방법 논문

굴곡진 혈관 및 동맥류 내 혈관 내피세포 기능의 고해상도 이미징을 위한 3D 프린팅 희생 잉크 플랫폼

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DOI:

10.3791/72574

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2026년 9월 29일

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1Laboratory of Cell and Tissue Morphodynamics, Cell Biology and Physiology Center, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Biomedical Engineering and Physical Science Shared Resource, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health, 3Center for Biomedical Engineering Technology Acceleration, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health, 4Instrumentation Development and Engineering Application Solutions (IDEAS), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health

이 논문에서

요약

본 프로토콜에서는 압출 프린터 또는 살균된 희생 잉크의 수동 도포를 사용하여 굴곡진 구간이나 동맥류 구간이 포함된 혈관을 in vitro에서 설계하고 조립하는 방법과, 혈역학적 흐름 및 혈관 내피 세포 반응을 분석하는 방법을 상세히 설명합니다.

초록

혈관의 굴곡성과 동맥류는 다양한 인체 조직과 혈관 유형 전반에 걸쳐 심각한 건강 위험을 초래합니다. 이러한 혈관 형태의 변화는 혈류 역학의 이상을 일으키며, 이는 내피 세포 기능에 상당한 영향을 미칩니다. 이러한 혈관 질환 상태에 대한 동물 모델이 일부 사례에서는 유용했으나, 구축 비용이 많이 들고 해당 동물 종의 생리학적 특성으로 제한된다는 한계가 있습니다. 이에 대응하여, in vitro 3D 장기 칩(OOC) 모델은 인간 세포에서 혈관 기능과 내피 세포 반응을 평가하기 위한 강력한 도구 세트가 되었습니다. 각 OOC 모델마다 강점이 있지만, 생리학적 전단 속도와 압력 하에서 굴곡진 혈관 및 동맥류의 혈관 기능 핵심 지표인 혈관 투과성을 연구할 수 있는 접근성 높은 시스템이 필요합니다 . 본 연구에서 제시하는 방법론은 입문용 바이오프린터를 사용하여 경제적인 굴곡 혈관 모델 시스템 내에서 혈류 이상에 대한 인간 내피 세포의 반응을 연구할 수 있게 하며, 이 시스템으로 제작된 혈관은 생리학적 유체 유량, 투과성 연구, 고해상도 광학 현미경 관찰 및 생리학적 강도를 가진 세포외 기질 지지체와 호환됩니다.

서론

혈관의 형태는 혈관 기능의 중요한 지표이며, 혈관의 굴곡도와 동맥류는 다양한 질병 및 건강 위험의 주요 특징입니다. 혈관 굴곡도는 Marfan1, Turner2, Loeys-Dietz3와 같은 증후군에서 나타나는 것처럼 선천적일 수 있으며, 또는 고혈압, 당뇨병, 암 및 가능하게는 죽상동맥경화증4,5,6을 포함한 여러 질환의 특징으로서 생애 후반에 발달할 수 있습니다. 경동맥7, 관상동맥8, 대퇴동맥9, 대동맥10, 뇌동맥11을 포함한 동맥 조직의 동맥류는 자발적 박리 또는 파열로 인한 이환율 및 건강 위험과 관련이 있습니다. 혈관 굴곡도와 동맥류는 혈류의 불규칙성과 그에 따른 내피 염증을 유발할 뿐만 아니라, 기저 조직의 기능 부전과 염증을 나타낼 수도 있습니다. 예를 들어, 신생아와 어린이의 경우 동맥 굴곡 증후군은 소아 뇌졸중12, 지속성 폐고혈압 및 대동맥 박리4,13의 임상적 예측 인자가 됩니다. 성인의 경우 망막 혈관염은 굴곡진 망막 혈관으로 나타나며, 기저 염증이 해소됨에 따라 이러한 양상이 덜 뚜렷해집니다14. 굴곡도가 어떻게 감지되고 질병 진행을 촉진하는 비정상적인 신호로 변환되는지는 여전히 활발한 연구 분야입니다. 혈관을 내벽하는 내피세포가 이 과정에서 일차적인 센서 역할을 하는 것으로 생각됩니다. 혈관 굴곡도나 동맥류로 인해 유도된 교란 흐름 또는 저속 흐름은 전단 응력을 변화시켜, 염증 신호전달15 및 장벽 기능16에서 내피세포의 변화를 유발합니다. 내피세포는 일차 섬모17, 기계적 자극 민감성 부착 단백질18,19, 그리고 이온 통로20,21과 관련된 메커니즘을 통해 유체 흐름에 매우 민감하며, 이는 누출, 염증 및 내피세포 재프로그래밍22,23,24을 활성화할 수 있는 신호전달을 유도합니다. 따라서 굴곡진 혈관 기하학적 구조에 대한 내피세포의 반응을 연구하는 방법은 혈관 치료법 개발에 중요합니다.

혈관 질환 상태에서의 혈관 내피 세포 기능은 in vivo 동물 모델, 장기 칩(OOC) 시스템 및 바이오프린팅 접근법을 통해 모델링되어 왔습니다. 마우스 모델은 알려진 질환 유전자 발현을 제어할 수 있으며, 벽세포 및 면역 세포의 관여를 포함한 조직 구조와 생리학적 복잡성을 통합합니다. 죽상동맥경화증25, 마르판 증후군26 및 다양한 동맥류27,28,29의 마우스 모델은 혈관 기능 장애와 관련된 병리학적 통찰을 제공합니다. 이러한 장점에도 불구하고, RNA 시퀀싱과 같은 벌크 방식 외에는 혈관 내피 세포의 직접적인 관찰, 실험적 조작 및 정량화가 어렵습니다. 또한, 동물 모델은 윤리적 및 비용적 고려 사항이 수반되며 종 특이적 생리학으로 인해 한계가 있습니다.

층류 및 교란류에 대한 인간 혈관 내피세포의 반응을 연구하기 위해 2D33,34 및 3D35,36,37 시스템 모두에서 여러 in vitro OOC 접근 방식이 개발되었습니다30,31,32. 광범위한 OOC 문헌38은 주로 생체의학 공학에 의해 주도되었으며, 설계 특징들은 특정 생체의학적 질문들을 해결하는 방향으로 구성되었습니다. 많은 혈관 OOC 모델은 혈관 구조를 제어하기 위해 폴리디메틸실록산(PDMS) 지지체를 사용합니다38. 이러한 모델들은 복잡한 기하학적 구조를 고해상도로 제어할 수 있게 하며, 간39, 뇌40, 폐41를 포함한 장기-혈관 상호작용의 모델링을 가능하게 합니다. 하지만 제한 사항이 남아 있습니다. PDMS 및 유사 폴리머의 거대 분자에 대한 낮은 투과성은 혈관 장벽 기능 연구를 제한할 수 있습니다. 또한, 대부분의 경화된 PDMS는 약 0.8–10 MPa의 강성을 가지나42, 대안적인 배합을 통해 8–200 kPa의 더 생리학적인 범위의 강성을 구현할 수 있습니다43. 혈관 기저막 강성의 추정치는 혈관 유형과 측정 방법론에 따라 ~350 Pa44에서 ~70 kPa45까지 다양하며, 대부분의 건강한 혈관 기저막은 2–3 kPa 범위에 있습니다46. 죽상동맥경화증 및 고혈압과 같은 혈관 질환은 부분적으로 세포외 기질(ECM) 강성의 증가와 관련이 있고47,48,49,50,51, 내피세포가 ECM 강성에 반응하므로, in vitro 모델에서 강성을 생리학적 범위 내로 제어하는 것이 중요합니다. 보다 최근의 OOC 접근 방식들은 복잡한 기하학적 구조를 허용하는 생리학적 기질을 사용하거나52,53, 장기 기능을 재현하기 위해 여러 세포 유형을 통합하고39,54,55,56,57, 면역-혈관 상호작용을 구현하거나58, 환자 맞춤형 혈관 구조를 모델링하며59,60, 전임상 약물 개발을 지원합니다61,62. 다른 세포 유형과의 상호작용을 포함하는 많은 미세혈관 모델에서, 내피세포는 기하학적 구조가 비교적 제어되지 않은 상태로 자발적으로 혈관을 형성합니다63. 반대로, 제어된 유량 하에서 정의된 혈관 기하학적 구조를 가능하게 하는 OOC 시스템은 종종 상당한 공학적 인프라, 재료 및 전문 지식을 필요로 합니다53,64. 따라서 생리학적으로 유의미한 조건 하에서 혈관 세포의 거동 연구를 용이하게 하기 위해, 비전문가도 접근 가능한 견고한 방법론이 필요합니다.

생리학적 ECM 하이드로젤과 호환되는 바이오프린팅 플랫폼은 다양한 혈관 기하학적 구조에 걸친 내피세포 기능을 연구하기 위한 다각적인 in vitro 모델을 제공합니다65. 이러한 접근 방식은 혈관 모양으로 내피세포 함유 젤을 직접 증착하거나66, 희생 잉크를 사용하여 ECM 내에 개방형 관형 루멘을 생성한 뒤 이후 이를 용해시켜 내피세포를 파종할 수 있는 루멘을 남기는 방식을 사용합니다54. 젤라틴, 콜라겐, 피브린을 포함한 생체 적합성 ECM 기질은 혈관 기저막과 유사한 강도(1–3 kPa67)로 조정될 수 있으며, in vivo에서 사용되는 것과 유사한 혈관 투과성 분석을 가능하게 합니다. 이러한 방식은 PDMS 제작만큼의 정교한 형태 및 크기 해상도를 달성하지는 못하지만, 곡선형, 분지형 및 협착된 혈관을 생성할 수 있습니다52,66,68. 따라서 이러한 플랫폼은 굴곡진 혈관 및 동맥류 혈관을 포함한 혈관 기하학적 구조를 모델링하는 데 매우 적합합니다.

여기에 제시된 방법은 공압성 압출 기반의 3D 프린팅 방식, 3차원 마이크론 규모의 위치 제어, 프린트 베드 및 잉크 포함 프린트 헤드의 온도 제어, 그리고 신장-혈관 상호작용 칩 구현을 위해 이전에 개발된 희생 잉크(sacrificial ink)67,69를 이용합니다. 희생 잉크를 원하는 혈관 기하구조로 프린트한 후 즉시 ECM 내에 매립합니다. 이후 온도 변화를 통해 잉크를 제거하면 개방된 ECM 루멘(lumen)이 형성되며, 여기에 인간 혈관 내피세포를 시딩합니다. 기본 ECM은 젤라틴과 피브린으로 구성되어 신속한 겔화와 트롬빈 매개 피브린 중합을 가능하게 하며, 많은 혈관 기저막에 적합한 기계적 강성을 제공합니다. 혈관 기저막 조성을 더 잘 모사하고 내피세포 부착을 촉진하기 위해 라미닌 또는 피브로넥틴을 포함한 추가 ECM 성분을 통합할 수 있습니다70,71,72. 시스템은 금속 지지대, 실리콘 고무 가스켓, 고해상도 현미경 커버슬립이 포함된 재사용 가능한 Rose 챔버73 내에 조립되며, Luer-lock 니들을 통해 유체 펌프와 연결할 수 있습니다. 대안적으로, 상단 및 하단 플레이트는 폴리락트산(polylactic acid) 또는 탄소 섬유 강화 재료를 사용하여 3D 프린팅으로 제작할 수 있습니다. 조립된 시스템은 생리적 유체 흐름 속도에 의해 생성되는 압력을 견딜 수 있습니다. 또한, 저온 살균 절차를 통해 희생 잉크의 물리적 성질을 변화시키지 않으면서 멸균 상태를 개선할 수 있습니다. 아울러, 니들 템플릿 및 바이오잉크 방식을 사용하면 바이오프린터 없이도 동맥류(aneurysm)가 포함된 직선 혈관을 제작할 수 있습니다. 이렇게 제작된 내피세포화된 굴곡진 또는 동맥류성 혈관은 고해상도 광학 현미경을 사용하여 약 1주일 동안 생리적 흐름 하에서 관찰할 수 있으며, 이를 통해 변화된 혈관 기하구조에 대한 급성 내피세포 반응을 조사할 수 있습니다.

이 시스템의 주요 장점은 광학 현미경과의 호환성입니다. 이 프로토콜을 사용하여 생성된 In vitro 혈관은 여러 이미징 방식에 적용 가능하며, 특히 스피닝 디스크 또는 레이저 스캐닝 공초점 형광 현미경에 적합합니다. 이미징 조건을 선택할 때 공간 및 시간 분해능, 민감도, 대물렌즈의 작동 거리(working distance)를 고려해야 합니다. 이 시스템으로 생성된 대부분의 혈관의 경우, 대물렌즈는 커버스립으로부터 약 100–300 µm 지점에 도달하여 혈관의 중앙 지점을 이미징할 수 있는 충분한 작동 거리를 가져야 합니다. 소기관 및 세포 접착 부위를 포함한 내피 구조의 고해상도 이미징과, 흐름 하에서의 기준 비드(fiducial beads) 추적과 같이 높은 시간 분해능이 필요한 라이브 이미징을 위해서는 고개구수(high-numerical-aperture) 대물렌즈 가 필요합니다. 형광 기반 내피 장벽 측정과 같이 광자 포집 효율이 낮아도 되는 일부 분석은 10–20× 공기 대물렌즈와 같은 저개구수 대물렌즈를 사용하여 수행할 수 있습니다.

본 프로토콜은 생리학적 유체 흐름과 고해상도 현미경 관찰을 지원하는 in vitro 시스템에서 인간 혈관 내피 세포로 구성된 굴곡성 및 류성 혈관을 생성하는 방법을 설명합니다. 작업 흐름에는 혈관 설계, 챔버 제작, 희생 잉크 준비 및 3D 프린팅, ECM 준비 및 잉크 제거, 내피 세포 파종 및 흐름 하 배양, 혈관 누출 평가, 유동 매핑, 그리고 면역형광 염색이 포함됩니다(그림 1).

프로토콜

1. 용기 설계

  1. 현미경 호환 챔버 내에 들어갈 수 있는 혈관 세그먼트를 선택하십시오. Rose 챔버의 경우, 입구 및 출구 리저버 사이의 거리를 1.6cm 이하로 유지하십시오.
  2. 대조 CT 혈관 조영술(그림 2A), 자기공명 혈관 조영술 또는 투시 혈관 조영술 이미지를 ImageJ/FIJI 또는 다른 이미지 분석 프로그램으로 가져오십시오.
  3. 점 측정 도구를 사용하여 혈관의 축 중심을 따라 XY 좌표를 정의하십시오. 해당 좌표를 스프레드시트 프로그램으로 내보내십시오(그림 2B).
    참고: CT 혈관 조영술 유래 STL 파일은 대부분의 프린터 소프트웨어로 직접 가져올 수 있습니다. 하지만 폴리곤 기반 프린팅은 여러 번의 패스가 필요할 수 있으며 꼬인 형태의 혈관이 생성될 수 있습니다(Supplemental Figure 1). 단일 패스 프린팅을 위해서는 직접 G-code를 사용하십시오. 이러한 이유로 G-code를 이용한 좌표 매핑 및 설계가 권장됩니다. Supplemental Files의 G-code 예시를 참조하십시오.
  4. 스프레드시트의 XY 좌표를 수정하여 혈관의 중심이 그래픽 원점에 위치하도록 하십시오. 필요한 경우 챔버 경계를 가져와 최종 출력물이 챔버 내에 들어가는지 확인하십시오.
  5. 혈관 XY 좌표를 사용하여 첫 번째 프린팅 레이어에서 혈관을 설계하십시오(그림 2C). 혈관과 인접한 입구 및 출구 리저버를 포함한 첫 번째 레이어의 높이를 200µm로 설정하십시오.
  6. 바늘 삽입이 용이한 입구 및 출구 리저버를 생성하십시오. 유체를 혈관 입구 쪽으로 효율적으로 유도하여 유입 난류를 최소화하기 위해 적절한 경우 다이아몬드 형태의 리저버를 사용하십시오(그림 2).
  7. 리저버가 혈관과 인접하게 유지되도록 프린팅의 첫 번째 레이어에 포함시키십시오. 입구 및 출구 바늘을 배치할 수 있는 충분한 부피를 확보하기 위해 베이스 레이어 위에 5–9개의 레이어를 추가하십시오. G-code 설계 시 다음 세부 사항이 중요합니다:
    1. 온도 조절이 가능한 경우, 프린터 소프트웨어나 프린트 파일 시작 부분의 적절한 G-code 명령어를 사용하여 프린트 헤드와 프린트 베드를 37°C로 설정하십시오.
    2. 여러 개의 프린트 헤드가 있는 경우 G-code에서 프린트 헤드 또는 익스트루더를 지정하십시오. G-code가 절대 좌표와 압출 거리를 사용하도록 구성하십시오.
    3. 바늘의 크기와 모양, 잉크 유량 압력 및 프린트 헤드 속도에 따라 레이어 높이를 조정하십시오. 본 예시에서는 첫 번째 레이어 위의 각 리저버 레이어에 200µm 레이어 높이를 사용하십시오.
    4. 리저버의 경우 14–17psi의 배압과 6mm/s(G-code: F360)의 프린트 헤드 속도를 사용하십시오. 혈관의 경우 프린트 헤드 속도를 15mm/s(G-code: F900)로 높이십시오.
  8. 최종 혈관을 프린팅하기 전에 챔버가 없는 유리 슬라이드에서 각 새로운 혈관 설계를 테스트하십시오.

2. 희생 잉크 준비

  1. 멸균 마그네틱 바가 들어 있는 멸균된 밀폐 용기에 2.1g의 polyethylene oxide (PEO)를 차가운 멸균수 60mL에 첨가하여 3.5% w/v 용액을 준비한다. 4°C에서 최소 48시간 동안 교반하며, 모든 분말이 용해되었는지 주기적으로 확인한다.
    참고: PEO 용액은 밀폐 용기에 담아 4°C에서 최대 1개월 동안 보관한다.
  2. 멸균 마그네틱 바가 들어 있는 멸균된 밀폐 용기에 17.5g의 Pluronic F-127을 차가운 멸균수 50mL에 첨가하여 35% 용액을 준비한다. 4°C에서 최소 48시간 동안 교반하며, 분말이 완전히 혼합되었는지 주기적으로 확인한다.
  3. 멸균된 50mL 원추형 튜브에 차가운 3.5% PEO 11.4mL와 차가운 35% Pluronic F-127 28.6mL를 혼합한다. 회전 혼합기(rotary mixer)를 사용하여 4°C에서 최소 24시간 동안 혼합한다.
  4. 기포가 용액 위로 떠올라 제거될 수 있도록 튜브를 4°C에서 하룻밤 동안 세워 둔다.
  5. 잉크가 담긴 원추형 튜브를 항온수조에 넣고 63°C에서 3시간 동안 배양한다. 가열하는 동안 팽창하는 공기가 빠져나갈 수 있도록 캡을 약간 열어 둔다.
  6. 튜브를 항온수조에서 꺼내 실온까지 서서히 식힌다. 용액이 식은 후 캡을 꽉 조인다.
  7. 살균된 잉크를 얼음 위에 2시간 동안 두고, 기포가 생기지 않도록 가끔씩 부드럽게 흔들어 준다.
  8. 주사기 플런저를 제거하고 바늘 포트를 캡으로 막은 뒤, 주사기 용량의 60%–70%까지 채운다. 플런저를 삽입하고 주사기를 거꾸로 세운 뒤, 바늘 포트 캡을 제거하여 갇혀 있는 모든 공기를 배출한다.
    참고: 채워진 주사기는 실온에서 최대 1개월 동안 보관한다.

3. Rose 챔버 제작 및 배관 준비

  1. 알루미늄으로 상단 및 하단 클램프 플레이트를 제작하거나, 제공된 CAD/STL 파일을 사용하여 플레이트를 3D 프린팅합니다(그림 2). 고개구수 대물렌즈가 접근할 수 있도록 충분히 큰 베벨 형태의 하단 포트를 포함하고, 가스켓에 밀착되어 커버슬립을 단단히 압착할 나사용 지지 테두리를 만듭니다.
    참고: 가열 스테이지 현미경 사용 시 알루미늄이 더 나은 열전달 효율을 제공합니다. 3D 프린팅된 PLA 또는 탄소 섬유 강화 부품은 프로토타이핑에는 적합하지만, 열전달 효율이 낮을 수 있으며 반복적인 가열 시 변형될 수 있습니다.
  2. 실리콘 시트를 38mm × 51mm 클램프 플레이트 크기에 맞게 자릅니다. 18mm 홀 펀치를 사용하여 중앙 관찰창을 만듭니다.
  3. 선택한 나사 직경에 적합한 구멍을 뚫습니다. 완성된 가스켓을 물로 충분히 헹궈 잔류 실리콘 부스러기를 제거합니다.
  4. 금속 클램프 플레이트, 나사, 너트 및 실리콘 가스켓을 밀폐된 알루미늄 호일 파우치에 넣어 20분간 건조 사이클로 오토클레이브 멸균합니다.
  5. 3D 프린팅된 플레이트를 70% ethanol에 1분 동안 담급니다. 멸균 구역에서 플레이트를 건조합니다.
  6. Luer-lock 커넥터와 인라인 튜브 클램프가 장착된 10–30cm 길이의 튜브, 적절한 연동 펌프 튜브, 3방향 스톱콕, 펄스 댐퍼 및 2포트 배지 저장조를 준비합니다(그림 3).
  7. 내열성 튜브 및 저장조 구성품은 오토클레이브로 멸균합니다. 오토클레이브가 불가능한 구성품은 ethanol에 노출시켜 멸균합니다.

4. 세포외 기질 시약 준비

  1. 37°C로 데운 PBS 12.5mL를 인간 혈장 피브리노겐(human plasma fibrinogen) 1g에 넣어 80mg/mL 스톡 솔루션을 준비한다. 37°C에서 배양하며, 볼텍싱 없이 가끔씩 부드럽게 흔들어준다.
  2. 피브리노겐이 용해되어 뿌연 용액이 형성될 때까지 1~2시간 동안 둔다. 용액을 멸균 튜브에 소분하여 −20°C에서 최대 3개월 동안 보관한다.
  3. 마그네틱 스터 바가 들어 있는 멸균 병에 멸균 PBS 135mL와 젤라틴 22.5g을 넣는다. 70°C에서 16시간 동안 교반하며, 완전히 용해되도록 병을 주기적으로 흔들어준다.
  4. 1M NaOH를 사용하여 젤라틴 용액의 pH를 7.5로 조정한다. 용액이 뜨거운 상태에서 진공 여과한 후, 소분하여 4°C에서 최대 6개월 동안 보관한다.
    참고: 여과 전 젤라틴을 최소 16시간 동안 불린다(bloom). 필터 막힘을 최소화하기 위해 진공 여과 중에 용액과 여과 장치를 37°C로 유지한다.
  5. 인간 혈장 트롬빈(human plasma thrombin)을 멸균 PBS에 녹여 1,000 U/mL 농도로 준비한다. 부드럽게 섞은 후, 소분하여 −20°C에서 최대 1년 동안 보관한다.
  6. 트랜스글루타미나아제(transglutaminase) 300mg을 PBS 5mL에 녹이고 37°C에서 가끔 섞어주며 1시간 동안 배양한다. 용액을 새 튜브에 멸균 여과하여 옮기고 실온에서 유지한다.
    참고: 트랜스글루타미나아제 용액은 매일 새로 준비한다. 분말 형태의 트랜스글루타미나아제는 4°C에서 건조 보관한다.
  7. 염화칼슘을 물에 녹여 1M 용액을 준비한다. 용액을 멸균 여과하여 실온에서 최대 1년 동안 보관한다.

5. 커버스립 준비 및 활성화

  1. 깨끗한 커버슬립을 에탄올에 담근 후, 분젠 버너 불꽃 위에 조심스럽게 통과시켜 에탄올을 증발시킵니다.
    주의: 에탄올은 가연성 물질입니다. 대용량 에탄올은 열린 불꽃에서 멀리 두고, 적절한 실험실 화재 안전 절차에 따라 화염 멸균을 수행하십시오.
  2. 유리가 깨지거나 이가 나가지 않도록 커버슬립을 스테인리스 스틸 랙에 배치합니다.
  3. 물에 희석한 0.5% (3-aminopropyl) trimethoxysilane에 커버슬립을 담그고 실온에서 30–60분 동안 둡니다. 배양하는 동안 가볍게 흔들어 줍니다.
    주의: (3-aminopropyl) trimethoxysilane을 취급할 때는 적절한 화학 보호 장비와 공학적 제어 장치를 사용하십시오.
  4. 가볍게 흔들어 주면서 6회 물을 교체하며 커버슬립을 세척합니다. 랙을 옮기는 동안 커버슬립이 이탈되지 않도록 주의하십시오.
  5. 랙을 물에서 꺼내어 여분의 물기를 닦아내고, 50°C에서 30분 동안 건조합니다.
  6. PBS에 0.5% glutaraldehyde를 준비하는 동안 커버슬립을 실온으로 식힙니다.
    주의: Glutaraldehyde는 독성과 자극성이 있습니다. 적절한 개인 보호 장비를 착용한 상태에서 적절한 화학 흄 후드 내에서 용액을 준비하고 취급하십시오.
  7. 기포 축적을 최소화하고 균일한 활성화를 촉진하기 위해, 가볍게 흔들어 주면서 0.5% glutaraldehyde에서 커버슬립을 60분 동안 배양합니다.
  8. 멸균수를 3회 교체하며 커버슬립을 헹구고, 실온에서 자연 건조시킵니다.
    참고: 활성화된 커버슬립은 진공 데시케이터 내에서 최대 2개월까지 보관할 수 있습니다.

6. 커버슬립에 세포외 기질 기초층 코팅하기

  1. 1× PBS, 젤라틴 스톡 및 피브리노겐 스톡을 37°C에서 30~60분 동안 가온합니다.
  2. 멸균된 15cm 페트리 접시 바닥에 깨끗한 파라필름을 깔고, 표면에 70% 에탄올을 분무한 뒤 과량의 액체를 제거하고 생물안전작업대(biosafety cabinet) 내에서 자연 건조시킵니다.
  3. 15mL 원추형 튜브에 가온된 PBS 1.68 mL, 젤라틴 스톡 2.5mL, 1M CaCl₂ 12.5µL, 피브리노겐 스톡 625µL, 트랜스글루타미나아제 용액 167µL를 순차적으로 첨가합니다.
  4. ECM 혼합물을 37°C 항온수조에서 30분 동안 둡니다.
  5. 커버슬립 하나당 5µL의 트롬빈 스톡이 들어있는 1.7mL 튜브를 각각 준비합니다.
  6. 트롬빈 튜브에 ECM 준비액 400µL를 첨가하고, 기포 발생을 최소화하면서 피펫팅으로 한 번 섞어줍니다.
  7. 혼합물 200µL를 멸균된 파라필름 위에 즉시 분주하고, 핀셋을 사용하여 활성화된 커버슬립 하나를 방울 위에 올립니다. 커버슬립을 가볍게 눌러 전체적으로 덮이게 합니다.
    참고: ECM 혼합물과 트롬빈을 결합한 후 약 20초 이내에 이 단계를 완료하십시오.
  8. 페트리 접시를 덮고 코팅된 커버슬립을 실온에서 10분 동안, 이어서 습윤 인큐베이터의 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
  9. 파라필름을 커버슬립 반대 방향으로 굽혀 각 커버슬립을 파라필름에서 조심스럽게 떼어냅니다.
  10. 새로 코팅된 커버슬립의 젤 쪽이 위로 향하게 하여 습윤 인큐베이터 내의 깨끗한 페트리 접시에 두고 1일 이내에 사용합니다.
  11. 또는, 코팅된 커버슬립을 비습윤 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양하고 2일 이내에 사용합니다.

7. 희생 잉크를 바이오프린팅하고 ECM으로 캡슐화하기

  1. 혈관을 출력하기 전, 잉크와 출력 파라미터가 원하는 혈관 크기를 구현하는지 확인하기 위해 테스트 출력을 수행합니다. 출력 파일을 프린터 소프트웨어에 로드합니다.
    참고: 25% Pluronic F127/1% PEO 잉크와 32 G 테이퍼형 디스펜싱 니들을 사용하면 여기 설명된 조건에서 약 150µm까지의 혈관 직경을 안정적으로 구현할 수 있습니다. 유리 위에 단순한 선 출력물을 생성하여 프린트 헤드 속도와 배압을 최적화하십시오.
  2. 하단 클램프 플레이트, ECM 코팅된 하단 커버슬립, 실리콘 가스켓, 상단 커버슬립이 없는 상단 클램프 플레이트 및 나사 2개를 조립합니다. 조립체를 뚜껑이 덮인 100 mm 페트리 접시에 넣고 당일 사용할 때까지 37 °C로 유지합니다.
  3. 출력 니들을 잉크 시린지에 부착하고, 시린지를 공압 압출 프린터에 설치합니다. 출력 스테이지, 프린트 헤드 및 인접한 가열 플레이트를 37 °C로 예열합니다.
  4. 섹션 6에 설명된 대로 ECM 매트릭스를 준비하고 37 °C 항온수조에서 유지합니다. Rose 챔버당 1.5 mL의 매트릭스를 5 mL 단위로 준비합니다.
  5. 각 챔버를 위해 멸균된 1.7 또는 2 mL 튜브에 트롬빈 스톡 5 µL를 넣습니다. 활성화된 코팅되지 않은 추가 커버슬립을 생물안전 작업대(biosafety cabinet)에 준비해 둡니다.
  6. ECM 코팅된 커버슬립이 포함된 챔버를 프린터 스테이지에 놓고 XY 원점에 맞춥니다. 니들을 챔버 창 중심의 ECM 또는 유리 표면에 닿을 때까지 내리고, 이 위치를 XYZ 원점으로 정의합니다.
  7. 니들을 올리고 최대 압력을 가해 잉크를 완전히 채우고 눈에 보이는 기포를 모두 제거합니다. 멸균된 실험용 티슈로 니들 팁을 닦아냅니다.
  8. 업로드된 G-코드 파일을 사용하여 혈관 및 저장소 기하구조를 출력합니다. 출력이 끝나면 즉시 니들을 올리고 챔버를 제거합니다.
  9. 출력된 혈관에 기포나 불연속성이 있는지 검사합니다. 결함이 있는 구조물은 폐기하고 다시 출력합니다.
  10. 챔버를 37 °C 가열 플레이트에 놓고, 나사와 상단 클램프 플레이트를 제거한 뒤, 준비된 ECM 매트릭스 1 mL를 트롬빈 분주액과 피펫팅으로 한 번 섞습니다.
  11. 활성화된 ECM 혼합물을 기포가 생기지 않도록 혈관 챔버로 옮기고, 즉시 활성화된 커버슬립을 ECM 위에 뒤집어 놓습니다. 상단 클램프 플레이트를 다시 장착하고 나사를 너무 세게 조이지 않으면서 적당히 조입니다.
  12. 완성된 챔버를 뚜껑이 덮인 100 mm 페트리 접시에 넣고 37 °C에서 2시간 동안 배양합니다.

8. 와이어 템플릿을 사용하여 동맥류 제작하기

  1. 실리콘 가스켓의 반대편에 21-gauge 바늘을 삽입하고 정렬합니다.
  2. 15 mL 원심분리관에 1% BSA가 포함된 PBS를 넣고, 직경 0.0190-inch의 304 스테인리스강 의료용 맨드릴 와이어를 초음파 처리합니다. 와이어를 꺼내 생물안전작업대(biosafety cabinet) 내의 멸균 페트리 접시에서 공기 건조시킵니다.
  3. BSA가 코팅된 와이어를 가스켓에 있는 두 바늘 사이로 통과시킵니다(그림 2). 이후 회전을 용이하게 하기 위해 돌출된 한쪽 끝을 약간 구부립니다.
  4. 가스켓, 바늘, 와이어 및 클램프 플레이트 조립체를 호일 파우치에 넣어 오토클레이브 멸균합니다.
  5. 바늘/가스켓 조립체를 활성화되어 ECM이 코팅된 커버슬립 위에 배치합니다.
  6. 저온 살균된 Pluronic/PEO 잉크가 담긴 시린지에 21 G 바늘을 부착합니다.
  7. 챔버 중앙의 와이어 측면에 희생 잉크를 소량 떨어뜨립니다. 밀봉을 위해 각 바늘-와이어 접합부에 잉크를 소량 도포합니다.
  8. ECM 혼합물을 준비하고 섹션 7.10–7.12에 설명된 대로 챔버를 조립합니다.
  9. ECM이 겔화된 후, 구부러진 와이어 끝을 부드럽게 회전시켜 ECM 및 희생 잉크로부터 분리합니다. 장치에서 와이어를 천천히 뽑아냅니다.
  10. 200 µL 피펫을 사용하여 입구 바늘에 PBS를 채우고 PBS가 루멘을 통해 배출되도록 합니다. 이 과정을 한 번 더 반복한 후 섹션 9로 진행합니다.

9. 용기 챔버에서 희생 잉크를 세척합니다

  1. 항생제가 첨가된 차가운 (4 °C) PBS가 담긴 저장조에 튜브를 연결하고, 3방향 스톱콕을 설치한 후, 튜브 끝을 수컷 루어락(Luer-lock) 피팅과 멸균된 23 G 바늘로 마감합니다.
  2. 스톱콕 시린지를 사용하여 PBS가 바늘 구멍으로 나올 때까지 공급 튜브를 차가운 PBS로 채웁니다. 그 후 튜브를 클램프로 고정합니다.
  3. 두 번째 튜브 조각을 PBS로 채우고 23 G 바늘로 마감합니다. 튜브를 클램프로 고정하고 충전용 시린지를 제거합니다.
  4. 공급 바늘을 가스켓을 통해 입구 저장조에 삽입하고, 배수 바늘을 출구 저장조에 삽입합니다. 도립 현미경 또는 실체 현미경을 사용하여 정확하게 배치되었는지 확인합니다.
  5. 어셈블리를 4 °C로 옮기고 공급 저장조를 입구보다 30 cm 위에 배치합니다. 출구는 폐기물 용기 위, 용기 출구 바늘보다 5–10 cm 아래에 배치합니다.
  6. 클램프를 풀고 챔버를 통해 최소 250 mL의 차가운 PBS를 흘려보냅니다. 플러싱 하는 동안 시스템에 누출이나 기포가 있는지 점검합니다.

10. 추가 ECM 성분으로 용기 내강을 코팅하고 전처리합니다

  1. fibronectin은 20 µg/mL, laminin은 10 µg/mL, 또는 basement membrane matrix는 1:30 비율로 3 mL의 PBS에 희석합니다.
  2. 희석된 ECM 시약에 갓 준비한 transglutaminase를 추가합니다.
  3. 혈관 입구 및 출구와 직접 연결된 튜빙을 연결된 상태로 둡니다.
  4. 1 mL 주사기를 사용하여 ECM/transglutaminase 용액을 혈관에 천천히 주입합니다. 3 mL 전체가 혈관을 통과할 때까지 이 과정을 반복합니다.
  5. 커넥터를 고정하고, 입구와 출구를 멸균된 Luer 캡으로 막은 후 37 °C에서 1시간에서 하룻밤 동안 배양합니다.
  6. penicillin/streptomycin이 포함된 완전 내피 세포 배지로 혈관을 100 mL만큼 세척합니다. 튜빙 커넥터를 고정하고 출구를 캡으로 막습니다.
    참고: 배지가 채워진 혈관을 4 °C에서 최대 1주일 동안 보관하십시오. 루멘 내에 기포가 남아 있지 않은지 확인하십시오.

11. 혈관의 세포화

  1. ECM 혈관 템플릿이 들어 있는 챔버를 37 °C에서 2시간 동안 배양합니다. penicillin/streptomycin이 포함된 완전 혈관 내피 세포 배지를 37 °C로 가온합니다.
  2. 10-cm 배양 접시 하나 또는 T75 플라스크 하나에서 혈관 내피 세포를 trypsin 처리하고, 완전 배지로 trypsin을 중화시킵니다. 현탁액을 15 mL 원심 분리관으로 옮기고 세포 수 측정을 위해 일정량을 취합니다.
  3. 세포를 1,000 × g에서 5분 동안 원심 분리합니다. 펠렛을 재현탁하여 5 × 106 cells/mL 농도의 세포 현탁액 150 µL를 준비합니다.
  4. 배출 튜브를 멸균 폐액 저장조에 연결하고 튜브 클램프를 닫힌 상태로 유지합니다.
  5. 유입 튜브를 분리하고 유입 바늘 허브에서 잔류 배지를 제거합니다. 혈관을 수직으로 세우고 세포 현탁액을 바늘 허브에 피펫으로 넣습니다.
  6. 배출 클램프를 풀어 세포 현탁액이 혈관 내부로 들어가게 합니다. 전체 현탁액이 내강으로 진입하면 배출구를 다시 클램핑합니다.
  7. 가온된 완전 배지를 유입 바늘 허브에 추가한 후, 멸균 Luer 캡으로 닫습니다. 배출구를 분리하고 캡을 씌웁니다.
  8. 챔버를 정방향으로 세워 37 °C에서 3시간 동안 배양합니다.
  9. 섹션 11.5–11.8 과정을 반복하고 챔버를 뒤집어 37 °C에서 3시간 동안 배양합니다.
  10. 완전 배지 1 mL로 혈관을 부드럽게 세척하고 37 °C에서 3시간 동안 배양합니다.
  11. 현미경으로 혈관 내피 세포의 부착을 확인하고, 신선한 배지로 부착되지 않은 나머지 세포들을 부드럽게 씻어낸 후 37 °C에서 12–24시간 동안 배양합니다.

12. 유량 하에서 용기 배양

  1. 완전 배지 200 mL를 1시간 동안 가온한 후, 멸균 필터 유닛을 사용하여 진공 상태에서 탈기합니다. 가습된 CO₂ 인큐베이터에서 배지를 다시 가온합니다.
  2. 멸균 바이오세이프티 캐비닛 내에서 배지 저장조 배출구와 3방향 스톱콕, 펌프 튜빙, 맥동 댐퍼, 선택 사항인 버블 트랩, 유입 튜빙, 용기 챔버, 배출 튜빙, 그리고 배지 저장조로 이어지는 회귀 튜빙을 순서대로 연결합니다 (그림 3).
  3. 전체 유체 회로를 배지로 프라이밍하고 기포나 에어 포켓이 남아 있지 않은지 확인합니다.
    참고: 재연결 전에 커넥터와 니들 허브를 액체로 채우십시오. 세포가 부착된 용기에 기포가 유입되면 갑작스러운 전단력으로 인해 내피세포가 소실될 수 있습니다.
  4. 어셈블리를 37 °C 인큐베이터로 옮기고 용기 내 유속을 1 dyn/cm2로 시작합니다. 이 유속을 12시간 동안 유지합니다.
  5. 유속을 높여 12–16 dyn/cm2를 생성하고, 하위 분석을 수행하기 전까지 18–24시간 동안 유지합니다. 해당 용기에 필요한 유속을 계산하려면, 인쇄된 용기의 길이와 평균 직경을 측정하십시오. 온라인 계산기를 사용하여 측정된 파라미터를 입력하고, 원형 단면, 10% 혈청 포함 배지, 그리고 무시할 수 있는 튜빙 저항(튜빙의 직경이 인쇄된 용기보다 훨씬 큼)을 설정하십시오.
    참고: 유동 조건화 후 가능한 한 빨리 용기를 사용하십시오. 1주일 이상 배양하면 내피세포 사이에 간격이 생길 수 있으며, 이는 세포 소실 또는 내피 프로테아제에 의한 ECM 변형과 관련이 있을 수 있습니다.

13. 혈관 누출 분석 수행

  1. Alexa 647로 표지된 BSA 또는 10 kDa Alexa 647 dextran을 35 mL의 완전 배지에 첨가하여 최종 농도가 5 mg/mL가 되도록 합니다. 이 용액을 37 °C로 가온합니다.
  2. 혈관을 250 ng/mL TNFα와 같은 테스트 약제로 1~2시간 동안 사전 배양하고, 분석 배지에도 동일한 약제를 포함시킵니다.
  3. 37 °C 항온수조를 준비하고 펌프를 현미경 근처에 배치합니다. 현미경, 획득 소프트웨어 및 스테이지 가열 시스템을 작동시키고, 이미징 전 30분 동안 스테이지를 37 °C로 평형화합니다.
  4. 배양기의 흐름을 중단하고 배양 배지 저장조를 분리한 후, 챔버와 연결된 튜빙을 예열된 현미경 스테이지로 옮깁니다.
  5. 펌프를 표지되지 않은 배지가 담긴 유리 마이크로피펫이 장착된 약 20 cm 길이의 튜빙에 연결합니다. 마이크로피펫 튜빙을 형광 리포터 배지에 삽입하고 배출 튜빙을 수집 용기에 배치합니다.
  6. 펌프의 유속을 0.2 mL/min에 해당하는 값으로 설정하고, 이미징 준비가 완료될 때까지 흐름을 시작하지 마십시오.
  7. 위상차 이미징을 사용하여 혈관의 중앙선에 초점을 맞추고 647 형광 채널로 전환합니다. 섹션 13.6에서 설정한 속도로 흐름을 시작하고, 예상 반응 시간에 따라 1~5분마다 이미지를 획득합니다.
  8. 획득한 이미지로부터 카이모그래프(kymograph)를 생성하고 임계값이 적용된 강도 값에 선형 기울기를 맞춥니다. 누출량은 리포터가 분당 혈관 외벽 표면으로부터 이동한 거리(µm)로 보고합니다.

14. 유체 흐름 매핑

  1. 10 µm 형광 비드를 1분 동안 볼텍싱한 후, 배스 소니케이터에서 1분 동안 초음파 처리합니다. 완전 배지 10 mL에 비드를 희석하여 1.8 × 105beads/mL 농도로 조절합니다.
  2. 섹션 13에 설명된 대로 혈관 누출 분석을 위해 현미경 스테이지 상의 유체 시스템을 구성합니다. 유출 수집 용기를 포함하고 유속을 0.2 mL/min으로 설정합니다.
  3. 적절한 작동 거리를 가진 대물렌즈를 사용하여 혈관의 중앙 평면에 초점을 맞춥니다. 노출 시간, 검출기 감도, 들뜸 강도 및 빛 수집 효율이 허용하는 최대 실용 주파수로 이미지를 획득합니다.
  4. 입자 이미지 유속계(PIV) 소프트웨어를 사용하여 타임랩스 이미지 시퀀스를 분석합니다.

15. 내피세포화된 혈관의 고정 및 면역염색

  1. 10 mM CaCl₂와 10 mM MgCl₂가 포함된 PBS 내의 4% 파라포름알데히드 40 mL를 준비한다.
    주의: 파라포름알데히드는 독성 물질이다. 파라포름알데히드가 포함된 용액은 적절한 개인 보호구를 착용한 상태로 적합한 화학 흄 후드 내에서 준비하고 취급해야 한다.
  2. 흐름을 중단하고, 유입 튜브를 클램프로 고정한 뒤 펌프에서 분리하고, 혈관 누출 분석(vascular leak assay)에 사용된 흡입 튜브에 연결한다. 흡입 튜브를 고정액에 넣고 중력에 의해 35 mL가 혈관을 통과하도록 한다.
  3. 튜브를 클램프로 고정하고 혈관을 고정액에 넣은 채 실온에서 30분 동안 배양한다.
  4. 0.4% Triton, pH 6.1의 20 mM PIPES, 138 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 2 mM EGTA 및 5.5 mM glucose가 포함된 투과화 버퍼 25 mL로 혈관을 중력 세척한다. 튜브를 클램프로 고정하고 실온에서 10분 동안 배양한다.
  5. 1% BSA, 0.05% Tween 20, pH 7.4의 20 mM Tris, 140 mM NaCl 및 5 mM KCl이 포함된 블로킹 버퍼로 혈관을 세척한다. 실온에서 2시간 또는 4 °C에서 하룻밤 동안 배양한다.
  6. 선택한 1차 항체를 100–500 µL의 블로킹 버퍼에 1:50–1:500 비율로 희석한다. 유입 튜브를 제거하고, 세포 파종(cell seeding)을 위해 섹션 11에 기술된 절차를 사용하여 항체 용액을 주입한다.
  7. 혈관을 4 °C에서 하룻밤 동안 배양한다.
  8. 유입 튜브를 다시 연결하고 20 mL의 PBS로 혈관을 세척한다.
  9. 적절한 2차 항체를 블로킹 버퍼에 1:200–1:1,000 비율로 희석하고, 필요한 경우 형광 팔로이딘(fluorescent phalloidin)을 1:250으로 첨가한다. 섹션 15.6에 기술된 절차를 사용하여 용액을 주입하고 실온에서 2시간 동안 배양한다.
  10. 혈관을 40 mL의 PBS로 세척하고, 튜브 클램프를 닫은 뒤 튜브 캡을 씌운다.
    참고: 염색된 혈관은 4 °C에서 보관하고 2주 이내에 이미징한다.
  11. 형광 팔로이딘으로 F-actin을, anti-GM130으로 골지체(Golgi apparatus)를, DAPI로 핵을 염색한다.
  12. FibrilTool74를 사용하여 팔로이딘 이미지를 분석하여 F-actin 스트레스 섬유의 평균 방향성을 결정한다.
  13. 각 핵과 골지체의 질량 중심 사이의 축을 결정한다. 이전에 기술된 대로75 수치 계산 소프트웨어에서 결과 방향성을 분석하고 플롯한다.

결과

희생 잉크를 사용하여 다양한 관형 조직을 프린팅하는 방법은 여러 연구 그룹에 의해 잘 확립되었으며, 특히 혈관과 함께 신세뇨관을 제작한 Lewis 연구실이 대표적입니다.67,76유사한 접근 방식이 폐포 구조를 프린팅하는 데 사용되었습니다.77 및 혈관화된 종양78여기서는 생리적 유체 흐름 하에서 내피세포의 반응을 조사하기 위한 혈관 기하학적 구조를 생성하기 위해 이러한 접근 방식들을 응용하였습니다.그림 2혈관 형상은 혈관 영상에서 좌표 맵으로 변환된 후, 출력 경로를 정의하기 위해 G-코드(G-code)로 변환되었습니다.그림 2A–C). 결과적으로 이러한 접근 방식을 통해 굴곡진 혈관 및 동맥류에 의해 내피 기능과 세포골격 조직이 어떻게 변화하는지 연구하기 위한 혈관 템플릿 제작이 가능해졌습니다.그림 2D–G또한, 기계 가공 서비스 이용의 필요성을 없애기 위해 3D 프린팅이 가능한 Rose 챔버 설계가 도입되었습니다.그림 2H). 혈관 프린팅을 위한 G-code 파일의 예시는 다음에서 제공됩니다. 보충 파일 1, 그리고 이에 해당하는 Rose 챔버 및 스테이지 마운트 CAD 파일이 다음에서 제공됩니다. 보충 파일 2 및 보충 파일 3각각이다. STL 기반 프린팅은 여러 번의 프린트 헤드 패스가 필요할 수 있으며, 이는 루멘이 분리된 꼬임 형태의 혈관 기하구조를 초래한다(부록 그림 1). 이렇게 제작된 플랫폼은 생체공학적 전문 지식이 최소한인 혈관 세포 생물학자들도 쉽게 접근할 수 있도록 설계되었으며, 생리학적 압력 및 유량을 지원하고 고해상도 현미경 관찰이 가능하도록 하였습니다.그림 2I).

혈관 제작 및 세포화 이후, 제어된 배지 순환을 가능하게 하기 위해 혈관 장치를 폐쇄 루프 관류 시스템에 통합하였다(그림 3). 이 시스템은 유동 회로 내에 순차적으로 배치된 연동 펌프, 프라이밍 시린지에 연결된 3방향 스톱콕, 버블 트랩, 펄스 댐퍼, 혈관 장치 및 배지 저장소로 구성되었다(그림 3A). 이러한 구성은 시스템 프라이밍, 기포 제거 및 연동 펌프에 의해 생성되는 맥동의 감쇄를 위한 구성 요소를 포함하면서, 공학적으로 제작된 혈관을 통해 배지가 지속적으로 순환하도록 하였다. 조립된 시스템은 그림 3B에 표시된 것과 같이 혈관 장치가 실험 설정 내에 배치된 상태로 작동될 수 있으며, 이는 제어된 유량 조건 하에서 세포화된 혈관의 후속 관류를 위한 실용적인 구성을 제공한다.

이전에 설명한 희생 잉크 방식에 적용된 한 가지 수정 사항은 출력 전 잉크를 저온 살균하는 것이었습니다. 기재된 잉크 조제 프로토콜을 적용했을 때 배양물에 곰팡이 오염이 발생했기 때문에 이러한 수정이 필요했습니다. 이 용도로 사용되는 다른 Pluronic 기반 잉크와 마찬가지로, 25% Pluronic F127/1% PEO 잉크는 저온에서는 액체 상태를 유지하며 온도가 상승함에 따라 조밀한 미셀 젤(micellar gel)로 전이됩니다. 이 배합의 전이 온도는 15°C이는 인큐베이터 온도에서 구조체 템플릿을 제작하고 잉크를 제거하는 데 편리하며 4°C순수 Pluronic과 마찬가지로, 이 재료 또한 프린팅 온도에서 상당한 전단 희석(shear thinning) 현상을 나타냅니다 (그림 4A). 하지만 저온에서도 잉크의 점도가 너무 높아 표준 조직 배양 필터와 진공 장치를 이용한 필터 멸균이 불가능합니다. 잉크는 다음 온도에서의 저온 살균을 통해 멸균할 수 있지만, 70°C 20초 동안 이 온도 또는 그 이상의 온도에서 처리하면 잉크가 가역적으로 변하여 프린팅 온도에서의 점도가 감소합니다(데이터는 제시되지 않음). 더 낮은 온도에서 더 오랜 시간 동안 진행하는 저온 장시간 저온 살균법을 통해 63°C ~을 위한 / ~용의 >1시간의 처리는 인쇄 적정 온도에서 잉크의 복잡 점도를 변화시키지 않으면서 진균 및 기타 미생물에 의한 오염을 감소시킵니다. 25 mm 콘-플레이트 기하학 구조가 장착된 레오미터를 이용한 유변학적 특성 분석 결과, 원료 잉크와 저온 살균된 잉크는 인쇄 온도에서 다양한 변형 속도 범위에 걸쳐 유사한 점도를 나타냈습니다.그림 4B), 이는 저온살균이 출력 가능성을 저해하지 않음을 보여줍니다. 또한 살균된 잉크를 사용하면 혈관 내피 기능에 영향을 줄 수 있는 항진균제 없이도 더 장기간의 혈관 배양이 가능합니다.

혈관 세포화가 완료되면, 그림 5에서 보여주는 바와 같이 합쳐진(confluent) 내피세포가 혈관 전체를 덮어야 하며, 그림 5A는 최대 강도 투영(maximum-intensity projection)을, 그림 5B는 단면을 나타냅니다. 이후 배지 흐름을 생리학적 전단 속도로 증가시킬 수 있으며, 대략적인 원형 혈관의 경우 Hagen-Poiseuille 식79을 사용하여 이를 추정할 수 있습니다. 실제로는 배지의 점도와 미세유체 저항을 고려하여 원하는 전단 응력을 달성하는 데 필요한 유량을 추정할 수 있습니다. 일반적인 2D in vitro 배양에서 12 dyn/cm2의 배지 흐름은 대부분의 내피세포 유형이 흐름 축을 따라 배열되도록 유도합니다. 이러한 반응은 F-actin의 형광 phalloidin 염색(그림 5D,E) 또는 Golgi-핵 축 분석(그림 5D,F)을 통해 시각화할 수 있으며, 두 방법 모두 이전에 설명한 바와 같이18 내피세포 분극과 일치하는 비등방성 배향을 보여줍니다. in vivo에서는 40 dyn/cm2를 초과하는 전단 응력이 발생하지만, 본 실험에서는 그러한 조건을 모델링하지 않았습니다.

혈관 기하학적 구조의 변화로 인한 주요 결과는 유체 흐름의 변화이며, 내피세포는 여러 신호 전달 경로를 통해 이에 반응합니다80,81. 혈류 속도를 모니터링하기 위해 4D 도플러 초음파82, 4D 흐름 자기공명영상83, 레이저 스펙클 이미징84을 포함한 여러 방법이 사용 가능합니다. 이러한 기술들은 중요한 in vivo적 장점을 제공하지만, 단일 혈관 내의 국소적 흐름 차이를 분석하는 것은 어려울 수 있습니다. 본 플랫폼의 높은 수치구경 이미징 능력은 직접적인 형광 입자 추적(그림 6B)과 입자 이미지 유속계(PIV)를 이용한 혈관 곡률로 유도된 흐름 이상 현상의 고해상도 공간 매핑(그림 6C)을 가능하게 합니다. 예를 들어, 혈관의 외측 곡선보다 내측 곡선을 따라 흐름이 더 느리게 관찰되며(그림 6C), 이는 내피세포 반응의 변화에 기여할 수 있습니다85.

합쳐진(confluent) 혈관이 형성되면, 덱스트란(dextran)이나 단백질과 같이 형광 표지된 거대 분자를 내강으로 관류시켜 개통성 및 장벽 기능을 평가할 수 있습니다. HUVEC으로 내피가 형성된 개통된 혈관은 형광 표지된 덱스트란의 통과를 억제합니다(그림 6D,F). 반면, TNFα와 같은 장벽 파괴 자극에 노출되면 혈관 누출이 증가합니다(그림 6H, J). 국소 누출 속도는 카이모그래프(kymograph) 분석을 통해 시각화할 수 있습니다(그림 6E,G,I,K). 카이모그래프는 X축으로 거리, Y축으로 시간을 나타내므로, 분절된 형광 강도에 맞춘 직선의 기울기를 정량화하여 상대적인 누출 속도를 비교할 수 있습니다(그림 6E,G,I,K). 이러한 분석을 통해 특정 자극에 반응하여 국소 혈관 기하학적 구조가 내피 장벽 기능에 어떤 영향을 미치는지 평가할 수 있습니다.

이 플랫폼의 핵심 장점은 기존에 가능했던 것보다 현미경 접근성이 향상되었다는 점입니다. 생체 내(in vivo)또한 이 시스템은 혈관 내피 세포의 분자적 구성, 특히 액틴 세포골격의 면역조직화학적 분석을 용이하게 합니다. 혈관 내피 세포는 매우 얇으며 평활근 세포에 의해 둘러싸여 있습니다. 생체 내이는 특히 내피세포 내에서 세포골격 구조의 위치를 확인하는 것을 어렵게 만들 수 있습니다. 본 플랫폼을 통해 내피세포 내 접착 분자와 필라멘트형 액틴을 간편하게 염색하고 이미징할 수 있습니다.그림 5) 및 수행하기 어려운 다성분 분석을 지원합니다. 생체 내(in vivo)생리적 흐름 하에서의 내피세포 극성 및 분열 평가를 포함하여 (그림 5D–F). 이러한 분석법들을 단일 플랫폼으로 결합함으로써 혈관 기하학적 구조, 흐름의 변화, 장벽 기능, 내피세포 분자 조직 및 세포 간 접착 사이의 관계를 직접적으로 조사할 수 있습니다.

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그림 1: 칩 상의 3D 혈관 출력 및 사용 워크플로우. 칩 상의 3D 혈관 제작 및 사용 프로토콜의 흐름도. 검은색 원은 해당 프로토콜 번호를 나타낸다. 상자의 색상은 각 프로토콜이 수행되거나 샘플이 배양되는 온도를 나타낸다. 워크플로우에는 혈관 형태 모델링, 잉크 준비, 세포외 기질(ECM) 준비, 챔버 준비, 혈관 출력, 혈관 세척 및 코팅, 세포화, 유체 배양, 기능 분석 및 조직학적 분석이 포함된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2혈관 프린팅 및 챔버 설계. 혈관은 다음을 이용하여 설계할 수 있습니다. 생체 내(in vivo) 환자 맞춤형 혈관 기하학적 구조를 재현하기 위한 혈관 영상. (A조영 증강 컴퓨터 단층촬영(CT)으로 촬영한 소관상동맥 영상, Parekh 등으로부터 허가를 받아 재현함.86 스케일 바 = 2 mm. (B) 패널 A에 표시된 혈관 일부의 기준점 좌표 지도이며, FIJI의 점 기록(point recording) 기능을 통해 생성되었습니다. (C) 프린터 제어 소프트웨어를 사용하여 좌표 맵으로부터 생성된 G-코드 출력물. 우측 하단에 X, Y, Z 좌표가 표시되어 있음. (D) 바이오프린팅된 혈관이 포함된 Rose 챔버의 모식도. 상단 썸 너트가 포함된 이 설계는 3D 프린팅된 폴리락트산(PLA) 챔버와 호환됩니다. (E) ECM이 코팅된 커버스립 위에 희생 바이오잉크로 출력된 용기와 저장조가 포함된 로즈 챔버. 스케일 바 = 9 mm. (F) 동맥류 모델을 위해 구성된 Rose 챔버의 모식도. 입구 및 출구 바늘을 통해 통과시킨 와이어가 혈관 템플릿 역할을 하며, 와이어 위에 증착된 희생 바이오잉크가 동맥류 템플릿 역할을 한다. (G) ECM이 코팅된 커버슬립 위에 와이어와 희생 바이오잉크 템플릿이 들어 있는 로즈 챔버. (H) 3D 프린팅된 PLA 현미경 스테이지 어댑터(왼쪽)와 Rose 챔버(오른쪽)로, 기계 가공된 알루미늄 부품의 대안을 제공함. 스테이지 어댑터의 금속 클램프는 어댑터 플레이트에 고정되어 있음. 스케일 바 = 30 mm. (I) 현미경 스테이지에 장착되고 유입 및 유출 바늘과 튜빙이 연결된 알루미늄 Rose 챔버 내의 출력 및 세척된 혈관. 스케일 바 = 20 mm. 약어: CT = 컴퓨터 단층촬영; ECM = 세포외 기질; PLA = 폴리락틱산. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: Rose 챔버 내 세포화된 혈관의 유체 흐름 시스템. (A) 세포화된 혈관이 포함된 Rose 챔버를 통해 유체 흐름을 형성하는 데 사용된 튜빙 구성의 모식도. 화살표는 흐름 방향을 나타낸다. 번호가 매겨진 구성 요소는 (1) 연동 펌프, (2) 프라이밍 시린지가 연결된 3방향 스톱콕, (3) 버블 트랩, (4) 맥동 댐퍼, (5) 혈관 장치, (6) 배지 저장소이다. 배지와 접촉하는 모든 구성 요소는 사용 전 멸균한다. (B) 조직 배양 인큐베이터 내 Rose 챔버에 세포화된 혈관이 포함된 유체 흐름 시스템. 숫자는 패널 A에 표시된 구성 요소와 일치한다. 입구 및 출구 바늘은 안정성을 위해 테이프로 고정되어 있다. 스케일 바 = 40 mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 4: 희생 바이오잉크의 레올로지 특성 분석. (A) 5 °C, 10 °C, 14.4 °C, 15 °C 및 23 °C에서 전단 속도에 따른 비살균 25% Pluronic F127/1% polyethylene oxide (PEO) 잉크의 전단 점도. (B) 25 °C 및 37 °C에서 비살균 및 살균 Pluronic F127/PEO 잉크의 각주파수에 따른 복소 점도. 약어: PEO = polyethylene oxide. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-5
그림 5: 고정 및 염색된 내피세포화 혈관의 이미징 및 정량 분석. (A) 초기 세포 파종 및 낮은 전단 응력(1 dyn/cm2) 하의 배양 후 완전히 세포화된 혈관의 스피닝 디스크 공초점 형광 이미지의 최대 강도 투영. 혈관은 VE-cadherin (녹색), F-actin (적색) 및 DAPI를 이용한 DNA (청색)로 염색되었다. 스케일 바 = 50 µm. (B) F-actin (적색)을 표지하기 위해 형광 phalloidin으로 염색된 완전히 세포화된 혈관의 스피닝 디스크 공초점 형광 이미지 z-스택의 재구성된 xz 단면. 스케일 바 = 50 µm. (C) 12 dyn/cm2의 유량에서 24시간 동안 흐름을 가한 후 완전히 세포화된 혈관의 스피닝 디스크 공초점 형광 이미지 z-스택의 최대 강도 투영. F-actin은 형광 phalloidin (적색)으로 표지되었다. 스케일 바 = 100 µm. (D) 16 dyn/cm2의 전단 응력 하에서 24시간 배양 후 혈관 영역의 스피닝 디스크 공초점 형광 이미지. 혈관은 VE-cadherin (황색), F-actin (자색), 골지체 마커 GM130 (녹색) 및 DAPI를 이용한 DNA (청색)로 염색되었다. 화살표는 흐름의 방향을 나타낸다. 스케일 바 = 30 µm. (E) FibrilTool74를 사용하여 패널 D의 F-actin 채널로부터 평균 스트레스 섬유 방향을 정량화한 대표 결과. 각각 1,600 µm2 면적을 가진 45개 영역의 그리드를 분석하였으며, 평균 섬유 방향은 흐름 방향에 대한 방사형 히스토그램으로 표시되었다. (F) 내피세포 극성의 척도로서 패널 D로부터 핵-골지 축을 정량화한 대표 결과. 각 핵의 중심에서 해당 골지체 중심으로 향하는 벡터가 흐름 방향에 대한 방사형 히스토그램으로 도식화되었다; n = 75 vectors. 약어: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-6
그림 6: 유체 흐름 및 혈관 누출 분석. (A) 패널 B-K의 분석에 사용된 혈관 기하학적 구조의 모식도. 문자는 각 패널에 해당하는 대략적인 혈관 영역을 나타냄. (B) 곡선 혈관 영역을 통해 흐름에 따라 이동하는 형광 비즈를 보여주는 타임랩스 spinning-disk 공초점 형광 이미지 시퀀스의 색상 코딩된 시간 투영물. 색상은 1에서 100까지의 프레임 번호를 나타내며, 외측 및 내측 곡률이 표시됨. (C) 곡선 혈관 영역 전체의 상대적 흐름 속도를 보여주는 입자 이미지 유속계(PIV) 분석. 색상은 상대 속도를 나타내며, 화살표는 흐름의 방향과 크기를 나타냄. 스케일 바 = 50 µm. (D–G) Alexa 647이 표지된 10 kDa dextran을 관류시킨 처리되지 않은 혈관의 대표적인 혈관 장벽 분석. (D,D′,D″) 각각 0, 70, 150분에 획득한 직선 혈관 영역의 이미지. 흰색 선은 패널 E의 kymograph에 사용된 영역을 나타냄. (E) 패널 D의 직선 영역에 대한 kymograph로, 점선의 기울기인 0.39 µm/min의 누출 속도를 보여줌. (F,F′,F″) 0, 70, 150분에 획득한 곡선 혈관 영역의 이미지. 흰색 선은 패널 G의 kymograph에 사용된 영역을 나타냄. 스케일 바 = 150 µm. (G) 패널 F의 곡선 영역에 대한 kymograph로, 점선의 기울기인 1.01 µm/min의 누출 속도를 보여줌. (H–K) 250 ng/mL의 tumor necrosis factor alpha (TNFα)로 전배양한 후의 대표적인 혈관 장벽 분석. (H,H′,H″) 각각 0, 200, 400분에 획득한 직선 혈관 영역의 이미지. 흰색 선은 패널 I의 kymograph에 사용된 영역을 나타냄. 스케일 바 = 250 µm. (I) 패널 H의 직선 혈관 영역에 대한 kymograph 분석으로, 점선의 기울기인 2.1 µm/min의 누출 속도를 보여줌. (J,J′,J″) 0, 200, 400분에 획득한 곡선 혈관 영역의 이미지. 흰색 선은 패널 K의 kymograph에 사용된 영역을 나타냄. 스케일 바 = 250 µm. (K) 패널 J의 곡선 혈관 영역에 대한 kymograph 분석으로, 점선의 기울기인 6.7 µm/min의 누출 속도를 보여줌. 패널 D-K의 별표는 kymograph를 생성하는 데 사용된 선의 해당 끝단을 식별함. 약어: PIV = particle image velocimetry; TNFα = tumor necrosis factor alpha. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

부록 그림 1: STL 기반 프린터 프로그래밍을 이용한 혈관 프린팅. (A) STL 기반 프린터 프로그래밍을 사용하여 생성된 프린팅 혈관의 미분 간섭 대비(differential interference contrast) 이미지. 프린터 헤드가 두 번 통과하도록 지시하여 꼬임 형태의 혈관 구조를 생성하였다. 스케일 바 = 250 µm. (B) Alexa 647로 표지된 bovine serum albumin (BSA)로 채워진 세척된 꼬임 혈관의 3D 렌더링. 두 개의 꼬인 가닥의 내강 사이에 틈이 보인다. 스케일 바 = 100 µm. 약어: BSA = bovine serum albumin; STL = standard tessellation language. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: 혈관 프린팅을 위한 G-코드 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2: Rose 챔버의 CAD 도면 여기에서 이 파일을 다운로드하십시오.

보충 파일 3: 스테이지 장착 어댑터의 CAD 도면 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

굴곡진 혈관, 동맥류 및 분지점을 포함하여 흐름의 교란과 관련된 혈관 기하학적 구조를 모델링하기 위한 견고한 시스템이 설명됩니다. 이 방법은 바이오공학 경험이 적은 세포 생물학자들도 접근 가능한 플랫폼 내에서 고해상도 이미징, 흐름 매핑 및 혈관 장벽 기능 평가를 지원합니다. 주요 접근 방식에는 바이오프린터가 필요하지만, 상용화된 압출 기반 프린터는 오픈 소스 시스템부터 여러 개의 프린트 헤드를 갖춘 고급 플랫폼까지 다양합니다. 프린터의 핵심 기능으로는 프린트 헤드 및 잉크 온도 제어, 정밀한 압력 조절, 프린트 베드 온도 제어가 포함됩니다. 바이오프린팅된 굴곡 및 분지 혈관 외에도, 이 방법에는 바이오프린터 없이 생성할 수 있는 동맥류 모델이 포함되어 있습니다. 이러한 접근 방식들을 통해 세포 생물학 연구실에서 흔히 사용되는 현미경 관찰법을 이용하여 굴곡진 혈관 내 혈관 내피 세포의 기능을 조사하는 것이 용이해집니다.

혈관 기능을 연구하기 위해 수많은 in vitro 모델 시스템이 사용 가능하며87,88, 각각 뚜렷한 장점과 한계를 가지고 있습니다. 이전 연구54,67,69를 바탕으로 조정된 본 시스템은 환자 유래 혈관 기하구조를 직접 모델링하고 단일 장치 내에서 혈관 곡률을 체계적으로 변화시킬 수 있기 때문에, 혈관 굴곡도가 내피 세포 기능에 미치는 영향을 조사하는 데 특히 적합합니다. 다른 접근 방식에서는 광중합성 젤라틴 메타크릴레이트를 사용하여 환자의 관상 동맥을 모델링함으로써 생리학적 흐름 하에서 축소된 혈관 구조를 생성하였습니다60. 이러한 시스템은 정확한 혈관 모델링과 흐름 분석이 가능하며, 중막(tunica media) 층을 통합할 수 있는 잠재력을 제공합니다. 그러나 전체적인 크기와 유리 지지대의 필요성으로 인해 고해상도 이미징과 국소 누출 분석에 제한이 있을 수 있습니다. 반면, iPSC 유래 내피 세포의 자가 조립을 기반으로 하는 더 작은 시스템은 고해상도 이미징이 가능하며 내피 세포와 혈관 평활근 세포를 모두 포함할 수 있습니다89. 하지만 이러한 모델은 혈관 기하구조에 대한 제어력이 낮으며, 높은 유량과 전단 속도를 설정하는 것이 어려울 수 있습니다. 따라서 본 시스템은 정의된 혈관 기하구조와 혈관 굴곡도의 고해상도 이미징을 결합한 실용적인 중간적 접근 방식을 제시합니다.

이 플랫폼의 주요 장점은 곡선 및 직선 영역을 모두 포함하는 혈관을 생성할 수 있다는 점이며, 그림 6에 나타난 바와 같이 다른 실험 변수를 일정하게 유지하면서 동일한 샘플 내에서 국소 혈관 기하학적 구조를 직접 비교할 수 있게 해줍니다. 또 다른 장점은 혈관 조영술 또는 조영 증강 CT를 통해 얻은 환자 유래 혈관 이미지를 사용할 수 있다는 것입니다. 환자 혈관을 재현하는 데 있어 주요 제한 사항은 크기입니다. 직경 150µm 미만의 혈관은 재현성 있게 프린팅하기 어렵고, 수 cm 이상 연장되는 혈관 분절은 더 큰 마운팅 챔버가 필요합니다. 또한, 혈관 분절은 현미경 이미징 중에 베이스 매트릭스 층 위에 프린팅되고 대물렌즈의 작동 거리 내에서 유지될 수 있도록 3차원적으로 상대적으로 평평한 상태를 유지해야 합니다.

향후 연구에서는 본 논문에서 설명한 시스템을 더욱 수정하여 혈관 기하학적 구조가 병태생리에 영향을 미칠 수 있는 죽상동맥경화증과 같은 질환을 모델링할 수 있을 것입니다. 생리학적 복잡성을 높이기 위해 유전자 변형 내피세포나 평활근 세포 및 면역 세포를 포함한 추가적인 세포 유형을 도입할 수 있습니다. 더 단순한 시스템에서 입증된 바와 같이, 내피층 아래에 평활근 세포를 통합함으로써 혈관 굴곡 및 질환에서의 평활근-내피 상호작용에 대한 추가적인 통찰을 얻을 수 있을 것입니다90. 추가적인 수정 사항으로는 종양 세포를 포함시켜 혈관 내 침입68,91 및 이 과정에 미치는 굴곡도의 영향을 조사하는 것이 포함될 수 있습니다. 또한 이 플랫폼을 사용하여 교란된 흐름이 염증 반응을 어떻게 변화시키는지92,93 조사하고, COVID-1994와 같은 감염과 관련된 혈관 합병증에 어떻게 기여하는지 잠재적으로 확인할 수 있습니다. 인간의 건강과 질병에서 혈관계의 광범위한 관여를 고려할 때, 이와 같이 접근 가능한 시스템은 다양한 질병 상황에서 내피 기능을 더욱 심도 있게 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다.

공개 사항

본 콘텐츠의 책임은 전적으로 저자에게 있으며, 반드시 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 대표하는 것은 아닙니다. 저자들은 상충하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

저자들은 이 연구의 초기 탐색 과정에서 조언을 준 하버드 대학교 Jennifer Lewis 연구실 구성원들과 피드백 및 조언을 제공한 Waterman 연구실 구성원들에게 감사를 표합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
(3-Aminopropyl)trimethoxysilane (APTMS), 97%Sigma-Aldrich281778ECM 부착 전 유리 커버슬립의 실란화 및 활성화에 사용됨.
1mL 멸균 주사기Fisher Scientific14-823-434시약 주입, 용기 코팅 및 유체 핸들링에 사용됨.
1x 인산염 완충 식염수 (PBS)Thermo Fisher ScientificJ61196.AP시약 조제, 세척 및 용기 플러싱에 사용됨.
10mL 멸균 주사기Fisher Scientific14-955-459시약 조제 및 유체 이송에 사용됨.
뚜껑 포함 15mL 원추형 튜브Fisher Scientific05-538-59A시약 조제, 세포 핸들링 및 용액 저장에 사용됨.
150mm 폴리스티렌 페트리 접시Fisher ScientificFB0875714멸균 작업 또는 배양 용기로 사용됨.
21G 바늘Fisher Scientific14-817-227용기 템플릿 제작 및 챔버 접근에 사용됨.
23G 바늘Fisher Scientific14-817-237플러싱 및 관류 중 용기 입구 및 출구 연결에 사용됨.
27G 투명 테이퍼드 디스펜싱 바늘Nordson7018417희생 잉크 압출 및 프린팅 중 기포 시각화에 사용됨.
3mL 멸균 주사기Fisher Scientific14-955-459유체 이송 및 시약 주입에 사용됨. 제공된 번호가 10 mL 주사기와 동일하므로 카탈로그 번호를 확인할 것.
304 스테인리스강 의료용 맨드릴 와이어, 직경 0.0190 inComponent SupplyGWX-0190-36와이어 기반 동맥류 모델의 직선 루멘을 위한 제거 가능한 템플릿으로 사용됨.
뚜껑 포함 50mL 원추형 튜브Fisher Scientific05-526B시약의 조제, 혼합, 살균 및 저장에 사용됨.
Alexa 488 anti-mouse 2차 항체Thermo Fisher ScientificA32723TR면역 염색에 사용되는 형광 2차 항체.
Alexa 555 anti-rabbit 2차 항체Thermo Fisher ScientificA-21428면역 염색에 사용되는 형광 2차 항체.
Alexa 647 표지 소 혈청 알부민Thermo Fisher ScientificA34785혈관 장벽/누출 분석에 사용되는 형광 고분자 추적자.
Alexa 647 표지 덱스트란, 10 kDaThermo Fisher ScientificD22914내피 장벽 기능 및 혈관 누출 평가에 사용되는 형광 추적자.
Alexa 647-phalloidinThermo Fisher ScientificA22287세포골격 이미징 및 배향 분석을 위해 F-actin을 형광 표지하는 데 사용됨.
Albumin, bovine serum, Fraction V, fatty acid-freeSigma-Aldrich126575-10GM블로킹 및 단백질 함유 용액 조제에 사용됨.
Antibiotic-Antimycotic, 100xThermo Fisher Scientific15240062ECM 및 배양 배지를 위한 선택적 항균 보충제.
Anti-GM130 항체, clone 4A3Sigma-AldrichMABT1363내피 극성 분석을 위해 골지체를 표지하는 데 사용되는 1차 항체.
Anti-VE-cadherin 토끼 단클론 항체, D87F2Abcam65707내피 세포 간 접합부를 시각화하는 데 사용되는 1차 항체.
염화 칼슘Sigma-AldrichC7902ECM 조제 및 고정 버퍼에 사용됨. 의도한 시약이 무수 또는 수화 염화 칼슘인지 확인할 것.
커넥터 키트World Precision Instruments504954미세 유체 관류 회로를 조립하는 데 사용되는 Luer-to-tubing 커넥터.
커버글라스 염색 랙Electron Microscopy Sciences72240세척, 실란화, 활성화 및 세척 중에 커버슬립을 고정하는 데 사용됨.
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG7021-100G면역 염색 중 사용되는 투과화 버퍼의 성분.
DAPIThermo Fisher Scientific62248세포 이미징 및 극성 분석에 사용되는 형광 핵 염색제.
디지털 핫 플레이트Fisher Scientific11-475-028조립 중 용기 챔버와 시약을 약 37 °C로 유지하는 데 사용됨.
EGTA tetrasodium saltSigma-AldrichE8145-10G투과화 버퍼에 사용되는 킬레이트제.
1/16 in ID 튜빙용 암형 바브 Luer 커넥터Scientific Commodities Inc.BB330A미세 유체 회로 내의 튜빙 연결에 사용됨.
1/16 in ID 바브 포함 암형 Luer, CrystalVu QCFisher Scientific01-000-123튜빙 및 용기-챔버 연결에 사용됨.
피브리노겐Sigma-AldrichF8630용기 지지 하이드로겔을 형성하기 위해 젤라틴 및 트롬빈과 함께 사용되는 ECM 성분. 출처 확인: 원고에는 인간 혈장 피브리노겐으로 기술되어 있으나, 제공된 표에는 소 혈장으로 기재되어 있음.
유체 펄스 댐퍼Darwin MicrofluidicsSE-D1606-3NB-PC-31연동 펌프에 의해 생성되는 맥동 변동을 줄이는 데 사용됨.
식품 산업용 고온 실리콘 고무 스트립McMaster-Carr8417K51Rose 챔버용 가스켓 제작에 사용됨.
돼지 피부 유래 젤라틴, 겔 강도 300, Type ASigma-AldrichG2500용기 루멘을 둘러싸는 하이드로겔을 형성하는 주요 ECM 성분.
유리 커버슬립, No. 1.5VWREN-MAS-25X25-1-5-CS고해상도 현미경 기판 및 챔버 표면.
글루타르알데하이드, 25%Electron Microscopy Sciences16220ECM 부착 전 커버슬립 활성화를 위해 희석하여 사용됨.
Growth Kit-BBEATCCPCS-100-040내피 세포 배양을 위해 혈관 세포 기초 배지와 함께 사용되는 보충 키트.
Growth Kit-VEGFATCCPCS-100-041필요 시 혈관 세포 기초 배지와 함께 사용되는 내피 성장 보충제.
인간 혈장 피브로넥틴Sigma-AldrichFC010내피 세포 부착을 촉진하기 위해 사용되는 선택적 루멘 ECM 코팅제.
인라인 튜빙 클램프Sigma-AldrichZ503371-1PAK챔버 조작 및 배양 중 튜빙을 통한 흐름을 중단하고 조절하는 데 사용됨.
Ismatec Reglo 디지털 연동 펌프Masterflex78018-12세포화된 혈관을 통해 제어된 유체 흐름을 생성하는 데 사용됨.
라미닌Sigma-AldrichL2020-1MG내피 세포의 부착 및 분극 수정을 위한 선택적 루멘 ECM 코팅제.
Luer-to-tubing 커플러 어소트먼트 키트World Precision Instruments504954튜빙, 주사기 및 챔버 입구/출구 구성 요소를 연결하는 데 사용됨. 커넥터 키트 카탈로그 번호와 중복됨; 동일한 경우 하나만 유지할 것.
염화 마그네슘 6수화물Sigma-AldrichM2393-100G고정 및 투과화 버퍼의 성분.
1/16 in ID 튜빙용 수형 바브 슬립 Luer 커넥터Scientific Commodities Inc.BB329A미세 유체 튜빙 연결에 사용됨.
수형 Luer 피팅, 1/16 in IDWorld Precision Instruments13160-100튜빙을 주사기 및 챔버 구성 요소에 연결하는 데 사용됨.
MatrigelSigma-AldrichCLS356234-1EA내피 세포 부착에 사용되는 선택적 루멘 ECM 코팅제.
배지 병 뚜껑Fisher Scientific05-719-310흐름 회로를 위한 멸균 배양 배지 저장조를 구축하는 데 사용되는 2포트 캡.
Nalgene Pharma-Grade 실리콘 튜빙, 1/16 in IDThermo Fisher Scientific8600-0020미세 유체 관류 및 플러싱 회로에 사용되는 유연한 튜빙.
ParafilmElectron Microscopy Sciences70990-125커버슬립 상의 ECM 코팅 중합 시 비부착 표면으로 사용됨.
PBS, 10x, pH 7.4Thermo Fisher Scientific70011044작업용 PBS 용액을 조제하는 데 사용되는 농축 버퍼.
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122내피 배양 배지 및 플러싱 용액에 사용되는 항생제 보충제.
PIPESSigma-AldrichP1851-25G투과화 용액의 완충 성분.
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443희생 프린팅 잉크의 온도 응답성 성분.
수형 Luer 포함 폴리카보네이트 3방향 스톱콕Fisher ScientificNC9593742관류 회로의 유체 경로 프라이밍, 전환 및 제어에 사용됨.
폴리에틸렌 옥사이드 (PEO)Sigma-Aldrich372781희생 잉크 제형의 고분자 성분.
로터리 믹서Fisher Scientific888610504 °C에서 PEO/Pluronic 희생 잉크를 혼합하는 데 사용됨.
슬라이드 유닛 염색 접시MSE SuppliesDWK90020커버슬립 세척, 염색 또는 시약 배양에 사용됨.
정사각형 커버 글라스, No. 2, 25mm x 25mmSigma-AldrichCLS285525-1000EA챔버 커버슬립; 더 두꺼운 No. 2 유리는 파손 저항성이 높으며 적절한 공기 또는 수침 대물렌즈와 호환됨.
스테인리스강 뭉툭한 디스펜싱 바늘, 21 G, 1 inComponent SupplyNE-212PL유체 주입 또는 와이어 템플릿 혈관 모델 구축에 사용됨.
Steriflip 진공 필터 유닛MilliporeSigmaSE1M179M6가온된 젤라틴 및 기타 호환 용액을 멸균 필터링하는 데 사용됨.
멸균 플라스틱 5mL 주사기AlleviPSYR5-S공압 압출 프린팅을 위한 희생 잉크 충전에 사용됨.
Thrombin, human plasma, high activitySigma-Aldrich605195ECM 겔 형성 중 피브린 중합을 개시하는 데 사용됨.
TransglutaminaseMoo Gloo1201젤라틴/피브린 ECM의 조제 및 수정 중에 사용되는 가교 효소.
Triton X-100Sigma-Aldrich648466면역 염색 전 내피 세포 투과화를 위해 사용되는 세제.
TrypLE Express Enzyme, 1x, phenol redThermo Fisher Scientific12605010혈관 시딩 전 내피 세포를 수확하는 데 사용되는 세포 분리 시약.
Tween 20Sigma-Aldrich11332465001면역 염색 블로킹 버퍼의 세제 성분.
Vascular Cell Basal MediumATCCPCS-100-030내피 세포 배양 및 관류 실험에 사용되는 기초 배지.

참고문헌

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