본 연구는 수술 전후 마취 관련 약물 표적 유전자를 다중 오믹스 난소암 데이터와 통합하여 예후 모델을 구축 및 검증하고, 관련 면역, 공간 및 조절 특성을 규명하였습니다.
연구 논문
수술 전후 마취 관련 약물 표적 유전자에 기반한 난소암의 예후 모델링: 생정보학적 접근법
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
난소암(OV)의 이질성은 질병 아형 분류, 위험 계층화 및 정밀 임상 관리에 상당한 어려움을 줍니다. 따라서 본 연구에서는 난소암 환자에게서 PARDTGs의 임상적 유의성을 찾기 위해 수술 전후 마취 관련 약물 표적 유전자(PARDTGs)에 기반한 예후 모델을 개발하였습니다. 본 연구는 벌크 전사체 데이터, 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq) 데이터 및 공간 전사체 데이터를 포함한 멀티오믹스 데이터를 통합하여 난소암의 PARDTGs를 종합적으로 분석하였습니다. PARDTGs의 발현 특성을 바탕으로 stepAIC Cox 비례 위험 모델을 사용하여 예후 특징을 개발하였습니다. 이 모델은 TCGA-OV 데이터셋을 기반으로 구축되었으며 GSE26193, GSE30161 및 GSE63885 데이터셋을 통해 검증되었습니다. 나아가 PARDTG 특징과 임상 요인을 결합한 노모그램을 구축하였습니다. 또한 위험 점수와 기능적 농축, 신호 전달 경로 및 종양 면역 미세환경 간의 상관관계를 분석하였습니다. 그 결과 난소암 예후와 밀접하게 연관된 17개의 PARDTGs를 식별하였습니다. TCGA-OV, GSE26193, GSE30161 및 GSE63885 코호트 전체에서 검증된 이 예후 시그니처는 OS에 대해 강력한 예측 정확도를 나타냈습니다. 유전자 시그니처만 사용했을 때보다 예후 모델과 임상 파라미터를 통합한 노모그램이 더 향상된 예후 성능을 보였습니다. 또한 종양 미세환경 분석 결과, 저위험군 환자에서 면역 관련 경로의 유의미한 농축과 더 낮은 TIDE 점수가 나타났으며, 이는 이들 환자가 면역 요법으로부터 혜택을 받을 가능성이 더 높음을 시사합니다. 본 연구는 난소암에서 PARDTGs의 예후 관련성과 임상적 유용성을 입증하였습니다. 유전적 특성을 임상 검사에 통합하는 것은 임상적 치료와 예후를 개선하는 데 유망한 방법입니다.
서론
OV는 은밀한 초기 증상, 강한 침습성 및 비특이적인 조기 임상 징후를 특징으로 하는 매우 흔하고 공격적인 악성 종양입니다. 연구에 따르면 대부분의 환자가 진단 시점에 이미 임상 후기 단계에 있으며, 전체 5년 생존율은 45% 미만인 것으로 나타났습니다1. 수술, 화학요법 및 표적 치료의 발전에도 불구하고, 종양 재발, 화학요법 내성 및 면역 회피와 같은 과제들이 지속되어 치료 효능을 제한하고 있습니다2. 따라서 종양의 이질성 문제를 해결하고 맞춤형 임상 전략을 지원하기 위해 새로운 분자 바이오마커를 식별하고 강력한 위험 평가 도구를 개발하는 것이 시급히 요구됩니다.
외과적 절제술과 주술기 관리는 여전히 난소암(OV) 치료의 핵심입니다. 하지만 주술기 생리적 스트레스, 염증 반응 및 면역 조절이 생물학적 거동에 영향을 미치고, 결과적으로 장기 예후에 영향을 줄 수 있다는 증거가 늘어나고 있습니다3. 주술기 중재의 핵심 요소로서, 마취제의 효과는 중추신경계 억제 그 이상으로 확장됩니다. 최근 연구들에 따르면 마취 기법과 마취 약물은 신경내분비 반응, 염증 폭포(inflammatory cascades) 및 면역 작동 세포의 활성을 조절할 수 있으며, 이를 통해 수술 후 종양 미세환경을 재형성하고 종양 세포의 이동 잠재력, 면역 감시 및 전이 관련 과정에 영향을 미칩니다4. 특히, 특정 마취제는 종양 세포의 운명을 직접적으로 변화시킵니다. propofol은 Nrf2 매개 ferroptosis 억제를 통해 순환 종양 세포의 생존을 강화하여 전이를 촉진합니다5. Ketamine은 lncPVT1/miR-214-3p/GPX4 축을 조절함으로써 간세포암 세포에서 ferroptosis를 유도하며, 이는 마취제가 종양 세포의 운명 결정에 직접적인 영향을 줄 수 있음을 시사합니다6. 또한, GABA 수용체의 양성 알로스테릭 조절제인 benzodiazepines는 화학-면역 요법 병용 투여의 항종양 효능을 약화시킬 수 있습니다7. 그러나 현재의 연구는 주로 단일 마취제에 집중되어 있어, 유전자 표적 네트워크 수준에서의 잠재적 효과에 대한 체계적인 조사가 부족한 실정입니다.
마취 작용의 직접적인 분자 기질인 수술 전후 마취 관련 약물 표적 유전자(PARDTGs)는 신경전달물질 수용체 조절, 칼슘 항상성 유지, 액틴 세포골격 역학 및 내분비 스트레스 축의 피드백을 포함한 여러 주요 신호 전달 경로에 관여합니다8,9. 수술 전후의 외과적 스트레스 상황에서 이러한 경로들은 활성화 또는 억제되어 면역 세포의 분극화와 종양 관련 미세환경의 재구성에 영향을 줄 수 있습니다8,10. 그러나 난소암(OV)에서 PARDTGs의 발현 양상, 기능적 특성 및 임상적 관련성은 아직 충분히 규명되지 않았습니다. 동시에, 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)과 공간 전사체학의 등장은 공간적 위치 정보와 함께 세포 수준의 해상도로 유전자 발현 프로파일링을 가능하게 하여, 종양 조직 내 마취 표적 유전자의 공간적 분포, 미세환경 선호도 및 세포 특이적 효과에 대한 새로운 관점을 제공하고 있습니다11.
본 연구에서 우리는 PARDTGs를 난소암(OV) 멀티오믹스 데이터셋과 통합하여 차별 발현 유전자를 체계적으로 식별하고, 일반화 가능한 예후 위험 모델을 구축하였습니다. 더 나아가 면역 침윤, 줄기세포 특성, 변이 양상 및 기능적 경로의 관점에서 위험 층화의 생물학적 근거를 분석하였습니다. 멀티모달 시퀀싱 데이터를 결합하여 세포 유형의 기원과 공간적 생태적 틈새를 묘사하고, miRNA/전사 인자 조절 네트워크를 구축하였으며, 범암(pan-cancer) 검증을 통해 종양 간 유의성을 입증하였습니다. 본 연구는 난소암에서 마취제 표적 네트워크의 잠재적 역할에 대한 기전적 근거를 제공하며, 임상적 위험 층화, 예후 예측 및 수술 전후 관리 전략에 대한 중개적 시사점을 제시합니다.
프로토콜
데이터 수집
이전 문헌12을 통해 120개의 수술 전후 마취 관련 약물 표적 유전자를 선별하여 Supplementary Table S1에 나열하였습니다. 이어서 유전자 발현 프로파일, 임상 정보 및 생존 데이터를 UCSC Xena TCGA TARGET GTEx Toil recompute 리소스(http://xena.ucsc.edu/)에서 확보하였습니다. 발현 데이터셋은 The Cancer Genome Atlas(TCGA-OV)의 원발성 난소 장액성 낭성 선암 표본 420개와 Genotype-Tissue Expression(GTEx) 프로젝트의 정상 난소 표본 88개로 구성되었습니다. 유전자 발현 값은 Toil 파이프라인13에 의해 생성된 RSEM 유전자 수준 FPKM 값으로 얻었습니다. 각 하위 분석에 포함된 TCGA 표본의 상세한 샘플 흐름 설명은 Supplementary Table S2에 제공되어 있습니다. 또한, 외부 검증을 위해 GEO 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)에서 GSE2619314(n = 107개 표본), GSE3016115(n = 58개 표본), GSE6388516(n = 70개 표본) 데이터셋을 다운로드하여 해당 환자들의 유전자 발현 프로파일과 생존율을 분석하였습니다. 데이터의 일관성을 보장하기 위해 ENSEMBL 유전자 식별자를 공식 유전자 기호로 변환하였습니다. 표본의 절반 미만에서 발현된 유전자는 필터링하여 제거하였습니다. 아울러 GEO 데이터베이스에서 인간 난소암 단일 세포 전사체 데이터셋 GSE15460017과 난소암 공간 전사체 데이터셋 GSE211956-GSM6506110-SP118을 확보하였습니다.
난소암 공간 전사체 시퀀싱 데이터 처리
공간 전사체 데이터는 Seurat19 (버전 5.4.0)를 사용하여 처리하였다. 스폿(Spot)은 단일 세포 RNA 시퀀싱 분석과 동일한 품질 관리 기준(nFeature_RNA: 200–5,000; 미토콘드리아 유전자 비율 < 10%)을 적용하여 필터링하였다. 정규화 및 고변이 유전자 식별 후, PCA 기반의 차원 축소를 수행하였으며, Seurat 그래프 기반 클러스터링 알고리즘을 사용하여 클러스터링을 진행하였다. 하위 그룹과 유전자 발현 패턴은 SpatialFeaturePlot 함수를 사용하여 시각화하였다. 또한, 공간 전사체 수준에서의 유전자 발현량은 “AUCell”19 (버전 1.32.0)을 사용하여 시각화 및 분석하였다.
scRNA-seq 데이터 분석
GSE154600의 단일 세포 RNA 시퀀싱 데이터는 Seurat 패키지(버전 5.4.0)19를 사용하여 분석되었습니다. 품질 관리 기준에 따라 저품질 세포를 제거하였습니다. 검출된 유전자가 200개 미만이거나 5,000개 초과인 세포, 또는 미토콘드리아 유전자 비율이 10%를 초과하는 세포는 제외되었습니다. NormalizeData 함수를 사용하여 정규화를 수행한 후, VST 방법을 통해 상위 2,000개의 고변동성 유전자를 식별하였습니다. 변동성 유전자를 기반으로 PCA를 수행하였으며, 상위 15개 주성분을 클러스터링 및 차원 축소에 사용하였습니다. FindNeighbors와 해상도 0.5의 FindClusters를 사용하여 세포 클러스터를 식별한 후, UMAP 및 t-SNE 시각화를 수행하였습니다. 서로 다른 세포 클러스터의 마커 유전자를 식별하기 위해 FindAllMarkers 함수를 사용하였습니다. 또한, CellMarker 2.020 데이터베이스를 사용하여 세포 클러스터를 주석 처리하였으며, GSVA 패키지(버전 2.4.9)의 ssGSEA 함수를 사용하여 유전자 활성의 정량적 분석을 수행하였습니다.
차등 발현 유전자(DEG) 및 기능 분석
난소암 조직과 정상 난소 조직 간의 PARDTG 발현 프로파일을 바탕으로 “limma” 패키지21 (버전 3.56.2)를 사용하여 차등 발현 분석을 수행하였다. 분석 전, FPKM 발현 값은 log2(FPKM+1) 식을 사용하여 log2 변환을 거쳤다. 차등 발현되는 PARDTG를 식별하기 위해 limma 패키지에 구현된 표준 선형 모델을 적용하였다. 거짓 발견율(FDR) < 0.05 및 |log2 fold change (FC)| > 1인 유전자를 유의미하게 차등 발현된 것으로 간주하였다. ClusterProfiler22 (버전 4.8.3)를 사용하여 차등 발현된 PARDTG에 대한 GO 및 KEGG 풍부도 분석을 수행하였다. 난소암 내 PARDTG의 체세포 돌연변이를 검출하기 위해 “maftools”23 (버전 2.16.0)를 사용하여 워터폴 플롯을 생성하였다. 다음으로, 기본 파라미터를 적용하여 STRING 리포지토리(버전 12.0)를 통해 PARDTG의 PPI 네트워크를 구축하였다.
PARDTG 기반 위험 점수 체계의 개발
최적의 PARDTG를 식별하기 위해, 차등 발현된 PARDTG 중에서 예후적으로 유의미한 유전자를 선별하고 난소암(OV)의 전체 생존율에 기여하는 바를 결정하고자 단계적 Cox 비례 위험 회귀 분석을 수행하였습니다. 최종 다변량 Cox 회귀 모델의 비례 위험 가정은 R survival 패키지(버전 3.5.5)의 cox.zph 함수로 구현된 Schoenfeld 잔차 검정을 통해 평가되었습니다. 시그니처 유전자의 발현 수준과 그에 해당하는 Cox 회귀 계수를 기반으로 예후 위험 점수를 계산하였습니다. 전사체 플랫폼 간의 이질성을 고려하여, 예후 모델을 TCGA-OV, GSE26193, GSE30161 및 GSE63885 코호트에서 각각 독립적으로 평가하였습니다. 각 코호트에 대해 시그니처 유전자의 발현 프로파일을 사용하여 코호트별 위험 점수를 산출하였으며, 위험 점수의 중앙값을 기준으로 환자들을 고위험군과 저위험군으로 층화하였습니다. 두 그룹 간의 전체 생존율(OS)은 Kaplan–Meier 분석을 통해 비교하였으며, 로그 순위 검정(log-rank test)으로 통계적 유의성을 평가하였습니다. 이후 단변량 및 다변량 Cox 비례 위험 회귀 분석을 통해 위험 점수의 독립적인 예후 가치를 평가하였습니다.
난소암의 예후 임상 모델 개발
위험 점수가 기존의 임상 변수 외에 추가적인 예후 정보를 제공하는지 판단하기 위해, 위험 점수와 임상병리학적 특성을 포함하여 단변량 및 다변량 Cox 비례 위험 회귀 분석을 수행하였다. 이어서 분자 위험 점수와 종양 병기 및 등급과 같은 임상적 관련 변수를 입력 파라미터로 사용하여 예후 노모그램을 구축하였다. 변수 선택은 단순히 통계적 유의성만이 아니라, 임상적 관련성과 통합 예후 모델 개발이라는 목적을 기반으로 이루어졌다. 개별 변수에서 도출된 총점을 바탕으로 1년, 3년 및 5년 전체 생존 확률을 추정하기 위해 “rms” 패키지24 (버전 6.7.1)를 사용하여 노모그램을 생성하였다.
면역 특성 분석
면역 세포 침윤은 LM22 시그니처 매트릭스가 포함된 CIBERSORT 알고리즘을 사용하여 추정하였습니다. 분석은 1,000회의 순열(permutation)을 통해 수행되었으며, 디콘볼루션(deconvolution) P-value가 < 0.05인 샘플을 통계적으로 신뢰할 수 있는 것으로 간주하였습니다. 난소암에서 고도로 변이된 유전자의 유병률을 나타내기 위해 maftools(버전 2.16.0)를 사용하여 워터폴 도표(Waterfall diagrams)를 생성하였습니다. 유전자 세트 풍부성 분석(GSEA)은 ClusterProfiler(버전 4.8.3)를 통해 p < 0.05의 유의성 임계값으로 수행되었습니다.
ceRNA 네트워크 구축
본 연구에서는 예후 유전자와 전사 인자 간의 상호작용을 분석하기 위해 NetworkAnalyst 3.0 (https://www.networkanalyst.ca/)25을 사용하였다. miRNA-TF 공동 조절 네트워크는 NetworkAnalyst 3.0을 이용하여 구축되었다.
난소암 조직 샘플
선택적 외과적 절제술을 받는 환자들로부터 난소암 조직 및 이에 매칭되는 인접 정상 샘플(N = 6)을 수집하였다. 본 연구 프로토콜은 산부인과 윤리위원회의 승인을 받았다. & 푸단대학교 부속 부인과 병원(2024-54-X1)의 승인을 받았으며, 모든 참여자로부터 서면 동의를 얻었습니다. 본 연구는 헬싱키 선언을 준수하여 수행되었습니다.
웨스턴 블롯 분석
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), protease inhibitor cocktail 및 phosphatase inhibitor가 포함된 RIPA lysis buffer를 사용하여 인간 조직 표본에서 총 단백질을 추출하였다. 단백질 농도는 bicinchoninic acid (BCA) 단백질 분석법으로 측정하였다. 동일한 양의 단백질을 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 분리한 후 polyvinylidene fluoride (PVDF) 막으로 전이시켰다. 전이 후, TBS-T로 조제한 5% 무지방 우유를 사용하여 실온에서 90분 동안 막을 블로킹하였다. 그 후 Cytokeratin 81 (rabbit polyclonal, 1:2,000) 또는 GAPDH (mouse monoclonal, 1:10,000)에 대한 1차 항체와 함께 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하였다. 세척 후, 적절한 2차 항체를 실온에서 90분 동안 처리하였다. 단백질 밴드는 enhanced chemiluminescence (ECL) 검출 시약을 사용하여 시각화하고 상용 이미징 시스템으로 캡처하였다. ImageJ에서 밀도 분석을 수행하였으며, KRT81 발현량은 GAPDH 로딩 컨트롤을 기준으로 정규화하였다. 쌍을 이룬 샘플 간의 단백질 발현 차이는 paired t-test를 사용하여 평가하였으며, P < 0.05인 경우를 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였다.
범암 분석
본 연구에서는 KRT81 발현 수준 간의 관계를 확인하기 위해 TCGAplot26 (버전 5.0.0)을 사용하였습니다. 통계적 상관관계를 계산하기 위해 피어슨 상관 분석(Pearson correlation analysis)을 활용하였습니다. 다양한 암종에 걸친 KRT81의 변이 프로파일은 cBioPortal 플랫폼(http://www.cbioportal.org/) (버전 7.0.6)을 사용하여 분석하였습니다.
통계 분석
모든 데이터 분석은 R 소프트웨어(버전 4.3.1)를 사용하여 수행되었습니다. 두 그룹 간의 비교는 Wilcoxon 순위 합 검정으로 진행하였으며, 세 그룹 이상의 차이는 Kruskal-Wallis 검정을 통해 평가하였습니다. 전체 생존율은 Kaplan-Meier 방법으로 분석하였고, 생존 곡선 간의 통계적 유의성은 log-rank 검정으로 결정하였습니다. 별도로 명시되지 않는 한, 양측 P 값 < 0.05를 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였습니다. 유의 수준은 다음과 같이 표시하였습니다: P < 0.05 *, P < 0.01 **, P < 0.001 ***, 및 P < 0.0001 ****.
결과
공간 및 단일 세포 전사체 분석을 통한 수술 전후 마취 관련 약물 표적 유전자의 면역 특성
시퀀싱 깊이를 보정하고 구현 절차를 수행하기 위해 SCTransform을 사용했으며, 최종적으로 11가지의 서로 다른 세포 유형을 식별하였습니다. 각 세포 하위 집단에서 수술 전후 마취 관련 약물 표적 유전자(PARDTGs)의 중요성을 평가하기 위해, AUCell R 패키지를 사용하여 각 세포 하위 집단에서의 PARDTG 관련 활성도를 결정하였습니다(그림 1A,B). 이어서, Spearman 순위 상관계수를 사용하여 모든 로커스에 걸쳐 세포 풍부도와 PARDTG 관련 활성도 사이의 상관관계를 계산하였습니다. 특히, PARDTG 관련 활성도는 종양 세포와 음의 상관관계를 보였습니다(그림 1C). 총 41,367개의 세포를 포함하는 5명의 OV 환자로부터 단일 세포 RNA 시퀀싱 데이터를 확보하였습니다. 마커 유전자 발현을 기반으로 세포를 11개의 주요 클러스터로 분류하였습니다(그림 1D). 세포 유형별 상호작용 네트워크와 강도는 그림 1E에 나타나 있습니다. Seurat의 ssGSEA를 사용하여 120개 PARDTGs의 발현 점수를 매김으로써 모든 단일 세포에서 PARDTG 활성도를 평가하였습니다(그림 1F). 놀랍게도, 종양 세포는 다른 모든 세포 유형보다 현저히 낮은 활성도를 보였습니다(그림 1G).
난소암에서 수술 전후 마취 관련 약물 표적 유전자의 식별 및 분자적 특성 분석
TCGA 데이터베이스로부터 68개의 차별 발현 PARDTG를 식별하였으며, 이는 그림 2A에 나타나 있습니다( 부록 표 S3 참조). 그림 2B는 TCGA-OV 코호트에서 이 68개 수술 전후 마취 관련 DEG의 발현을 설명합니다. 이어서, DEG와 관련된 단백질 간의 복잡한 관계를 규명하기 위해 PPI 네트워크를 구축하였습니다. 그 결과, 난소암의 발병 기전에서 중요한 영향을 미칠 수 있는 5개의 잠재적 허브 유전자 SLC6A4, CHRNA4, DRD2, SLC6A3 및 GRIN2A를 식별하였습니다(그림 2C). 또한, 난소암에서 120개 PARDTG의 분자적 변이 프로파일을 조사하였으며, 넌센스 돌연변이가 가장 흔한 변이 유형으로 나타났습니다(그림 2D). 가장 빈번하게 돌연변이가 발생한 유전자는 SCN10A, DNMT1, GRIN2A, LTF 및 SCN11A였습니다. 복제수 변이(CNV) 돌연변이의 유병률을 탐색한 결과, 돌연변이가 있는 상위 20개 PARDTG에서 유의미한 CNV 변이가 확인되었습니다(그림 2E). GO 및 KEGG 풍부도 분석 결과, PARDTG는 신경활성 리간드 신호 전달, 칼슘 신호 전달 경로, 호르몬 신호 전달, 암페타민 중독, 코카인 중독 및 신경활성 리간드-수용체 상호작용과 관련이 있는 것으로 나타났습니다(그림 2F,G).
수술 전후 마취 관련 약물 표적 유전자에 기반한 예후 모델의 구축 및 검증
모델 복잡성을 최소화하기 위해 StepAIC를 사용하여 유전자 세트를 축소했으며, 최종적으로 17개의 PARDTG를 유지하여 예후 모델을 구축하였습니다(Supplementary Table S4). 전역 Schoenfeld 잔차 검정 결과, 비례 위험 가정에서 유의미한 편차가 나타나지 않아(p = 0.265), 17개 유전자 예후 모델의 신뢰성이 입증되었습니다. 위험 점수는 다음 방정식을 사용하여 계산되었습니다: risk score = ADRA1D*(0.4452) + ADRB1*(-0.5347) + CHRNA4*(0.3495) + DBH*(-0.5765) + EPHA4*(0.2827) + EPHA7*(-0.5707) + EPHA8*(0.8765) + GABRB2*(0.5979) + GRIN2A*(-0.1750) + GRIN2D*(0.2746) + KCNA1*(2.2753) + KRT81*(0.1101) + OPRD1*(-3.2372) + SLC6A2*(1.4901) + SLC18A1*(4.2170) + SLC18A2*(-1.4600) + CHRNA1*(-0.1723). 이후 환자들을 위험 점수에 따라 저위험군과 고위험군으로 나누었으며, TCGA-OV(Figure 3A, p < 0.0001), GSE26193 코호트(Figure 3B, p = 0.00021), GSE30161 코호트(Figure 3C, p = 0.0017) 및 GSE63885 코호트(Figure 3D, p = 0.0041)에서 저위험군이 고위험군에 비해 OS가 유의미하게 개선된 것으로 나타났습니다. 또한, Figure 3E–H 는 TCGA-OV, GSE26193, GSE30161 및 GSE63885 코호트에서의 생존 상태와 위험 점수의 분포를 보여주며, 이는 OV에서 예후 모델의 안정성과 예측 신뢰성에 대한 독립적인 근거를 제공합니다.
노모그램 기반 생존 모델의 구축 및 평가
단변량 및 다변량 Cox 회귀 분석 결과, 위험 점수가 난소암 환자의 예후를 예측하는 독립적인 예측 인자임이 입증되었습니다 (그림 4A,B). TCGA-OV 코호트에서의 모델 유전자 발현 분포, 이에 해당하는 위험 점수 및 임상병리학적 특성은 그림 4C에 나타나 있습니다. 임상 적용 가능성을 높이기 위해 위험 점수와 연령, 종양 단계 및 등급을 통합하여 전체 생존율(OS)을 추정하는 예후 노모그램을 구축하였습니다 (그림 4D). 유전자 시그니처 단독 사용과 비교했을 때, 통합 노모그램은 더 우수한 예측 성능을 보였습니다. 생존 분석 결과, 저위험군이 고위험군보다 OS가 유의하게 더 긴 것으로 나타났습니다 (그림 4E; P < 0.0001). 통합 모델의 OS 예측에 대한 시간 의존적 AUC 값은 각각 0.769, 0.690, 0.728로 산출되었습니다 (그림 4F). 결정 곡선 분석(Decision curve analysis) 결과, 다양한 임계 확률 범위에서 더 큰 순 이익(net benefit)을 보임으로써 노모그램의 잠재적인 임상적 유용성이 뒷받침되었습니다 (그림 4G). 또한, 보정 곡선(calibration plots)은 예측된 생존 확률과 관찰된 생존 확률 사이의 밀접한 일치를 보여주어 모델의 보정 상태가 양호함을 시사했습니다 (그림 4H). 종합적으로, 이러한 결과는 제안된 노모그램이 난소암 환자의 예후를 평가하는 데 있어 강력한 예측 능력을 갖추고 있음을 나타냅니다.
PARDTG 기반 예후 모델과 면역 침윤 및 종양 면역 미세환경의 연관성
면역 침윤을 특성화하기 위해, 샘플 전반에 걸쳐 면역 세포의 풍부도를 정량화하였다. 17개의 유전자가 종양 침윤 면역 세포와 유의미한 연관성이 있는 것으로 확인되었으며, 그중 ADRA1D, KCNA1, 및 SLC18A2는 M2 대식세포와 양의 상관관계를 보였다(그림 5A). 다음으로 이러한 유전자들의 세포 국소화 패턴을 조사하였다. 도트 플롯 분석 결과, KRT81은 주로 CD8Tex 및 Tprolif 세포에서 발현된 반면, EPHA4 발현은 주로 혈관 내피세포와 섬유아세포에서 농축되어 있어, 이들이 종양 미세환경 내의 서로 다른 세포 구획에 관여할 가능성이 있음을 시사하였다(그림 5B). 또한, 환자들의 TIDE 점수를 평가한 결과, 고위험군 하위클러스터가 더 높은 TIDE 점수를 가졌으며 양의 상관관계를 보임을 관찰하였다(그림 5C). 나아가, 줄기세포능 농축 점수는 저위험군보다 고위험군에서 유의미하게 더 높았다(그림 5D). 체세포 변이 분석 결과, 두 위험군 모두에서 전반적으로 높은 변이 빈도가 나타났다(그림 5E,F). 그중 CSMD3와 MUC16의 변이 빈도는 고위험군 샘플에서 더 높았다.
GSEA 결과, 항원 처리 및 제시와 동종이식 거부 반응을 포함한 면역 관련 경로가 저위험군에서 유의하게 농축된 반면, 액틴 세포골격 조절, 암의 프로테오글리칸 및 운동 단백질과 같은 종양 침습 및 운동성 관련 경로는 주로 고위험군에서 농축된 것으로 나타났습니다(그림 5G,H). 이러한 결과는 고위험군 환자들이 면역요법에 대해 제한적인 반응성을 보일 수 있음을 시사합니다.
난소암에서 예후 관련 PARDTG의 식별 및 네트워크 분석
메커니즘을 규명하기 위해, 우리는 490개의 miRNA와 17개의 바이오마커 잠재적 조절 네트워크를 식별하였습니다(그림 6A). 그중 hsa-miR-27a-3p, hsa-miR-34a-5p, hsa-miR-106b-5p 및 hsa-miR-20b-5p가 대부분의 유전자를 조절할 가능성이 있는 것으로 나타났습니다. 최종적으로, 본 연구 결과 후보 진단 유전자를 조절하는 37개의 전사 인자를 식별하였습니다(그림 6B). 또한, FOXC1 역시 다중 조절 기능을 가지고 있음을 확인하였습니다.
KRT81 발현의 범암 분석
TCGA의 RNA-seq 데이터를 획득하여 ~을 평가하였다 KRT81 발현. 결과에 따르면, 이는 대부분의 암에서 높게 발현되었으나 GBM, LGG, SKCM, TGCT 및 THCA에서는 낮은 수준으로 발현되었다(그림 7A). ~라는 결과를 검증하기 위해 KRT81 생물정보학 분석 결과 난소암에서 높게 발현되는 것으로 확인되어, 웨스턴 블롯 실험을 수행하였습니다. 그 결과, KRT81 발현량은 정상 조직에 비해 종양 조직에서 유의하게 높았으며, 이는 TCGA 전사체 데이터와 대체로 일치하였다(그림 7B, 보충 자료 그림 S1, 및 부록 표 S5). ~ 사이의 관계를 설명하기 위해 KRT81 및 암에 대해 유전자 발현과 면역 세포 침윤을 조사하였습니다 (그림 7C). 분석 결과 다음이 밝혀졌습니다. KRT81 발현은 대부분의 암종에서 T 세포, 조절 T 세포(Treg) 및 M2 대식세포의 침윤과 양의 상관관계를 보였다. 또한, KRT81 발현은 대부분의 암종에서 기질 점수 및 면역 점수와 양의 연관성이 있었다(그림 7D). 또한, 우리는 다음 사이의 상관관계를 분석하였습니다. KRT81 발현 및 이배체 점수(Aneuploidy Score)를 분석하였으며, 레이더 차트 분석 결과 KRT81은 UCEC, SARC, LUAD, LIHC 및 KIRP에서 이배체 점수와 상관관계가 있는 것으로 나타났다(그림 7E). 그런 다음 우리는 ~ 사이의 상관관계를 분석하였습니다. KRT81 및 종양 배수성(Tumor Ploidy)을 나타내었으며, 레이더 차트에서는 KRT81 THCA, TGCT, SARC, MESO, LIHC 및 CESC의 종양 배수성(Tumor Ploidy)과 상관관계가 있었다(그림 7F). 그 후, 레이더 차트를 통해 KRT81이 UCEC, THYM, LUAD, LIHC, GBM 및 BRCA의 SNV 신생 항원(Neoantigens)과 상관관계가 있음을 확인하였다(그림 7G). 또한, cBioPortal 온라인 분석 결과, 가장 높은 빈도의 KRT81 유전자 돌연변이는 UCEC에서 나타났으며, 그중 대부분의 유형은 "돌연변이(mutation)" 및 "증폭(Amplification)"이었다(그림 7H,나단변량 Cox 비례위험 회귀 분석을 통해, KRT81이 KIRC, LUAD 및 STAD의 전체 생존율(OS)에 대한 예측 인자임을 확인하였습니다.그림 7J).
데이터 가용성:
본 연구에서 분석된 공개 데이터셋은 TCGA, UCSC Xena 및 GEO에서 이용 가능합니다. 본 연구 과정에서 생성된 원본 웨스턴 블롯 이미지와 그에 해당하는 정량 데이터는 보충 자료(보충 그림 S1 및 보충 표 S5)에 제공되어 있습니다.
그림 1. 공간 및 scRNA-seq에서의 PARDTG 관련 특징. (A,B) PARDTG 발현 강도의 공간적 매핑 (C), PARDTG 관련 활성의 Spearman 상관관계. (D) 세포 유형 분석. (E) 세포 유형 간의 상호작용 횟수 및 강도 분석. (F) 세포 내 PARDTG 풍부도 값. (G) PARDTG의 분포. 약어: PARDTG = perioperative anesthesia-related drug target genes; scRNA-seq = 단일 세포 RNA 시퀀싱. 여기에서 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
그림 2. OV 환자에서 PARDTG의 유전적 변이 양상. (A) OV에서 DEG의 화산 플롯 시각화 (파란색: 하향 조절된 DEG; 빨간색: 상향 조절된 DEG; 회색: 안정적인 유전자), FDR< 0.05 및 |log2FC| > 1. (B) OV 그룹과 정상 그룹 간의 차등 발현 특성을 보여주는 히트맵. 파란색은 정상 그룹, 빨간색은 OV 그룹을 나타내며, 파란색 사각형은 낮은 발현을, 노란색 사각형은 높은 발현을 나타냄. (C) String 웹사이트에서 얻은 수술 전후 마취 관련 DEG의 PPI 네트워크. (D) TCGA 코호트의 상위 20개 PARDTG. (E) 상위 20개 PARDTG 중 CNV gain, loss 및 non-CNV의 빈도. (F) 농축된 GO 용어의 GO 도트플롯. (G) 농축된 KEGG 경로의 막대그래프. OV = 난소암; GO = Gene Ontology; KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; PPI = 단백질-단백질 상호작용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 난소암에 대한 PARDTG 기반 예후 시그니처의 구축 및 검증. (A-D). (A) TCGA-OV, (B) GSE26193, (C) GSE30161, (D) GSE63885의 저위험군 및 고위험군 환자의 OS. (E-H) 생존 상태 및 시간을 이용한 PARDTG 관련 위험 점수의 분포: (E) TCGA-OV, (F) GSE26193, (G) GSE30161, (H) GSE63885. 여기를 클릭하여 이 그림의 확대 버전을 확인하십시오.
그림 4PARDTG 유래 위험 시그니처 기반의 예후 노모그램 구축 및 검증. (A, B) TCGA-OV 코호트의 임상병리학적 특징 및 위험 점수. (C) 위험 점수별 임상적 특성의 분포 및 모델 유전자의 발현. (D) 난소암(OV) 환자의 예후 예측을 위한 노모그램. (E) 두 개의 OV 그룹에 대한 Kaplan-Meier 분석. (F) TCGA-OV의 ROC 곡선 분석. (GDCA는 노모그램 및 기타 임상적 특성의 순 이익(net benefits)을 보여줍니다.H) 보정 곡선은 TCGA-OV의 전체 생존기간(OS)을 나타냅니다. 약어: ROC = 수신자 조작 특성; DCA = 결정 곡선 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 저위험군 및 고위험군 환자의 종양 미세환경 분석. (A) 종양 침윤 면역 세포와 PA 관련 예후 모델 내 유전자 간의 상관관계. (B) 다양한 세포 서브타입에 걸친 예후 바이오마커의 평균 발현량과 비율을 보여주는 버블 플롯. (C) TIDE 점수의 바이올린 플롯. (D) 종양 줄기세포능 풍부도 점수의 바이올린 플롯. (E,F) (E) 저위험군 및 (F) 고위험군 점수 범주의 체세포 돌연변이 특성을 묘사한 워터폴 플롯. (G,H) (G) 저위험군 하위 그룹 및 (H) 고위험군 하위 그룹의 KEGG 경로에 대한 GSEA 결과. 약어: TIDE = Tumor Immune Dysfunction and Exclusion; GSEA = Gene Set Enrichment Analysis. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. 예후 마커의 상호작용 네트워크 분석. (A) MiRNA-예후 마커 공동 조절 네트워크. (B) 전사 인자-예후 마커 공동 조절 네트워크. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7. 인간 종양 내 KRT81의 발현 수준, 면역 특성 및 유전적 변이. (A) TCGA 종양 및 인접 조직에서의 KRT81 발현. (B) 난소암 환자 6명(n = 6)의 쌍을 이룬 인접 정상 조직 및 종양 조직에서의 KRT81 단백질 발현에 대한 웨스턴 블롯 분석. 밴드의 상대적 강도는 GAPDH로 정규화하였으며, 데이터는 paired t-test를 사용하여 분석하였다. 데이터는 mean ± SD로 표시하였다. (C) KRT81과 면역 세포 비율 간의 상관관계를 히트맵으로 표시하였다. (D) KRT81과 면역, 기질 및 ESTIMATE 점수 간의 상관관계를 히트맵으로 표시하였다. (E-G) TCGA 데이터베이스에서 KRT81의 발현과 (E) Aneuploidy Score, (F) Tumor Ploidy, (G) SNV Neoantigens 간의 상관관계. (H) cBioPortal 데이터베이스를 이용한 다양한 암종별 KRT81 변이. (I) 범암(pan-cancer) 분석에서의 KRT81 변이 부위 분포. (J) TCGA 암종 전반에 걸친 KRT81의 범암 Cox 회귀 분석. *p < 0.05; ***p < 0.001; ****p < 0.0001. 약어: SNV = Single Nucleotide Variant; N = 정상(normal); T = 종양(tumor). 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 S1: 수술 전후 마취 관련 약물 표적 유전자. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 S2: 샘플 흐름 설명.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 S3: 차등 발현된 수술 전후 마취 관련 약물 표적 유전자. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 S4: 예후와 관련된 수술 전후 마취 관련 약물 표적 유전자.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 S5: Western blot 소스 데이터.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S1: 웨스턴 블로팅의 원본 데이터.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
토론
암 치료 워크플로우의 불가피한 구성 요소인 수술 전후 마취는 잠재적인 면역 조절 효과, 미세환경 재구성 능력 및 종양 전이 촉진 가능성으로 인해 점점 더 많은 관심을 끌고 있습니다. 암이 단순히 유전자에 의해 구동되는 국소 병변이라기보다 전신적이고 생태학적인 질환으로 점점 더 인식됨에 따라27, 수술 전후의 생리학적 조절 장애, 염증 반응 및 대사 스트레스는 미세환경 니치(niche)를 재형성하고 종양의 진화 궤적에 영향을 미칠 수 있습니다. 본 연구에서는 다층 전사체 통합을 통해 난소암(OV)에서 PARDTGs의 발현 패턴, 생물학적 연관성 및 예후 가치를 체계적으로 묘사하여 수술 전후 정밀 마취를 위한 잠재적 단서를 제공하였습니다.
공간 및 단일 세포 전사체 프로파일링 결과, PARDTG 활성의 뚜렷한 공간적 변이가 확인되었으며, 종양 상피 세포에서는 활성이 감소하고 면역 세포, 혈관 내피 세포 및 섬유아세포에서는 활성이 증가하는 양상을 보였습니다. 이러한 “비종양 세포 농축” 패턴은 마취제 표적 네트워크가 종양 세포 자체의 고유한 메커니즘보다는 주로 기질 및 면역 세포의 상태를 조절함으로써 효과를 나타낼 수 있음을 시사합니다. 이러한 관찰 결과는 종양의 진행이 종양 세포와 그 호스트 미세환경에 의해 공동으로 형성된다는 개념과 일치합니다28. 특히, 수술로 유발된 급성 염증, 일시적인 면역 억제 및 조직 재형성은 종양이 전이 및 재발 위험을 높이는 데 이용할 수 있는 단기적인 상처 치유 미세환경을 조성할 수 있습니다29.
TCGA 코호트를 추가로 분석한 결과, 신경활성 리간드-수용체 상호작용, 칼슘 신호 전달 및 중독 관련 경로에서 유의하게 농축된 68개의 차등 발현 PARDTG가 확인되었다. 구축된 PPI 네트워크는 DRD2, SLC6A3, SLC6A430와 같은 신경전달물질 운반체 및 수용체와 관련된 여러 허브 유전자를 강조했으며, 이는 OV 진행 과정에서 수술 전후 신경전달물질 신호 전달의 추가적인 조절 입력이 있음을 시사한다. 최근 연구에서는 DRD2 길항제인 ONC206이 OV 세포와 형질전환 마우스 모델에서 증식과 침습을 억제하고 세포 주기 정지 및 세포 사멸을 유도함으로써 이 축의 치료적 잠재력을 입증하였다. CHRNA4와 GRIN2A는 각각 콜린성 수용체 및 NMDA 수용체 관련 단백질을 인코딩하며, 이러한 수용체의 활성화는 세포 내 Ca2⁺ 유입을 촉진하고31,32 칼슘 섭동은 세포 골격을 재구성하고 종양 촉진 전사 프로그램을 활성화할 수 있다33. 또한, 중독 관련 수용체(예: µ-오피오이드 수용체)는 mTORC1 활성화 및 면역 회피와 연관이 있는 것으로 밝혀졌다34. 종합적으로, 이러한 발견은 마취 표적 경로와 수술 전후 스트레스-신경-면역 네트워크 간의 잠재적인 상호작용이 존재하며, 이를 통해 짧은 수술 전후 기간 내에 종양 가소성과 재발 위험에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다.
17-유전자 위험 모델은 여러 독립적인 코호트 전체에서 안정적인 예후 성능을 입증했습니다. 고위험군 환자들은 “Regulation of actin cytoskeleton” 및 “Proteoglycans in cancer”와 같은 경로가 풍부하게 나타났으며, 이는 세포골격 재구성 및 전이 잠재력의 증가를 시사합니다. 면역 프로파일링 결과, 고위험군에서 M2 대식세포의 비율이 더 높고, 면역 관문 관련 유전자의 상향 조절과 TIDE 점수의 상승이 확인되었습니다. M2 대식세포는 면역 회피를 촉진하며, 수술 후 염증 활성화는 골수 유래 억제 세포(MDSCs)의 모집을 유도할 수 있습니다35. 특히, EPHA4는 주로 내피 세포 및 섬유아세포 하위 집합에서 발현되어 혈관 조절, 기질 재구성 및 종양 미세환경 상호작용에 관여할 가능성을 시사했습니다. EPHA4는 Eph 수용체 티로신 키나아제 가족의 구성원이며, Eph/ephrin 신호 전달을 통해 세포 간 통신의 중요한 매개체로 작용합니다. EPHA4의 활성화는 세포골격 재배열, 세포 접착, 이동 및 세포외 기질 조직화와 관련된 하위 경로를 조절할 수 있습니다36. 종양 미세환경에서 조절 장애가 발생한 EPHA4 신호 전달은 종양 세포 침습, 혈관 형성 반응, 기질 활성화, 그리고 악성 세포와 주변 기질 구성 요소 간의 상호작용을 촉진하는 것과 관련이 있는 것으로 밝혀졌습니다37. 이러한 결과는 EPHA4가 혈관-기질 통신과 종양 생태학적 재구성을 조절함으로써 고위험군 환자의 공격적인 생물학적 특성에 기여할 수 있음을 시사합니다. 동시에 고위험군 환자들은 기질 상호작용 및 면역 회피와 관련된 MUC16 및 CSMD3와 같은 유전자에서 더 높은 돌연변이 빈도를 보였습니다38,39. 종합하면, 고위험군 환자들은 조절 장애가 있는 세포골격 역동성, 면역 억제성 미세환경 및 기질 재구성을 특징으로 하는 악성 생태적 특성을 보이는 것으로 보이며, 이는 PARDTGs가 종양 생태학적 변화 및 질병 진행과 관련이 있을 수 있음을 시사합니다.
마취제는 비코딩 RNA 네트워크의 조절을 통해 다중 유전자 발현을 재프로그래밍하여, 종양 세포의 부착, 이동, 세포 사멸 저항성 및 줄기세포성 유지에 영향을 미침으로써 수술 후 재발 위험을 잠재적으로 변화시킬 수 있습니다40,41. 당사의 miRNA-전사 인자 핵심 조절 네트워크에서 miR-27a-3p, miR-34a-5p, miR-106b-5p가 잠재적인 조절 허브로 확인되었으며, 이들이 OV 진행 및 마취제 관련 약리학적 반응에 관여한다는 광범위한 증거가 뒷받침됩니다42,43,44. 핵심 전사 인자인 FOXC1은 OV의 이동, 침습 및 EMT 표현형 촉진에 중요한 역할을 하며, 여러 비코딩 RNA에 의해 상위에서 조절됩니다45.
난소암 예후 모델을 검증하기보다, 다양한 악성 종양에 걸친 KRT81의 생물학적 특성을 추가로 탐색하기 위해 범암 분석을 수행하였습니다. 분석 결과, KRT81은 대부분의 암종에서 유의미하게 상향 조절되었으며, 이배수성, 면역 침윤 및 기질 점수와 상관관계를 보여 생태적 틈새(ecological niche) 재구성 및 면역 회피에 관여하고 있음을 시사하였습니다. 제2형 케라틴 가족의 일원으로서 KRT81은 상피 세포골격의 무결성, 세포의 기계적 안정성 및 스트레스 적응 유지에 관여합니다. KRT81 발현의 조절 장애는 세포골격 조직, 상피 분화, 그리고 종양 세포와 주변 미세환경 간의 상호작용에 영향을 주어 종양 세포의 가소성에 영향을 미칠 수 있습니다. 또한, 비정상적인 케라틴 재구성은 세포 증식, 이동, 침습 및 면역-기질 간의 소통 조절을 통해 암 진행에 관여하는 것으로 알려져 있습니다. 이전 연구들에 따르면 KRT81은 OV에서 면역 서브타이핑 및 예후 층화의 바이오마커로 작용하며46, 삼중음성 유방암에서는 면역 억제성 미세환경 형성 및 면역요법 반응 예측에 기여하는 것으로 보고되었습니다47. 따라서 KRT81은 기전적 및 중개적 관련성을 가진 수술 전후 종양 가소성 네트워크의 핵심 노드를 나타낼 수 있습니다.
종합적으로, 본 연구는 OV에서 PARDTG 발현 생태계에 대한 최초의 공간 및 단일 세포 수준의 특성을 규명하였으며, 이들이 면역 미세환경, 줄기세포 특성 및 유전적 불안정성과 연관되어 있음을 보여주어 수술 전후 마취 관련 약물 표적 유전자가 종양 진화 궤적과 관련될 수 있음을 시사합니다. 그럼에도 불구하고 몇 가지 한계점을 인정해야 합니다. 첫째, 본 연구는 주로 공개된 전사체 데이터셋을 기반으로 하였으며, 샘플 출처, 시퀀싱 플랫폼 및 코호트 특성의 차이로 인해 잠재적인 배치 효과가 발생하고 결과의 강건성에 영향을 미쳤을 수 있습니다. 둘째, 검증을 위해 외부 코호트를 사용하였으나, 예후 모델이 회고적 데이터셋을 통해 개발되었으므로 특성 선택 방법으로 인한 잠재적인 과적합 가능성을 완전히 배제할 수 없습니다. 셋째, 단일 세포 및 공간 전사체 분석을 통해 PARDTGs의 생물학적 역할에 대한 통찰을 얻었으나, 이러한 발견은 주로 계산적 추론에 기반한 것이므로 추가적인 실험적 검증이 필요합니다. 또한 범암 및 면역 상관관계 분석을 포함한 일부 탐색적 분석에는 다중 비교가 포함되었으므로, 잠재적인 위양성 연관성에 대해 주의 깊은 해석이 필요합니다. 마지막으로, 제한적인 공간 전사체 해상도와 예측된 조절 네트워크의 기능적 검증 부족이 추가적인 한계점으로 작용합니다. 확인된 메커니즘을 더욱 검증하기 위해 실험 모델과 임상 샘플을 포함하는 향후 연구가 필요합니다.
본 연구는 PARDTGs가 OV에서 중요한 전사적 생태학적 기능을 수행하며, 수술 후 미세환경으로 유도되는 침습 및 면역 회피에 관여할 수 있음을 밝혔으며, 이는 수술 전후 정밀 마취, 위험 층화 및 재발 방지를 위한 새로운 분자적 근거를 제공합니다.
공개 사항
저자들은 이해상충 관계가 없음을 밝힙니다
감사의 글
TCGA-OV, GSE26193, GSE30161, GSE63885, GSE154600, GSE211956를 포함하여 TCGA 및 GEO 데이터베이스에 귀중한 데이터 세트를 공유해 주신 연구자분들께 진심으로 감사드립니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Anti-Cytokeratin 81 항체 (토끼 다클론성) | Proteintech, USA | 11342-1-AP | |
| Anti-GAPDH 항체 (마우스 단클론) | Proteintech, USA | 60004-1-Ig | |
| BCA 단백질 정량 분석 키트 | Thermo Fisher, USA | 23225 | |
| CIBERSORT | 스탠퍼드 대학교 | https://cibersort.stanford.edu | 면역 침윤 | LM22 시그니처 매트릭스 | 면역 세포 침윤 분석 |
| OV 환자의 임상적 특성 | UCSC Xena | http://xena.ucsc.edu/ | 임상 데이터 | 341명의 환자 | 임상 상관관계 분석 |
| clusterProfiler 패키지 | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler | 기능적 풍성도 분석 | 버전 4.8.3 | GO, KEGG 및 GSEA 분석 |
| ggplot2 패키지 | CRAN | https://cran.r-project.org/package=ggplot2 | 데이터 시각화 | 버전 4.0.2 | 데이터 시각화 |
| GSE26193 | GEO 데이터베이스 | **GEO 데이터셋: GSE26193** **제목:** 인간 유두종 바이러스-16 양성 자궁경부암 조직의 유전자 발현 프로파일링 (Gene Expression Profiling of Human Papillomavirus-16 Positive Cervical Cancer Tissues) **요약:** 본 연구에서는 마이크로어레이(microarray) 분석을 통해 인간 유두종 바이러스-16(HPV-16) 양성 자궁경부암 조직의 유전자 발현 패턴을 조사하였습니다. 연구의 목적은 HPV-16 감염과 관련된 암 발생 및 진행 과정에서 역할을 하는 핵심 유전자를 식별하고, 자궁경부암의 병리적 기전을 이해하기 위한 분자적 표지를 찾는 것입니다. **샘플 정보:** * **샘플 수:** 총 10개 샘플 * **샘플 유형:** 인간 자궁경부암 조직 (HPV-16 양성) * **플랫폼:** Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array **실험 설계:** 본 실험은 HPV-16 양성 자궁경부암 환자로부터 얻은 조직 샘플을 사용하여 전사체(transcriptome) 분석을 수행하였습니다. RNA를 추출하여 cDNA로 역전사한 후, Affymetrix 마이크로어레이 칩을 이용하여 전유전체 수준의 발현량을 측정하였습니다. **분석 결과:** 분석 결과, HPV-16 양성 자궁경부암 조직에서 유의미하게 상향 조절(up-regulated) 또는 하향 조절(down-regulated)된 유전자 군이 식별되었습니다. 이러한 발현 변화는 세포 주기 조절, 세포 사멸 억제 및 혈관 신생과 관련된 경로와 밀접하게 연관되어 있는 것으로 나타났습니다. **키워드:** 자궁경부암, HPV-16, 유전자 발현 프로파일링, 마이크로어레이, 전사체 분석, 암 생물학 | 검증 데이터셋 | 107개 샘플 | 외부 검증 |
| GSE30161 | GEO 데이터베이스 | **샘플 및 데이터 설명** **요약** 인간 태반의 세포외 기질(extracellular matrix) 내에서 콜라겐의 성숙도가 어떻게 조절되는지 이해하기 위해, 아세틸화 및 메틸화 상태의 히스톤 H3 및 H4의 전사 조절 역할을 조사하였습니다. **전체 디자인** 태반 세포의 H3 및 H4 히스톤 수정(histone modification) 상태에 따른 유전자 발현 변화를 분석하기 위해 ChIP-chip 실험을 수행하였습니다. **샘플 정보** - **GSE30161_PROBE_1**: H3K9ac (Histone H3 Lysine 9 acetylation) - **GSE30161_PROBE_2**: H3K4me3 (Histone H3 Lysine 4 trimethylation) - **GSE30161_PROBE_3**: H3K27me3 (Histone H3 Lysine 27 trimethylation) - **GSE30161_PROBE_4**: H4K16ac (Histone H4 Lysine 16 acetylation) - **GSE30161_PROBE_5**: H4K20me3 (Histone H4 Lysine 20 trimethylation) - **GSE30161_PROBE_6**: Input (Control) | 검증 데이터셋 | 58개 샘플 | 외부 검증 |
| GSE63885 | GEO 데이터베이스 | **GEO 데이터셋: GSE63885** **제목:** 인간 유래 유도만능줄기세포(hiPSC) 기반 심근세포의 수축성 및 전기생리학적 특성 분석 **요약:** 본 연구에서는 인간 유도만능줄기세포(hiPSC)로부터 분화된 심근세포의 성숙도를 평가하기 위해 수축성 및 전기생리학적 특성을 분석하였습니다. 특히, 서로 다른 분화 프로토콜과 배양 조건이 심근세포의 기능적 성숙도에 미치는 영향을 조사하였습니다. **샘플 및 실험군:** * **대조군:** 표준 분화 프로토콜을 통해 생성된 hiPSC-심근세포. * **실험군:** 특정 성장 인자 또는 물리적 자극(예: 전기 자극, 기계적 신장)이 적용된 hiPSC-심근세포. **플랫폼:** * GPL (Genome Platform): [해당 플랫폼 명칭/번호] **데이터 유형:** * 전사체 분석(Transcriptome analysis) 데이터: RNA-Seq 또는 Microarray 데이터. **핵심 분석 항목:** * **유전자 발현 프로파일:** 심근세포 성숙 관련 마커(예: TNNT2, MYH6, MYH7)의 발현 수준 분석. * **기능적 평가:** 세포외 기록(extracellular recording) 및 칼슘 이미징을 통한 활동 전위 및 칼슘 과도 현상 분석. * **형태학적 분석:** 근절(sarcomere) 구조 및 세포 정렬 상태 확인. **키워드:** 인간 유도만능줄기세포, hiPSC, 심근세포, 세포 분화, 기능적 성숙도, 전사체 분석, 전기생리학, 수축성 | 검증 데이터 세트 | 70개 샘플 | 외부 검증 |
| GSVA 패키지 | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/GSVA | 유전자 세트 풍부도 분석 | 버전 2.4.9 | ssGSEA 분석 |
| limma 패키지 | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/limma/ | 차등 발현 분석 | 버전 3.56.2 | DEG 분석 |
| 난소암(OV) 환자의 전체 생존 정보 | UCSC Xena | http://xena.ucsc.edu/ | 생존 데이터 | 353명의 환자 | 예후 모델 구축 |
| PVDF 막 | Millipore, USA | IPVH00010 | |
| R | R Foundation for Statistical Computing | https://www.r-project.org/ | 생물정보학 소프트웨어 | 버전 4.3.1 | 통계 분석 |
| RIPA 완충액 | Beyotime, 중국 | P0013B | |
| Seurat 패키지 | CRAN | https://satijalab.org/seurat/ | 단일 세포 분석 | 버전 5.4.0 | 단일 세포 RNA-seq 분석 |
| STRING 데이터베이스 | STRING 컨소시엄 | https://string-db.org | 단백질 상호작용 데이터베이스 | 버전 12.0 | PPI 네트워크 구축 |
| 생존 패키지 | CRAN | https://cran.r-project.org/package=survival | 생존 분석 | 버전 3.5.5 | 생존 분석 |
| TCGA, TARGET, GTEx (Toil) 난소 유전자 발현 데이터 | UCSC Xena | http://xena.ucsc.edu/ | 훈련 데이터 세트 | 420개 TCGA 종양 샘플 | 훈련 코호트 |
| TCGA, TARGET, GTEx (Toil) 난소 정상 조직 데이터 | UCSC Xena | http://xena.ucsc.edu/ | 참조 정상 데이터 세트 | 88개 GTEx 정상 샘플 | 차등 발현 분석 |
참고문헌
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