연구 논문

급성 뇌경색 및 폐쇄성 수면 무호흡 증후군 환자의 말초 혈액 miR-486-3p 수치에 관한 후향적 코호트 연구

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DOI:

10.3791/72643

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2026년 8월 28일

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1Department of Neurology, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, 2The Second Clinical Medical College, Xuzhou Medical University

이 논문에서

요약

폐쇄성 수면 무호흡 증후군을 동반한 급성 뇌경색 환자에서 miR‑486‑3p는 발현이 감소하며, 질병의 중증도 및 염증 지표와 음의 상관관계를 보이고 1년 후의 좋지 않은 예후를 예측하므로, 진단 및 예후 바이오마커로서의 잠재적 가능성을 뒷받침합니다.

초록

폐쇄성 수면 무호흡 증후군(OSAS)을 동반한 급성 뇌경색(ACI)은 뇌졸중 재발 및 사망의 위험을 높이지만, 이러한 동반 질환에 대한 효과적인 바이오마커는 여전히 제한적입니다. 본 후향적 코호트 연구에서는 2020년 11월부터 2023년 12월 사이에 ACI 진단을 받은 환자 270명을 모집하였으며, 이들을 ACI 군(n = 100, 무호흡-저호흡 지수 [AHI] < 5)과 OSAS 동반 ACI 군(n = 170, AHI ≥ 5)으로 분류하였습니다. 후자는 다시 경증(5 ≤ AHI < 15, n = 60), 중등도(15 ≤ AHI < 30, n = 75), 중증(AHI ≥ 30, n = 35) 하위 그룹으로 층화하였습니다. 혈청 miR-486-3p 발현량은 RT-qPCR로 측정하였으며, tumor necrosis factor-α (TNF-α), C-reactive protein (CRP), hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α)를 포함한 염증 마커들은 ELISA로 정량화하였습니다. miR-486-3p의 진단적 가치는 수신자 조작 특성(ROC) 곡선 분석을 통해 평가하였고, 예후적 유의성은 Kaplan-Meier 생존 분석 및 Cox 회귀 모델을 통해 평가하였습니다. miR-486-3p는 동반 질환 군에서 현저히 낮았으며 강력한 진단 능력(AUC = 0.927)을 보였습니다. 특히, OSAS 중증도 하위 그룹 전반에서 뚜렷한 용량 의존적 경향이 관찰되었는데, OSAS가 경증에서 중증으로 갈수록 miR-486-3p는 점진적으로 감소하고 TNF-α와 CRP는 단계적으로 증가하였습니다. Spearman 상관 분석 결과, miR-486-3p는 AHI, NIHSS 점수, TNF-α 및 CRP와 음의 상관관계를 보였습니다. 1년 추적 관찰 결과, miR-486-3p 발현량이 낮은 환자는 발현량이 높은 환자에 비해 기능적 결과가 유의하게 더 나빴습니다. 다변량 Cox 회귀 분석을 통해 miR-486-3p가 1년 예후에 대한 독립적인 보호 요인임이 확인되었습니다. 이러한 결과는 miR-486-3p가 전신 염증의 조절 역할을 통해 OSAS를 동반한 ACI 환자의 새로운 진단 및 예후 바이오마커로 활용될 수 있음을 시사하며, 더 큰 규모의 전향적 코호트에서 추가적인 검증이 필요함을 나타냅니다.

서론

폐쇄성 수면 무호흡 증후군(OSAS)은 수면 중 호흡이 반복적으로 중단되는 것을 특징으로 하는 흔한 질환입니다1. OSAS는 흔히 대사, 심혈관, 신장, 폐 및 신경정신과적 질환과 같은 동반 질환과 관련이 있습니다2. 심혈관 및 대사 질환과의 일반적인 연관성을 넘어, OSAS는 급성 허혈성 뇌졸중에서 구체적이고 심각한 위협이 되며, 최대 70%의 사례에서 합병증을 유발하고 신경학적 악화, 사망 및 뇌졸중 재발 위험을 증가시킵니다3,4,5. 급성 뇌경색(ACI)은 뇌졸중의 가장 흔한 형태입니다. 최근 몇 년 동안 ACI 치료에 상당한 진전이 있었음에도 불구하고, 대부분의 환자는 여전히 심각한 장애를 겪거나 심지어 사망에 이릅니다6. ACI와 OSAS가 결합된 시너지 상호작용은 허혈성 손상과 전신 염증을 악화시켜 뇌졸중 재발, 장애 및 사망 위험을 실질적으로 높입니다. 따라서 이러한 고위험 동반 질환의 조기 진단 및 관리를 위한 신뢰할 수 있는 바이오마커를 식별하는 것이 매우 중요합니다.

최근 몇 년 동안 마이크로RNA(miRNA)는 바이오마커로서 큰 가능성을 보여주었습니다. 그중에서도 miR-486-3p는 신경혈관 질환에서 매우 중요한 의미를 갖습니다. 이전 연구들에 따르면 폐쇄성 수면 무호흡증(OSA)에서 miR-486-3p의 발현이 억제되는 것으로 나타났습니다7. 또한, 광견병 바이러스 당단백질-miR-486-3p-엑소좀 치료는 신경행동 장애, 뇌부종, 혈뇌장벽 손상 및 신경퇴행을 완화할 수 있으며8, 이는 miR-486-3p가 뇌 손상에서 역할을 한다는 것을 시사합니다. ACI 이후, 손상된 뇌 조직 내의 미세아교세포가 활성화되어 염증성 사이토카인의 분비를 촉진합니다5. OSAS는 간헐적 저산소증 증상을 유발하여 교감신경계의 활성화와 산화 스트레스를 일으키며, 결과적으로 전신 염증 폭포 반응을 유발합니다9. miR-486-3p는 염증과 밀접한 관련이 있습니다10. 이러한 증거들은 miR-486-3p가 OSAS 관련 저산소증, 전신 염증 및 뇌졸중 후 회복 사이의 분자적 연결 고리 역할을 할 수 있음을 시사합니다.

하지만 OSAS를 동반한 ACI 환자에서의 발현 프로필, 진단 정확도 및 예후적 중요성은 아직 체계적으로 조사되지 않았으며, 이것이 OSAS의 중증도나 염증 매개체와 용량 의존적인 방식으로 상관관계가 있는지 여부는 알려지지 않은 상태입니다. 이러한 공백을 메우기 위해, 본 연구에서는 ACI 환자의 OSAS에 대한 miR-486-3p의 진단적 가치를 평가하고, OSAS 중증도 및 염증 마커(TNF-α, CRP 및 HIF-1α)와의 용량 의존적 관계를 조사하며, 1년 기능적 결과에 대한 예후적 유용성을 평가하였습니다. 저희가 알고 있는 한, 본 연구는 miR-486-3p가 전신 염증 조절을 통해 ACI-OSAS 동반 질환의 새로운 진단 및 예후 바이오마커로 활용될 수 있음을 입증한 최초의 종합적인 연구입니다.

프로토콜

본 연구는 서주 의과대학교 부속 병원 윤리 위원회의 승인을 받았으며 (승인 번호: XYFY2024-KL238-01), 환자로부터 추가적인 고지된 동의를 얻어야 하는 요건이 면제되었습니다. 사용된 시약과 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

환자 및 검체
본 연구는 후향적 코호트 연구로 진행되었다. 2020년 11월부터 2023년 12월까지 Xuzhou Medical University 부속 병원에서 ACI 치료를 받은 총 270명의 환자를 연속적으로 모집하였다. 환자 선정 과정은 부록 그림 1에 요약되어 있다. 뇌졸중 병동의 모든 신규 입원 환자를 매일 스크리닝하여 적격 환자를 식별하였다. 입원 전 72시간 이내의 증상 발현 여부는 응급 의료 기록 검토를 통해 확인하였으며, 전문 신경과 의사가 환자 병력 및 가족 면담을 통해 최종 확정하였다. 표본 크기는 그룹 간 miR-486-3p 수준의 유의미한 차이를 검출할 수 있는 능력을 기준으로 산출하였다. 효과 크기 0.5, 양측 α 0.05, 검정력 (1-β) 0.80을 가정했을 때, 그룹당 최소 64명의 환자가 필요했다. 최종 그룹 크기는 미리 결정된 할당량이 아니라, 실제 모집 결과와 뇌졸중 환자군 내 OSAS의 높은 유병률을 반영한 것이다. ACI와 OSAS가 동반된 환자들은 1년 동안 예후를 추적 관찰하였다.

선정 기준은 다음과 같았다: (1) 입원 전 72시간 이내에 증상이 발현되었으며, 자기공명영상으로 확인된 급성 허혈성 뇌졸중. (2) 연구 설문지와 신경학적 평가를 이해하고 완료할 수 있는 능력. (3) 입원 시 미국 국립보건원 뇌졸중 척도(NIHSS)를 통해 급성 뇌경색(ACI)의 중증도를 평가하였다. NIHSS 점수가 <5점 미만이면 경증 ACI로 분류하고, NIHSS 점수가 5점에서 20점 사이이면 중등도 ACI로 간주합니다. 주요 제외 기준에는 악성 종양 병력, 기존의 심각한 신체 장애 또는 정신 질환, 심각한 심장, 폐 또는 신부전, 이전 3개월 이내의 주요 수술 또는 외상, 활동성 감염 또는 자가면역 질환, 6개월 이내의 뇌졸중 병력, 면역 억제 요법, 그리고 OSAS의 이전 진단 또는 치료(지속적 양압 환기 요법 포함)가 포함되었습니다.

MRI 확인을 위해 모든 환자는 3.0-T 시스템에서 T1-가중, T2-가중, 액체 감쇠 역전 회복(FLAIR), 확산 강조 영상(DWI) 및 겉보기 확산 계수(ADC) 매핑을 포함한 표준 뇌 MRI 촬영을 받았습니다. 급성 경색은 DWI에서 고신호 강도가 나타나고 이에 상응하는 ADC에서 저신호 강도가 나타나는 것으로 정의되었습니다. 모든 MRI 스캔은 임상 데이터를 알지 못하는 두 명의 숙련된 신경방사선과 전문의가 판독하였으며, 의견 불일치는 합의를 통해 해결했습니다. NIHSS 점수 측정은 혈전 용해제 투여 또는 혈관 내 치료 전에 공인된 신경과 전문의에 의해 입원 시 수행되었습니다.

뇌졸중 발생 후 24시간에서 48시간 사이에, 최소 8시간 이상의 밤샘 금식 후 공복 정맥혈을 채취하였다. 일주기 변동을 최소화하기 위해 채혈은 오전 6:00에서 8:00 사이에 수행되었다. 총 5 mL의 말초 정맥혈을 EDTA 코팅 진공 튜브에 수집하였다. 채취 후 2시간 이내에, 냉장 원심분리기를 사용하여 4 °C에서 1,500 × g로 15분 동안 혈액 샘플을 원심분리하였다. 혈청 상층액을 1.5 mL RNase-free 마이크로 원심분리 튜브에 조심스럽게 분주하고, RNA 추출 전까지 −80 °C에서 즉시 보관하였다. 반복적인 동결-해동 주기는 엄격히 피하였으며, 모든 분주액은 분석 전 최대 1회의 동결-해동 주기만을 거치도록 하였다.

환자 군 분류
참가자들은 수면다원검사를 통해 측정된 AHI 점수를 기준으로 군을 분류하였다. 모든 기록은 병원 수면실에서 오후 10시부터 오전 6시 사이에 최소 7시간 동안 수행되었다. 모니터링된 생리학적 채널은 뇌파(EEG; 6개 채널), 안구전도(EOG; 2개 채널), 근전도(EMG; 턱 및 양측 전경골근), 심전도(ECG; 단일 리드), 비강 기류(서미스터 및 압력 변환기), 흉부 및 복부 호흡 노력(호흡 유도 플레티스모그래피) 및 맥박 산소 포화도(SpO2)를 포함하였다. 수면 연구 기술자가 AHI를 산출하였다. 수면 단계 및 호흡 사건의 판독은 Somnolyzer 24×7 소프트웨어를 사용하여 미국수면의학회(AASM) 2012 판독 매뉴얼에 따라 공인 수면 기술자가 수동으로 수행하였다. 널리 인정되는 미국수면의학회의 진단 기준에 따르면, 시간당 5회 이상의 AHI 사건이 OSA 진단의 표준 임계값이다. 따라서 AHI < 5인 참가자는 ACI 군(n = 100)으로 분류하였고, AHI ≥ 5인 참가자는 ACI 및 OSAS 병합 군(n = 170)으로 분류하였다. AHI ≥ 5인 환자(ACI 및 OSAS 병합 군, n = 170) 중에서는 기설정된 기준에 따라 경증 OSAS (5 ≤ AHI < 15, n = 60), 중등도 OSAS (15 ≤ AHI < 30, n = 75), 중증 OSAS (AHI ≥ 30, n = 35)의 세 가지 중증도 하위 군으로 추가 층화하였다. 이러한 층화를 통해 저산소 부담, miR-486-3p 발현 및 염증 마커 사이의 용량 의존적 관계를 평가할 수 있었다. 기저 AHI 측정의 혼란 변수를 방지하기 위해, 이전의 OSAS 치료(예: CPAP) 경험이 있는 환자는 연구에서 제외하였다.

예후 평가
1년 시점은 급성 효과가 해소되고 OSAS의 누적 저산소 부하가 나타나는 시기로, 예후적 영향을 평가하기 위한 강력한 창을 제공합니다. OSAS를 동반한 ACI 환자의 임상적 예후는 질환 발생 후 수정 Rankin 척도(mRS)를 통해 평가되었습니다. 모든 mRS 평가는 연구 전 표준화된 교육을 이수한 공인 신경과 전문의가 구조화된 mRS 인터뷰 양식을 사용하여 수행하였습니다. 평가자 간 신뢰도는 kappa 계수 >0.85로 확인되었습니다. 추적 평가 내원 시 예정된 외래 진료 방문을 통해 진행되었습니다. 직접 방문이 불가능한 환자의 경우, 교육받은 연구 간호사가 표준화된 스크립트를 사용하여 구조화된 전화 인터뷰를 수행하였습니다. 모든 평가자는 환자의 miR-486-3p 수치와 OSAS 상태에 대해 눈가림 처리되었습니다. 외래 평가와 전화 평가 간의 일관성을 유지하기 위해 두 형식 모두 동일한 구조화된 설문지를 사용하였으며, 모든 평가자는 연구 전 보정 연습을 완료하였습니다. 점수가 0–2점인 환자는 양호한 예후 군으로, 3–6점인 환자는 불량한 예후 군으로 분류되었습니다. 추적 관찰에서 탈락한 환자는 없었습니다. SAQLI, ESS, TNF-α 및 HIF-1α는 예후 그룹을 정의하는 대신 예후 변수로 평가되었습니다. NIHSS, SAQLI 및 ESS는 교육받은 연구 직원이 실시하였습니다. SAQLI와 ESS는 조용한 방에서 면접자 실시 설문지 형태로 진행되었습니다.

점수 지표
NIHSS는 뇌졸중에 대한 정량적 척도입니다.11점수가 높을수록 ACI의 중증도가 더 심함을 나타냅니다. SAQLI는 1~7점 척도로 구성된 OSA 삶의 질 설문지로, 점수가 높을수록 삶의 질이 더 낮음을 의미하며, 일상 활동, 사회적 상호작용, 정서 상태, 증상 및 치료 관련 증상을 다룹니다.12ESS는 환자가 직접 보고한 주간 졸음 정도를 조사하는 데 사용되며, 점수 범위는 0점에서 24점까지이며, 점수 > 10은 낮 시간의 졸음을 나타냅니다.13.

RNA 추출 및 역전사
TRIzol 시약을 사용하여 200 µL의 혈청에서 총 RNA를 추출하였다. 간단히 설명하면, 혈청 샘플을 800 µL의 TRIzol과 혼합하여 실온에서 5분 동안 배양한 후, 4 °C에서 12,000 × g 로 15분 동안 원심분리하였다. 클로로포름(200 µL)을 첨가하고 혼합물을 15초 동안 강하게 흔들어 섞은 뒤, 3분간 배양하고 4 °C에서 12,000 × g로 15분 동안 원심분리하였다. 수층을 새 튜브로 옮기고 500 µL의 이소프로판올로 RNA를 침전시킨 후, −20 °C에서 1시간 동안 배양하고 4 °C에서 12,000 × g로 10분 동안 원심분리하였다. RNA 펠릿을 75% 에탄올로 세척하고 공기 건조시킨 후, 20 µL의 RNase-free water에 용해시켰다. 마이크로볼륨 분광광도계를 사용하여 RNA 농도와 순도를 측정하였으며, A260/A280 비율이 1.8에서 2.0 사이인 경우 후속 분석에 적합한 것으로 간주하였다. RNA 무결성은 아가로스 겔 전기영동으로 확인하였다.

제조사의 프로토콜에 따라 random hexamer 프라이머를 사용하여, 총 20 µL의 반응 부피에서 Reverse Transcription Kit와 500 ng의 total RNA를 이용해 역전사를 수행하였다. 역전사 반응은 25 °C에서 10분, 42 °C에서 60분, 70 °C에서 5분 동안 진행하였다. 생성된 cDNA는 사용 전까지 −20 °C에서 보관하였다.

실시간 역전사 정량 PCR (RT-qPCR)
miR-486-3p 발현은 실시간 정량 PCR(qPCR) 시스템에서 microRNA 정량을 위한 SYBR Green 기반 실시간 PCR 키트를 사용하여 검출하였다. 반응 혼합물에는 다음이 포함되었다. 10 µL 2 중의× SYBR Green Master Mix, 2 µL cDNA 템플릿(1:5로 희석됨)의, 1 µL 각 프라이머의 (10 µM), 그리고 nuclease-free water를 사용하여 최종 부피를 다음으로 맞춥니다. 20 µL프라이머 서열은 다음과 같습니다(5'-3' 방향): miR-486-3p-정방향: TCGGCAGCGGGGCAGCUCAGU, 역방향: CTCAACTGGTGTCGTGGA; 그리고 U6-정방향: CTCGCTTCGGCAGCACA, 역방향: AACGCTTCACGAATTTGCGT. qPCR 사이클 조건은 다음과 같았습니다: 95 °C 2분간 수행한 후, 다음으로 40회 사이클의 95 °C 30초 동안, 60 °C 30초 동안 수행하고, 72 °C 60초 동안 수행하였다. 각 시료는 3회 반복 측정하였으며, 매 분석 시 템플릿 미포함 대조군(no-template control)을 포함하였다. 증폭의 특이성은 다음의 용해 곡선 분석(melting curve analysis)을 통해 확인하였다. 60 °C ~로 / ~에게 / ~하기 위하여 95 °C사이클 임계값(Ct)은 기본 임계값 설정을 사용하여 QuantStudio 6 Pro 소프트웨어(v1.5)에 의해 자동으로 결정되었습니다. miR-486-3p 수준은 2--ΔΔ컴퓨터 단층촬영 방법을 사용하였으며 U6로 정규화하였다. 그룹 간의 일관성을 보장하기 위해 NormFinder 알고리즘을 사용하여 혈청 샘플에서 U6가 안정적인 참조 유전자임을 검증하였다. 분석 간 및 분석 내 변동 계수는 <5%.

ELISA
ELISA 키트를 사용하여 C-reactive protein (CRP), TNF-α 및 HIF-1α의 혈청 농도를 측정하였습니다. 실험 절차는 제조사의 지침에 따라 수행되었습니다. 간단히 설명하면, 혈청 샘플을 얼음 위에서 해동한 후 제공된 희석 버퍼로 1:2 비율로 희석하였습니다. 샘플과 표준 물질을 코팅된 96-well 플레이트에 첨가(100 µL/well)하고 37°C에서 2시간 동안 배양하였습니다. 300 µL의 세척 버퍼로 4회 세척한 후, biotin-conjugated 검출 항체 100 µL를 첨가하고 37°C에서 1시간 동안 배양하였습니다. 다시 한번 세척 단계를 거친 후, horseradish peroxidase-conjugated streptavidin 100 µL를 첨가하고 암소의 37°C에서 30분 동안 배양하였습니다. 발색 기질(tetramethylbenzidine, 100 µL)을 첨가하고 빛을 차단한 상태로 37°C에서 15분 동안 배양하였습니다. 정지액 50 µL를 첨가하여 반응을 종결시켰으며, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였습니다. 농도는 기지의 농도를 가진 재조합 단백질로 생성된 표준 곡선을 이용하여 계산하였습니다. 각 샘플은 이중으로 측정하였으며, 분석에는 평균값을 사용하였습니다. 제조사에서 제공한 품질 관리(QC) 샘플을 각 플레이트에 포함하였으며, QC 값이 제조사에서 지정한 범위 내에 있을 때만 결과를 인정하였습니다.

품질 관리 및 재현성
모든 실험실 분석은 RT-qPCR에 관한 MIQE(정량적 실시간 PCR 실험 출판을 위한 최소 정보) 가이드라인 및 ELISA의 적절한 보고 표준에 따라 수행되었습니다. 주요 장비는 제조사의 일정에 따라 교정되었습니다. 플레이트 간 변동성을 모니터링하기 위해 각 RT-qPCR 및 ELISA 실행 배치에 음성 및 양성 대조군 샘플을 포함하였습니다. 모든 데이터는 Microsoft Excel을 사용하여 기록 및 관리되었으며, 교신 저자는 합당한 요청이 있을 경우 상세한 실험 프로토콜과 원천 데이터를 제공할 것입니다.

통계 분석
데이터 분석에는 SPSS 23.0과 통계 및 그래프 소프트웨어가 사용되었습니다. 정규 분포는 Shapiro–Wilk 검정으로 평가하였습니다. 연속형 변수는 평균 ± SD 또는 중앙값 (IQR)으로 표시하였으며, 적절한 경우 t-검정 또는 Mann–Whitney U 검정으로 비교하였습니다. 범주형 변수는 χ2 검정으로 비교하였습니다. 상관관계는 데이터 분포에 따라 Pearson 또는 Spearman 분석을 사용하여 검토하였습니다. 예측값은 ROC 곡선을 사용하여 결정하였으며 5-fold 교차 검증으로 확인하였습니다. miR-486-3p의 최적 컷오프 값은 Youden 지수를 최대화하여 결정하였습니다. 상관관계 평가에는 Pearson 및 Spearman 상관분석이 사용되었습니다. 예후 분석을 위해 환자들을 miR‑486‑3p 발현량의 중앙값에 따라 층화하였으며, 그룹 간 생존 결과 비교에는 log-rank 검정을 이용한 Kaplan–Meier 곡선을 사용하였습니다. 단변량 Cox 회귀 분석에서 P < 0.1인 변수들을 다변량 Cox 모델에 포함시켰습니다. P < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였습니다.

결과

ACI 군과 ACI 및 OSAS 동반 군의 기저 특성
표 1에 나타낸 바와 같이, ACI 군은 남성 68명과 여성 32명으로 구성되었으며 평균 연령은 62.84 ± 12.65세였고, ACI 및 OSAS 동반 군은 남성 16명과 여성 54명으로 구성되었으며 평균 연령은 61.31 ± 1.25세였습니다. ACI 및 OSAS 동반 군은 AHI, NIHSS 점수 및 CRP 수치가 유의하게 더 높았습니다. 그러나 두 군의 연령, 성별, BMI, 고혈압, DM, 심장질환, 이상지질혈증, 흡연, 음주, 혈전용해술 및 TOAST 분포는 유사했습니다.

OSAS 중증도 하위 그룹에 따른 miR-486-3p 및 염증 마커의 변화
OSAS 중증도와 분자적 변화 사이의 용량 의존적 관계를 평가하기 위해, AHI 기준에 따라 ACI 및 OSAS 환자 170명을 경증(5 ≤ AHI < 15, n = 60), 중등도(15 ≤ AHI < 30, n = 75), 중증(AHI ≥ 30, n = 35) 하위 그룹으로 층화하였습니다. 그림 1A–C에 나타낸 바와 같이, 4개 그룹(ACI, 경증, 중등도, 중증 OSAS) 전반에서 명확한 단계적 패턴이 관찰되었습니다. 구체적으로, miR-486-3p 발현은 ACI 그룹에서 중증 OSAS 하위 그룹으로 갈수록 점진적으로 감소하였습니다(그림 1A, P < 0.01 vs. ACI 그룹). 반면, 혈청 TNF-α 및 CRP 수치는 OSAS 중증도가 증가함에 따라 단계적으로 상승하였습니다(그림 1B,C, P < 0.01 vs. ACI 그룹). 이러한 결과는 OSAS에 의해 유발된 저산소 부담이 miR-486-3p의 단계적 억제 및 전신 염증의 병행 증가와 관련이 있음을 나타냅니다.

ACI 환자의 OSAS에 대한 miR-486-3p의 진단 가치
miR-486-3p는 AUC 0.927(최적 컷오프 값 0.845), 민감도 92.94% 및 특이도 79.0%를 보여 ACI와 OSAS가 동반된 경우 유의미한 진단 가치를 가질 수 있습니다(그림 1D). 진단 모델의 견고성을 평가하고 잠재적인 과적합을 배제하기 위해, miR-486-3p의 ROC 분석에 대해 5-겹 교차 검증을 수행하였습니다. 부록 표 1에 나타난 바와 같이, 5개 폴드의 평균 AUC는 0.928(0.847에서 0.969 범위)이었으며, 이는 초기 분석에서 얻은 겉보기 AUC인 0.927과 매우 일치하였습니다. 평균 민감도와 특이도는 각각 8.83% 및 87.0%였습니다.

ACI와 OSAS 동반 환자군에서 miR-486-3p와 뇌졸중 중증도 및 염증 마커 간의 상관관계
OSAS가 동반된 ACI 군에서 Spearman 상관 분석 결과, miR-486-3p 발현은 NIHSS 점수(그림 2A), TNF-α(그림 2B) 및 CRP(그림 2C)와 유의미한 음의 상관관계를 보였다.

양호한 예후 그룹과 불량한 예후 그룹의 예후 지표
ACI와 OSAS가 동반된 환자들은 mRS 점수에 따라 양호한 예후 그룹과 불량한 예후 그룹으로 나누어졌다. 표 2에 나타난 바와 같이, 불량한 예후 그룹에서 mRS 점수, SAQLI 점수, ESS 점수, HIF-1α 및 TNF-α가 증가하였다.

ACI와 OSAS가 동반된 환자의 1년 결과에 대한 miR-486-3p의 예후적 가치
Kaplan-Meier 곡선 결과, miR-486-3p 수치가 높을수록 양호한 예후와 관련이 있었으며, 수치가 낮을수록 불량한 예후와 관련이 있었습니다 (그림 2D). 단변량 분석에서 miR-486-3p 발현 및 NIHSS 점수가 임상 결과와 연관이 있었습니다. SAQLI 점수 (P = 0.078), HIF-1α (P = 0.086), TNF-α (P = 0.072), 연령 (P = 0.082), DM (P = 0.067), 심장질환 (P = 0.065), AHI (P = 0.069)를 포함한 다른 변수들은 예후와 경계성 유의한 연관성을 보였으며, 이들 또한 다변량 Cox 분석에 포함되었습니다. 다변량 분석에서 miR-486-3p는 독립적인 보호 요인으로 유지된 반면 (HR = 0.437, 95% CI: 0.278–0.684, P < 0.01), 심장질환 (HR = 1.82, 95% CI: 1.070–3.104, P = 0.027)과 NIHSS 점수 (HR = 1.597, 95% CI: 1.08–2.529, P = 0.046)는 불량한 임상 결과의 독립적인 위험 요인으로 나타났습니다 (표 3).

연구 결과 요약
요약하자면, 본 연구는 OSAS가 동반된 ACI 환자에서 miR‑486‑3p가 유의하게 감소되어 있으며, 해당 환자군에서 OSAS를 식별하는 데 높은 진단 정확도를 보인다는 것을 입증하였다. OSAS 중증도 하위 그룹 간에 명확한 용량 의존적 관계가 관찰되었으며, OSAS가 경증에서 중증으로 갈수록 miR‑486‑3p는 점진적으로 감소하고 염증성 마커(TNF‑α 및 CRP)는 단계적으로 증가하였다. 상관관계 분석을 통해 miR‑486‑3p가 뇌졸중 중증도(NIHSS) 및 전신 염증 모두와 음의 상관관계가 있음이 추가로 확인되었다. 중요한 점은, 낮은 miR‑486‑3p 발현이 좋지 않은 1년 후의 기능적 예후를 예측했으며, 다변량 Cox 회귀 분석 결과 NIHSS 및 AHI를 포함한 잠재적 교란 요인을 보정한 후에도 miR‑486‑3p가 독립적인 보호 인자로 확인되었다는 것이다. 종합적으로, 이러한 결과는 miR‑486‑3p가 전신 염증 조절 역할을 통해 ACI‑OSAS 동반 질환의 새로운 진단 및 예후 바이오마커로 활용될 수 있다는 가설을 뒷받침한다.

데이터 가용성:
본 연구의 결과를 뒷받침하는 원시 데이터는 보충 파일 1(Supplementary File 1)에서 확인할 수 있으며, 여기에는 모든 등록 환자의 기초 특성, miR‑486‑3p 발현 수준, ELISA 측정값 및 1년 mRS 추적 관찰 데이터가 포함되어 있습니다.

miR-486-3p, TNF-α, CRP 수치의 비교 분석 그래프, ACI 및 OSAS에 대한 ROC 곡선.
그림 1ACI 결합 OSAS 중증도 하위 그룹에 따른 miR-486-3p 및 염증 마커의 변화와 OSAS에 대한 miR-486-3p의 진단 성능. (A) ACI 군 및 ACI와 OSAS 동반 하위 군에서의 miR-486-3p의 상대적 발현량. (B) 혈청 TNF-α 농도 통합. (C) ACI 군의 혈청 CRP 농도 (AHI < 5, n=10) 및 경증(5 ≤ AHI < 15, n=60), 중등도 (15 ≤ AHI < 30, n=75) 및 중증(AHI ≥ 30, n=35) OSAS 하위 그룹으로 나누었다. (DOSAS 동반 ACI 환자와 비동반 환자를 판별하기 위한 miR-486-3p의 ROC 곡선.P < 0.001. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

NIHSS, TNF-α, CRP 수치와 miR-486-3p 발현의 상관관계, 생존 분석 그래프.
그림 2miR-486-3p와 뇌졸중 중증도 및 염증성 마커 간의 상관관계와 1년 예후에 대한 예측 가치. (A–C) NIHSS 점수, TNF-α 및 CRP와 miR-486-3p 발현 간의 스피어만 상관관계 분석. (D) miR-486-3p 발현 중앙값을 기준으로 층화한 1년 추적 관찰 시 양호한 예후 확률의 Kaplan-Meier 생존 곡선. ***P < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

변수ACI (n=10)ACI 및 OSAS (n=170)p-값
연령 (세)62.84 ± 12.6561.31 ± 11.250.303
성별 (남성/여성)68/32116/540.968
BMI (kg/m²2)24.74 ± 3.5725.02 ± 3.470.531
고혈압, n (%)74 (74%)134 (78.82%)0.365
당뇨병, n (%)22 (22%)43 (25.29%)0.543
심장질환, n (%)13 (13%)25 (14.71%)0.698
무호흡-저호흡 지수(AHI, 회/시간)2.07 ± 1.4219.95 ± 9.19< 0.001***
NIHSS 점수1.70 ± 1.184.05 ± 1.73< 0.001***
CRP (ng/mL)2.03 ± 0.173.01 ± 0.27< 0.001***
ACI 등급 (경증/중등도)99/169/101< 0.001***
이상지질혈증 (예/아니오)52/4896/740.478
흡연 여부 (예/아니오)48/5291/790.382
음주 여부 (예/아니오)40/6087/830.076
혈전용해술 (예/아니오)38/6281/890.124
TOAST0.487
심장성 색전증 (n)2236
소혈관 폐색 (n)1828
대동맥 경화증 (n)1325
원인 불명 뇌졸중 (n)519
기타 결정된 원인에 의한 뇌졸중 (n)4262

표 1: OSAS 동반 여부에 따른 ACI 환자의 기저 특성. 데이터는 연속 변수의 경우 평균 ± SD로, 범주형 변수의 경우 n (%)로 표시되었습니다. P 값은 연속 변수의 경우 독립 t-검정을, 범주형 변수의 경우 카이제곱 검정을 사용하여 계산되었습니다. ACI, 급성 뇌경색; OSAS, 폐쇄성 수면 무호흡 증후군; BMI, 체질량 지수; DM, 당뇨병; AHI, 무호흡-저호흡 지수; NIHSS, 미국 국립보건원 뇌졸중 척도; CRP, C-반응성 단백질; TOAST, 급성 뇌졸중 치료의 Org 10172 임상 시험.

변수양호한 예후 (n=97)불량한 예후 (n=73)P 값
mRS 점수0.8 ± 0.844.55 ± 1.08< 0.01***
SAQIL 점수2.59 ± 1.173.12 ± 1.480.09**
ESS 점수8.69 ± 2.7610.05 ± 2.790.02**
HIF-1α (pg/mL)159.94 ± 27.861283.88 ± 445.150.027*
TNF-α (pg/mL)121.4 ± 12.87128.4 ± 11.67< 0.01***

표 2: OSAS를 동반한 ACI 환자의 예후 양호 및 양호하지 않은 그룹의 예후 지표. 환자들은 1년 mRS 점수를 기준으로 예후 양호 그룹(mRS 0–2, n = 97)과 예후 양호하지 않은 그룹(mRS 3–6, n = 73)으로 나누어졌다. 데이터는 평균 ± SD로 표시되었다. P 값은 독립 t-test를 사용하여 계산되었다. mRS, 수정 Rankin 척도; SAQLI, Calgary 수면 무호흡 삶의 질 지수; ESS, Epworth 졸음 척도; HIF‑1α, 저산소 유도 인자-1α; TNF‑α, 종양 괴사 인자-α.

변수 심박수단변량 95% 신뢰구간 P 심박수다변량 95% 신뢰구간(CI)P 
낮춤상부낮춤상부
miR-486-3p0.4420.2280.679<0.0010.4370.2780.684<0.001
SAQLI 점수0.6280.3751.0530.0780.7130.4161.220.217
ESS 점수0.9220.5951.4290.718
HIF-1α0.6940.4571.0530.0860.8020.5231.2290.311
TNF-α1.4690.9662.2330.0721.4940.9782.2840.063
연령1.4450.9552.1880.0821.290.8451.970.238
성별0.8290.5341.2850.401
체질량지수1.1960.7861.8210.402
고혈압0.7540.4651.2220.252
당뇨병1.5120.9722.3510.0671.2460.791.9650.343
심장질환1.6110.9712.6730.0651.8221.073.1040.027
무호흡-저호흡 지수(AHI)1.4680.972.2220.0691.1250.7341.7250.588
NIHSS 점수1.5881.0272.4550.0371.5971.0082.5290.046
이상지질혈증1.1780.7761.7880.442
흡연0.8950.5931.350.596
음용1.1160.7381.6890.603
혈전 용해술1.2590.8341.9020.272

표 3: OSAS를 동반한 ACI 환자의 1년 내 불량한 예후에 대한 단변량 및 다변량 Cox 회귀 분석. HR, 위험비; CI, 신뢰 구간; SAQLI, Calgary 수면 무호흡증 삶의 질 지수; ESS, Epworth 졸음 척도; HIF‑1α, 저산소 유도 인자-1α; TNF‑α, 종양 괴사 인자-α; BMI, 체질량 지수; DM, 당뇨병; AHI, 무호흡-저호흡 지수; NIHSS, 미국 국립보건원 뇌졸중 척도. 단변량 분석에서 P < 0.1인 변수들이 다변량 Cox 모델에 포함되었습니다.

보충 그림 1: 환자 선정 및 하위 그룹 층화 흐름도.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 1: miR-486-3p의 진단 가치 내부 검증을 위한 5-겹 교차 검증. AUC, 곡선 아래 면적; CI, 신뢰 구간. 평균 AUC, 민감도 및 특이도는 5개 겹의 산술 평균으로 계산되었습니다.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: 본 연구의 결과를 뒷받침하는 원시 데이터.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

폐쇄성 수면 무호흡증(OSAS) 환자는 반복적인 기도 허탈과 폐쇄를 경험하며, 이는 간헐적 저산소증(IH)과 과도한 낮 졸음(EDS)으로 이어져 신경세포 손상을 유발할 수 있습니다.14폐쇄성 수면 무호흡증(OSA)은 급성 관상동맥 증후군(ACI) 이후 매우 흔하게 나타나며, 환자의 약 72%에 영향을 미치고 심혈관 위험을 현저히 악화시킵니다.15ACI는 불충분한 관류로 인한 국소적 뇌 허혈 및 저산소증에서 비롯되는 일련의 신경학적 결손을 구성한다.‌16폐쇄성 수면 무호흡증(OSAS) 병리의 핵심인 간헐적 저산소증은 급성 뇌경색(ACI)의 허혈성 손상과 시너지 효과를 일으켜 뇌 손상을 증폭시킬 가능성이 큽니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 고위험 공존 질환 상태에 특별히 초점을 맞춘 연구는 부족한 실정입니다. 축적되는 증거들은 miRNA가 OSAS와 ACI 모두의 발병 기전에서 중추적인 역할을 한다는 것을 시사합니다.17,18이전에 miR-486-3p가 폐쇄성 수면 무호흡증(OSAS) 및 급성 뇌경색(ACI)과 관련이 있을 수 있음이 보고된 바 있습니다. 이에 따라 본 연구에서는 OSAS와 ACI 사이의 잠재적 분자적 연결 고리로서 miR-486-3p를 조사하였습니다. 특히, 본 코호트는 COVID-19 팬데믹 기간인 2020년 11월부터 2023년 12월까지 모집되었습니다. 축적된 증거에 따르면, SARS-CoV-2 감염으로 유발된 지속적인 전신 염증이 신경 손상을 악화시키고 신경퇴행성 병변의 진행을 촉진할 수 있음을 시사합니다.19,20하지만 본 연구는 SARS-CoV-2/COVID-19 감염에 초점을 맞추지 않았으며, 연구 목적 및 설계 또한 COVID-19와 무관합니다. OSAS를 동반한 ACI 환자에서 혈청 miR-486-3p 수치가 유의하게 낮게 나타났으며, 이는 해당 동반 질환에서 miR-486-3p의 역할에 대한 기초적인 임상적 근거를 제공하며 추가 연구의 필요성을 강조합니다.

NIHSS 점수는 뇌졸중의 중증도를 평가할 수 있습니다11. 수면다원검사에서의 AHI는 OSAS 진단에 흔히 사용되며, AHI 점수가 높을수록 OSAS가 더 심각함을 의미합니다21. 수면다원검사의 임상적 및 물류적 어려움을 고려할 때, 뇌졸중 환자의 폐쇄성 수면 무호흡증을 식별할 수 있는 접근 가능한 바이오마커를 찾는 것이 매우 중요합니다22. 본 연구 결과는 miR-486-3p 수치가 AHI 및 NIHSS 점수 모두와 역상관 관계를 보이며 질병의 중증도를 반영하므로, ACI 동반 OSAS에 대해 상당한 진단적 가능성을 가지고 있음을 나타냈습니다.

방법론적으로, 본 연구는 단일 코호트에서 분자 프로파일링과 정량적 임상 표현형 분석을 통합하여 진단 정확도, 용량-반응 관계 및 예후 가치를 동시에 평가할 수 있는 가능성을 입증합니다. 이러한 통합 프레임워크는 여러 병태생리학적 경로 간의 복잡한 상호작용으로 인해 기존의 단일 종점 분석이 까다로운 뇌졸중 관련 동반 질환의 향후 바이오마커 발굴 연구에 참고 자료가 될 수 있습니다.

IH는 OSAS의 전형적인 특징이며, 염증 유발 신호 전달 경로를 활성화함으로써 염증과 조직 손상을 유도합니다23. 결정적으로, 이러한 염증 상태는 허혈 후 염증이 이차적 뇌 손상을 매개하는 ACI의 병태생리와 상호작용하며 이를 악화시킵니다24,25. TNF-α 및 CRP와 같은 주요 염증 매개체는 두 질환 모두에서 수치가 상승하며, 저산소증 유발 및 허혈 트리거 염증 폭포의 결절점에 위치하여 ACI와 OSA의 동반 병리에서 핵심적인 분자로 작용합니다26,27,28. 따라서, OSAS를 동반한 ACI 환자의 혈청 TNF-α 및 CRP 농도를 측정하였습니다. 본 연구에서 OSAS 동반 ACI 환자의 혈청 miR-486-3p 수치와 TNF-α 및 CRP 수치 사이에 관찰된 음의 상관관계는, 이 miRNA와 해당 동반 질환의 특징인 전신 염증 상태 사이에 잠재적인 연결 고리가 있음을 시사합니다.

OSAS는 삶의 질에 매우 부정적인 영향을 미치며, SAQLI는 OSA 전용 삶의 질 설문지입니다29. EDS는 OSAS의 흔한 증상이며, EDS를 동반한 OSAS는 더 많은 유해 사례와 더 좋지 않은 예후로 이어집니다30. ESS는 낮 시간 졸음의 심각도를 결정하는 데 흔히 사용됩니다31. OSAS에서 반복적인 IH 에피소드는 혈관 질환의 독립적인 위험 요인으로 간주됩니다32. 또한, IH에서 유래된 산화 스트레스는 골다공증, 심혈관 위험 증가 및 신경학적 변화와 같은 합병증을 유발할 수 있습니다33. 따라서 본 연구에서는 HIF-1α 발현 또한 조사하였습니다. OSAS를 동반한 ACI 환자의 예후 불량군에서 HIF-1α가 상승했다는 결과는 OSAS에서의 만성 간헐적 저산소증 병태생리와 일치합니다. 또한, 결과에 따르면 miR-486-3p와 TNF-α가 OSAS 동반 ACI의 예후와 상관관계가 있었으며, miR-486-3p의 낮은 수치는 불량한 예후와 관련이 있었습니다. 이는 IH로 유도된 HIF-1α가 miR-486-3p를 억제하고, 이로 인해 TNF-α와 같은 염증 매개체의 상향 조절에 기여하여 결과적으로 ACI의 뇌 손상을 악화시키는 잠재적인 연쇄 반응을 시사합니다.

본 연구에는 여전히 한계점이 있습니다. 본 연구는 대조군(건강한 대조군, OSAS 단독군)의 부재로 인해 제한적이며, 이로 인해 miR-486-3p의 정상 범위를 정의하고 동반 질환에 특이적인 변화를 OSAS 단독으로 인한 변화와 구별하는 것이 불가능합니다. 따라서 miR-486-3p의 발현 프로파일을 완전히 규명하기 위해서는 향후 연구에 이러한 대조군들이 반드시 포함되어야 합니다. 또한, 단순히 상관관계만으로는 miR-486-3p의 구체적인 조절 기전을 추론하기에 불충분합니다. 저희는 향후 실험을 통해 그 분자적 기전을 추가로 검증할 예정입니다.

중개적 관점에서 miR‑486‑3p의 높은 진단 정확도와 독립적인 예후 가치는 여러 잠재적인 임상 적용 가능성을 시사합니다. 혈액 기반 바이오마커로서 miR‑486‑3p는 일상적인 뇌졸중 정밀 검사에 통합되어 기저 OSAS가 있는 ACI 환자를 식별함으로써, 수면다원검사로의 조기 의뢰와 적시 개입을 촉진할 수 있습니다. 급성 및 아급성 단계 동안 miR‑486‑3p 수치를 모니터링하면 염증 역학을 추적하고 예후 위험도에 따라 환자를 분류하여 개인 맞춤형 재활 전략을 수립하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 중개적 경로들은 향후 전향적 다기관 연구를 통한 추가 조사가 필요합니다. 종합적으로, miR-486-3p는 염증 인자를 조절함으로써 OSAS가 동반된 ACI에 관여할 수 있으며, OSAS가 동반된 ACI에서 진단 및 예후적 가치를 가집니다.

공개 사항

본 연구는 ‘뇌졸중 예방 및 치료 기술 연구’(No. WKZX2023CZ0143)의 지원을 받아 수행되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
3.0T MRI 스캐너Siemens Healthineers, 독일MAGNETOM Skyra급성 뇌경색 확진을 위한 뇌 영상 촬영
96-웰 ELISA 마이크로플레이트Shenzhen Xinbosheng Biological Co., Ltd., ChinaXBS-PLATEELISA 검출을 위한 항원-항체 반응
수면 관련 호흡 장애에 관한 AASM 임상 진료 지침미국수면의학회2020 전체 가이드라인표준화된 AHI 진단 및 OSAS 중증도 층화 기준
캘거리 수면 무호흡증 삶의 질 지수(SAQLI) 중국어 타당도 검증 버전캘거리 대학교2021년 번역판폐쇄성 수면 무호흡증(OSAS)이 동반된 뇌경색(ACI) 환자의 삶의 질 평가
EDTA-K2 5 mL 진공 채혈관BD Biosciences, USA367863혈청 분리를 위한 말초 정맥혈 채혈
에프워스 졸음 척도(ESS) 중국어 검증 버전존스 홉킨스 대학교2018년 개정판뇌졸중 환자의 주간 졸음 평가
GraphPad Prism 9GraphPad Software, USA버전 9.4.1산점도, 박스플롯, ROC 곡선 시각화
인간 CRP ELISA 키트Shenzhen Xinbosheng Biological Co., Ltd., 중국 선전XBS-H001혈청 C-반응성 단백질의 정량적 검출
인간 HIF-1α ELISA 키트Shenzhen Xinbosheng Biological Co., Ltd., 중국 선전XBS-H007혈청 저산소 유도 인자-1의 정량적 검출α
인간 TNF-α ELISA 키트Shenzhen Xinbosheng Biological Co., Ltd., 중국 선전XBS-H003혈청 TNF-α의 정량적 검출α 염증 인자
IBM SPSS Statistics 23.0IBM, Armonk, NY, USA버전 23.0모든 통계 분석(t-검정, 상관관계, ROC, Kaplan-Meier 분석)은–마이어-콕스 회귀 분석(Meier, Cox regression)
마이크로플레이트 분광광도계Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)Multiskan FC450 nm에서 ELISA 플레이트의 흡광도 측정
miR-486-3p & U6 qPCR 프라이머Sangon Biotech, 중국 상하이맞춤형 합성qPCR을 위한 표적 및 참조 유전자 증폭
miScript SYBR Green PCR KitQiagen GmbH, Hilden, Germany218073miR-486-3p 및 U6의 실시간 정량 PCR 증폭
미국 국립보건원 뇌졸중 척도(NIHSS) 중국어 검증판미국 국립신경질환뇌졸중연구소 (NINDS)표준 임상판ACI 환자를 위한 기저 신경학적 중증도 평가
PSG 수면 판독 소프트웨어BMC Medical Co., Ltd., 중국v3.2수면 호흡 사건의 자동 예비 판독
QuantStudio 6 Pro 실시간 PCR 시스템Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)QuantStudio 6 ProRT-qPCR 증폭, 융해 곡선 획득, Ct 값 기록
QuantStudio 실시간 PCR 소프트웨어Applied Biosystems, USAv1.7qPCR 원시 데이터 내보내기, Ct 값 분석
냉장 벤치탑 원심분리기Xiangyi Centrifuge Instrument Co., Ltd., 중국 후난성TDZ5-WS전혈로부터의 혈청 분리 (2700 × g, 4 °C)
RevertAid RT 역전사 키트Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAK1691혈청 miRNA의 cDNA 역전사
RNase-free 1.5 mL 마이크로원심분리관Axygen, USAMCT-150-C분리된 혈청의 소분 및 보관
TRIzol RNA 분리 시약Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA15596026인체 혈청 샘플에서의 총 RNA 추출
초저온 냉동고Haier Biomedical, 중국 산둥성DW-86L388장기간 혈청 시료 보관 조건 −80 °C
YH-600B 수면다원검사 장치BMC Medical Co., Ltd., 중국 베이징YH-600B폐쇄성 수면 무호흡증(OSAS) 진단을 위한 야간 수면 모니터링 및 무호흡-저호흡 지수(AHI) 계산

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