본 프로토콜은 adenosine monophosphate-activated protein kinase alpha 1/3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase 경로에 초점을 맞추어, N-lactoyl-phenylalanine이 당뇨병성 심근병증, 심장 지질 대사 및 콜레스테롤 합성에 미치는 영향을 조사하기 위한 in vivo 및 in vitro 접근 방식을 설명합니다.
연구 논문
N-Lactoyl-phenylalanine가 지질 대사 조절을 통해 당뇨병성 심근병증 마우스 모델의 심장 기능을 개선함
이 논문에서
요약
초록
당뇨병성 심근병증(DCM)은 당뇨병의 가장 심각한 합병증 중 하나입니다. 내인성 대사물질인 N-lactoyl-phenylalanine(Lac-Phe)은 체중 감소를 촉진하고 포도당 항상성을 개선할 수 있습니다. 본 연구에서는 DCM에 대한 Lac-Phe의 치료 효과를 조사하고 그 기저 메커니즘을 추가로 탐구하고자 하였습니다. DCM이 동반된 제2형 당뇨병 쥐에 Lac-Phe를 투여하였습니다. Lac-Phe는 심장 수축 기능을 강화하고, 병적 리모델링을 개선하며, 심장 내 지질 축적을 감소시켰습니다. In vitro 실험에서는 고농도 포도당과 palmitic acid로 자극된 H9c2 세포에서 Lac-Phe의 효과를 조사하였습니다. Lac-Phe는 H9c2 세포 내 콜레스테롤 합성을 감소시킴으로써 지질 축적을 줄였습니다. 메커니즘적으로 Lac-Phe는 adenosine monophosphate-activated protein kinase alpha 1(AMPKα1)의 인산화 및 활성화를 촉진하였습니다. 이어서 활성화된 AMPKα1은 하위 표적인 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase(HMGCR)를 인산화하여 억제함으로써 콜레스테롤 합성을 감소시키고, 결과적으로 H9c2 세포의 지질 대사 불균형을 개선하였습니다. 이러한 결과는 Lac-Phe가 AMPKα1/HMGCR 경로를 통해 DCM 상태의 H9c2 세포 내 지질 대사를 개선하며, 이를 통해 심장 수축 기능을 강화하고 병적 리모델링을 완화시킨다는 것을 나타냅니다. Lac-Phe는 당뇨병성 심근병증의 잠재적인 치료 방법이 될 수 있습니다.
서론
당뇨병은 지속적인 고혈당을 특징으로 하는 대사성 질환입니다1. 지난 20년 동안 당뇨병은 전 세계 사망 원인 10위 안에 드는 질병이 되었으며, 매년 600만 명 이상의 사람들이 당뇨병 및 그 합병증으로 사망하고 있습니다2. 당뇨병으로 인해 발생하는 심장 병리적 상태인 당뇨병성 심근병증(DCM)은 당뇨병과 관련된 가장 심각한 합병증 중 하나입니다3,4. 이는 심부전의 독립적인 위험 요인으로 작용하며, 심장 섬유화 및 심근세포 비대를 포함한 구조적, 기능적 심근 변화를 특징으로 하며, 궁극적으로 이완기 및 수축기 기능 장애를 모두 유발합니다5,6. 현재 DCM 관리에는 β-차단제, 안지오텐신 전환 효소 억제제 및 안지오텐신 II 1형 수용체 차단제와 같은 여러 전통적인 심혈관 치료법이 사용되고 있지만7,8, 임상 현장에서의 효능은 여전히 최적화되지 않은 상태입니다. DCM의 기저 기전이 충분히 연구되지 않았기 때문에9, 현재 이 질환을 표적으로 하는 명확한 치료 전략이 없는 실정입니다10,11. DCM의 임상적 징후는 초기 단계의 무증상 이완기 기능 장애에서 후기 단계의 수축기 기능 장애 및 임상적 심부전, 그리고 사망에 이르기까지 진행됩니다12,13. 따라서 이 상태에 대한 효과적인 치료 옵션을 탐색하고 개발하는 것이 시급합니다.
불균형한 지질 대사는 DCM의 주요 특징입니다14. DCM에서는 혈중 유리 지방산(FFAs) 수치의 증가가 심근세포의 과도한 지방산 흡수로 이어질 수 있습니다15,16. 심근세포의 지방산 대사는 주로 지방산 산화에 의존합니다. 시간이 지남에 따라 심근세포 내의 지방산 산화로는 섭취된 모든 지방산을 완전히 대사하기에 불충분해지며, 과잉 지방산과 그 중간 대사물이 심근세포에 축적됩니다17. 이러한 과도한 지질 부하는 지질 독성을 유발하고, 심근 에너지 공급을 방해하며, 심장의 산화 스트레스와 염증 반응을 촉진하여 궁극적으로 심근세포에 심각한 손상을 입힙니다18,19. 따라서 심장 지질 대사를 능동적으로 조절하는 것은 DCM의 잠재적인 치료 표적이 될 수 있습니다20.
N-lactoyl-phenylalanine (Lac-Phe)는 운동 후 농도가 급격히 상승하는 내인성 대사물질입니다21. 기전적으로, Lac-Phe는 세포질 효소인 carnosine dipeptidase 2 (CNDP2)에 의해 lactate와 phenylalanine의 응축을 통해 합성됩니다. 이러한 생합성 경로는 대식세포, 상피세포, 중간엽 줄기세포를 포함한 다양한 세포 유형에 널리 분포하며, 신체 활동 후 Lac-Phe를 혈액 순환계로 분비합니다22. Lac-Phe의 만성 투여는 음식 섭취를 효과적으로 감소시키고 비만과 체중을 줄이며, 포도당 항상성을 개선하는 것으로 나타났습니다21. 최근의 한 연구에서는 Lac-Phe가 척수 손상 후 미세아교세포/대식세포의 지질 대사 능력을 개선할 수 있음을 보여주었습니다23. 흥미롭게도, 제2형 당뇨병의 1차 치료제인 metformin의 급성 및 만성 투여 모두 Lac-Phe 수치를 높일 수 있으며, Lac-Phe가 metformin의 항비만 효과를 매개한다는 연구 결과가 있습니다22. 또한, Sha 등은 최근 Lac-Phe가 미토콘드리아 기능 장애를 완화하여 심근 세포 사멸을 개선함으로써 횡대동맥 결찰 (TAC)-유도 심부전을 개선한다는 것을 입증했습니다24. 지속적인 고혈당과 비만은 DCM의 지질 대사 조절 장애에 기여하는 중요한 요인입니다25. 종합하면, 이러한 증거들은 Lac-Phe가 DCM에 대해 잠재적인 치료 효과를 가질 수 있음을 시사합니다. 하지만 현재까지 DCM에서 Lac-Phe의 구체적인 역할은 연구되지 않았습니다.
본 연구에서 우리는 당뇨병성 심근병증(DCM)이 있는 마우스에 Lac-Phe를 외인성으로 투여했을 때 심장 수축 기능이 효과적으로 개선되고 심장의 병적 리모델링이 완화됨을 확인했습니다. 우리는 Lac-Phe가 지질 대사 불균형의 조절을 통해 DCM 마우스의 심장 기능을 개선한다는 것을 발견했습니다. Lac-Phe는 DCM 마우스 심근세포 내의 지질 방울(LD) 축적을 감소시켰으며 심장의 콜레스테롤 함량을 낮추었습니다. 기전적으로 Lac-Phe는 adenosine monophosphate-activated protein kinase alpha 1 (AMPKα1)의 인산화 및 활성화를 촉진하여 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase (HMGCR)의 인산화를 촉진했습니다. HMGCR의 인산화는 해당 효소의 활성을 감소시켜 콜레스테롤 생성을 줄이며, 이를 통해 심근세포 내 지질 대사의 불균형을 개선합니다. 이러한 결과는 Lac-Phe를 이용한 DCM의 잠재적 치료를 위한 이론적 근거를 제공합니다.
프로토콜
동물 연구 프로토콜은 Nanjing Drum Tower Hospital의 기관 윤리 위원회(승인 번호: 2025AE1065, 2025년 9월 26일)로부터 승인을 받았으며, 다음의 가이드라인에 따라 수행되었습니다. 실험동물의 관리 및 사용 지침 (제8판), 미국 국립보건원에서 발행함.
동물
본 연구에서는 5주령의 수컷 C57BL/6J 마우스 30마리를 사용하였습니다. 1주일간의 적응 급이 후, 모든 마우스는 온도 22°C ± 2°C, 습도 40%–60%의 환경에서 12시간 명-암 주기에 따라 먹이와 물을 자유롭게 섭취하며 사육되었습니다. DCM 마우스 모델을 구축하기 위해 저용량 STZ와 HFD를 병행하여 사용하였습니다(그림 1A). 고지방 식이(HFD; 지방 60%, 단백질 20%, 탄수화물 20%) 급이를 시작하고 4주 후, 마우스를 하룻밤 동안 금식시킨 다음, 스트렙토조토신(STZ; pH 4.5의 시트르산 완충액에 용해된 8 mg/mL)을 35 mg/kg/day의 용량으로 3일 연속 복강 내 주사하였습니다. 대조군 마우스는 대조 식이(지방 10%, 단백질 20%, 탄수화물 70%)를 섭취하고 동일한 양의 시트르산 완충액을 투여받았습니다. 이후 15주 동안 고지방 식이를 유지한 후, 무작위 혈당 ≥13.3 mmol/L 및 좌심실 박출률(LVEF) <55%라는 두 가지 기준을 모두 충족하는 마우스를 성공적으로 구축된 DCM 모델로 정의하였습니다. 이렇게 검증된 DCM 마우스들에 번호를 부여하고 난수표를 이용하여 DCM 군과 DCM + Lac-Phe 군으로 무작위 배정하였습니다. 마우스의 약 절반은 모델 구축에 실패하였으며, 이 동물들은 동물 윤리 규정에 따라 안락사되었습니다. 요약하자면, 마우스는 대조군, DCM 군, DCM + Lac-Phe 군의 세 그룹으로 나뉘었습니다(그룹당 n = 10). 각 그룹의 마우스 10마리 모두 심초음파 검사, 체중 측정 및 OGTT를 수행하였습니다. 28일간의 처리 기간 후, 후속 분석을 위해 심장을 적출하였습니다. 각 그룹에는 10마리의 마우스가 있었으며, 이 중 그룹당 3마리는 전사체 시퀀싱에, 3마리는 투과 전자 현미경 및 조직학적 염색에, 3마리는 단백질 발현 분석에 사용되었습니다. 각 그룹의 나머지 마우스 1마리는 예비용으로 확보하였습니다. DCM 모델이 성공적으로 구축된 후, Lac-Phe를 생리식염수에 녹여 최종 농도 10 mg/mL로 조제하였습니다. DCM + Lac-Phe 군의 마우스는 50 mg/kg/day의 Lac-Phe를 5 mL/kg의 주사 부피로 28일 연속 매일 1회 복강 내 투여받았습니다. 대조군과 DCM 군의 마우스에게는 용매 대조군으로서 동일한 양의 생리식염수를 투여하였습니다.
그림 1Lac-Phe는 당뇨병성 심근병증 마우스의 심장 기능 및 병적 리모델링을 개선한다. (A) HFD/STZ로 유도된 DCM 마우스 모델 및 Lac-Phe 처리 프로토콜의 모식도. (B) 4주간의 처리 기간 동안 Control, DCM 및 DCM + Lac-Phe 군 마우스의 체중; 군당 n = 10. (C) 표시된 군에서의 경구 당부하 검사(OGTT); 군당 n = 10. (D) 처리 0, 2, 4주 차의 대표 심초음파 이미지. (E,F) 좌심실 박출률(LVEF) (E) 및 분획 단축률(FS) (F)의 정량 분석; 군당 n = 10. (G) 대표적인 hematoxylin and eosin (H&(E) 염색된 심장 단면. 스케일 바 = 1 mm. (H,I) 심장 단면의 대표적인 Masson’s trichrome 염색(H) 및 섬유화 영역의 정량 분석(I); 그룹당 n = 3. 스케일 바 = 50 μm(J, K) 심장 절편의 대표적인 밀배아 응집소(WGA) 염색 사진(J) 및 상대적 심근세포 면적의 정량화 결과(K); 그룹당 n = 3. 스케일 바 = 20 μm데이터는 평균으로 나타내었습니다. ± 표준 편차 P < 0.05, **P < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
심장 기능
이소플루란(isoflurane) 흡입 마취 후, 마우스들을 온도 조절 플랫폼(37°C) 위에 앙와위로 고정하였습니다. 40 MHz 트랜스듀서가 장착된 초음파 진단기를 사용하여 이완기와 수축기 동안의 좌심실 크기와 승모판 혈류 속도를 측정하였으며, 이를 통해 좌심실 박출률(LVEF)과 단축률(FS)을 계산하였습니다. 각 마우스당 3회의 연속적인 심장 주기를 수집하였습니다.
세포 처리
H9c2 세포는 10% fetal bovine serum과 1% penicillin–streptomycin이 첨가된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium에서 37°C, 5% CO₂를 포함하는 습윤한 환경으로 배양되었습니다. 세포는 confluence가 70%–80%에 도달할 때마다 2–3일 간격으로 계대 배양하였습니다. 실험을 위해 세포를 10 cm dish에 분주한 후 Control, high glucose/palmitic acid (HG/PA), HG/PA + Lac-Phe의 세 그룹으로 나누었습니다. HG/PA 그룹과 HG/PA + Lac-Phe 그룹의 세포를 먼저 0.25 mM palmitic acid와 50 mM glucose에 24 h 동안 노출시켰습니다. 그 후, HG/PA + Lac-Phe 그룹의 세포에는 HG/PA 노출을 유지하면서 10 μg/mL Lac-Phe를 24 h 동안 추가로 처리하였고, HG/PA 그룹의 세포에는 동일한 HG/PA 조건에서 동량의 PBS를 처리하였습니다. p-AMPK 억제 실험에서는 10 μM AMPK-IN-3 (DMSO에 용해)를 Lac-Phe와 동시에 24 h 동안 처리하였으며, 해당 대조군에는 동일한 부피의 DMSO를 처리하였습니다. atorvastatin 실험에서는 HG/PA 조건의 H9c2 세포에 10 μM atorvastatin을 단독으로 또는 10 μg/mL Lac-Phe와 병용하여 24 h 동안 처리하였습니다.
조직학적 염색
Lac-Phe를 28일 동안 투여한 후, 마우스의 심장을 적출하여 4% paraformaldehyde (pH 7.4)에 24시간 동안 침지 고정하였습니다. 고정된 심장 조직은 파라핀에 매립한 후 6-μm 두께의 절편으로 제작하였습니다. 조직 절편은 hematoxylin and eosin, wheat germ agglutinin 및 Masson’s trichrome으로 염색하였습니다. 모든 염색 과정은 제조사의 프로토콜을 엄격히 준수하여 수행되었습니다. 디지털 카메라 시스템이 장착된 고해상도 명시야 현미경을 사용하여 20× 배율로 전체 슬라이드 이미징을 수행하였습니다.
웨스턴 블롯 분석
단백질 농도는 Bradford assay를 사용하여 측정하였습니다. 조직 용해물을 10% (w/v) acrylamide 겔에서 SDS-PAGE로 분리한 후 polyvinylidene difluoride 막으로 전기영동 전이시켰습니다. 비특이적 결합 부위는 5% bovine serum albumin을 사용하여 실온에서 2시간 동안 블로킹하였습니다. 그 후 막을 1차 항체(1:1,000 희석)와 함께 4°C에서 하룻밤 동안 반응시켰으며, 이어서 쉐이커 위에서 TBST로 6회 세척(각 5분)하였습니다. 다음으로 막을 horseradish peroxidase-conjugated 2차 항체(1:5,000 희석)와 함께 실온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 다시 TBST로 6회 세척(각 5분)하였습니다. 단백질 밴드는 enhanced chemiluminescence reagent kit를 사용하여 시각화하였습니다. Western blot 결과의 정량화는 ImageJ 소프트웨어를 이용한 밀도 분석(densitometric analysis)으로 수행하였습니다. 본 연구에 사용된 모든 항체는 재료 표(Table of Materials)에 나열되어 있습니다.
전사체학
TRIzol Reagent 및 RNeasy mini 키트를 사용하여 C57BL/6J 마우스의 심장 조직에서 총 RNA를 분리하였습니다. 2100 bioanalyzer를 사용하여 RNA 품질을 평가하였으며, 높은 RNA 순도와 무결성을 확인하였습니다. RNA-seq 라이브러리는 VAHTS Universal V10 RNA-seq Library Prep Kit에 따라 준비되었으며, Illumina NovaSeq 6000 System(single-read, 150 bp)을 사용하여 시퀀싱하였습니다. DESeq2를 사용하여 차별 발현 유전자를 식별하였으며, 보정된 P 값 < 0.05 및 절대 log₂ fold change > 1을 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였습니다. 차별 발현 유전자에 대해 유전자 온톨로지(GO) 농축 분석을 수행하였으며, GO 용어에서 차별 발현 유전자의 농축 유의성은 초기하 분포 알고리즘을 사용하여 계산하였습니다.
Oil Red O 염색 및 LD540 지질 염색
심장 조직을 OCT 화합물에 매립한 후 10-μm 두께의 절편으로 제작하였다. 동결 절편을 실온에서 30분 동안 평형화한 후 4% 파라포름알데히드로 10분 동안 고정하였다. PBS로 세척한 후, 절편을 60% 이소프로필 알코올에 15초 동안 담갔다가 Oil Red O 작업 용액으로 30분 동안 처리하였다. 그 다음 절편을 60% 이소프로필 알코올로 15초 동안 처리하고 PBS로 3회 세척하였다. LD540 지질 염색을 위해, H9c2 세포를 PBS로 세척하고 실온에서 4% 파라포름알데히드로 10분 동안 고정하였다. 이후 세포를 10 μM LD540과 함께 실온에서 30분 동안 배양하였다.
투과 전자 현미경 (TEM)
신선한 마우스 심장 조직을 1–2 mm3 크기로 절단하여 4°C의 전자현미경 고정액에서 4시간 동안 고정한 후, 2중 증류수로 세척하고 점진적으로 농도가 높아지는 에탄올 용액에 침지시켰습니다. 샘플을 포매 및 절편화한 다음 투과 전자현미경으로 관찰하였습니다.
총 콜레스테롤(TC) 함량
혈청 및 H9c2 세포 시료의 총 콜레스테롤(TC) 수치를 Amplex Red Cholesterol and Cholesteryl Ester Assay Kit를 사용하여 제조사의 지침에 따라 측정하였습니다.
경구 당부하 검사 (OGTT)
마우스를 14시간(19:00부터 9:00까지) 동안 금식시킨 후, 포도당(20% 스톡, 2 g/kg)을 경구 투여하였습니다. 투여 후 0, 15, 30, 60, 120분 시점에 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하여 혈당 수치를 측정하였습니다.
Cell counting kit-8 (CCK-8) 측정
세포 생존율을 측정하기 위해 CCK-8을 사용하였습니다. H9c2 세포를 96-well plate에 초기 밀도 3 × 104 cells/well로 분주하였습니다. HG/PA 조건에서 다양한 농도의 Lac-Phe로 24시간 동안 처리한 후, well당 100 μL의 배지에 10 μL의 키트 시약을 첨가하고 37°C에서 4시간 동안 배양하였습니다. 광학 밀도(OD) 값을 얻기 위해 multimode microplate reader를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였습니다.
분자 도킹
Lac-Phe와 AMPKα1의 결정 구조는 PubChem26에서 다운로드하였습니다. 분자 도킹 과정은 CB-DOCK227를 사용하여 수행하였습니다.
통계 분석
모든 심초음파 측정, 조직학적 염색 및 이미지 정량화는 그룹 배정을 알지 못하는 연구원에 의해 수행되었습니다. 모든 데이터 분석은 Prism 및 SPSS 20.0을 사용하여 수행되었습니다. 각 실험은 최소 3회 반복되었으며, 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시되었습니다. 분산의 균질성은 Levene 테스트를 사용하여 평가되었습니다. 정규성은 잔차의 그래프 검토를 통해 확인되었습니다. 다중 그룹 간의 비교는 일원 분산 분석(one-way analysis of variance)을 실시한 후, 쌍별 비교를 위해 Tukey 사후 검정을 수행하였습니다. OGTT 데이터의 경우, 그룹을 피험자 간 요인으로, 시간을 피험자 내 요인으로 하는 이원 반복 측정 분산 분석(two-way repeated-measures ANOVA)을 사용하였으며, 이어서 Bonferroni 사후 검정을 수행하였습니다. P < 0.05인 경우를 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였습니다.
결과
당뇨병성 심근병증 마우스에서 Lac-Phe는 심장 기능을 개선한다
저희는 HFD와 STZ 주사를 병행하여 C57BL/6J 마우스에서 DCM을 유도하였으며(그림 1A) 모델 구축이 성공적으로 이루어진 DCM 마우스를 무처리군(DCM군)과 Lac-Phe 치료군으로 무작위 배정하였고, 음성 대조군으로 정상 C57BL/6J 마우스를 사용하였다. Li 등21의 연구를 바탕으로, 저희는 치료용량으로 50 mg/kg의 Lac-Phe를 선택하였다. 모델 구축 후, Lac-Phe 치료군은 4주간 외인성 Lac-Phe를 주사받았으며, 무처리군은 동일한 부피의 생리식염수를 주사받았다. DCM군과 비교하여, Lac-Phe로 치료한 당뇨병성 심근병증 마우스는 4주 후 체중이 유의하게 감소하였다(그림 1B). OGTT 결과, 음성 대조군에 비해 DCM군 마우스는 측정된 모든 시간점에서 혈당 수치가 유의하게 상승하여 포도당 내성을 저하된 것으로 나타났다. 반면, Lac-Phe로 치료한 DCM 마우스는 포도당 내성이 개선되었다(그림 1C). 심초음파 분석 결과, 음성 대조군 마우스에 비해 DCM 마우스는 LVEF 및 FS가 유의하게 감소하였다(그림 1D–F). Lac-Phe 치료는 DCM 마우스의 LVEF 및 FS를 증가시켰다. H&E 염색을 통한 조직병리학적 분석 결과, 대조군 마우스에 비해 DCM 마우스의 심장 조직에서 병리학적 비대가 관찰되었다(그림 1G). Lac-Phe 치료는 심근 비대를 현저히 완화시켰다. Masson’s 삼색 염색은 또한 Lac-Phe가 DCM 심장의 심근 섬유화를 유의하게 완화시킴을 보여주었다(그림 1H,I). WGA 염색 결과, Lac-Phe는 DCM 심장에서 심근세포의 단면적을 유의하게 감소시켰다(그림 1J,K). 이러한 실험 결과들은 외인성 Lac-Phe 투여가 DCM 마우스에서 심장 기능을 효과적으로 개선하고 병리학적 재형성을 완화시킨다는 것을 입증한다.
Lac-Phe는 DCM에서 조절이 비정상적으로 이루어지는 지질 대사를 개선한다
Lac-Phe가 DCM에서 작용하는 기전을 추가로 명확히 하기 위해, 마우스 심장 조직의 전사체 분석을 수행하였다. 데이터 수집 후, GO 및 KEGG 경로 분석을 실시하였다. 지방산 대사 과정에 대한 GSEA 및 KEGG 경로 풍부화 분석을 통해 지질 대사와 관련된 경로의 변화가 나타났다(그림 2A,B). Lac-Phe가 DCM 마우스 심장에서 어떻게 기능하는지 추가로 조사하기 위해, Lac-Phe 처리가 DCM 마우스 심장의 초미세 구조 형태에 변화를 유도했는지 확인하기 위해 투과전자현미경(TEM) 분석을 수행하였다(그림 2C,D). TEM 영상 분석 결과, 대조군 마우스에 비해 DCM 마우스 심장 내 지방소체(LD) 밀도가 유의하게 증가하였으며, Lac-Phe 투여는 이러한 LD 밀도를 효과적으로 감소시켰다. DCM에서 지질 대사 이상의 중요성이 이미 알려져 있음에 따라, Oil Red O 염색을 통해 심장 내 지질 축적을 추가로 평가하였다(그림 2E,F). 조직학적 분석 결과, DCM 마우스 심장에서 지질 축적이 현저히 증가하였으나, Lac-Phe 처리는 이러한 지질 축적을 감소시켰다. 또한 Lac-Phe 처리는 DCM 마우스의 혈청 내 총콜레스테롤(TC) 수준도 감소시켰다(그림 2G). 체외 실험을 위한 적절한 Lac-Phe 용량을 선정하기 위해, 다양한 농도의 Lac-Phe를 고농도 포도당/팔미트산(HG/PA) 조건에서 처리한 H9c2 세포의 생존율을 CCK-8 분석으로 측정하였다(그림 2H). HG/PA 조건에서 10 μg/mL 농도의 Lac-Phe를 처리한 H9c2 세포가 시험된 농도들 중에서 가장 높은 생존율을 나타내었다. 따라서 후속 실험에서는 10 μg/mL의 Lac-Phe를 사용하였다. HG/PA에 노출된 H9c2 세포는 LD540 염색 및 형광 정량 결과에 따라 유의한 지질 축적이 관찰되었으며(그림 2I,J), TC 함량도 증가하였다(그림 2K). Lac-Phe 처리는 이러한 변화를 역전시켜 H9c2 세포 내 지질 축적과 TC 수준을 모두 유의하게 감소시켰다. 종합적으로, 이 실험 결과들은 Lac-Phe가 DCM 마우스에서 심장 지질 축적을 효과적으로 억제하고 지질 대사 이상을 개선하며, HG/PA 처리된 H9c2 세포에서도 지질 축적과 TC 수준을 감소시킨다는 것을 보여준다.
그림 2. Lac-Phe는 당뇨성 심근병증에서 조절 이상을 보이는 지질 대사를 개선한다. (A) 대조군 및 DCM 군에서 지방산 대사 과정에 대한 유전자 집합 풍부화 분석(GSEA). (B) DCM 군과 DCM + Lac-Phe 군을 비교한 교토 유전자 및 유전체 사전(KEGG) 경로 풍부화 분석. (C) 심장 조직의 대표적인 투과 전자현미경(TEM) 이미지. 붉은 화살표는 지질 방울(LD)을 나타낸다. 스케일 바 = 2 μm. (D) 100 μm2당 LD의 평균 수 정량; n = 3. (E, F) 심장 조직의 대표적인 Oil Red O 염색(E) 및 Oil Red O 양성 면적의 상대적 정량(F); n = 3. 스케일 바 = 20 μm. (G) 각 군에서 채취한 혈청의 상대적 총 콜레스테롤(TC) 농도; n = 3. (H) 고농도 포도당 및 팔미트산(HG/PA) 조건에서 0, 1, 5, 10 또는 20 μg/mL의 Lac-Phe를 처리한 H9c2 세포의 세포 생존율을 CCK-8 분석법으로 측정. (I, J) H9c2 세포의 대표적인 LD540 염색(I) 및 평균 LD540 형광 강도 정량(J); n = 3. 스케일 바 = 200 μm. (K) 각 군의 H9c2 세포에서 측정한 TC 농도; n = 3. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 제시한다. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Lac-Phe는 DCM 마우스와 H9c2 세포의 심장에서 HMGCR의 인산화를 증가시킨다
Lac-Phe가 지질 대사를 개선하는 잠재적 타겟을 확인하기 위해, GeneCards28를 사용하여 DCM 관련 단백질을 스크리닝하고 SwissTargetPrediction29을 이용하여 Lac-Phe와 잠재적으로 상호작용할 수 있는 단백질을 예측하였다(그림 3A). 두 결과를 비교한 결과, 6개의 잠재적 타겟 유전자를 확인하였다(그림 3B). 이 6개 유전자에 대한 분석을 통해 HMGCR이 콜레스테롤 대사의 핵심 조절 인자이며 DCM에서도 중심적인 역할을 한다는 것을 밝혀냈다(그림 3C)30. Lac-Phe가 HMGCR을 매개로 하여 지질 대사를 조절하는지 여부를 확인하기 위해, 마우스 심장에서 p-HMGCR/HMGCR 비율을 먼저 조사하였다. 웨스턴 블롯 분석 결과, DCM 마우스 심장에서는 p-HMGCR/HMGCR 비율이 감소하였으나, Lac-Phe 처리 시 이 비율이 증가하였다(그림 3D,E). 이러한 결과는 Lac-Phe 처리 후 HMGCR의 인산화가 증가하고 HMGCR 활성이 감소하였다는 기존의 보고와 일치한다. 체외 실험에서 고농도 포도당/팔미트산(HG/PA) 조건 하에서 H9c2 세포의 p-HMGCR/HMGCR 비율이 감소하였으나, Lac-Phe 처리 시 이 비율이 증가하였다(그림 3F,G). 이 결과들은 Lac-Phe가 DCM 마우스 심장 및 HG/PA 처리된 H9c2 세포에서 HMGCR의 인산화를 증가시킴으로써 지질 대사에 대한 Lac-Phe의 효과에 HMGCR이 관여함을 뒷받침한다.
그림 3. Lac-Phe는 당뇨병성 심근병증을 가진 생쥐의 심장 및 H9c2 세포에서 HMGCR의 인산화를 증가시킨다. (A) DCM 관련 단백질과 예측된 Lac-Phe 관련 단백질 간의 중복을 보여주는 벤 다이어그램. (B) DCM과 Lac-Phe 모두와 관련된 6개의 중복 단백질. (C) DCM 관련 단백질 네트워크 내에서 HMGCR을 보여주는 단백질-단백질 상호작용 네트워크. (D, E) 각 그룹에서 추출한 심장 조직의 p-HMGCR 및 HMGCR에 대한 대표적인 웨스턴 블롯 이미지 (D) 및 p-HMGCR/HMGCR 비율의 정량화 (E); 그룹당 n = 3. (F, G) 각 그룹의 H9c2 세포에서 p-HMGCR 및 HMGCR에 대한 대표적인 웨스턴 블롯 이미지 (F) 및 p-HMGCR/HMGCR 비율의 정량화 (G); 그룹당 n = 3. 로딩 컨트롤로서 β-Tubulin을 사용하였다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 제시하였다. *P < 0.05. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
라크-페닐알라닌(Lac-Phe)과 아토르바스타틴의 병용 투여가 H9c2 세포에서 지질 대사를 개선한다
HMGCR를 통한 Lac-Phe의 지질 대사에 대한 영향을 추가로 평가하기 위해, 아토바스타틴을 대조군으로 사용하였다. 체외 실험 결과, 고포도당/팔미트산(HG/PA) 조건 하에서 Lac-Phe와 아토바스타틴의 병용 처리는 아토바스타틴 단독 처리보다 지질 축적 감소 효과가 더 컸다. LD540 염색 및 형광 정량 분석을 통해 Lac-Phe와 아토바스타틴의 병용 처리가 H9c2 세포에서 지질 방울(LD) 축적을 감소시킨 것을 확인하였다(그림 4A,B). 총 콜레스테롤(TC) 함량 측정에서도 유사한 결과가 나타났다(그림 4C). 웨스턴 블롯 분석 결과, Lac-Phe와 아토바스타틴의 병용 처리는 p-HMGCR/HMGCR 비율을 유의하게 증가시켰다(그림 4D,E). 이러한 결과들은 Lac-Phe와 아토바스타틴의 병용 처리가 H9c2 세포에서 지질 축적 및 TC 수준 감소와 함께 HMGCR 인산화 증가와 관련됨을 시사한다.
그림 4. 락-페(Lac-Phe)와 아토르바스타틴의 병용 투여가 H9c2 세포에서 지질 대사를 개선한다. (A, B) 각 처리군에 따른 H9c2 세포의 대표적인 LD540 염색 이미지 (A) 및 평균 LD540 형광 강도 정량화 결과 (B); 각 그룹당 n = 3. 스케일 바 = 200 μm. (C) 각 처리군에서 H9c2 세포의 총 콜레스테롤(TC) 농도; 각 그룹당 n = 3. (D, E) 각 처리군에서 H9c2 세포의 p-HMGCR 및 HMGCR 단백질에 대한 대표적인 웨스턴 블롯 이미지 (D) 및 p-HMGCR/HMGCR 비율 정량화 결과 (E); 각 그룹당 n = 3. 로딩 컨트롤로 β-튜불린을 사용하였다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 제시하였다. *P < 0.05, **P < 0.01, ****P < 0.0001. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Lac-Phe는 AMPKα1 인산화를 증가시킨다
Lac-Phe가 HMGCR을 조절하는 분자 기전을 추가로 탐구하기 위해, 마우스 심장 전사체 데이터를 재분석하였다. 전사체 데이터의 KEGG 분석을 통해 DCM 그룹과 대조군 사이에서 160개의 상이하게 풍부화된 경로와 DCM 그룹과 DCM + Lac-Phe 그룹 사이에서 89개의 상이하게 풍부화된 경로를 확인하였다(그림 5A). 두 비교 사이에서 60개의 경로가 중복되었다. 이러한 60개의 중복 경로 중에서 우리는 AMPK 경로를 선택하였다. AMPK는 DCM에서 지질 대사 조절에 중요한 역할을 한다31. 또한, AMPK는 HMGCR의 상위에 위치한다(그림 5B). 우리는 Lac-Phe가 AMPK를 조절함으로써 HMGCR을 조절하고, 궁극적으로 지질 대사를 개선할 수 있다고 가설을 세웠다. 이 가설을 검증하기 위해, 먼저 CB-DOCK2를 사용하여 AMPKα1과 Lac-Phe의 분자 도킹을 수행하였다. 분자 도킹 결과, Lac-Phe와 AMPKα1 사이에서 예측된 최고 순위의 결합 구조는 −7.6 kcal/mol의 친화도를 나타내었다(그림 5C). 이러한 결과는 Lac-Phe와 AMPKα1 사이의 잠재적인 상호작용을 시사하지만, 세포 내 직접적인 결합을 입증하지는 않는다. Lac-Phe가 DCM에서 AMPK 경로에 영향을 미치는지 확인하기 위해, DCM 마우스 심장에서 AMPKα1의 인산화를 조사하였다. 웨스턴 블롯 분석 결과, DCM 마우스 심장에서 p-AMPKα1/AMPKα1 비율이 감소하였으나, Lac-Phe 처리 시 이 비율이 증가하였다(그림 5D,E). 체외 실험에서는 고농도 포도당/팔미트산(HG/PA) 조건에서 H9c2 세포의 p-AMPKα1/AMPKα1 비율이 감소하였으나, Lac-Phe 처리 시 이 비율이 증가하였다(그림 5F,G). 이러한 결과들은 Lac-Phe가 DCM 마우스 심장 및 HG/PA 처리된 H9c2 세포에서 AMPKα1의 인산화를 증가시킨다는 것을 나타낸다.
그림 5. Lac-Phe는 당뇨성 심근병증을 가진 생쥐의 심장 및 H9c2 세포에서 AMPKα1의 인산화를 증가시킨다. (A) DCM/대조군 및 DCM + Lac-Phe/DCM 비교 분석에서 경로 부유도 결과의 중복을 보여주는 벤 다이어그램. (B) 콜레스테롤 합성 억제와 관련된 AMPK 및 HMGCR 인산화를 설명하는 개요도. (C) Lac-Phe와 AMPKα1 간의 예측된 3차원 분자 도킹 상호작용; 결합 친화도 = −7.6 kcal/mol. (D,E) 각 그룹에서 채취한 심장 조직의 p-AMPKα1 및 AMPKα1에 대한 대표적인 웨스턴 블롯 이미지 (D) 및 p-AMPKα1/AMPKα1 비율의 정량화 (E); 그룹당 n = 3. (F,G) 각 그룹의 H9c2 세포에서 p-AMPKα1 및 AMPKα1에 대한 대표적인 웨스턴 블롯 이미지 (F) 및 p-AMPKα1/AMPKα1 비율의 정량화 (G); 그룹당 n = 3. 로딩 컨트롤로 GAPDH를 사용하였다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 제시하였다. *P < 0.05, **P < 0.01. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
AMPK 억제는 Lac-Phe 매개 HMGCR 인산화 및 H9c2 세포에서 지질 대사 개선을 약화시킨다
그런 다음 Lac-Phe 처리를 받는 H9c2 세포에 p-AMPK 억제제를 추가하였다. p-AMPK 억제제는 p-AMPKα1/AMPKα1 비율을 감소시켰다(그림 6A,B)이며, p-HMGCR/HMGCR 비율도 감소시켰다(그림 6C,D). 이러한 결과들은 Lac-Phe 처리 중 AMPK 인산화 억제가 HMGCR 인산화 감소와 함께 발생함을 나타낸다. p-AMPK 억제제는 또한 Lac-Phe의 지질 대사에 대한 효과를 약화시켰다. LD540 염색 및 형광 정량 결과, AMPK 억제제를 처리한 H9c2 세포에서 AMPK 억제 없이 Lac-Phe만 처리한 세포에 비해 지질 축적이 증가한 것으로 나타났다(그림 6E,F). 또한 H9c2 세포에서 AMPK 억제 후 TC 농도도 증가하였다(그림 6G). 이러한 결과들은 종합적으로 Lac-Phe의 지질 대사에 대한 효과에서 AMPKα1/HMGCR 신호전달 경로의 관여를 뒷받침한다. Lac-Phe는 AMPKα1 인산화를 증가시켰으며, 이는 HMGCR 인산화 증가 및 지질 축적과 TC 농도 감소와 관련되었다. AMPK 억제는 H9c2 세포에서 이러한 효과들을 약화시켰으며, 이는 Lac-Phe가 AMPKα1/HMGCR 경로의 조절을 통해 지질 대사를 개선한다는 가설을 지지한다.
그림 6. AMPK 억제는 Lac-Phe가 H9c2 세포에서 HMGCR 인산화 및 지질 축적에 미치는 효과를 약화시킨다. (A, B) HG/PA, Lac-Phe 및/또는 AMPK-IN-3를 처리한 H9c2 세포에서 p-AMPKα1 및 AMPKα1의 대표적인 웨스턴 블롯 이미지 (A)와 p-AMPKα1/AMPKα1 비율의 정량화 (B); 각 군당 n = 3. (C, D) 표시된 처리군의 H9c2 세포에서 p-HMGCR 및 HMGCR의 대표적인 웨스턴 블롯 이미지 (C)와 p-HMGCR/HMGCR 비율의 정량화 (D); 각 군당 n = 3. GAPDH와 β-tubulin은 각각 (A)와 (C)에서 로딩 컨트롤로 사용하였다. (E, F) 표시된 처리군의 H9c2 세포에서 LD540 염색 대표 이미지 (E) 및 평균 LD540 형광 강도 정량화 (F); 각 군당 n = 3. 스케일 바 = 200 μm. (G) 표시된 처리군의 H9c2 세포에서 총 콜레스테롤(TC) 농도; 각 군당 n = 3. 데이터는 평균 ± 표준편차로 제시하였다. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
생체 내 및 생체 외 실험에서 얻어진 결과들은 Lac-Phe가 AMPKα1과 HMGCR의 인산화를 증가시켜 DCM에서 콜레스테롤 수치와 지질 축적을 감소시키고, 심장 기능 및 병리학적 리모델링을 개선한다는 제안된 기전을 뒷받침한다. Lac-Phe의 작용을 매개하는 제안된 AMPKα1/HMGCR 경로는 그림 7에 개략적으로 요약되어 있다.
그림 7. Lac-Phe가 AMPK/HMGCR 경로를 통해 당뇨병성 심근병에서 지질 대사를 개선하는 제안된 기전. Lac-Phe가 AMPKα1의 인산화를 촉진하고, 이후 HMGCR의 인산화를 유도함으로써 당뇨병성 심근병에서 지질 방울 축적과 지독성을 감소시킨다는 제안된 기전을 보여주는 개요도. AMPK, AMP-활성화 단백질 키나제; HMGCR, HMG-CoA 환원효소; LD, 지질 방울. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
데이터 이용 가능성:
이 연구의 결과를 뒷받침하는 원시 데이터는 Zenodo에 저장되어 있으며, https://zenodo.org/records/21991371 에서 공개적으로 이용할 수 있습니다.
토론
본 연구에서 우리는 DCM에 대한 Lac-Phe의 치료 효과를 뒷받침하는 증거를 제공합니다. Lac-Phe는 심근세포의 콜레스테롤 생성을 줄이고 지질 대사 불균형을 개선함으로써 DCM의 심장 리모델링과 심기능 부전을 개선했습니다. 메커니즘적으로 Lac-Phe는 AMPKα1 인산화를 증가시켰습니다. 결과적으로, 증가된 AMPKα1 인산화는 하위 표적인 HMGCR의 인산화 증가 및 억제와 연관되어 콜레스테롤 합성을 감소시켰으며, 궁극적으로 심근세포의 지질 대사 불균형을 개선했습니다. 요약하자면, 본 연구는 Lac-Phe가 AMPK/HMGCR 신호 전달 경로를 통해 DCM의 심장 지질 대사를 개선함을 입증합니다. 주요 결과와 제안된 메커니즘의 도식적 요약은 그림 7에 제시되어 있습니다.
지질 대사 불균형은 DCM에서 심근 손상을 유발하는 주요 요인 중 하나입니다15. 심근세포 내의 과도한 지질 축적은 지질 독성으로 이어져 심근세포 기능 장애와 병리적 심장 리모델링을 초래합니다16. 장기적인 고혈당과 비만은 지질 대사 장애를 일으키는 중요한 요인입니다25. Lac-Phe는 음식 섭취를 효과적으로 줄이고 비만과 체중을 감소시키며 포도당 항상성을 개선할 수 있는 내인성 물질임이 밝혀졌습니다21. 최근 보고에 따르면 Lac-Phe는 척수 손상 시 미세아교세포/대식세포의 지질 대사를 조절할 수 있음이 나타나23, Lac-Phe가 다른 질환 모델에서도 지질 대사를 조절할 수 있음을 보여주었습니다. 내인성 대사산물로서 Lac-Phe가 대사성 질환에서 갖는 역할은 상당한 관심을 끌어왔습니다. 하지만 DCM에서 Lac-Phe의 역할에 대해서는 아직 충분히 연구되지 않았습니다. 본 연구에서는 DCM의 심근세포 지질 대사에서 Lac-Phe의 역할을 밝혔습니다. 전사체 분석을 통해 Lac-Phe 처리가 DCM 마우스 심장의 지질 대사 관련 경로 변화와 연관되어 있음을 확인하였습니다. Oil Red O 염색과 TEM 관찰을 통해 Lac-Phe를 투여한 DCM 마우스의 심장에서 지질 축적이 감소했음을 확인하였습니다. 이러한 결과는 Lac-Phe가 심장 지질 축적을 줄이고 병리적 리모델링을 개선함으로써 DCM에서 심장 보호 효과를 나타냄을 시사합니다. 또한, in vitro 실험을 통해 Lac-Phe 투여가 HG/PA 조건에 노출된 H9c2 세포의 지질 축적을 완화한다는 것을 입증하였습니다.
HMGCR은 메발로네이트 경로의 NADPH 의존적 속도 제한 효소입니다30. HMGCR은 콜레스테롤 생합성의 핵심 단계인 HMG-CoA에서 메발로네이트로의 전환을 촉매합니다30,31,32. HMGCR은 심혈관 질환 및 DCM과 관련된 치료 표적입니다33. 임상적으로 HMGCR 억제는 심혈관 위험을 낮추기 위해 확립된 접근 방식입니다34. 본 실험 데이터는 Lac-Phe가 제2형 당뇨병 쥐의 심장에서 HMGCR 인산화를 증가시키며, 이는 HMGCR 활성 억제 및 콜레스테롤 합성 감소와 일치함을 보여줍니다. In vitro 연구에서는 Lac-Phe 투여가 HG/PA 조건에 노출된 H9c2 세포에서 HMGCR 인산화를 증가시켰으며, 이는 콜레스테롤 수치 감소를 동반했습니다. 또한, 검토된 실험 조건에서 Lac-Phe와 콜레스테롤 저하제인 atorvastatin을 병용 투여했을 때 atorvastatin 단독 투여보다 더 큰 효과가 나타났습니다. Atorvastatin으로 처리한 H9c2 세포에 Lac-Phe를 추가하면 HMGCR 인산화가 증가하고 지질 축적이 감소했습니다. 이러한 결과는 Lac-Phe를 통해 HMGCR 인산화를 표적함으로써 콜레스테롤 생산을 줄이고 DCM에서 지질 대사 균형을 회복시키는 것이 가능함을 뒷받침합니다. 하지만 Lac-Phe가 DCM 환자에게 안전하고 효과적인 치료 전략이 될 수 있을지에 대해서는 추가적인 연구가 필요합니다.
미토콘드리아 에너지 대사의 핵심 효소인 AMPK는 당뇨병과 같은 대사성 질환 연구의 중심이 됩니다35,36. AMPK는 인산화 및 탈인산화 조절을 통해 심장 지질 대사에서 중추적인 역할을 합니다. 인산화된 AMPK는 활성 형태를 나타냅니다37. p-AMPK는 CPT-1을 조절함으로써 FAO를 위해 지방산이 미토콘드리아로 유입되는 것을 촉진합니다38. 이전 연구들39과 일치하게, 본 연구 결과에서는 AMPK 인산화의 증가가 HMGCR 인산화의 증가 및 콜레스테롤 합성의 감소와 관련이 있음을 보여주었습니다. STZ와 HFD로 유도된 DCM 마우스에서 지속적인 고혈당은 심장 p-AMPK 수준의 변화를 초래할 수 있습니다40. 심장 기능이 변하지 않은 당뇨 초기 단계에서는 심장 p-AMPK 수준이 영향을 받지 않을 수 있습니다10,37,41. 8주 이상 지속적인 고혈당이 나타나는 진행성 당뇨병에서는 병리적 심장 리모델링이 시작되며 p-AMPK 수준이 감소할 수 있습니다10. AMPK 활성화를 유지하는 것은 DCM을 예방하는 효과적인 전략으로 제안되어 왔습니다10,42. 제2형 당뇨병 치료에 널리 사용되는 약물인 Metformin는 AMPK 경로를 활성화하는 것으로 나타났으나, 심장에는 중립적인 영향을 미치는 것으로 보고되었습니다43,44. 흥미롭게도 Metformin의 급성 및 만성 투여 모두 Lac-Phe 수준을 증가시킬 수 있습니다22. 이러한 관찰 결과는 Lac-Phe가 AMPK 활성화와 관련된 대사 신호 전달에 기여할 가능성을 시사하지만, 본 연구는 외인성 Lac-Phe가 Metformin보다 더 특이적이거나 안전한 효과를 낸다는 것을 입증하지는 않았습니다.
본 연구에서, 그림 5D,E에 나타난 바와 같이 후기 단계 DCM 모델에서 AMPKα1 인산화가 현저히 감소하였으며, 이는 이전 연구42와 일치하는 결과입니다. 전사체 분석 결과, Lac-Phe를 처리한 제2형 당뇨병 쥐의 심장에서 AMPK 경로와 관련된 변화가 나타났으며, 웨스턴 블롯 분석에서는 Lac-Phe 처리 후 AMPKα1 인산화가 증가한 것이 확인되었습니다. 분자 도킹 분석 결과 Lac-Phe와 AMPKα1 사이에 잠재적인 상호작용이 있음이 시사되었으며, 이는 최근의 연구23와 일치합니다. 중요한 점은, 분자 도킹만으로는 Lac-Phe와 AMPKα1 사이의 직접적인 세포 내 결합을 입증할 수 없다는 것입니다. In vitro 실험에서는 AMPK 억제제 처리가 AMPKα1 인산화를 억제하고 HMGCR 인산화의 감소를 동반한다는 것을 보여주었습니다. AMPK 억제제 첨가 후 Lac-Phe의 효과가 약화되었으며, 이는 H9c2 세포 내 지질 축적 증가 및 콜레스테롤 함량 상승과 일치하였습니다. 종합적으로, 이러한 결과들은 Lac-Phe가 지질 대사에 미치는 영향에 AMPKα1/HMGCR 신호 전달이 관여함을 뒷받침합니다. Lac-Phe는 AMPKα1 인산화를 증가시켰으며, 이는 HMGCR 인산화 증가, 콜레스테롤 수치 감소 및 지질 축적 감소와 연관되었고, AMPK 억제 시 이러한 효과들이 약화되었습니다.
본 연구에는 몇 가지 한계점이 있습니다. 첫째, 모든 동물 실험이 수컷 마우스를 대상으로 수행되었습니다. 수컷 C57BL/6J 마우스에서 Lac-Phe의 DCM 치료 효과를 입증하였으나, 성별은 심혈관 질환에 영향을 미치는 중요한 요인입니다45. 따라서 Lac-Phe가 암컷 마우스에서도 동일한 효과를 나타내는지 여부는 아직 알려지지 않았습니다. 둘째, 전장 심장 샘플을 대상으로 전사체 시퀀싱을 수행하였으며, 이는 Lac-Phe 처리 후 심장에서 발생하는 세포 유형별 변화를 가렸을 가능성이 있습니다. 단일 세포 시퀀싱은 관찰된 효과의 기저에 있는 세포 및 분자적 이질성에 대해 더 깊은 통찰력을 제공할 수 있으며46,47, 이 가설을 추가로 조사하기 위한 대안적 접근 방법이 될 수 있습니다. 마지막으로, 본 연구에 사용된 초음파 장비의 한계로 인해 마우스의 심장 이완 기능을 평가할 수 없었습니다. 따라서 Lac-Phe의 DCM 치료 효과를 명확히 하고, 잠재적인 성별 의존적 효과를 평가하며, 세포 유형별 반응을 조사하고, 이완 기능을 평가하며, 관찰된 효과의 기저 기전을 추가로 규명하기 위한 후속 연구가 필요합니다. 요약하면, 본 연구는 Lac-Phe가 DCM 치료를 위해 주목할 만한 잠재적 내인성 대사물질임을 뒷받침하는 근거를 제공합니다. 또한, 본 연구 결과는 Lac-Phe가 AMPKα1/HMGCR 경로를 통해 DCM 과정 중 심근세포의 지질 축적을 감소시킨다는 제안된 기전을 뒷받침합니다. 구체적으로, Lac-Phe는 AMPKα1 인산화를 증가시켰으며, 이는 HMGCR 인산화 증가, 콜레스테롤 합성 및 지질 축적 감소, 그리고 병리적 리모델링 개선과 연관되었습니다. Lac-Phe와 AMPKα1 사이의 분자적 상호작용을 확립하고 이러한 발견의 잠재적 중개 응용 가능성을 결정하기 위한 추가 조사가 필요합니다.
공개 사항
이해관계 충돌:
저자들은 공개할 사항이 없습니다.
감사의 글
기술 지원을 제공해주신 남경 드럼 타워 병원 임상 대학 및 남경 대학교 의과대학 부속 병원의 연구원과 직원분들께 진심으로 감사드립니다. 본 연구는 중국 국가 자연과학 재단(지원 번호 81870291 및 82300384), 중국 박사후 과학 재단(지원 번호 2023M731625), 강쑤성 자연과학 재단(지원 번호 BK20220175)의 연구비를 지원받아 수행되었습니다. 또한, 남경 공과대학교 고등 합성 연구소에서 제공한 리소스와 협력 지원에 감사드립니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| AMPK-IN-3 (p-AMPK 억제제) | MedChemExpress (MCE) | HY-132921 | 사용 시점 10 μM Lac-Phe 처리 세포에서 AMPK 신호 전달을 억제하기 위한 AMPK 억제 실험 중에. |
| Amplex Red 콜레스테롤 및 콜레스테릴 에스테르 분석 키트 | Beyotime | S0211S | 혈청 및 H9c2 세포 샘플의 총 콜레스테롤 수치를 측정하는 데 사용됩니다. |
| 항-AMPKα1 | Cell Signaling Technology | 2532; RRID: AB_330331 | AMPK의 웨스턴 블랏 분석에 사용된 1차 항체α1. |
| Anti-GAPDH | 세포 신호 전달 기술 | 5174; RRID: AB_10622025 | GAPDH의 웨스턴 블롯 분석에 사용된 1차 항체. |
| 항-HMGCR | Abcam | ab174830; RRID: AB_2749818 | HMGCR의 웨스턴 블롯 분석에 사용된 1차 항체. |
| Anti-p-AMPKα1 (Thr172) | 세포 신호 전달 기술 | 2535; RRID: AB_331250 | 인산화된 AMPK의 웨스턴 블롯 분석에 사용된 1차 항체α1. |
| Anti-p-HMGCR (Ser872) | Abcam | ab124350 | 인산화된 HMGCR의 웨스턴 블롯 분석에 사용된 1차 항체. |
| HRP 결합 항-토끼 IgG 항체 | Cell Signaling Technology | 7074; RRID: AB_2099233 | 웨스턴 블롯 검출을 위해 1:5,000로 희석하여 사용함. |
| 항-β-튜불린 | 세포 신호 전달 기술 | 2128; RRID: AB_823664 | ~의 웨스턴 블롯 분석에 사용된 1차 항체 β-튜불린 |
| 아토르바스타틴 | MedChemExpress (MCE) | HY-17379 | HG/PA 처리된 H9c2 세포에서 지질 축적, 총 콜레스테롤 수치 및 HMGCR 인산화에 미치는 영향을 평가하기 위해 단독으로 또는 Lac-Phe와 병용하여 사용함. |
| 소혈청 알부민 | Sigma-Aldrich | A7906 | 웨스턴 블롯 분석 중 비특이적 결합을 차단하기 위해 5% 농도로 사용합니다. |
| 브래드포드 분석 시약/키트 | Thermo Fisher Scientific | 23200 | 웨스턴 블롯 분석 전 단백질 농도를 결정하는 데 사용됩니다. |
| C57BL/6J 마우스 (5주령, 수컷) | 난징대학교 모델 동물 연구 센터 | 제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주시기 바랍니다. | HFD/STZ 유도 당뇨병성 심근병증 마우스 모델을 구축하는 데 사용되었습니다. |
| 세포 계수 키트-8 (CCK-8) | Sharebio | SB-CCK8S | 처리 후 H9c2 세포의 생존율을 측정하는 데 사용됨. |
| 시트르산 완충액 | 자체 제작함 | 제공된 소스 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요. | pH 4.5로 조제하여 STZ를 용해하는 데 사용하였으며, 해당 용액을 매질 대조군으로 사용하였다. |
| 대조군 식단 (지방 10%, 단백질 20%, 탄수화물 70%) | Research Diets, Inc. | D12450J | 대조군 마우스의 식단으로 사용됨. |
| D-(+)-포도당 | Sigma-Aldrich | 제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 소스 텍스트를 입력해 주세요. | HG/PA 세포 처리 및 경구 당부하 검사에 사용됨. |
| 디메틸설폭사이드 (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | AMPK-IN-3의 용매 및 그에 대응하는 용매 대조군(vehicle control)으로 사용되었습니다. |
| Dulbecco’수정된 이글(Eagle) 배지’S 배지 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11965092 | H9c2 세포의 기본 배양 배지로 사용되었습니다. |
| 40 MHz 트랜스듀서가 장착된 심초음파 진단기 | FUJIFILM VisualSonics | Vevo 3100 LT; 40 MHz 트랜스듀서 | 좌심실 크기와 승모판 혈류 속도를 측정하고, 좌심실 박출률(LVEF) 및 단축률(FS)을 도출하는 데 사용됩니다. |
| 전자현미경 고정액 | 서비스바이오(ServiceBio) | G1102 | 투과전자현미경 관찰을 위해 신선한 마우스 심장 조직을 고정하는 데 사용되었습니다. |
| 에탄올 | Sigma-Aldrich | E7023 | 투과 전자 현미경 시료 준비 과정 중 탈수를 위해 농도를 점진적으로 높여 사용함. |
| 우태아혈청 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10099141 | H9c2 세포 배양 배지의 보충제로 10% 농도로 사용함. |
| H9c2 세포주 | Sunncell | RRID: CVCL_0286 | HG/PA 및 Lac-Phe 처리 실험을 위한 인비트로(in vitro) 심장 세포 모델로 사용됨. |
| 헤마톡실린 및 에오신 염색 | ServiceBio | G1005-1/2 | 심장 조직의 조직학적 평가에 사용됩니다. |
| 고지방 식이 (60 kcal% 지방) | Research Diets, Inc. | D12492 | 당뇨병성 심근병증 마우스 모델을 구축하기 위해 저용량 STZ와 함께 사용되었습니다. |
| 고해상도 명시야 현미경 | Leica | DM2500 | 염색된 심장 조직의 20배율 전체 슬라이드 이미징에 사용됨× 배율 |
| ImageJ | 미국 국립보건원 | 입력된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 제공해 주시기 바랍니다. | 웨스턴 블롯 결과의 밀도 분석 정량화에 사용됩니다. |
| 이소플루레인 | Sigma-Aldrich | 792632 | 마우스 심초음파 검사 중 마취용으로 사용됨. |
| 이소프로필 알코올 | Sigma-Aldrich | I9516 | 냉동 심장 절편의 Oil Red O 염색 과정에서 60% 농도로 사용됨. |
| LD540 지질 염색 | Beyotime | C2050S-1 | 사용 시점 10 μM 세포 내 지질을 염색하기 위해. |
| 마손(Masson)’삼색 염색 (Trichrome stain) | 서비스바이오(ServiceBio) | G1006 | 심장 조직의 조직학적 염색에 사용됩니다. |
| N-락토일-페닐알라닌 (Lac-Phe) | MedChemExpress (MCE) | HY-146098 | DCM 마우스에 투여되었으며, HG/PA에 노출된 H9c2 세포를 처리하는 데 사용되었다. |
| Oil Red O 작업 용액 | 서비스바이오(ServiceBio) | G1015-100ML | 동결 심장 조직 절편 내의 지질을 염색하는 데 사용됩니다. |
| Omni-ECL 고효율 화학발광 키트 | EpiZyme | SQ203L | 웨스턴 블로팅 후 단백질 밴드의 화학발광 시각화에 사용됩니다. |
| 팔미트산 | Sigma-Aldrich | P0500 | HG/PA 처리 H9c2 세포 모델을 구축하기 위해 고농도 포도당과 함께 0.25mM 농도로 사용하였다. |
| 파라포름알데히드 | Sigma-Aldrich | P6148 | 4% 용액으로 조제하여 조직학적 염색 또는 지질 염색 전 심장 조직과 세포를 고정하는 데 사용한다. |
| 페니실린-스트렙토마이신 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140122 | H9c2 세포 배양 배지에서 1% 농도로 사용함. |
| 인산완충생리식염수 (PBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | 염색 과정 중 세척액으로 사용되며, 세포 처리 실험에서 그에 상응하는 매질(vehicle)로 사용됩니다. |
| 프리즘 | GraphPad 소프트웨어 | 버전 8.0 | 실험 데이터의 통계 분석에 사용됩니다. |
| PVDF 전이 막, 0.45 μm | Thermo Fisher Scientific | 88518 | 웨스턴 블롯 분석 중 단백질의 전기영동 전이에 사용됩니다. |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | 마우스 심장 조직으로부터 총 RNA를 분리/정제하는 데 사용됨. |
| 염화나트륨 용액, 0.9% (생리식염수) | Sigma-Aldrich | S8776 | Lac-Phe를 용해하는 데 사용되었으며, 대조군 및 DCM 마우스의 매개체 대조군(vehicle control)으로 사용되었습니다. |
| SPSS | IBM | 버전 20.0 | 실험 데이터의 통계 분석에 사용됩니다. |
| 스트렙토조토신 (STZ) | Sigma-Aldrich | S0130 | 당뇨병성 심근병증 마우스 모델을 구축하기 위해 고지방 식이(HFD) 급여와 함께 투여되었습니다. |
| TBS Tween-20 완충액 (20×) | Thermo Fisher Scientific | 28360 | 웨스턴 블롯 분석 중 1차 및 2차 항체 배양 후 멤브레인을 세척하는 데 사용됩니다. |
| Tissue-Tek O.C.T. 화합물 | Sakura Finetek | 4583 | Oil Red O 염색을 위한 동결 절편 제작 전, 심장 조직을 포매하는 데 사용됩니다. |
| 투과전자현미경 | HITACHI | HT7800 | 마우스 심장 조직의 초미세구조 변화를 조사하는 데 사용됩니다. |
| TRIzol 시약 | Invitrogen | 15596026 | 마우스 심장 조직으로부터 총 RNA를 분리하는 데 사용됩니다. |
| VAHTS Universal V10 RNA-seq 라이브러리 제작 키트 | Vazyme | NR616-01 | 전사체 분석을 위한 RNA-seq 라이브러리 제작에 사용됩니다. |
| 밀 배아 응집소 (WGA) | 서비스바이오(ServiceBio) | W7024 | 심장 조직의 조직학적 평가에 사용됨. |
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