, 단기 친숙 개체, 그리고 새로운 동종 개체와 같이 여러 대상의 동시 비교를 가능하게 합니다. 3-챔버 및 습관화-탈습관화 분석법과 같은 전통적인 패러다임은 주로 짧은 노출 기간 이후의 단기적인 새로움 선호도(novelty preference)를 평가합니다7,8,9,10. 이전 연구들에서는 무제한 사회적 상호작용 패러다임 및 사회적 친숙도를 평가하기 위해 설계된 수정된 다중 챔버 아레나를 포함하여, 새로운 동종 개체와 함께 장기 케이지 메이트(cagemates)를 포함시키기도 했습니다17,18. 그러나 이러한 접근 방식은 동일한 분석 내에서 장기 친숙, 단기 친숙 및 새로운 사회적 자극을 동시에 비교하지 않습니다. 단기 대상과 함께 장기 케이지 메이트를 통합함으로써, 4-컵 패러다임은 장기간의 공동 거주로 인해 발생하는 지속적인 사회적 기억을 조사할 수 있는 수단을 제공합니다. 암수 CD-1 마우스 모두의 대표 데이터는 4-컵 패러다임이 성별에 관계없이 성공적으로 적용될 수 있음을 보여주며, 성별 특이적인 행동 패턴을 나타냅니다. 마찬가지로, CD-1 및 C57BL/6 마우스 모두의 대표 데이터는 4-컵 패러다임이 흔히 사용되는 여러 실험실 계통에 걸쳐 성공적으로 구현될 수 있음을 더욱 입증합니다. 사회적 인식과 새로움 선호도는 마우스 계통에 따라 종종 다르지만7,19, 두 계통의 수컷에서 관찰된 친숙도 식별의 전반적인 패턴은 이 분석법이 광범위하게 적용 가능함을 시사합니다. 그럼에도 불구하고, 사회적 인식 행동은 계통, 성별, 연령 및 실험적 상황에 따라 다를 수 있으므로, 연구자는 자신의 질문과 관련된 특정 동물 모델에서 이 분석법을 검증해야 합니다. 또한, 이 패러다임은 4-암(arm) 또는 4-챔버 아레나로 조정될 수 있지만, 오픈 필드 아레나에서 실행하면 항해 및 공간 기억과 사회적 기억 사이의 분리가 더 명확해집니다. 별개의 구획이나 암을 항해할 때는 공간 기억 부하가 더 커지므로, 사회적 기억 기전을 조사할 때는 공간 기억이 평가해야 할 중요한 변수가 되어야 합니다. Netser 등(2017) 또한 공간 항해의 필요성을 최소화하는 유사한 2-챔버 아레나 대안을 제안하면서, 전형적인 3-챔버 분석 아레나와 관련된 이러한 주의사항을 논의하였습니다20. 이 방법은 사회적 친숙도의 신경 표상, 사회적 인지의 종단적 변화, 그리고 장기 사회적 기억이 선택적으로 변화될 수 있는 조건을 연구하는 데 매우 적합합니다.
공개 사항
저자들은 공개할 사항이 없습니다.
감사의 글
본 연구는 NPC에 대한 McKnight Neuroscience Award 및 Klingenstein Neuroscience Award의 지원을 받아 수행되었습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 행동 분석 소프트웨어 | Behavioral Observation Research Interactive Software | Version 9.12.7 | 수동 이벤트 주석 작성을 위한 소프트웨어 |
| 오픈 필드 아레나 | Rafferty Machine and Tool | 맞춤 제작 | 구조용 FRP 유리섬유 시트, 정방형 아레나 (49.5 cm x 49.5 cm x 49.5 cm); 비투명 벽면, 아레나가 투명할 경우 동물의 주의 분산을 최소화하기 위해 외부 벽면을 종이로 덮음 |
| 오버헤드 카메라 | Logitech | Logitech C920x HD Pro PC Webcam | 연속 비디오 녹화가 가능한 카메라; 아레나 중앙 상단에 설치 |
| 천공 컵 | Chinco Store | ONG-Chinco-0279 | 컵 크기: 4.01"L x 4.01"W x 4.52"H; 천공된 플라스틱 또는 금속 컵, 정사각형 또는 원통형 가능 |
| Prism | Graph Pad | Version 10.6.0 | 데이터 분석용 소프트웨어; 다른 소프트웨어로 대체 가능 |
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