프로테아제의 지향적 진화를 위한 최적화된 효모 표면 디스플레이 워크플로우

요약

이 프로토콜은 표면 디스플레이 기반 선택 시스템을 사용하여 Saccharomyces cerevisiae 에서 바이러스 프로테아제의 방향성 진화를 최적화한 워크플로우를 제공합니다. DNA 삽입 라이브러리 및 기질 카세트 설계, 높은 형질전환 효율을 위한 전기천공, 형광 활성화 세포 분류 기반 프로테아제 절단 선택, 그리고 농축 변이체의 시퀀싱을 개괄합니다.

초록

지향 진화는 빠르고 통제된 실험실 환경에서 자연스러운 진화 과정을 모방하여 원하는 기능이나 형질을 가진 단백질을 진화시키는 것입니다. 돌연변이 단백질 코딩 유전자의 방대한 풀을 스크리닝함으로써 생명공학, 의학, 합성생물학 분야에 적용할 원하는 변이의 기능적 선택이 가능합니다. 이 프로토콜을 사용하여 Saccharomyces cerevisiae 에서 비원래 기질 서열에 대해 높은 특이성을 가진 프로테아제 변이체를 설계하기 위해 방향 진화를 수행했습니다. 우리는 효모 세포 표면에 이러한 프로테아제 변이체를 표시하여 여러 차례의 농축 과정을 거쳐 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 통해 원하는 변이체를 선택할 수 있도록 합니다. 기질 카세트의 네 가지 핵심 요소는 프로테아제 라이브러리와 함께 발현되어 있습니다: (i) 효모 부착 수용체 소단위 Aga2, (ii) 선택 및 (iii) 역선택 기질 서열, (iv) 에피토프 태그 서열, 그리고 선택적 소포체 회출 신호 서열로 구성된 융합 단백질입니다. 선택 기질 서열만 절단된 효모 세포는 형광(피코에리트린/플루오레세인 이소티오시아네이트 표지) 항에피토프 항체를 이용해 다색 FACS를 사용해 분리합니다. 여기서는 DNA 삽입물 라이브러리 설계 및 기질 카세트 설계, 높은 형질변환 효율을 가진 효모세포 전기천공(최대 10⁹ 개) DNA의 전환 효율, FACS 기반 선택, 농축 및 진화 변이체의 시퀀싱을 포함한 프로테아제 진화 캠페인을 수행하는 최적화된 단계별 프로토콜에 대한 세부 정보를 제공합니다. 우리는 담배 에치 바이러스 핵 포함물인 프로테아제(TEVp)를 자연 기질 서열인 ENLYFQ↓S에서 새로운 서열인 ENLYFE↓S로 진화시킴으로써 유도 진화 프로토콜을 시연합니다.

서론

포티바이러스과(Potyviridae) 계열의 시스테인 프로테아제, 특히 핵 포함물인 A(NIa) 프로테아제는 서열 특이적 엔도펩티다아제의 대부분 미개척 공급원입니다. 3,800개 이상의 가족 구성원을 특징지은 NIa 프로테아제는 뚜렷한 7개의 아미노산 기질 서열을 절단합니다. 포티바이러스 계열은 프로그래밍 가능한 단백질 제어 시스템 설계, 직교 프로테아제 기반 유전 회로 구축, 서열 특이적 생명공학 도구 개발을 위한 다양한 프로테아제 집합을 제공합니다 ^1,2. 이러한 자연적 다양성에도 불구하고, 광범위한 실험실 및 생명공학 용도로 철저히 특성 및 설계된 NIa 프로테아제는 TEVp와 담배정맥 얼룩 바이러스 프로테아제(TVMVp) 두 가지뿐입니다 ^3,4. 이 제한된 프로테아제 툴킷은 직교 프로테아^{제 활성을} 요구하는 다성분 회로의 설계 공간을 제한하여, 방향성 진화를 통해 NIa 프로테아제를 더욱 확장하고 특성화하려는 노력을 촉진합니다 ^6,7.

효모 표면 디스플레이는 형광 활성화 세포 분류(FACS^)6,7을 통해 고처리량 단백질 라이브러리 스크리닝을 가능하게 하는 지향 진화의 가장 강력한 플랫폼 중 하나로 부상했습니다. 예를 들어, 효모 소포체 격리 선별(YESS) 시스템은 S. cerevisiae ^6,7의 분비 경로를 통해 프로테아제 활성과 표면 노출을 결합합니다. YESS 시스템은 새로운 프로테아제-기질 특이성을 설계하는 데 적용되었으며, 다라운드 지향 진화 캠페인에 유용함을 입증했습니다. 이 시스템에서는 프로테아제 변이체가 에피토프 마커가 있는 절단 기질 카세트를 포함하는 융합 단백질과 공동 발현되며, Aga1p 표면 앵커는 EBY100 효모 균주에서 발현됩니다. 형광 항체를 이용한 차별 표지는 절단된 기질과 세포 표면에 표시된 비절단된 기질 카세트를 구분합니다. 이 활동 의존 표시 메커니즘은 10,⁷ 이상 변종^{라이브러리 6,7에} 대한 반복 FACS 기반 선택과 직접 호환됩니다.

지향 진화의 근본적인 전제 조건은 목표 서열 공간을 충분히 커버할 수 있도록 충분한 규모로 변이 라이브러리를 도입할 수 있는 능력입니다. 여러 아미노산 위치에 걸쳐 있는 부위 포화 돌연변이 유발 라이브러리의 경우, 라이브러리에 도입된 다양성이 분류된 집단에 잘 대표되도록 하기 위해 10 8에서 10^{9개의 고유} 변형체가 생성되어야 합니다. S. cerevisiae에 외인성 DNA를 도입하는 여러 방법이 있으며, 각각 뚜렷한 처리량 상한을 가집니다. 기존의 화학 변환 방법은 단순성과 접근성 때문에 리튬 아세테이트/단일 가닥 운반체 DNA/폴리에틸렌 글리콜(LiAc/ssDNA/PEG)을 사용합니다. 그러나 일반적으로 DNA 마이크로그램당 10⁴–10⁶ 콜로니 형성 유닛(CFU)의 형질전환 효율을 달성하며, 대규모 라이브러리 캠페인에 필요한 서열 변이에 미치지 못합니다^. 반면, 전기천공법은 고전압 전기장을 적용하여 세포막을 일시적으로 투과시키고 DNA 흡수를 촉진합니다. 전기천공은 사용 가능한 변형 방법 중 가장 높은 형질전환 효율을 지속적으로 달성하며, 최적화된 프로토콜에서는 10⁸–10⁹ CFU⁹의 수율을 보고합니다. S. cerevisiae의 전기천공 효율은 세포 성장기, DNA 질량, 완충 조성에 매우 민감하다는 점이 관찰되었으며, 이는 이후 라이브러리 규모의 지향 진화에 널리 적용된 틀을^{제공합니다.}

여기서 설명하는 프로토콜은 효모 표면 디스플레이에 널리 채택된 숙주 균주인 S. cerevisiae 균주 EBY100을 사용합니다. EBY100은 Boder와 Wittrup가 갈락토스 유도성 GAL1 프로모터의 제어 하에 AGA1 발현 카세트를 프로테아제 결핍 모체 균주 BJ5465¹⁰의 염색체 AGA1 유전자에 통합하여 설계했습니다. 이 품종은 ATCC(카탈로그 번호)에서 상업적으로 구할 수 있습니다. MYA-4941; 이 유전자형 MATa AGA1::GAL1-AGA1:URA3 ura3-52 trp1 leu2-Δ1 HIS3-Δ200 pep4::HIS3 prb1Δ1.6R can1 GAL (URA+, leu−, trp−)을 지니고 있습니다. 그 결과, Aga1p와 Aga2p 기질 카세트 융합 모두 동일한 갈락토스 유도 프로모터에서 발현되어, 두 소단위체가 함께 유도되어 디황화드 결합 Aga1p–Aga2p 복합체로 조립되어 나타나는 융합을 세포벽에 고정시킵니다.

효모 디스플레이 응용 분야에서 EBY100이 널리 사용되고 있음에도 불구하고, 라이브러리 규모의 수율로 이 균주를 전기포링하기 위해 체계적으로 최적화된 공식 프로토콜은 없습니다. EBY100 특이적 매개변수들, 예를 들어 수확 시 최적 성장 단계, 하위배양 중 배지 조성, 600 nm 초기 광밀도(OD₆₀₀)와 형질 효율 간의 정량적 관계 등은 아직 엄격히 특성화되고 최적화되어야 합니다. 여기서는 EBY100의 형질 전환 효율이 수확 시 배양의 OD₆₀₀ 에 따라 단조적으로 증가하며, 로그 후반 세포가 초기 로그 단계에서 수확된 세포보다 훨씬 높은 형질전환율을 보인다고 보고합니다. 접종 시 초기 OD₆₀₀ 값, 2× 효모추출물 펩톤 덱스트로스(YPD) 배양지의 사용, 전기천공 완충 제형, 전기천공 후 성장 조건 등 중요한 프로토콜 매개변수를 평가했습니다. 여기 제시된 프로토콜은 전기적이면서도 EBY100 세포를 준비하고 고효율 DNA 라이브러리 전기천공을 수행하기 위한 최적화된 단계별 워크플로우(그림 1A–C, 그림 2, 그림 3A–D, 그림 4A–E)를 제공하며, 변환율을 일관되게 10⁹ 이상으로 유지합니다 CFU. 이 프로토콜을 검증하기 위해, 우리는 FACS 기반 선택 및 농축 4라운드에 걸쳐 절단 특이성이 변화된 TEVp를 공학적으로 설계하는 포괄적인 지향 진화 캠페인을 수행했습니다. 농축된 프로테아제 변이체의 시퀀싱은 프로테아제의 기질 결합 주머니 내 표적 잔기에서 상당한 다양화를 확인하여, 프로토콜이 생산적인 진화 캠페인을 지원할 수 있는 충분한 라이브러리 범위를 서열 공간에 제공함을 입증했습니다. 이 프로토콜은 효모 표면 디스플레이 기반 방향 진화와 프로테아제, 항체⁹, 키나제¹¹, 수용체¹² 등 다양한 단백질의 FACS 호환 고처리량 스크리닝을 위해 EBY100을 사용하는 연구자들에게 폭넓은 유용성을 제공합니다.

프로토콜

재조합 S. cerevisiae 를 이용한 모든 실험은 텍사스 대학교 댈러스 캠퍼스의 기관 생명안전 및 화학 안전 위원회의 정책과 절차에 따라 수행되었습니다. 재조합 효모 균주는 기존의 기관 미생물학 관행에 따라 생물안전 레벨 1(BSL-1) 격리 하에 취급되었습니다. 전기천공, 배양, 형광 활성화 세포 분류(FACS)는 승인된 기관 생물안전 절차에 따라 수행되었습니다. 효모 배양물과 오염된 소모품은 제염 후 기관 지침에 따라 생물학적 위험 폐기물로 폐기되었습니다.

1. 벡터 및 인서트 준비

1. 부위 포화 돌연변이 유발을 통한 포티바이러스 프로테아제 라이브러리 생성
   1. 30-50-mer, 순방향 및 역방향 올리고뉴클레오타이드를 겹쳐 프로테아제 돌연변이 라이브러리를 생성하는 서열 설계 소프트웨어를 사용해 설계합니다. 해당 올리고뉴클레오타이드의 야생형 코돈을 NNS 퇴화 코돈으로 대체하는데, 여기서 N은 A, T, G, C를, S는 G 또는 C를 나타내며, 돌연변이 유발 위치를 나타냅니다.
   2. 각 순방향 및 역방향 올리고뉴클레오타이드 쌍 사이의 3′ 겹침 지점을 녹는가(Tm)로 설계하여 55–60 °C로 설정하세요. 첫 번째와 마지막 올리고뉴클레오타이드를 제한 부위 이외의 효모 표면 표시 벡터와 50-NT 중복하도록 설계하세요.
   3. 상동 재조합을 용이하게 하기 위해 인서트의 적어도 한쪽 끝이 선형 벡터의 한쪽 끝과 정확히 겹치도록 해야 한다^. 인접한 올리고뉴클레오타이드 사이의 간격을 피하세요¹⁴.
   4. 올리고를 100 μM까지 탈이온화된 H2_O로재현탁합니다. 멸균된 1.5 mL 튜브에서 각 올리고 0.5 μL을 최종 부피 200 μL(각 올리고당 최종 농도 250 nM)에 결합합니다.
   5. 표 1에 나열된 성분으로 PCR 반응을 설정하여 표 2의 열순환 조건을 사용하여 프로테아제 라이브러리를 조립합니다.
   6. 첫 번째 조립된 PCR 산물을 템플릿으로 사용하여 가장 바깥쪽 순방향 및 역방향 올리고(표 3)를 사용하여 두 번째 PCR 반응을 설정합니다. 표 4에 표시된 대로 곱을 증폭합니다.
   7. 두 번째 PCR 산물을 1% 아가로스 젤과 에티듐 브로마이드(0.5 μg/mL)를 240 V에서 30분간 돌리세요. 예상 DNA 길이에 해당하는 밴드를 절단합니다.
      주의: 에티듐 브로마이드는 돌연변이 유발 물질이므로 실험실 코트, 니트릴 장갑, 안전경 등 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 사용해 다루어야 합니다. 피부 접촉과 흡입은 피하세요. 에티듐 브로마이드 함유 겔, 완충제, 소모품은 기관 안전 지침에 따라 유해 화학 폐기물로 폐기합니다.
   8. 젤 추출 키트를 사용해 정제하세요. 50 μL 가루 분리된 수소₂O에 용출합니다.
   9. 분광광도계를 사용해 DNA 농도를 측정하세요. DNA는 −20 °C에 보관하세요.
      참고: 2^차 PCR의 각 50 μL 반응은 약 0.5–1.0 μg의 총 DNA를 생성합니다. 각 전기천공은 프로테아제 라이브러리(즉, 삽입물)의 12 μg를 필요로 하므로 반응 수를 그에 맞게 확대해야 합니다.
2. 기판 카세트 조립
   1. LB-한천 플레이트와 LB-클로람페니콜 액체 배지를 준비합니다. 표 5의 레시피를 참고하세요.
   2. 기판 카세트 조립을 위해 순방향과 역방향으로 겹치는 30머 올리고뉴클레오타이드 세트를 설계하세요. 각 역올리고뉴클레오타이드의 5′ 끝과 다음 조각의 순방향 올리고뉴클레오타이드를 4뉴클레오타이드만큼 맞추도록 설계하세요.
   3. 탈이온화된 H₂O를 사용해 동전 건조 올리고를 100 μM까지 재현탁합니다.
   4. 표 6처럼 시약을 혼합하세요.
   5. 표 7의 사이클링 프로그램을 사용해 올리고 혼합물을 어닐링하고 인산화하세요.
   6. 희석 어닐링된 올리고를 탈이온화된 H₂O에서 4배 어닐링하여 최종 농도인 1.25 μM에 도달합니다.
   7. 표 8에 따라 어닐링된 올리고 혼합물과 벡터(예: pDD1523)를 결합합니다.
   8. 표 9에 있는 사이클링 프로그램에 따라 골든 게이트 조립을 수행하세요.
      참고: 예를 들어, pDD1523 플라스미드는 GAL1/10 프로모터 하류에 유형 IIS 제한 부위(BsmBI)를 가지고 있습니다. 성공적인 조립 시 기판 카세트⁷의 갈락토스 유도가 가능합니다.
   9. 생성된 플라스미드를 대장균으로 변환합니다.
   10. LB 한천에 해당하는 항생제를 배지 처리합니다. 37 °C에서 16–18시간 배양합니다.
   11. 분리된 집락을 골라 5mL의 LB 배지에 접종합니다. 37°C에서 하룻밤(16–18시간) 진동시키고 220rpm으로 부양합니다.
   12. 플라스미드 미니프렙 키트를 사용해 하룻밤 배양에서 플라스미드를 추출하세요.
   13. 분광광도계로 플라스미드 농도를 측정한 후 시열 분석을 위해 보내세요.
3. 효모 표시 벡터의 선형화
   1. 효모 디스플레이 플라스미드를 선형화하여 pDD1524를 SphI 및 PstI 제한효소와 함께 분해하여 기질 카세트를 포함한 효모 디스플레이 벡터를 전기천공을 준비합니다. 표 10 에 나열된 시약을 혼합하여 37 °C에서 1시간 배큐합니다.
   2. 제한 분해 제품을 1% 아가로스 젤에 240V에서 30분간 돌립니다. 예상 DNA 길이에 맞는 밴드를 절제하고 젤 추출 키트를 사용해 정제하세요.
      참고: 50 μL 제한 소화당 약 0.5–1.0 μg의 총 DNA를 생성합니다. 각 전기천공마다 4μg의 선형 변환 베터가 필요하므로, 소화 반응을 그에 맞게 확대해야 합니다.

2. 전기천공

참고: 생물학적 물질 및 시약을 취급할 때 기관 안전 절차를 준수하고, 적절한 개인 보호 장비를 착용하며, 기관 지침에 따라 생물학적 및 화학 폐기물을 처리하십시오.

1. 완충제, 플레이트, 배지 준비 (전기천공 2일 전)
   1. 성장 배지 준비(1 × YPD; 2 × YPD; 합성 포도당 카사미노산(SDCAA+); 그리고 합성 갈락토스 카사미노산(SGCAA+), 플레이트(YPD 및 SDCAA), 전기천공 완충제, 그리고 표 5의 레시피에 따른 멸균수가 포함됩니다. 4°C에서 보관하세요.
2. EBY100 줄무늬 플레이트 준비 중.
   1. 글리세롤 스톡에서 YPD 한천 위에 EBY100 효모를 줄여 내세요. 30°C에서 2일간 재배하세요.
   2. 성장 후 플레이트는 4°C에 보관하세요.
      참고: 줄무늬가 있는 판은 최대 1개월간 사용할 수 있습니다; 접시에 연속 날짜를 표시하세요.
3. EBY100 전배양 준비 (전기천공 1일 전)
   1. 1× YPD 125mL를 500mL 에를렌마이어 플라스크에 준비합니다.
   2. 50mL 원뿔관 안에 1× YPD 25mL를 준비합니다. 마이크로피펫 팁을 사용해 2일간 배양한 플레이트에서 EBY100 세포를 채취합니다. 그 후 효모 세포를 피펫 팁에서 1 × YPD가 들어 있는 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
      참고: 세포 줄무늬는 약 1–2mm 길이의 얼룩을 형성해야 합니다.
   3. 마이크로피펫 팁을 제거하고 원뿔형 튜브를 소용돌이로 돌려 적절한 혼합을 보장합니다.
   4. 효모 세포가 포함된 1× YPD 25mL를 500mL 플라×스크에 옮겨 150mL 전배양물을 준비합니다. 믹스하기 위해 소용돌이.
   5. 분광광도계를 사용해 경로 길이 1cm의 두 개의 마이크로큐벳을 준비하여 OD₆₀₀ 을 측정합니다: 하나는 1 × YPD의 1 mL를 공백 대조군으로, 다른 하나는 1 mL의 전배양 대조군입니다
   6. 150mL의 사전 배양물을 30°C에서 하룻밤(16–20시간)에 270rpm의 궤도 진동으로 배양합니다.
4. 전기천공 당일, 원하는 초기 OD₆₀₀ 에서 아부배양 준비
   1. 표 5에 설명된 대로 컨디셔닝 버퍼와 성장 배지를 준비 합니다.
   2. 야간 전배양의 OD₆₀₀ 을 측정하세요(예상 OD₆₀₀₀은 17–22). 분광광도계의 선형 범위 내에 있으려면 사전 배양의 1:20 희석을 측정하세요.
   3. 100 mL 아배양 접종에 필요한 전배양 부피를 계산하세요. 초기 서브컬처 OD₆₀₀ 3.0–4.0이 권장됩니다.
   4. 500mL 에를렌마이어 플라스크에 2× YPD 100 mL에 배양물을 희석하여 원하는 초기 OD₆₀₀ 으로 희석합니다.
   5. 100 mL 아브컬처를 30 °C에서 270 rpm 궤도 진동으로 4시간 배양합니다.
5. 4시간 배양 중 배지 준비
   1. 얼음처럼 차가운 전기천공 완충제와 멸균수를 준비하세요(2.1.1단계에 따르면).
   2. 표 5의 레시피에 따라 100mL의 컨디셔닝 버퍼를 준비하세요. 각 변환마다 20mL의 컨디셔닝 버퍼를 사용하세요; 그에 맞게 규모를 키우세요. 실온(20–23 °C)에서 보관하세요.
      참고: 주의: 컨디셔닝 버퍼에는 디티오스레이톨(DTT)과 리튬 아세테이트(LiAc)가 포함되어 있으며, 이들은 피부와 눈 자극을 유발할 수 있는 화학적 자극물질입니다. 실험실 코트, 니트릴 장갑, 안전 안경 등 적절한 개인 보호 장비를 착용하고, 기관의 화학 안전 절차에 따라 시약을 다루세요. 사용하지 않은 용액과 사용한 완충제는 기관 지침에 따라 화학 폐기물로 폐기합니다.
   3. 성장 배지(50 mL) 준비: 2 × YPD 25 mL와 1 M 소르비톨 25 mL를 혼합합니다. 각 변이마다 8mL의 성장 배지를 사용하세요. 실온(20–23 °C)에서 보관하세요.
6. 4시간 배양 후 전기적합성 효모세포 제제.
   1. 100 mL 아위배양을 두 개의 50 mL 원뿔 튜브로 나누었습니다. 4°C, 1,500 × g에서 3분간 원심분리하여 세포를 채취한 후 배지를 디캔트합니다. 2.6.4 단계가 완료될 때까지 셀을 냉동 보관하세요.
   2. 각 세포 펠릿을 얼음처럼 차가운 멸균수 25mL로 부드럽게 재현탁합니다. 4°C, 1,500 g × 원심분리기를 3분간 사용한 후 매체를 디캔트합니다.
   3. 2.6.2단계를 반복합니다.
   4. 각 세포 펠릿을 25mL의 얼음 전기천공 완충제로 부드럽게 재현탁합니다. 4°C와 1,500 g × 원심분리기를 3분간 사용한 후 배지를 디캔트합니다.
   5. 세포를 얼음에서 꺼내고 각 세포 펠릿을 10mL 실온(20–23 °C) 조절 완충제로 부드럽게 재현탁합니다. 그 후 125mL 에를렌마이어 플라스크 하나에 모아 30°C에서 270rpm의 궤도 진동과 함께 30분간 배양합니다.
   6. 세포를 50mL 튜브에 부어주세요. 4 °C에서 원심분리기로 1,500 g × 3분간 가열합니다. 미디어를 디캔트하세요.
   7. 세포 펠릿을 50mL의 얼음 전기천공 완충제로 부드럽게 재현탁합니다. 4°C, 1,500 g × 원심분리기를 3분간 사용한 후 매체를 디캔트합니다.
   8. 약 100–200 μL 전기천공 완충제를 추가하여 세포 펠릿을 최종 부피 1mL로 재현탁합니다. 전기천공 전까지 세포를 얼음 위에 보관하세요.
      참고: 전기적극 셀은 냉동(즉, –80°C 냉동고에 보관)하여 나중에 사용할 수 있으며, 전기천공 효율이 크게 저하되지 않습니다.
7. 전기천공, 성장 및 도금
   1. 얼음 위에 0.2cm 간격의 프리 냉각 전기천공 큐벳.
   2. 재현탁된 펠릿 380 μL을 멸균된 1.5 mL 튜브에 옮깁니다. 플라스미드 DNA 4 μg 또는 선형 플라스미드 벡터 4 μg, 인서트 12 μg와 혼합합니다. 피펫팅으로 부드럽게 섞으세요.
      참고: 전기천공된 세포 수를 극대화하기 위해서는 벡터 및 삽입 DNA 농도는 이상적으로 700–800 ng/μL이어야 합니다. 농도가 그보다 낮으면 진공 농축기를 사용하세요.
   3. 현탁을 미리 냉각된 전기공공 쿠벳으로 옮깁니다. 5분간 얼음찜질하세요.
   4. 5분 후 보풀 없는 실험실용 물티슈로 큐벳 옆면을 닦아, 전기천공 시 아킹이 발생할 수 있는 잔여 습기를 제거하세요. 큐벳 금속판 위의 기포나 셀은 아크를 유발할 수 있으니 피하세요. 쿠벳의 차가운 온도를 유지하려면 플레이트 전극을 만지지 마세요.
   5. 50mL 원뿔형 튜브에 8mL의 성장 배지를 준비합니다.
   6. 전지를 전기공화하는 설정은 다음과 같습니다: 전압 2.5 kV, 정전 용량 25 μF, 저항 200 Ω⁹. 허용되는 시간 상수 범위는 2.8–4.5 ms입니다.
      참고: 주의: 전기천공은 고전압 전기 펄스를 포함합니다. 쿠벳이 제대로 자리 잡고 제조사의 사용 지침을 따르도록 하세요. 기관 지침에 따라 사용한 전기천공 쿠벳은 생물학적 유해 폐기물로 폐기해야 합니다.
   7. 즉시 원뿔형 튜브에서 나온 약 200μL의 성장 배지를 쿠벳에 붓고, 전기로 출혈된 세포를 50mL 원뿔 튜브로 옮깁니다. 추가로 200–350 μL의 성장 배지를 추가하여 큐벳에 보이는 액체가 남지 않을 때까지 추가합니다.
   8. 전기천공된 세포 50mL 원뿔 튜브를 30°C에서 8mL의 배지 속에 흔들지 않고 1시간 동안 배양합니다. 15분마다 튜브를 뒤집어 섞으세요.
   9. 세포를 1,500 × g, 25 °C에서 3분간 원심분리하여 수집합니다. 그다음 매체를 디캔트하세요.
   10. 전환된 세포의 선택을 유지하기 위해 적절한 효모 드롭아웃 배지에 세포를 재현탁합니다. TRP1 선택 마커가 포함된 플라스미드의 경우, 트립토판이 없는 250mL의 SDCAA+ 세포를 재현탁하여 플라스미드를 보유한 효모를 선택적으로 회수합니다.
   11. 30°C에서 하룻밤(16–20시간) 배양하며 궤도 진동을 270rpm으로 진행합니다.

3. 효모 세포의 유도, 염색 및 유세포 분류

1. 프로테아제 라이브러리와 기질 카세트 유도 (분류 1일 전)
   1. 2.4.2단계에 따른 OD₆₀₀ 을 측정하는데, 이는 드롭아웃 배지 내 전이체의 하룻밤 증식 후 됩니다.
   2. 효모 변형제 12mL를 알리콥트(aliquot)로 넣고 3,200 × g 에서 원심분리기를 5분간 사용하세요.
   3. 상청액을 제거하고 세포 펠릿을 SGCAA+ 유도 배지에 재현탁하여 OD₆₀₀ 0.5로 재현탁합니다. 희석 방정식인 C₁V₁ = C₂V₂를 사용하여 필요한 부유액을 계산합니다.
   4. 125mL 에를렌마이어 플라스크에 옮겨 30°C에서 18–24시간 동안 하룻밤 동안 성장시키고, 270rpm의 궤도 흔들림을 가합니다.
2. 형광 항체 염색 (분류 당일)
   1. 유도 후 세포의 OD₆₀₀ 을 측정하세요. 두 가지 쿠벳을 사용하세요: 하나는 1mL의 SGCAA+를, 다른 하나는 950μL의 SGCAA+와 50μL의 세포를 혼합한 것입니다. 측정된 OD₆₀₀ 값을 20으로 곱하면 유도 후 세포의 진짜 OD₆₀₀ 을 얻습니다.
   2. 항체 염색과 FACS 분류를 위해 각 샘플을 3× 10,⁷ 개의 세포로 정규화하세요. C₁V₁ = C₂V₂ 를 사용하여 유도 플라스크에서 옮길 셀의 부피를 계산합니다.
      참고: 4부위 NNS 포화 돌연변이 유발의 경우, 이론적 라이브러리 크기는 10⁶ 가지 변형입니다. 라이브러리를 충분히 샘플링하려면 라이브러리 크기의 최소 10배, 즉⁷ 셀 10개를 스크리닝하세요. 예시: 원한다면 C₁V₁ = 3 × 10⁷ 세포 및 C₂ = 유도 후 OD₆₀₀ / 6 / 6 (즉, 6 × 10⁷ 세포/mL)를 원한다면, 유도 세포 500 μL(즉, V₂ = 3 × 10⁷ 세포 / 6 × 10⁷ 세포 = 500 μL)를 알리코트합니다.
   3. 계산된 세포 부피를 1.5 mL 튜브에 옮기고 5,000 × g 에서 원심분리기를 5분간 투여했습니다.
   4. 상정액을 제거하고 500 μL 인산염 완충 생리식염수(PBS) + 0.5% 소 혈청 알부민(BSA)에 재현탁합니다.
   5. 5,000 g × 원심분리기를 5분간 하고 3.2.4 단계를 반복합니다.
   6. 5,000 g × 원심분리기를 5분간 진행하고, 그동안 3.2.7단계를 완료하세요.
   7. 항HA 형광섬유 이소티오시아네이트(FITC)(0.5 μg/10⁷ 세포), 항-FLAG 피코에리트린(PE)(0.05 μg/10⁷ 세포), PBS + 0.5% BSA(100 μL/10⁷ 세포)를 포함한 1.5 mL 튜브에 항체 염색 혼합물을 준비합니다. 튜브는 얼음 위에 보관하세요.
   8. 상정액을 제거하고 염색 혼합물과 함께 다시 부탁하세요. 3×⁷ 셀당 300μL의 염색 혼합물을 사용하세요. 튜브를 소용돌이로 만들지 마세요; 인버트나 플릭만 하세요.
   9. 재현금 후 세포를 어둠 속에서 1시간 동안 얼음 위에 보관하세요.
3. 스테인팅 후 워시
   1. 원심분리기로 세포를 5,000 × g에서 5분간 염색합니다. 상액을 제거하고 0.5% BSA가 포함된 PBS에 10⁷ 세포당 0.5 mL× 재현탁합니다(예: 10^{× 7} 세포당 500 μL 또는 3 × 10⁷ 세포 1.5 mL).
   2. 원심분리기 5,000 × g, 5분. 상청액을 제거하고, 750 μL PBS + 0.5% BSA에 재현탁합니다.
   3. 10mL 채집관에 PBS + 0.5% BSA를 추가로 750 μL 이송합니다.
4. FACS
   1. 새로운 실험을 위해 필요한 세포계기 시작 및 준비를 수행하세요.
   2. 세 개의 점플롯을 만드세요. 첫 번째 점표에서 X축 이름을 선택하여 전방 산란 영역(FSC-A) 채널을, Y축 이름을 선택하여 측면 산란 영역(SSC-A) 채널을 표시합니다.
      참고: 이는 살아있는 세포 선별을 용이하게 합니다.
   3. 두 번째 점도트에서 FSC-A 채널을 표시하려면 X축 이름을 유지하고, Y축 채널은 순방향 산란 높이(FSC-H)를 표시하도록 변경하세요.
      참고: 이 기능은 싱글렛 선택을 용이하게 할 것입니다.
   4. 세 번째 점표에서 PE 채널을 표시하려면 X축 이름을 선택하고, FITC를 표시하려면 Y축 이름을 선택하세요.
   5. 세포계에서 530/30nm(FITC)와 585/42nm(PE) 채널을 사용해 음의 대조를 실행하세요. 70 μm 노즐 과 70 psi 시스 압력으로 분류를 수행합니다. 샘플을 4000–5000 이벤트/초 속도로 획득하세요.
   6. 첫 번째 점플롯(FSC-A 대 SSC-A 대비)에서 FSC-A 및 SSC-A 신호가 낮은 이물질과 작은 입자를 배제하기 위해 온전한 효모 세포 주 집단 주위에 다각형 게이트를 그립니다.
   7. FSC-H와 FSC-A 플롯에서 FSC-H와 FSC-A 사이에 비례 관계를 보이는 선형 집단을 선택하여 이 게이트 내 게이트 싱글렛을 선택한다. 선형 분포에서 벗어나 이중항과 셀 집계에 해당하는 사건들은 제외합니다.
      참고: PE 대 FITC 세 번째 점플롯은 음성 대조군(즉, 온전한 기질 카세트를 발현한 효모 세포)을 위한 대각선 점군 군집을 표시할 것입니다.
   8. 샘플을 채취하고 원하는 PE/FITC 수치에 따라 효모 세포를 분류하여 수집관에 넣습니다. 모든 변이체를 적절히 표현하기 위해 이론 라이브러리 크기의 최소 10배에 해당하는 총 셀 수를 분석합니다(예: 이론적 다양성이 ~1 ×^{10 6}가지 변이체인 라이브러리에 대해 ~1 × 10^{7 셀을} 분석).
   9. 정렬 게이트를 음성 대조군의 PE/FITC 대각선 아래에 위치시킵니다.
      참고: 더 엄격한 게이트는 원하는 변이체의 농축을 개선하지만 세포 회복을 감소시킵니다.
5. FACS 이후
   1. 원심분리기 수집관을 3,200 × g에서 5분간 보관합니다. 상청액을 조심스럽게 제거하여 1mL만 남기고, 5mL의 PBS에 재현탁합니다.
      참고: 원심분리 후에는 세포 펠릿이 보이지 않으므로, 상청액은 1mL를 남겨두세요.
   2. 다시 3,200 g × 원심분리기 셀에 5분간 넣었습니다. 상원액을 제거하고 1mL만 남깁니다. SDCAA+ 4mL로 재현탁합니다.
   3. 250mL 얼렌마이어 플라스크에 SDCAA+ 15mL를 추가하세요. 3.5.2단계에서 재현탁된 세포를 이 플라스크로 옮깁니다.
   4. 30°C에서 18–24시간 동안 배양하며 궤도 진동을 270rpm으로 진행합니다.
   5. 각 방향성 진화 라운드마다 3.1, 3.2, 3.3, 3.4단계를 반복합니다.

4. 개별 클론의 플라스미드 회수 및 시서열 분석

1. 개별 군집을 키우기
   1. 3.5.4단계 이후 액체 배양액 500 μL와 멸균 50% 글리세롤 500 μL 혼합하여 글리세롤 스톡을 만들어 25% 글리세롤 스톡을 만듭니다. 소용돌이를 통해 세포들을 완전히 섞어.
   2. -80°C 냉동고에 하룻밤 보관하세요. 장기 보관을 위해서는 액체 질소로 옮기세요.
   3. 멸균된 1000 μL 팁으로 글리세롤 스톡을 긁어내고 100 μL SDCAA+ 액체에 섞습니다. 이 혼합물을 SDCAA 플레이트에 덮고 30°C에서 거꾸로 배양합니다.
   4. 3일 후에 군집을 따고, 14mL 튜브에 1.5mL SDCAA+ 주입 관에서 하룻밤 동안 배양하세요.
2. 플라스미드를 추출하기 위해 효모 미니프렙을 수행합니다
   1. 16,000 × g 에서 1분간 원심분리하여 하룻밤 배양을 하고, 효모 플라스미드 정제 키트에서 추출한 200 μL 용액 1에 재현탁합니다.
   2. 용해효소 용액 5 μL(5 U/μL)을 추가합니다.
   3. 37°C 인큐베이터에서 4시간 동안 종단 간 믹서 위에서 배양하세요.
   4. -80°C에서 20분간 얼린 뒤, 42°C에서 10분간 물욕에서 해동하는 동결-해동 사이클을 수행합니다.
   5. 효모 플라스미드 정제 키트에서 200 μL 용액 2를 추가하고, 2–3번 뒤집어 혼합한 후 5분간 방치합니다.
   6. 효모 플라스미드 정제 키트에서 400 μL 용액 3을 추가한 후 2–3번 역전하여 혼합합니다. 원심분리기 압력 16,000 g × 5분간 사용.
   7. DNA 결합 용량이 높은 정제 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 정제합니다.
      참고: 용해 세포에서 전단된 유전체 효모 DNA가 많이 나오기 때문에, 낮은 용량의 효모 플라스미드 DNA 정제 컬럼(5 μg) 대신 DNA 결합 용량이 높은 실리카 기반 컬럼(35 μg)을 사용해야 합니다¹⁵.
   8. 분광광도계를 사용해 DNA 농도를 측정하세요. DNA 수율은 10–30 ng/μL입니다.
3. 정제된 플라스미드를 화학적으로 적합한 대장균 세포로 변환합니다
   1. 표 5의 레시피에 따라 SOC 배지를 준비하고, LB-클로람페니콜 플레이트를 준비합니다. 또한, 물욕을 42°C로 예열하세요.
   2. 각 플라스미드마다 LB-클로람페니콜 플레이트를 37°C에서 20분간 예열합니다.
   3. -80 °C 냉동고에서 화학적으로 적합한 세포 한 관을 꺼내 얼음 위에서 해동하세요.
   4. 각 플라스미드마다 30 μL의 유능 세포를 얼음 위에 1.5mL 튜브에 넣습니다.
   5. 플라스미드 3 μL 용량을 정상 세포에 피펫 투여합니다. 뒤집어 섞고 얼음 위에 5분간 두세요.
   6. 42°C의 물욕에서 세포를 40초간 잠시 배양하여 열충격을 수행합니다.
   7. 얼음 위에 2분간 부양하세요.
   8. 세포에 300 μL SOC 배지를 첨가하고 37 °C, 220 rpm에서 15분간 배양합니다.
   9. 50–100 μL 형태의 변형된 유능 세포를 예열된 판에 플레이트 부착합니다.
   10. 플레이트를 37°C에서 거꾸로 18시간 부양하세요.
4. 군체 채취
   1. 14mL 둥근 배양관에 액체 LB-클로람페니콜 배지 5mL를 첨가합니다.
   2. 멸균된 1000 μL 팁을 사용해 군집을 골라 배양관에 넣으세요.
   3. 튜브를 셰이커(220rpm, 30°–45° 각도로 산소 공급을 극대화하기 위해 30°–45°)에 18시간 동안 넣습니다.
5. 박테리아 액체 배양에서 추출한 플라스미드
   1. 액체 배양물을 3,200 × g에서 4분간 원심분리하세요. 상액을 디캔팅하세요.
   2. 플라스미드 정제 키트를 사용해 하룻밤 배양에서 플라스미드를 추출하세요.
   3. 정제된 플라스미드의 농도를 분광광도계로 측정합니다.
6. 플라스미드를 시퀀싱을 위해 제출하세요
   참고: 전플라스미드 나노포어 시퀀싱 또는 또는 돌연변이 유발 영역 양옆에 프라이머를 부착한 생거 시퀀싱과 같은 서비스를 사용하세요.

결과

효율적인 라이브러리 구축은 돌연변이 공간의 충분한 보장을 보장하는 데 매우 중요합니다. 희귀 기능 변이의 손실을 방지하기 위해, 변환체 수는 이론적 라이브러리 크기의 최소 10×에서 100× 되어야 합니다. S. cerevisiae 의 형질 변환 효율은 세포 농도에 영향을 받으며, 초기 및 중간 로그 상 세포에서 가장 높기 때문에^, 전기천공 전에 초기 세포 밀도를 최적화했습니다. 효모 배양은 초기 OD₆₀₀ 값(1.0–4.0)으로 하위배양되어 4시간 동안 배양되었으며(n = 2–4개의 독립 생물학적 실험), 이후 최종 OD₆₀₀ 값이 S. cerevisiae 성장 곡선에 매핑되어 세포가 중간 로그 성장 단계에 남아 있음을 확인했습니다(그림 5A, 보충 그림 1).

4 μg 플라스미드 DNA로 이들 배양을 전기천공(n = 2개의 독립 생물학적 실험)을 통해 초기 OD₆₀₀ 조건에서 변형 효율이 유의미하게 차이를 보였다(일방향 ANOVA, p = 8.92 × 10^⁻7). OD₆₀₀ = 1.0에서 시작된 배양과 비교했을 때, 모든 높은 초기 세포 밀도가 유의미하게 더 높은 형질전환 효율을 보였습니다(Dunnett의 다중 비교 테스트; OD₆₀₀ = 1.5, 조정 p = 0.0020; OD₆₀₀ ≥ 2.0, 조정 p < 0.0001)에서 초기 OD₆₀₀ 에서 관찰된 가장 높은 변환 효율이 4.0이었습니다. 효모 세포가 가진 상동 재조합 능력을 활용하기 위해, 선형성 플라스미드 벡터 4 μg와 인서트(즉, 프로테아제 라이브러리) 12 μg를 효모 세포에 전기로 이식했습니다(n = 2건의 독립 생물학적 실험). 변환 효율은 시험된 초기 OD₆₀₀ 조건들 사이에서 유의미하게 차이가 났습니다(일방향 ANOVA, p = 0.0023). OD₆₀₀ = 1.0에서 시작된 배양과 비교했을 때, OD₆₀₀ = 3.0(조정 p = 0.0018), 3.5(조정 p = 0.0062), 4.0(조정 p = 0.0024)(Dunnett의 다중 비교 검정)에서 형질전환 효율이 유의하게 높았습니다. 우리는 중간 정도의 초기 아배양 밀도(OD₆₀₀ = 3.0)에서 가장 높은 형질전환 효율을 관찰했으며, 이는 이러한 조건에서 세포 능력과 재조합 효율성 간의 최적 균형을 나타냅니다(그림 5B). 플라스미드 단독 형질전환과 비교하면, 선형화된 벡터와 프로테아제 라이브러리 삽입물의 공전기천공(n = 2개의 독립 생물학적 복제)은 초기 OD₆₀₀ 조건에서 현저히 높은 형질전환 효율을 보였습니다(log10 형질전환 효율에 대한 양방향 ANOVA, p = 9.40 × 10⁻¹²). 평균적으로 코전공은 플라스미드 단독 형질전환에 비해 평균 121배 증가한 형질전환 효율(95% CI, 63–233배)을 보였습니다(그림 5B).

돌연변이 프로테아제 라이브러리와 기질 선택 카세트를 포함한 효모 세포의 FACS 실행 중(그림 6A), 세포는 절단된 카세트 또는 역선택 기질을 절단하는 프로테아제(Q1), 기능성 없는 프로테아제 변이체(Q2), 또는 선택 기질만 성공적으로 절단하는 프로테아제 변이체(Q3)를 나타냅니다. 비기능적 변이를 발현하는 효모 세포는 PE 및 FITC 플롯에서 대각선을 따라 분포한 우성 집단으로 나타났으며, 이는 두 신호의 공동 보존을 반영합니다(그림 6A, Q2). 반면, 선택 기질을 절단하고 원래(역선택) 기질은 보존한 기능적 변이체는 PE 세기가 높고 FITC 신호 강도가 중간에서 낮은 것으로 특징지어지는 뚜렷한 대각선 외 집단을 형성했습니다(그림 6A, Q3). 이 대각선 밖 집단을 격리하기 위해 엄격한 게이팅 전략을 적용하면,¹⁰번의 분류 단계에 걸쳐 기능적 변이의 점진적 풍부화가 이루어졌다. 이 풍부화는 대각선 군집에서 분리된 점점 더 뚜렷한 세포 군집으로 시각적으로 관찰됩니다(그림 6B, 왼쪽에서 오른쪽). 대각선 밖의 뚜렷한 개체군이 관찰되지 않는다면, 이는 라이브러리 품질이 낮거나, 발현이 불충분하거나, 염색 조건이 최적이 아닐 수 있습니다. 음성 대조군으로서 그림 6C,D는 전기천공된, 유도된 염색되지 않은 효모세포와 이에 대응하는 FITC 및 PE 형광 히스토그램을 보여줍니다.

비대각선 개체군 내에서 하위 집단은 FITC 강도에 따라 추가로 해소할 수 있습니다. 중간 FITC 신호를 보이는 셀은 낮은 FITC 신호를 가진 셀과 별도로 분류할 수 있습니다. 이 뚜렷한 집단을 시퀀싱한 결과, 고유한 돌연변이 프로필이 드러났으며(표 11), 이는 서로 다른 프로테아제 변이체와 관련된 절단 효율의 차이가 있음을 나타냅니다.

그림 1: 벡터 및 삽입물 준비. (A) 부위 포화 돌연변이 유발을 통한 포티바이러스 프로테아제 라이브러리 생성. (B) 기질 카세트 조립 및 효모 디스플레이 벡터(pDD1523)에 통합. (C) 효모 디스플레이 벡터(pDD1524)의 제한 소화를 통한 선형화. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: 기판 카세트와 PCR 증폭된 돌연변이 프로테아제 라이브러리를 유능한 EBY100 세포로 전기천공 하는 과정.(점선이 표시된 박스) 프로테아제와 기질 카세트를 모두 포함하는 플라스미드의 생체 내 원형화. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: 효모 세포의 유도, 염색 및 유세포 분류. (A) 단백질효소 라이브러리 및 기질 카세트의 유도. (B) 형광 항체 염색: 항HA 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)와 항-FLAG 피코에리트린(PE) 항체로 염색. (C) 염색된 세포는 형광활성화세포 분류(FACS)를 사용하여 분류됩니다. (D) 선택 배지에서 FACS로 분류된 세포의 회수. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4: 분리된 효모 세포의 플라스미드 회복 및 서열 분석. (A) 분리된 효모 세포의 플래팅. (B) 개별 효모 집락에서 플라스미드 추출. (C) 추출된 플라스미드의 대장균 형질전환. (D) 개별 대장균 집단에서 플라스미드 추출. (E) 추출된 플라스미드의 나노기공 시퀀싱. 플라스크와 튜브 아이콘은 각각 DBCLS와 헬리케이스 11에서 Bioicons(https://bioicons.com)를 통해 각각 적용되었으며, 크리에이티브 커먼즈 저작자 표시 4.0 국제 라이선스(CC BY 4.0) 조건에 따라 적용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 5: 다양한 배지 내 효모 성장 곡선과 600nm(OD₆₀₀) 서브컬처에서 초기 광밀도가 효모 전기천공 효율에 미치는 영향. (A) 1× 효모 추출물 펩톤 덱스트로스(YPD), 2× YPD, 항생제 없는 합성 덱스트로스 카사미노산 한가(SDCAA-), 항생제가 포함된 합성 덱스트로스 카사미노산 아가(SDCAA+)에서의 효모 성장 곡선. (B) 4 μg 플라스미드 벡터로 전기공링한 효모의 초기 OD₆₀₀ 서브배처 효모의 형질 효율, 그리고 선형화 벡터(4 μg)와 프로테아제 라이브러리 삽입물(12 μg)을 사용한 동일한 초기 OD₆₀₀ 값에서의 형질전환 효율. (A)의 데이터는 OD₆₀₀ ± SD 두 개의 독립적인 생물학적 실험에서 나온 것으로 제시됩니다 (n = 2). (B)의 데이터는 로그 y축 방향으로 전기천공당 평균 변환체 수로 제시되며, 개별 생물학적 복제체는 원으로 표시되어 있습니다 (n = 2). 플라스미드 및 벡터 플러스 인서트 전기천공 최적화 실험의 통계적 유의성은 log10 변환 전기천공 효율에 대한 일원 ANOVA를 사용해 산출한 후, OD₆₀₀ = 1.0을 대조군으로 사용한 Dunnett의 다중 비교 검정을 수행하였습니다. ns, 중요하지 않음; p < 0.01 (**); p < 0.0001 (****). 플라스미드 단독 및 벡터 플러 인서트 변환 효율 차이의 통계적 유의성은 log10 변환 효율에 대한 양측 ANOVA를 사용하여 결정하였다. p < 0.0001 (****). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 6: 효모 클론의 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 기반 농축. (A) 게이팅 전략의 도식적 표현. 세포는 세 영역으로 나뉘었습니다: Q1, 피코에리트린(PE) 저세포; Q2, PE 고/플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 높은 세포; Q3, PE 고혈질을 가진 낮은 중간간 FITC 형광을 가진 세포입니다. Q3 내 세포를 채취하여 농축을 진행하였다. (B) FITC 게이팅 엄격성이 점점 높아지는 순차적인 정렬 라운드를 보여주는 독립 진화 캠페인의 대표 FACS 플롯. 중간과 저FITC 세포를 별도로 수집하여 시퀀싱을 진행하였다. 백분율은 게이트 집단 내 살아있는 단일 효모 세포의 비율을 나타냅니다. (C) 전자포공되고 염색되지 않은 효모세포를 음성 대조군으로 보여주는 대표적인 FACS 플롯. (D) (C)에 표시된 데이터에 대응하는 FITC-A(왼쪽)와 PE-A(오른쪽) 형광강도의 히스토그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

표 1: 프로테아제 라이브러리의 1차 PCR 증폭을 위한 반응 혼합물. 프로테아제 라이브러리의 1차 증폭에 사용된 PCR 반응의 조성, 50 μL 반응에서 각 시약의 최종 농도와 양을 포함합니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

표 2: 프로테아제 라이브러리의 1차 PCR 증폭 사이클링 조건. 열 사이클링 프로그램은 프로테아제 라이브러리의 1차 PCR 증폭에 사용되었습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

표 3: 프로테아제 라이브러리의 2차 PCR 증폭을 위한 반응 혼합물. 프로테아제 라이브러리의 2차 증폭에 사용된 PCR 반응의 조성, 50 μL 반응에서 각 시약의 최종 농도와 양을 포함합니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

표 4: 프로테아제 라이브러리의 2차 PCR 증폭 사이클링 조건. 열 사이클링 프로그램은 프로테아제 라이브러리의 2차 PCR 증폭에 사용되었습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

표 5: 효모 전기천공 및 성장을 위한 배지 및 시약. 각 화학 성분에서 필요한 질량을 표로 설명하여 1× 및 2× 효모 추출물 펩톤 덱스트로스(YPD), 전기천공 버퍼, 조절 버퍼, 성장 배지, 항생제 함유 합성 덱스트로스 카사미노산(SDCAA+), 항생제가 포함된 합성 갈락토스 카사미노산(SGCAA+), 용해성 육수(LB) 배지, LB-클로람페니콜 배지, 슈퍼 최적 육수(SOB) 배지, 그리고 이산화물 억제(SOC) 배지를 포함한 초최적 육수(SOC) 배지를 조제하는 데 필요한 질량을 표로 설명합니다. 2M 소르비톨, 1M 디티오트레이톨(DTT), 2M 리튬 아세테이트(LiAc)와 같은 스톡 용액 제조 지침이 포함되어 있습니다. SDCAA, LB, YPD 한천 플레이트 준비에 대한 추가 지침이 제공됩니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

표 6: 올리고의 어닐링 및 인산화를 위한 반응 혼합물. 기판 카세트 조립을 위한 올리고뉴클레오타이드의 동시 어닐링 및 인산화에 사용되는 반응 혼합물의 조성. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

표 7: 올리고의 어닐링 및 인산화를 위한 사이클링 조건. 기질 카세트 조립을 위한 올리고뉴클레오타이드 어닐링 및 인산화에 사용되는 온도 프로그램. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

표 8: 기질 카세트와 벡터 플라스미드의 골든 게이트 조립을 위한 반응 혼합물. 기질 카세트를 벡터 플라스미드에 연결하는 데 사용된 골든 게이트 조립 반응의 조성. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

표 9: 기질 카세트와 벡터 플라스미드의 골든 게이트 조립 사이클링 조건. 골든 게이트 조립에 사용되는 열 사이클링 프로그램. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

표 10: 벡터 플라스미드의 선형화를 위한 반응 혼합물. 라이브러리 구축 전에 벡터 플라스미드를 선형화하는 데 사용된 제한 분해 반응의 조성. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

표 11: ENLYFES를 절단하는 TEVp 변이체의 나노기공 시퀀싱 결과. 플라스미드는 네 번째이자 마지막 FACS 세션 후 효모 세포에서 추출되었습니다. 각 클론의 돌연변이는 야생형 서열에 대해 상대적으로 표시됩니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 그림 1: 하위문화 기간 동안 초기 EBY100 배양 밀도와 최종 배양 밀도 간의 관계. EBY100 배양은 초기 OD₆₀₀ 값이 다양한 상태로 하위배양되었고, 최종 OD₆₀₀ 은 동일한 성장 조건(30 °C, 220 rpm)에서 인큐베이션 후 측정되었습니다. 최종 배양 밀도는 초기 OD₆₀₀ 이 증가함에 따라 선형적으로 증가했다(R² = 0.969, p = 5.77 × 10^⁻⁵). 데이터 포인트는 독립적인 생물학적 복제± (n = 2–4) SD 평균을 나타냅니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 2: TEVp 돌연변이 유발 라이브러리의 합리적 설계. TEVp(PDB ID: 1LVB)의 만화 표현으로, P1 잔기(보라색)에서 4개의 잔기(금)<5Å가 부위 포화 돌연변이 유발 대상입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

지향 진화는 다양화와 선택의 반복 주기를 사용하여 향상된 또는 새로운 생화학적 기능을 가진 단백질을 식별하는 고처리량 방법이다¹⁷. 이 프로토콜에서는 S. cerevisiae의 세포-표면 표시 시스템을 이용해 단백질-기질 인식을 진화시키기 위한 최적화된 워크플로우를 상세히 설명합니다. 표면 디스플레이 시스템은 프로테아제 활성을 검출 가능한 형광 기반 표현형에 매핑하여 원하는 클론의 FACS 기반 농축을 가능하게 합니다. 프로테아제 라이브러리 및 기판 카세트 조립, 고효율 전기천공, FACS 게이팅 및 분류, 프로테아제 변이체의 최종 시퀀싱에 대한 상세 절차를 제공합니다.

지향 진화에서 가장 중요한 단계 중 하나는 충분한 라이브러리 다양성과 잠재적 돌연변이에 대한 포괄성을 보장하는 것입니다. 우리의 전기천공 효율 실험은 초기 서브컬처 OD₆₀₀ 3.0이 10⁹ CFU를 초과하는 가장 높은 형질전환 효율을 보임을 보여줍니다. 최적화된 효모 전기천공으로 달성된 이 규모는 기존 화학 변환 방법을 훨씬 뛰어넘으며, 대규모 조합 라이브러리를 충분히 커버할 수 있게 합니다 ^8,9. 정확한 FACS 게이팅과 분류는 원하는 절단 특성을 보이는 세포와 비특이적 절단 특성을 보이는 세포를 분리하는 데 필수적입니다. FACS 기반 선택의 여러 라운드를 거치면, 원하는 프로테아제 변이체를 선택적으로 농축하기 위해 게이팅 전략이 점점 더 엄격해집니다. 게이팅이 너무 광범위하면, 원하는 변이체와 함께 원하지 않는 세포도 분류될 수 있습니다. 엄격한 게이팅(예: 라운드마다 FITC 신호의 임계값을 점점 낮추는 것)은 세포 집단이 새로운 표적 기질 서열¹⁰에 대해 더 높은 특이성과 활성을 가진 프로테아제 변이체에 대해 농축될 수 있게 합니다. 이전 캠페인 ^7,18과 일치하여, 우리는 기질 P1 잔기 Q와 상호작용하는 TEVp 기질 결합 주머니 내 네 개의 잔기(T146, D148, H167, S170)에 대해 NNS-코돈 돌연변이 유발을 수행했습니다(보충 그림 2). 그림 6B에 표시된 FACS 플롯은 게이팅 전략과 풍부화 워크플로우를 보여주는 단일 대표 분류 실험을 나타냅니다. 흥미롭게도, 우리의 캠페인 결과는 다른 아미노산 돌연변이 세트를 가진 TEVp 변이를 발견했습니다(표 11). 이 결과들은 프로테아제 진화의 핵심 특징을 뒷받침합니다: 여러 진화 경로가 동일한 목표를 달성할 수 있다는 점입니다.

실험을 수행할 때 수정과 문제 해결 전략이 필요할 수 있습니다. 예를 들어, 전기천공 중에는 얼음 위에서 작업할 때 지시가 있을 때 얼음 위에 작업하고, 각 단계에서 세포 펠릿을 조심스럽게 재현지하여 전기천공 전에 세포가 살아있고 건강한지 확인합니다. 효모세포는 전기천공 단계부터 성장 회복 단계까지 매우 섬세합니다. 또한, 효모 세포 응집을 방지하기 위해 FACS 피집액의 변형이 필요할 수 있습니다. 피유는 FACS 기계에서 흔히 사용되며, 박테리아와 곰팡이 성장을 억제하는 방부제가 포함될 수 있습니다. 따라서 분류 과정에서 세포 사멸을 방지하기 위해 피집 액체를 순수 PBS로 대체할 수 있습니다.

효모 표면 표시 시스템은 분비 경로를 성공적으로 통과하기 위해 적절히 접힌 단백질이 필요합니다. 일부 프로테아제 변이체는 오접힘으로 인해 활성이 저하될 수 있으며, 이는 비특이적 절단이나 배경 형광으로 인한 FACS 선택 중 위양성으로 이어질 수 있습니다. 이와 같은 플라스미드 기반 캠페인에서는 잘 규명된 위양성 원천이 주목할 만합니다. 절단은 C-말단 에피토프 태그의 손실로 읽히기 때문에, 그 태그를 교란하는 돌연변이는 실제 절단 사건과 동일한 저-FITC 표현형을 낳습니다; 이러한 태그 돌연변이는 대규모 상동 재조합 과정에서 발생하며, 연속적인 분류 라운드에 걸쳐 농축될 수 있습니다. 최근에는 일정한 기질 카세트의 염색체 통합이 이 문제를 완화하는 것으로 나타났습니다¹⁹. 이 프로토콜은 벡터(기질 카세트 포함)를 일정하게 유지하면서 삽입 라이브러리를 사용하는 방식입니다. 따라서 이 프로토콜은 프로테아제와 기질 라이브러리를 모두 진화시키고자 하는 이들에게는 적합하지 않습니다.

YESS 플랫폼은 프로테아제-기질 특이성을 재프로그래밍하는 일반적인 경로를 개척했습니다.¹⁸. 최근 개선 사항으로는 YESS2.0⁷에서 적정 효소/기질 조절 추가, 차세대 시퀀싱과의 결합, 고해상도 특이성 프로파일링 가능(²⁰), 그리고 발현 잡음 및 위양성 감소를 위한 리포터의 염색체 통합 등이^{있습니다.} 파지 보조 연속 진화와 같은 다른 직교 전략도 치료 표적에 대한 프로테아제 특이성 설계에 적용되었습니다²¹. 이 도구들은 TEV 프로테아제 공학을 넘어 SARS-CoV-2 주 프로테아제의 고해상도 프로파일링을 통해 억제제 설계를 안내하는 등 다양한 응용 분야를 발견했습니다²². 이러한 캠페인의 중요한 결정 요인은 EBY100 S. cerevisiae 균주에서는 체계적으로 최적화되지 않은 대규모 조합 라이브러리(>10⁹)를 포괄할 수 있는 충분한 변환 물질을 생성하는 것이다. EBY100 형질전환을 10⁹ CFU 이상으로 유도하는 성장 단계 및 전기천공 조건을 정의함으로써, 이 프로토콜은 병목 현상을 제거하여 수백만 개의 변이에 대한 포괄적인 FACS 기반 스크리닝을 가능하게 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Reagents
10 mM dNTP Mix	NEB	N0447S	PCR reactions (Tables 1, 3)
10X PBS, pH 7.4	Fisher	BP3994	Staining buffer base (Steps 3.2–3.3)
5X Q5 Reaction Buffer	NEB	B9027S	Sold separately; also included with Q5 polymerase
Agar, Bacto	BD Difco	281230-500g	SDCAA agar plates (Table 5); 15 g/L
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)	Fisher BioReagents	BP160-500	Gel Electrophoresis
Anti-FLAG PE Antibody	BioLegend	637309	FACS staining; PE-conjugated anti-FLAG
Anti-HA Tag Antibody [FITC]	GenScript	A01621	FACS staining; FITC-conjugated anti-HA
Bacto Casamino Acids	BD Difco	223120	SDCAA+, SGCAA+, SCAA media (Table 5); 5 g/L
Bacto Peptone / Tryptone	RPI	T60060-10000.0	LB/SOB media preparation; 20 g/L in YPD (Table 5)
BSA, Bovine Serum Albumin, Fraction V	Sigma-Aldrich	126575-10GM	0.5% in PBS; staining buffer (Steps 3.2–3.3)
BsmBI-v2 (200 U)	NEB	R0739S	Golden Gate assembly of substrate cassette (Table 8)
Calcium chloride solution (1M)	Sigma-Aldrich	21115-100mL	Electroporation buffer: 1 mM final (Table 5)
ColiRollers® Plating Beads	Sigma-Aldrich	71013-3	Sterilize by putting in reagent bottles and autoclaving at 121ºC, 15 psi, for 15 mins.
D-Galactose	Thermo Fisher	A12813.30	250 g; 20% w/v stock for SGCAA+ induction (Table 5)
D-Sorbitol	Thermo Fisher	1327300.10	Electroporation buffer (1 M) and outgrowth media (Table 5)
Dextrose (D-Glucose), anhydrous	Sigma-Aldrich	G8270-1KG	YPD, SDCAA+, 20% w/v dextrose stock (Table 5)
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids	Sigma	Y0626-250G	6.7 g/L in SDCAA/SGCAA (Table 5)
Difco YPD Broth (pre-mixed)	BD	242820-500g	Pre-made YPD alternative; 500 g
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-1G	Conditioning buffer: 10 mM final; aliquot 250 μL, store −20°C
E.Z.N.A. CyclePure PCR Purification Kit	Omega Bio-tek	D6492-02	PCR product cleanup
E.Z.N.A. Gel Extraction Kit	Omega Bio-tek	D2500-01	Gel purification post-PCR and restriction digest (Steps 1.1.8, 1.3.2)
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I	Omega Bio-tek	D6942-02	Plasmid purification (Step 4.2)
Glycerol (≥99%)	Fisher	BP229-4	50% v/v stock for glycerol stocks (Step 4.1.1)
Kanamycin Sulfate	Fisher	BP906-5	SDCAA+ and SGCAA+: 50 μg/mL final; replaces Sigma K0879-5G
KLD Enzyme Mix	NEB	M0554S	Kinase-Ligase-DpnI; site-directed mutagenesis
KLD Reaction Buffer	NEB	B0554A	Used with KLD Enzyme Mix
LB Broth (Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022-1KG	E. coli liquid culture
Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc·2H2O)	Thermo Fisher	A17921.30	Conditioning buffer: 0.1 M final; add before DTT (Table 5)
Luria Agar (Luria-Bertani Agar)	RPI	L24020-2000.0	E. coli plating; replaces Sigma LB Agar Lennox L2897-1KG
OmniPur Casamino Acids	Sigma	2240-500GM	Alternative casamino acids source
pDD1523	Zenodo	10.5281/zenodo. 20746804	pCTCon2-TRP-CEN/ARS-Gal10-SPAga2-BsaI; Gal1-Aga2-sfGFP
pDD1524	Zenodo	10.5281/zenodo. 20746804	pCTCon2-Aga2-6xHis-ENLYFQS-FLAG-ENLYFES-HA-ERS
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Corning	30-002-CI	SDCAA+, SGCAA+: 1X final
PstI-HF (5000 U)	NEB	R3140S	Vector linearization (Table 10); use HF version
Q5 HF DNA Polymerase	NEB	M0492S	High-fidelity polymerase; alternative to Q5 Hot Start
Q5 High GC Enhancer	NEB	B9028A	For high GC-content PCR reactions
Q5 Hot Start DNA Polymerase	NEB	M0491L	PCR assembly and amplification (Tables 1, 3)
rCutSmart Buffer (10X)	NEB	B6004S	Supplied with PstI-HF and SphI-HF (Table 10)
SalI-HF	NEB	R3138L	Additional restriction enzyme
SOC Medium	NEB	B9020S	Post-transformation recovery
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher	S271-1	LB / SOB media preparation
Sodium Hydroxide (NaOH)	Fisher	S318-500	Media pH adjustment
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S9763-500G	SDCAA plates, SCAA media: 38 mM (Table 5)
Sodium Phosphate Monobasic, anhydrous	VWR (BDH)	BDH4542-1KGP	SDCAA plates, SCAA media: 62 mM; replaces NaH2PO4·H2O monohydrate
SphI-HF (1000 U)	NEB	R3182S	Vector linearization in tandem with PstI-HF (Table 10)
Streptomycin	Life Technologies / Sigma	S6501-5g	Antibiotic
T4 DNA Ligase Buffer (10X)	NEB	B0202S	Table 6
T4 Polynucleotide Kinase (500 U)	NEB	M0201S	Table 6
T7 DNA Ligase (3000 U/mL)	NEB	M0318S	Table 8
Yeast Extract	RPI	Y20020-5000.0	YPD (10 g/L) and LB/SOB media
Zymolyase (1000 U)	Zymo Research	E1004-A	Yeast cell wall digestion for plasmid extraction (Step 4.2.2)
Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep II	Zymo Research	D2004	Yeast plasmid extraction; includes Solutions 1, 2, 3 (Step 4.2)
ZymoPURE II Plasmid Midi Kit	Zymo Research	D4201-B	Mid-scale plasmid prep; for larger-volume preparations
Equipment and Consumables
Disposable Cuvettes, 1.5 mL	Fisher	14-955-127	For measuring OD600 of liquid cultures
Erlenmeyer Flask, 125 mL	VWR	10536-912	Pre-culture and conditioning incubation
Erlenmeyer Flask, 250 mL	VWR	10536-914	Yeast subculture
Erlenmeyer Flask, 250 mL	VWR	75809-646	Wide-mouth variant
Erlenmeyer Flask, 500 mL	VWR	10536-926	Main pre-culture flask (Step 2.3.1, 2.4.3)
Falcon 50 mL Conical Tubes	Falcon	352070	Cell washes, centrifugation throughout protocol
Flow Cytometry Sorter: BD Fusion	BD Biosciences	FACSAria Fusion Flow Cytometer (catalog number not applicable)	For Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)
Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap	Bio-Rad	1652086	For electroporation of electrocompetent EBY100
GenePulser Xcell Electroporation System	Bio-Rad	1652660	INSTRUMENT; 2.5 kV, 25 μF, 200 Ω (Step 2.7.6)
New Brunswick Innova 40R - Benchtop Orbital Shaker	Eppendorf	M12990084	For yeast liquid culture incubation
Petri Dishes, 100 mm	Fisher	FB0875712	YPD and SDCAA agar plates
SpectraMax QuickDrop UV-Vis Spectrophotometer	Molecular Devices	SpectraMax QuickDrop	For measuring OD600 of liquid cultures and DNA concentration
Vacufuge plus	Eppendorf	2231001204	For concentrating DNA
Software
BD FACSDiva (Version: 8.0)	BD Biosciences	https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/software/instrument-software/bd-facsdiva-software	Collection of tools for flow cytometer and application setup, data acquisition, and data analysis
Benchling (Version: Web-based platform, continuous release)	Benchling, Inc.	https://www.benchling.com/	Sequence design software
SnapGene (Version: 8.0.1)	SnapGene, Inc.	https://www.snapgene.com/	Sequence design software