방법 논문

Drosophila melanogaster에서 DR-white 분석법을 이용한 DNA 이중 가닥 절단 복구 측정

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DOI:

10.3791/72635

⸱

2026년 8월 14일

 , 
1Department of Human Science, Georgetown University

이 논문에서

요약

DR-white 분석법은 다세포 생물인 Drosophila melanogaster에서 DNA 이중 가닥 절단 복구 결과를 검출하기 위한 다목적 유전적 리포터 분석법입니다.

초록

DNA 이중 가닥 절단(DSB) 복구에 관한 전통적인 연구들은 흔히 생화학적 조사나 단세포 시스템(예: 세포, 효모)으로 제한됩니다. 다세포 생물에서의 DSB 복구 연구를 용이하게 하기 위해, 본 연구에서는 Drosophila melanogaster에서 DR-white 분석법을 사용합니다. DR-white 분석법은 단순하면서도 다재다능한 DSB 복구 리포터 분석법으로, I-SceI 메가뉴클레아제의 발현에 의해 절단될 수 있는 단일 I-SceI 인식 서열을 포함합니다. I-SceI의 발현은 상시적으로, 열 충격을 통해, 또는 다른 프로모터 하에서 유도될 수 있어 조직 특이적 또는 발달 단계 특이적 복구 조사를 가능하게 합니다. 이 분석법의 주요 장점은 상동 재조합(HR), 비상동 말단 결합(NHEJ) 및 단일 가닥 어닐링(SSA)을 포함하는 복구 결과를 구별할 수 있다는 점입니다. 본 논문은 감수분열 전 생식선에서 DSB를 유도하고 자손을 측정하여 복구 사건을 표현형으로 분석하는 단계별 워크플로우를 포함하여, 기성 DR-white 분석법에 대한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 또한 중합효소 연쇄 반응(PCR), 시퀀싱 및 Tracking of Indels by DEcomposition (TIDE) R 스크립트를 이용한 복구 사건의 분자 분석 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 생체 모델에서 DNA 복구의 유전적 및 분자적 메커니즘을 조사하기 위한 유용한 도구를 제공합니다.

서론

유전체 무결성은 흔히 DNA 손상으로 인해 위협을 받으며, 그중에서도 이중 가닥 절단(DSB)은 특히 치명적입니다. 이러한 절단이 복구되지 않고 방치되면 유전적 손실, 염색체 재배열 및 세포 사멸로 이어질 수 있습니다1. 따라서 세포는 DSB를 복구하기 위해 여러 경로를 진화시켜 왔습니다. 비상동 말단 결합(NHEJ)은 DSB의 두 말단을 직접 결합시키며, 이 과정에서 절단 부위에 인델(indel)이 삽입될 가능성이 있습니다. 단일 가닥 어닐링(SSA)은 절단 부위 주변의 상보적 서열을 이용하여 복구하며, 그 결과 절단 부위에 결실이 발생합니다. 반면, 상동 재조합(HR)은 상동 서열을 복구 템플릿으로 활용합니다2,3.

역사적으로 DSB 수복 연구는 생화학적 분석4이나 박테리아5,6, 효모7,8, 포유류 세포 배양9,10과 같은 단일 세포 시스템으로 제한되어 왔습니다. 이러한 모델들은 핵심 수복 단백질과 그 메커니즘을 규명하는 데 중요한 역할을 했으나, 다세포 생물의 생물학적 복잡성은 결여되어 있습니다. Drosophila melanogaster는 DNA 수복 연구를 위한 대중적인 다세포 모델 시스템이 되었습니다. 하지만 현재의 많은 분석법들은 특정 수복 경로에 맞춰져 있거나11, P-element 절단12과 같은 거대한 염색체 수차를 이용하거나, 시간이 많이 소요되는 분자 분석을 필요로 합니다13. DR-white 분석법은 Drosophila 내 DNA 수복의 단순한 유전적 리포터를 제공함으로써 이러한 과제들을 해결합니다14. 본 연구에서는 잘 확립된 DR-white 분석법을 사용하여 DNA DSB 수복을 측정하기 위한 유전적 및 분자적 분석을 수행하는 완전하고 실용적이며 상세한 단계별 워크플로우를 제공합니다.

본 분석법은 야생형의 붉은 눈 색을 나타내는 Drosophila white (w) 유전자의 두 개의 직접 반복 서열을 이용합니다(그림 1). 두 복제본 모두 기능이 없는데, 첫 번째인 Sce.white는 야생형 SacI 부위에 I-SceI 메가뉴클레아제 인식 서열을 포함하는 삽입물이 있어 조기 종결 코돈이 도입되었으며, 두 번째인 iwhite는 5' 및 3' 말단이 모두 절단되어 HR 복구의 템플릿 역할을 합니다. 야생형의 갈색 몸 색을 나타내는 Drosophila yellow 트랜스유전자 (y+)가 두 white 반복 서열 사이에 존재합니다. DR-white 카세트가 y w 돌연변이 배경에 통합되어 있으므로, DR-white 초파리는 표현형적으로 야생형의 갈색 몸과 돌연변이형의 흰 눈을 나타냅니다.

DSB는 DR-white 초파리를 I-SceI 트랜스진을 보유한 초파리와 교배함으로써 Sce.white 부위에서 유도할 수 있습니다. 감수분열 전 생식세포 내 DSB의 복구는 테스터 교배의 자손을 분석하여 측정할 수 있습니다. NHEJ에 의한 복구는 부모 세대의 갈색 몸체, 흰색 눈 표현형을 나타내며(그림 1A), HR에 의한 복구는 야생형 white 서열을 복구하여 갈색 몸체, 붉은색 눈의 자손을 생성합니다(그림 1B). DSB의 SSA 복구 또는 유사분열 교차는 중간의 yellow 트랜스진 소실을 유발하여 노란색 몸체, 흰색 눈의 초파리를 생성합니다(그림 1C). 체세포 내 복구 결과를 분석하기 위해, 본 연구에서는 DR-white 분석법에서 프로세싱이 수반된 NHEJ 및 HR 복구를 특이적으로 검출하도록 Tracking Indels by DEcomposition (TIDE) 알고리즘을 응용하였습니다15,16.

DR-white 분석법은 Drosophila에서 이전에 확립된 DNA 복구 분석법들에 비해 여러 가지 장점을 제공합니다. 절단 및 복구가 생식선에서 발생하므로, 복구 결과를 표현형 분석을 통해 쉽게 검출할 수 있습니다. 동시에, 이 분석법은 매우 다재다능합니다. 주로 HR 복구를 측정하도록 설계되었으나, 세 가지 복구 경로를 모두 검출할 수 있습니다. 또한 두 가지의 추가적인 기능적 복구 템플릿을 개발하였습니다(그림 2). iwhite.mu 템플릿은 28개의 침묵 단일 염기 다형성(SNP)을 포함하며 붉은 눈의 자손을 생성하여(그림 2A), 유전자 전환 구역(GCT) 길이 및 서로 다른 서열 간의 HR 복구 연구를 용이하게 합니다14. iwhiteΔ9 템플릿은 야생형 SacI 부위에 9 염기쌍 결손이 있으며 오렌지색 눈의 자손을 생성합니다(그림 2B). 이러한 특징을 통해 연구자는 서로 다른 템플릿으로부터의 HR 복구를 추적할 수 있으며, 이는 DR-white 분석법만의 고유한 특징입니다15.

프로토콜

1. DR-white 분석

  1. 유전적 교배 (그림 3A)
    참고: 표준 Drosophila 배양 및 유전학 프로토콜은 Ralph J. Greenspan의 "Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics" 17을 참조하십시오. 계통 유전자형 정보는 재료 표(Table of Materials)에 제공되어 있습니다.
    1. 활성 효모를 뿌린 표준 Drosophila 배지에서 12시간 명/암 주기로 25 °C에서 초파리를 유지합니다.
    2. 바이알당 DR-white 처녀 암컷 8~10마리를 I-SceI 트랜스진을 보유한 수컷 3~5마리와 교배하여 5개의 열충격 바이알을 준비합니다 (교배 1, 그림 3A).
      참고: 응용 분야에 따라 서로 다른 I-SceI 트랜스진을 사용할 수 있습니다. 본 프로토콜에서는 열충격 유도를 위해 hsp70-I-SceI 트랜스진을 사용하였습니다11. 초기 세대에서 I-SceI의 누출 발현(leaky expression)을 방지하기 위해, DR-white과 I-SceI 트랜스진이 오직 이번 세대에서만 동일한 초파리 내에 결합되도록 하는 것이 중요합니다.
    3. 같은 날, y w 계통의 확장 병(expansion bottle)을 준비합니다. 이들이 테스터 초파리가 됩니다. 약 60~80회의 테스터 교배를 위해서는 3개의 확장 병이면 충분합니다.
    4. 열충격 바이알과 y w 확장 병을 25 °C에서 3일 동안 배양합니다.
    5. 셋째 날, 열충격 바이알과 y w 확장 병을 신선한 배지로 옮겨(flip) 백업 세트로 준비합니다.
  2. 열충격/DSB 유도
    참고: 열충격 유도형 I-SceI 트랜스진을 사용하지 않는 경우, 일반적으로 단계 1.1.5의 3일 후에 수행하는 단계 1.2.5로 건너뛰십시오.
    1. 모든 자손이 모체-접합자 전환(maternal-zygotic transition)을 거쳤는지 확인하기 위해 열충격 바이알을 25 °C에서 3시간 동안 둡니다.
    2. 원래의 바이알을 38 °C 온수조에서 1시간 동안 열충격 처리합니다. 유충이 수면 위로 기어 나오지 않도록 수위가 최소한 솜 뭉치 바닥과 일치하는지 확인하십시오.
    3. 유도 및 복구 결과는 열충격 시간과 온도에 따라 달라지므로, 온수조 온도를 15분마다 모니터링하여 38 ± 0.5 °C 이내로 유지하십시오.
    4. 바이알을 25 °C로 되돌립니다.
    5. 다음 날, 과도한 습기를 흡수하기 위해 접은 실험용 와이프(laboratory wipe) 1/3 분량을 배지에 추가합니다. 배지가 건조한 경우, 실험용 와이프에 약 100 µL의 물을 추가합니다. y w 확장 병에 솜 뭉치를 추가합니다.
    6. 열충격 처리된 바이알을 25 °C에서 6일 더 배양하거나, 초파리가 우화하기 시작할 때까지 배양합니다.
    7. 옮겨 담은 지 3일 후에 백업 바이알과 확장 병을 정리합니다. 백업 y w 확장 병은 정리 후 약 4일 후에 솜 뭉치를 추가합니다.
      참고: 필요한 경우, 백업 바이알을 단계 1.2.1부터 1.2.6까지와 동일하게 열충격 처리하고 아래에 설명된 대로 처리할 수 있습니다.
  3. 테스터 교배
    1. 발생 단계별 편향을 줄이기 위해 우화가 시작된 후 4~5일 동안 DR-white 및 I-SceI 트랜스진을 보유한 열충격 처리 초파리를 수집합니다.
      참고: DR-white 및 I-SceI 트랜스진을 보유하고 열충격 처리가 성공적으로 된 초파리는 배아 및 유충기 복구 이벤트가 성체 조직으로 발달함에 따라 모자이크 눈을 나타냅니다. 모자이크 현상의 정도가 항상 생식선 복구 이벤트와 상관관계가 있는 것은 아니므로, 테스터 교배(단계 1.3.3)를 위한 실험용 초파리를 선택할 때 결정적인 요인으로 사용해서는 안 됩니다.
    2. 5일 동안 y w 처녀 암컷을 수집합니다. 예상 샘플 수당 5마리의 처녀 암컷을 수집하십시오. 백업 확장 병에서 우화가 시작되는 즉시 수집합니다.
    3. 열충격 처리된 수컷 1마리와 y w 처녀 암컷 4~5마리를 교배하여 테스터 바이알을 준비합니다 (교배 2; 그림 3A). 발생 단계별 편향을 줄이기 위해 단계 1.3.1에서 모은 집단에서 수컷을 무작위로 선택하십시오. 테스터 교배군은 25 °C에서 배양합니다.
      참고: DR-white과 I-SceI의 교차를 피하기 위해 일반적으로 수컷 생식선을 분석하지만, 암컷 자손 또한 분석할 수 있습니다. 암컷 자손을 분석하는 경우, Cross 2 테스터 바이알을 암컷: y w 수컷 비율 2:5로 설정하고 생산성을 보장하기 위해 5~6일 동안 배양(다음 단계)합니다.
    4. 테스터 바이알을 준비한 지 4일 후에 생산성을 확인하여 정리 시점을 결정합니다.
      참고: 최소 20마리의 점수 측정 가능 자손을 확보할 수 있도록 충분한 알이 낳아졌는지 확인하되, 배양 밀도가 너무 높아지지 않도록 하십시오. 그렇지 않으면 초파리가 배지에 달라붙을 가능성이 큽니다.
    5. 테스터 바이알이 준비되면(테스터 교배 설정 후 최대 4~5일 뒤), 초파리를 제거하고 과도한 습기를 흡수하기 위해 접은 실험용 와이프 1/3 분량을 배지에 추가합니다.
      참고: 추가 분석(예: 분자 유전자형 분석)이 필요한 경우 이 시점에서 수컷을 수집할 수 있습니다.
    6. 테스터 바이알을 25 °C에서 5~6일 더 배양합니다.
  4. 점수 측정(Scoring)
    참고: 각 유전 실험(예: 동형접합 돌연변이 및 이형접합 대조군)의 각 조건에 대해 약 25개의 테스터 바이알을 설정합니다. 각 유전 실험은 2~3회 반복하며, 개별 바이알 데이터를 통합합니다.
    1. 첫 초파리가 우화하기 시작한 후 약 9일 동안 교배 2 (그림 3A)의 자손 점수를 측정합니다.
    2. CO2를 사용하거나, 배지가 없는 빈 바이알로 옮겨 -20 °C에서 최소 30분 동안 냉동하여 초파리를 마취합니다.
      참고: 초파리를 냉동한 경우, 며칠 후에까지 점수를 측정할 수 있습니다.
    3. 초파리를 플라이 패드(fly pad) 위에 놓고 적절한 표현형을 측정합니다 (그림 3A). 최소 20마리의 초파리가 측정된 바이알만 데이터 세트에 포함하십시오.
      1. 측정 시, 먼저 DR-white 카세트를 보유한 초파리를 분류한 다음(적색 형광 단백질 양성 [RFP+] 형광을 마커로 사용), 눈과 몸의 색상을 측정합니다.
      2. DR-white 카세트에 연결된 y+ 트랜스진은 완전히 야생형은 아닌 중간 정도의 갈색 몸 색상을 나타냅니다. No DSB/NHEJ (갈색 몸;  y+ w-)와 SSA (노란색 몸;  y- w-)를 구별하려면, DR-white 염색체가 없는 (RFP-) y w 자손과 초파리를 비교하십시오. SSA 이벤트는 이들 초파리와 동일한 노란색을 띱니다. 이들보다 더 어두운(더 갈색인) 초파리를 No DSB/NHEJ로 측정하십시오.
        참고: 그림 3A 에 설명된 표현형에서 벗어난 경우 오염을 시사할 수 있으며, 해당 바이알은 측정해서는 안 됩니다. 죽은 초파리 전체는 측정할 수 있지만, 표현형을 결정할 수 없을 정도로 손상된 초파리는 폐기해야 합니다.

2. TIDE 분석 (그림 4)

  1. 유전체 DNA(gDNA) 추출18
    1. DR-을 모두 보유한 열충격 처리된 초파리(또는 유충)를 수집하십시오.흰색 및 I-SceI 교배 1세대 자손의 외래유전자(transgene)와 같이그림 3A).
    2. 개별 파리를 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 넣고 급속 냉동하십시오(예: 드라이아이스/에탄올 배스 또는 액체 질소 사용).
      주의: 드라이아이스, 액체 질소, 에탄올, 이소프로판올 및 기타 화학 물질을 취급할 때는 적절한 개인 보호 장구와 기관의 안전 절차를 준수하십시오.
      중단 지점:  시료는 -80 °C에서 보관했다가 필요 시 나중에 처리할 수 있습니다. 성충이나 유충을 분석하는 경우, 시료당 성충 또는 유충 한 마리를 사용하십시오. 더 작은 조직(예: 뇌, 성충원반)을 분석하는 경우, DNA 수율을 높이기 위해 시료를 모아서 사용하십시오.
    3. 전기식 균질기를 사용하여 각 시료를 50 µL의 Buffer A(100 mM Tris-Cl, pH 7.5; 100 mM ethylenediaminetetraacetic acid [EDTA]; 100 mM sodium chloride; 0.5% sodium dodecyl sulfate [SDS])에서 균질화한다.
    4. 시료를 65 °C 항온수조에서 30분 동안 배양하십시오.
    5. 각 시료에 Buffer B(1.4 M 아세트산 칼륨, 4.3 M 염화 리튬) 100 µL를 첨가하고 튜브를 반전시켜 짧게 혼합한다.
      참고: 성체 초파리를 사용하는 경우, 샘플을 완전히 균질화하기 위해 더 많은 양의 용액이 필요할 수 있습니다. 이 경우, Buffer A와 Buffer B의 부피 비율을 1:2로 유지하십시오.
    6. 샘플을 얼음 위에서 최소 30분 동안 배양하십시오.
    7. 시료를 약 16,000 x g에서 원심분리하십시오. g 4 °C에서 15분 동안.
    8. 맑게 정제된 상층액 125 µL를 새로운 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 옮깁니다. 이때 침전물이 섞이지 않도록 주의하십시오.
    9. 상층액 125 µL당 실온의 100% 이소프로판올 100 µL를 첨가하고, 튜브를 반전시켜 짧게 혼합한다.
    10. 시료를 약 16,000 x g에서 원심분리하십시오. g 실온에서 10분 동안 처리합니다.
    11. DNA 펠렛이 손상되지 않도록 주의하며 상층액을 흡입하여 제거합니다.
      참고: 이 단계에서는 DNA 펠렛이 보이지 않을 수 있습니다. 마이크로원심분리기에 튜브를 넣을 때 튜브의 방향을 기억해 두었다가, 펠렛이 있을 것으로 예상되는 지점의 반대편에서 흡입하십시오.
    12. 펠렛을 얼음에 차갑게 보관한 70% 에탄올 250µL로 세척한 다음, 튜브를 부드럽게 뒤집어 짧게 혼합하십시오.
    13. 샘플을 약 16,000 x g에서 원심분리하십시오. g 4 °C에서 5분 동안.
    14. 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 흡입하십시오.
      참고: 에탄올 세척 후 펠렛(pellet)이 더 잘 보일 수 있습니다. 보이지 않는 경우, 다음을 참조하십시오. 참고 사항 단계 2.1.11을 위하여.
    15. 잔류 에탄올을 증발시키기 위해 튜브의 캡을 연 상태로 실온에 둡니다. 펠렛이 과하게 건조되면 완전히 재용해되지 않을 수 있으므로 주의하십시오.
    16. nuclease-free water 20 µL를 첨가하고 4 °C에서 하룻밤 동안 펠렛이 재구성되도록 둡니다.
      일시 중단 지점: DNA 펠렛이 완전히 용해되지 않은 경우, 증류수를 추가로 첨가할 수 있습니다.
    17. 다음 날, 튜브를 부드럽게 뒤집어 섞은 후 DNA 농도를 측정합니다. 즉시 처리하지 않을 경우 샘플을 -20 °C에서 보관하십시오.
      참고: 단일 초파리 추출 시, 수율은 일반적으로 약 100 ng/µL입니다. 고품질의 샘플을 확보하는 것이 중요합니다.260/A280 흡광도는 1.7에서 2.0 사이여야 합니다. 이 범위를 벗어나는 값은 단백질과 같은 오염 물질의 존재를 시사합니다. A260/A230 2.0에서 2.2 사이여야 합니다. 이 범위를 벗어나는 값은 에탄올 및 완충염과 같은 오염 물질이 존재함을 나타냅니다. 수율이 낮고 품질이 좋지 않은 시료는 PCR 증폭 효율을 떨어뜨릴 수 있습니다.
  2. 중합효소 연쇄 반응 (PCR)
    1. 전반적으로 증폭하여 Sce.white 100ng의 gDNA와 DR- 프라이머를 이용한 PCR을 통해흰색_8f (5’-GTGGATCAGGTGATCCAGG) 및 DR-하얀색제조사의 지침에 따라 DR-8a (5’-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC)를 포함하십시오.흰색 대조군 초파리 샘플 (즉, DR-흰색 부모 계통, 없음 I-SceI (트랜스지유전자 존재). 다음의 사이클 조건을 사용한다: 94 °C에서 3분; {94 °C에서 30초; 66 °C에서 30초(사이클당 -0.5 °C로 터치다운); 72 °C에서 30초} x 16회 사이클; {94 °C에서 30초; 58 °C에서 30초; 72 °C에서 30초} x 20회 사이클; 72 °C에서 5분; 12 °C에서 유지.
      참고: 다른 시약을 사용하는 경우, 사이클 조건의 조정이 필요할 수 있습니다.
    2. Sce의 증폭을 확인하기 위해 1% tris-acetate-EDTA (TAE)-아가로스 진단 젤에 약 2 µL의 PCR 산물을 전기영동하십시오.흰색예상 앰플리콘 크기는 약 1.7 kb입니다.
    3. PCR 정제 Sce.white 앰플리콘을 회수하고 DNA 농도를 측정합니다.
    4. 프라이머 DR-를 사용하여 정제된 PCR 산물을 시퀀싱하십시오.흰색_9f (5’-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC).
      참고: 일반적으로 40ng의 정제된 PCR 산물을 시퀀싱하지만, 이는 시퀀싱 서비스 업체의 지침에 따라 달라질 수 있습니다.
  3. TIDE 분석
    참고: TIDE R 스크립트 사용 시 발생하는 대부분의 오류는 잘못된 코드 형식에서 기인합니다.
    1. Bioconductor.org에서 필요한 R 패키지(sangerseqR 및 Biostrings)를 다운로드하십시오. 검색창을 사용하여 각 패키지의 최신 버전을 찾으십시오.
    2. 시퀀싱 크로마토그램을 분석하여 품질이 양호한지 확인하십시오. 절단 부위(break site) 이전에 배경 잡음(background)이 거의 없거나 전혀 없는 크로마토그램만 분석하십시오.
    3. 시퀀스 트레이스 파일(.ab1 확장자 사용)을 다운로드하여 모든 파일을 하나의 컴퓨터 폴더에 넣으십시오. 다음 단계에서 스크립트 수정이 용이하도록 시퀀스 파일 이름을 최대한 단순하게 지정하십시오(예: F1, Het2, Hom3).
    4. TIDE R 스크립트를 엽니다 (보충 파일 1) RStudio 통합 개발 환경(IDE; 다음을 참조하십시오. 재료 목록). 소스(Source) 창에서 Control로 시작하는 행을 찾으십시오. <- (보충 파일 2A) 그리고 .ab1 확장자를 포함하여 저장된 컨트롤 시퀀스 파일 이름을 큰따옴표 안에 정확하게 입력하십시오.
      참고: “대조 서열(control sequence)”은 parental DR-의 PCR 서열입니다.흰색 스톡 제외 I-SceI 외래 유전자 또는 유도.
    5. samplename으로 시작하는 행을 찾으십시오. <- c(를 입력하고 괄호 안에 각 샘플 서열 파일명을 입력하십시오(보충 파일 2A). .ab1 확장자를 포함하고, 각 파일명을 개별 따옴표로 묶은 후 쉼표로 구분하여 입력하십시오.
    6. 편집한 TIDE R 스크립트 파일을 분석할 서열 파일과 동일한 폴더에 저장하십시오. 다음 단계에서 오류가 발생하지 않도록 파일 이름을 단순하게 유지하십시오.
    7. IDE에서 출력 창(Output pane)의 파일(Files) 탭을 사용하여 TIDE 폴더로 이동하십시오.보충 파일 2B).
    8. ~을(를) 클릭하십시오. 더 보기 드롭다운 메뉴에서 선택하십시오 여기에서 새 터미널 열기 (보충 파일 2C). 콘솔 창(하단 왼쪽)에 새로운 터미널이 열립니다.
    9. 새로 연 터미널에 다음과 같이 입력하십시오. “R" 및 누르십시오. 입력 (보충 파일 2D).
    10. 터미널에서 R이 실행되면, source( 를 입력하여 TIDE R 스크립트를 실행하십시오."TIDE_분석.R") 및 누르십시오 입력 (보충 파일 2E). 터미널에서 스크립트를 실행하면 그래픽 표현이 생성됩니다 (보충 파일 2F) 및 각 샘플의 원시 데이터가 포함된 .csv 파일(보충 파일 2G 및 보충 파일 3). 출력 파일은 R 스크립트 및 서열 파일과 동일한 폴더에 저장됩니다.
      참고: 동일한 R 스크립트를 다시 실행하는 경우, 새로 생성되는 모든 .csv 파일은 기존 파일을 덮어씁니다. 동일한 파일에 대해 여러 번 분석을 수행하려면 폴더를 복사해 두십시오.
    11. 각 .csv 파일을 열어 데이터를 분석하십시오.
      1. 원시 데이터를 샘플 서열 내 인델(indel)의 비율로 해석하십시오. I-SceI 인식 서열에서 야생형 SacI 서열로의 상동 재조합 유전자 전환은 정형적인 23-bp 결실을 생성하며, 스크립트는 이 HR 값을 출력 결과 하단의 별도 행에 보고합니다.보충 파일 2G). 0-indel 값은 DSB가 발생하지 않았거나 인델(indel)이 없는 NHEJ를 나타냅니다. 그 외의 모든 인델 값을 합산하여 가공 과정이 포함된 NHEJ 값을 구합니다. 가공 과정이 포함된 NHEJ와 HR의 합계가 검출 가능한 전체 DSB 수선 사건의 수가 됩니다.
      2. 다음 방정식들을 사용하여 검출 가능한 DSB 수선 이벤트 중 수선 경로의 비율을 계산하십시오.
        가공이 수반된 NHEJ 비율 = (가공이 수반된 NHEJ) / (가공이 수반된 NHEJ + HR)
        HR 비율 = (HR) / (처리 과정을 거친 NHEJ + HR)
        참고: 각 유전학 실험(예: 동형접합 돌연변이 및 이형접합 대조군)의 각 조건당 약 10~15개의 샘플이 사용됩니다. 각 유전학 실험은 2~3회 반복하며, 개별 데이터를 통합합니다.

결과

초파리 상동 재조합에 의한 복구에 있어 Rad51의 필요성

성공적인 생식세포 실험에서는 그림 3A에 나타난 예상 표현형 클래스가 나타나며, 바이알당 최소 20마리 이상의 분석 가능한 자손이 확보됩니다. 예상치 못한 표현형이 나타나거나 분석 가능한 자손이 20마리 미만인 경우는 오염 또는 생산성 부족을 의미하며, 단계 1.4.3에 명시된 대로 제외해야 합니다. TIDE 분석의 경우, 성공적인 샘플은 약 1.7 kb의 앰플리콘을 생성하며 절단 부위 이전의 배경 잡음이 거의 없는 크로마토그램을 보입니다. 수율이 낮거나 오염된 DNA, 그리고 노이즈가 많은 크로마토그램은 최적의 상태가 아니므로 분석해서는 안 됩니다.

DR-를 사용할 때흰색 열충격 유도성 I-SceI 소스를 이용한 분석에서, 야생형 초파리의 상동 재조합(HR) 수복 빈도는 38.5 ± 1.2%(평균 ± 표준오차)인 반면, 단일 가닥 어닐링(SSA)은 약 3.2 ± 0.35%로 발생한다.그림 3B 및 보충 파일 4). Rad51(동일 상동 유전자에 의해 인코딩됨 spnA 입력값이 제공되지 않았습니다. 번역할 텍스트를 입력해 주세요. 초파리)은(는) 상동 재조합의 가닥 침입 단계에 필요합니다.14,19따라서 Rad51의 소실은 비효율적인 상동 재조합(HR)으로 이어질 것입니다. 실제로, 어느 한 DmRad51-/- 배경, 상동 재조합(HR) 복구는 1.3 ± 0.4%로 감소하며, 이와 동시에 단일 가닥 어닐링(SSA) 복구가 증가합니다(34.5 ± 1.8%; 그림 3B 및 보충 파일 4)14이는 상동 재조합으로 진행되던 복구 사건들이 대신 단일 가닥 어닐링에 의해 복구되었기 때문일 가능성이 가장 큽니다. 흰색 반복 서열.

Drosophila CtIP이 체세포 조직의 효율적인 HR 복구에 기여하는 역할

TIDE 알고리즘을 통해 체세포 내의 복구 경로 선택을 측정할 수 있습니다. 비돌연변이 배경에서, 검출 가능한 복구 이벤트의 59.0%에서는 가공 과정이 포함된 NHEJ가 발생하며, 41.0%에서는 HR이 발생합니다.그림 4B 및 보충 파일 4). CtIP은 DNA 말단 절제를 촉진함으로써 상동 재조합(HR) 복구의 개시에서 중요한 역할을 합니다.20따라서, 다음의 DmCtIP-/- 배경, 체세포에서 HR 경로 선택률은 이형접합 대조군의 41.0%에서 동형접합 돌연변이군의 10.9%로 현저히 감소하였습니다.그림 4B 및 보충 파일 4)16이는 ~에서/에 (이러한 점은 ~임을 시사합니다) 초파리, CtIP는 HR 수복에 기여하지만 필수적이지는 않습니다.

DNA 복구 경로를 보여주는 DR-white 분석 다이어그램; Sce.white 유전자 요소를 이용한 HR, NHEJ, SSA 방법.
그림 1DR-w하이트 DSB 리포터 분석 및 복구 결과. ~의 직접 반복(Direct Repeat) 하얀색 분석에는 두 개의 비기능성 복제본이 포함되어 있습니다. 하얀색 유전자: Sce.white (I-SceI 인식 부위를 포함하며 조기 종지 코돈을 도입하는 23-bp 삽입이 있는) 및 iwhite (5' 및 3' 말단이 절단된 공여 서열). DR-를 포함하는 초파리를 교배시킴으로써흰색 그리고 하나의 I-SceI 트랜스진(transgene)은 표현형적으로 또는 분자 생물학적으로 분석 가능한 부위 특이적 이중 가닥 절단(DSB)을 유도합니다. 그 결과로 나타나는 표현형은 (A) 흰색 눈의 자손 (y+ w−), 이는 DSB, 자매염색분체 간 HR 또는 NHEJ가 없음을 나타내며; (B) 적안 자손 (y+ w+), 이는 야생형을 복원하는 염색체 내 상동 재조합(HR)이 일어났음을 나타냅니다. SacI ~로부터의 서열 iwhite 공여체; 및 (C) 노란색 몸체와 흰색 눈을 가진 자손 (y− 제공해주신 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.−), 이는 단일 가닥 어닐링(SSA) 또는 유사분열 교차(mitotic CO)를 나타냅니다. Do 등이 작성한 그림을 수정하여 인용함.14. 약어: CO = 교차(crossover); DR-흰색 = white의 직접 반복; DSB = 이중 가닥 절단; HR = 상동 재조합; NHEJ = 비상동 말단 결합; SSA = 단일 가닥 어닐링. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

유전자 편집 도식: 상동 재조합, I-SceI 절단, DR-white.mu, DNA, iwihiteΔ9, SacI 부위.
그림 2: DR- 유도체하얀색 분석법 (A) DR-흰색.mu 어세이는 다음의 28개 침묵 SNP를 포함하고 있습니다. iwhite.mu 공여 서열을 통해 직접 반복 서열 사이에 1.4%의 서열 발산이 생성됩니다. 개별 다형성의 유전자 전환은 상동 재조합(HR) 이벤트마다 다르며, 시퀀싱을 통해 확인할 수 있습니다. (B) DR-하얀색 ~와 함께 아이화이트Δ9 공여체는 상동 염색체 간 재조합과 염색체 내 재조합을 구분합니다. 염색체 내 재조합으로부터의 상동 재조합(HR) iwhite 공여자가 야생형을 복구합니다. SacI 서열이며 붉은 눈의 자손을 생성한다. 상동 염색체 간의 상동 재조합(HR) iwhiteΔ9 공여체는 9-bp 결실로 인해 감소함으로써 주황색 눈의 자손을 생성합니다. 흰색 발현. 해당 수치는 Do 등의 연구에서 인용함.14 및 Fernandez 등이15약어: DSB = 이중 가닥 절단; HR = 상동 재조합; SNP = 단일 염기 다형성. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

초파리 유전자 수선 경로, 유전 교배 도식, 자손 분포 막대 그래프 분석.
그림 3: 감수분열 전 생식선에서 DSB 복구 결과를 검출하기 위한 실험 워크플로우. (A) 교배 1은 DR-을 결합합니다.하얀색 리포터(또는 그 유도체)와 I-SceI 형질전환 유전자(본 예시에서는 2번 염색체에 위치). DR- 양쪽 모두를 포함하는 자손하얀색 분석 및 I-SceI 트랜스진은 생식선 및 체세포 조직에서 유지 및 복구 이벤트를 수행합니다. 감수분열 전 생식선에서의 개별 복구 이벤트를 분석하기 위해, 두 트랜스진을 모두 보유한 자손을 다음과 교배합니다. y w 테스터 파리(교배 2)와 교배하며, 그 자손은 다음과 같이 판독합니다. 그림 1. (B) 야생형 초파리에서의 개별 생식세포 DNA 이중 가닥 절단(DSB) 복구 사건(n = 106개 생식세포선) 및 DmRad51 동형 접합 돌연변이체(n = 46개 생식선). **P < 0.01; ****P < 이원 분산분석(two-way ANOVA) 후 Sidak의 다중 비교 검정을 통해 0.001로 나타났다. 막대는 평균을 나타내며, 오차 막대는 표준오차(SEM)를 나타낸다. 데이터는 Do 등이 보고한 자료를 재분석한 것이다.14. 약어: ANOVA = 분산 분석; CO = 교차; DSB = 이중 가닥 절단; HR = 상동 재조합; NHEJ = 비상동 말단 결합; SEM = 평균 표준 오차; SSA = 단일 가닥 어닐링. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

TIDE 분석을 통한 생거 시퀀싱 기반의 유전자 편집 과정; 복구 방법 비교표 포함.
그림 4: DEcomposition(Tracking of Indels by DEcomposition)을 이용한 이중가닥 절단(DSB) 복구 결과 검출의 실험 워크플로우. (A) DR-를 보유한 초파리들하얀색 및 유도된 I-SceI gDNA 추출, DSB 부위의 PCR 증폭, 생거 시퀀싱 및 R 스크립트를 이용한 TIDE 분석을 통해 외래 유전자를 분석합니다.B) 의 대표 데이터 DmCtIP-/- 돌연변이체 (n = 23) 및 DmCtIP+/- 이형접합 대조군 (n = 31). 검출 가능한 복구 사건은 인델(indel)이 없는 DSB 없음/NHEJ를 제외하고, HR과 가공을 거친 NHEJ의 합으로 계산한다.P < 이원 분산 분석(two-way ANOVA) 후 Sidak 다중 비교 검정을 통해 0.01로 나타났다. 막대는 평균을, 오차 막대는 표준오차(SEM)를 나타낸다. 데이터는 Thomas 등의 연구에서 재분석되었다.16약어: ANOVA = 분산 분석; DSB = 이중 가닥 절단; gDNA = 게놈 DNA; HR = 상동 재조합; NHEJ = 비상동 말단 연결; PCR = 중합효소 연쇄 반응; SEM = 평균 표준 오차; TIDE = TIDE 분석(Tracking of Indels by DEcomposition). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: no-DSB 대조군 대비 서열 크로마토그램 내 삽입 및 결실을 식별하기 위한 TIDE R 스크립트. 사용자가 편집 가능한 대조군 파일 이름, 샘플 파일 이름 및 I-SceI 표적 서열은 스크립트 끝부분에 표시되어 있습니다. 필요한 입력 값, 출력 파일 및 해석 방법은 섹션 2.3에 설명되어 있습니다. sangerseqR 및 Biostrings 패키지가 필요합니다.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2: TIDE R 스크립트 워크플로의 단계별 스크린샷 가이드.각 패널은 섹션 2.3에서 설명한 소프트웨어 조작 과정을 보여줍니다.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 3: TIDE 출력 예시 및 복구 이벤트 계산. 0-indel 값은 DSB가 없거나 인델이 없는 NHEJ를 나타내며, 별도의 HR 행은 정형적인 23-bp 결실 생성물을 나타냅니다. 나머지 모든 인델 백분율은 처리가 동반된 NHEJ로 합산됩니다. 총 검출 가능한 복구량은 HR과 처리가 동반된 NHEJ의 합으로 계산됩니다.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 4: 그림 3B 및 그림 4B의 기초 데이터이며, 각각 편집 가능한 워크시트로 구성되어 있습니다. 이 데이터는 해당 그림 범례에 인용된 기존 출판 연구에서 재분석되었습니다.여기에서 파일을 다운로드하십시오.

토론

DR-white 시스템의 다재다능함은 DNA 복구 분야에서 이 시스템이 과거와 미래에 미칠 영향의 핵심 요인입니다. 첫째, DR-white 리포터 구조체 내의 attB 통합 서열을 통해 연구자는 리포터를 Drosophila 게놈 내의 수많은 위치에 표적화할 수 있으며21, 이미 여러 표적 라인이 구축되어 있습니다22. 둘째, hsp70 프로모터를 통한 열충격 발현(본 연구), ubiquitin 프로모터를 통한 구성적 발현23, 그리고 Bam 프로모터를 통한 감수분열 전 생식선 발현24과 같이 다양한 I-SceI 트랜스지인을 사용할 수 있어, DSB 복구를 탐구할 수 있는 수많은 발달 및 조직 특이적 맥락을 제공합니다. 사용된  I-SceI 트랜스지인과 관계없이, 적절한 DSB 유도를 보장하기 위해 I-SceI 트랜스지인이 최종 교배에서만 도입되도록 유전적 교배 계획을 세밀하게 세워야 합니다. 복구 빈도는 DR-white의 게놈 위치 및/또는 사용된 I-SceI 트랜스지인에 따라 크게 달라질 수 있음에 유의해야 합니다. 향후 실험에서는 게놈 위치와 I-SceI 트랜스지인을 추가로 비교하여 게놈 맥락이나 조직 특이성이 DSB 복구를 주도하는지 결정할 수 있을 것입니다.

DR-white 분석법 및 그 파생 분석법의 특별한 장점은 상동 재조합(homologous recombination), 처리 과정이 포함된 NHEJ, 그리고 대부분의 경우 SSA를 통한 DSB 복구를 식별할 수 있다는 점입니다. 이 시스템은 표현형적으로 생식세포선 복구 이벤트를 검출하도록 설계되었지만, TIDE 알고리즘 분석을 통해 체세포 조직의 분석도 가능하게 합니다. 이러한 장점에도 불구하고, 본 분석법에서 고려해야 할 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 특히, DR-white 분석법은 HR 빈도를 과소평가할 수 있습니다. 뉴클레아제 유도 DSB를 사용하는 다른 유전자 리포터 분석법과 마찬가지로, 자매 염색분체로부터의 HR을 통한 복구(intersister HR)는 DSB가 발생하지 않은 이벤트나 처리 과정이 없는 NHEJ와 구분이 불가능합니다. 따라서 No DSB/NHEJ 클래스의 일부는 실제로는 HR 이벤트일 수 있습니다. 이러한 제한 사항을 고려할 때, 유전적 요인(변이 라인 등)을 비교하는 결과는 신중하게 해석해야 합니다. 분석법의 다른 제한 사항으로는 생존 가능한 자손을 생성하지 않은 감수분열 전 이벤트를 점수화할 수 없다는 점이 있습니다. 예를 들어, 복구되지 않아 세포 사멸로 이어진 DSB 이벤트는 자손에서 점수화되지 않습니다. 전반적인 생식력(fertility)이 생식세포선 세포 사멸의 정성적 척도가 될 수 있지만, 세포 기반 분석법(TUNEL 등)이 필요할 수 있습니다. 또한, TIDE R 스크립트 분석은 세포 집단 내에서 검출 가능한 이벤트의 비율만을 제공합니다. 구체적인 indel 서열 결과를 확인하기 위해서는 멀티플렉스 DNA 시퀀싱을 이용한 개별 복구 이벤트의 시퀀싱이 필요합니다.

DR-white 분석법은 이미 DSB 복구 연구에 지대한 영향을 미쳤습니다. 이 분석법의 적용을 통해 연령25, 성별26, DSB 위치22,26, 공여 서열 위치15, 세포 주기 및 조직 유형26을 포함하여 다세포 생물의 DSB 복구에 기여하는 요인들이 확인되었습니다. 또한, 우리는 이 분석법을 이용하여 Msh627, Blm28, Rif116, 그리고 CtIP16,29을 포함하여 Drosophila에서 복구 경로 선택 및/또는 분기된 서열의 복구를 유도하는 여러 단백질을 식별했습니다. 실제로, 보존된 DNA 복구 단백질을 가진 유전 모델 생물로서 Drosophila의 잘 확립된 활용도는 복잡한 생물학적 맥락에서 DSB 복구에 기여하는 유전적, 세포적 및 개체적 요인을 조사할 수 있는 단순한 다세포 시스템을 제공합니다.

공개 사항

저자들은 공개해야 할 재정적 또는 비재정적 이해 상충 관계가 없습니다.

감사의 글

이 방법은 J.R.L.이 미국 노화 연구 연맹(American Federation for Aging Research)의 AFAR 연구 Grant 수혜자였을 때 개발되었습니다. 본 연구는 또한 국립 일반 의과학 연구소(National Institute of General Medical Sciences)의 지원(1R15GM110454 및 1R15GM129628)을 통해 J.R.L.에게 제공되었습니다. 도식은 BioRender(https://BioRender.com/b8sbcjp) 2026의 도움을 받아 제작되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.5 mL RNAse/DNAse-free 페스틀Fisher Scientific12141363gDNA 추출을 위한 시료 균질화용
탈지면Genesee Scientific51-101표준 초파리(Drosophila) 배양을 위해
초파리 펠티어 냉장 배양기셸 연구실SRI6PF표준 초파리(Drosophila) 배양을 위해
초파리 계통: y[1] w[1]Bloomington Drosophila  스톡 센터RRID:BDSC 1495
초파리 계통: y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; P{70I-SceI}2B Sco / CyO, P{GFP, w+} LaRocque 연구실제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.Bloomington Drosophila Stock Center의 표준 stock RRID:BDSC_6934 (y[1] w[*]; P{ry[+t7.2]=70FLP}11 P{v[+t1.8]=70I-SceI}2B sna[Sco]/CyO, S[2])의 표준 재조합을 통해 LaRocque lab에서 제작되었으며, 교신 저자에게 요청 시 제공 가능함
초파리 계통: y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; DR-white (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]LaRocque 연구실제시된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.stock RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP)에 통합된 DR-white 분석법’}(ZH-51C); 교신 저자에게 요청 시 제공 가능
초파리 계통: y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; DR-white.mu (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]LaRocque 연구실해당 사항 없음stock RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP)에 통합된 DR-white.mu 분석법’}ZH-51C); 교신 저자에게 요청 시 제공 가능
초파리 계통: y[1] w[*]; iwhite2 (y+).1 51C,RFP+ / [CyO]LaRocque 연구실제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.iwhiteΔ9명의 공여자가 스톡 RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP)에 통합됨’}ZH-51C); 교신 저자에게 요청 시 제공 가능
초파리 배양병 마개Genesee Scientific49-100표준 초파리(Drosophila) 배양을 위한
형광 실체현미경 (RFP)TriTech ResearchSMT1-FL표준 초파리(Drosophila)용 "초파리 밀기 (fly pushing)" 및 형광 기반 분리
FlyStuff 초파리 사육 패드Genesee Scientific59-172표준 초파리(Drosophila)용 "초파리 밀기 (fly pushing)"
KimwipesKimberly-Clarke06-666A
MyBath 4L 항온수조Midwest ScientificMB-2000-4~을 위한 / ~용으로  열 충격
NanoDrop OneThermo Fisher Scientific13-400-518LYDNA 정량을 위해
Nutri-fly Bloomington 배합 배지Genesee Scientific66-121표준 초파리 배양을 위한
펠렛 페스틀 무선 모터 균질기DWK Life SciencesK749540-0000gDNA 추출을 위한 시료 균질화용
폴리프로필렌 병Genesee Scientific32-130표준 초파리(Drosophila) 배양을 위해
폴리스티렌 바이알Genesee Scientific32-116열 충격을 포함한 표준 초파리(Drosophila) 배양을 위해
프라이머/올리고뉴클레오타이드 DR-white_8f해당 사항 없음; 모든 올리고뉴클레오타이드 합성 서비스가 가능함제공된 원문 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.5'GTGGATCAGGTGATCCAGG
프라이머/올리고뉴클레오타이드 DR-white_8a해당 사항 없음; 모든 올리고뉴클레오타이드 합성 서비스 사용 가능해당 사항 없음5’-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC
프라이머/올리고뉴클레오타이드 DR-white_9f해당 없음; 모든 올리고뉴클레오타이드 합성 서비스 사용 가능제공된 소스 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.5’-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC
R Studio가정하다버전 2023.06.1+524무료 다운로드 버전; 데이터 분석에 사용된 버전 외에 모든 버전의 R Studio를 사용할 수 있으며, 제시된 데이터는 다음 버전을 사용하여 분석되었습니다.  버전 2023.06.1+524
R Studio 패키지: BiostringsBioconductor.org (버전 3.24)버전 2.76.0R 스크립트가 사용자에게 이 패키지를 설치하도록 안내할 것입니다.
R Studio 패키지: sangerseqRBioconductor.org (버전 3.24)버전 1.44.0R 스크립트가 사용자에게 이 패키지를 설치하도록 요청합니다.
SapphireAMP Fast PCRTakaraRR350B
실체현미경LeicaM60표준 초파리(Drosophila)를 위해 "초파리 밀기 (fly pushing)"
Wizard SV Gel 및 PCR 정제 PromegaA9281

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