본 프로토콜은 가스크로마토그래피-텐덤 질량분석법을 이용한 농경지 토양 내 유기인계 농약의 다성분 분석을 위해, 마그네슘 실리케이트 흡착제 기반의 분산 고상 추출 정제법을 적용하여 변형된 Quick-Easy-Cheap-Effective-Rugged-Safe (QuEChERS) 방법을 설명합니다. 이 방법은 공동 추출 제거를 개선하고 매트릭스 관련 분석 간섭을 최소화하여 신뢰할 수 있는 미량 정량을 지원합니다.
방법 논문
가스크로마토그래피-텐덤 질량분석법을 이용한 농경지 토양 내 유기인계 농약 분석을 위한 변형 QuEChERS법
이 논문에서
요약
초록
가스 크로마토그래피-텐덤 질량 분석법(GC-MS/MS)을 이용한 농경지 토양 내 유기인계 농약(OPP) 잔류물의 정확한 정량은 함께 추출된 유기물, 휴믹 물질 및 광물 관련 간섭 물질로 인한 매질 유도 신호 효과로 인해 종종 어려움을 겪습니다. 기존의 Quick-Easy-Cheap-Effective-Rugged-Safe (QuEChERS) 정제 전략으로는 복잡한 토양 추출물에서 매질 성분을 충분히 제거하지 못해 분석 성능이 저하될 수 있습니다. 본 연구에서는 GC-MS/MS를 이용해 농경지 토양 내 12종의 OPP를 동시에 정량하기 위해, 혼합 흡착제 분산 고체상 추출(dSPE) 정제 단계에 흡착제를 통합한 수정된 QuEChERS 프로토콜을 제시합니다. 다양한 토양 특성을 가진 6종의 농경지 토양을 대상으로 7가지 dSPE 흡착제 조합을 평가하였습니다. 공동 추출물의 제거 정도를 중량 분석법으로 정량화한 결과, 1차-2차 아민, 옥타데실실란 및 마그네슘 실리케이트 흡착제 조합(각 50 mg, 무수 황산마그네슘 150 mg 포함)에서 가장 높은 평균 공동 추출물 제거율(88%)을 나타냈습니다. 매질 효과를 최소화하기 위해 에틸글리세롤, L-gulonic acid γ-lactone, D-sorbitol 및 shikimic acid로 구성된 분석물 보호제를 최종 추출물에 첨가하였으며, 매질 일치 검량선을 통해 토양별 신호 변동을 보정하였습니다. Chlorpyrifos-methyl-d10과 triphenyl phosphate를 각각 실험 절차 및 주입 내부 표준물질로 사용하였습니다. 매질 일치 검량선(5–600 µg/kg)은 대부분의 분석물-토양 조합에서 결정 계수 ≥0.9933으로 우수한 선형성을 보였습니다. 선형성 평가에는 검출 한계(5 µg/kg)가 사용되었으며, 방법 정량 한계는 검증된 최저 수준인 50 µg/kg으로 설정되었습니다. 세 가지 회수 수준(50, 200, 400 µg/kg, 수준당 n = 5)에서 평가한 정확도와 정밀도는 대부분의 분석물-토양 조합에서 회수율 70%~120%, 상대 표준 편차 ≤20%를 나타내어 SANTE/2020/12830 (Rev.2) 성능 기준을 충족하였습니다. 낮은 회수율은 일부 토양 매질의 fenamiphos, pirimiphos-ethyl 및 ethion에서만 관찰되었습니다. 이러한 결과는 마그네슘 실리케이트 흡착제가 공동 추출물을 감소시켜 dSPE 정제 효율을 향상시키며, 분석물 보호제 및 매질 일치 검량선과의 조합을 통해 복잡한 토양 매질 내 OPP의 신뢰성 있는 다성분 잔류 정량이 가능함을 입증합니다.
서론
유기인계 살충제(OPPs)는 작물 보호에 있어 광범위한 효능과 다용성을 갖추고 있어 전 세계적으로 가장 널리 사용되는 농약 부류 중 하나로 남아 있습니다1. 많은 유기인계 살충제가 유기염소계 살충제보다 더 빠르게 환경적으로 분해되지만, 이러한 화합물을 광범위하고 반복적으로 살포함에 따라 농경지 토양에 지속적으로 잔류하게 됩니다2. 토양은 살충제가 투입되는 주요 환경 구획으로 작용하며, 이곳에서 잔류물이 작물, 지표수, 지하수 및 주변 생태계로 전이될 수 있는 일시적인 저장소 역할을 할 수 있습니다3. 유기인계 살충제 잔류물의 존재는 이러한 화합물이 아세틸콜린에스테라아제 활성 억제를 통해 인간에게 신경독성 효과를 유발할 뿐만 아니라, 비표적 생물, 토양 미생물 군집 및 생태계 기능에 부정적인 영향을 미치기 때문에 우려 사항이 됩니다2. 따라서 농경지 토양 내 유기인계 살충제 잔류물의 발생은 먹이 사슬 및 수계 경로를 통해 생물 다양성 감소, 생태적 불균형 및 환경 노출의 원인이 될 수 있습니다3. 따라서 유기인계 살충제 잔류물을 신뢰성 있게 정량하는 것은 고품질의 발생 데이터를 생성하고, 환경 노출 평가를 지원하며, 다양한 농업 조건에서 유기인계 살충제의 환경적 거동에 대한 이해를 높이는 데 필수적입니다. 더욱이, 단일 토양 유형을 사용하여 개발 및 최적화된 분석법은 물리화학적 특성이 상반되는 토양에 적용했을 때 반드시 동일한 성능을 제공하는 것은 아니므로4,5, 다양한 농업 환경 전반에 걸쳐 분석법의 적용 가능성을 평가하는 것이 중요합니다. 그러나 농경지 토양은 물리화학적 변동성이 매우 커서 추출 효율, 매트릭스 효과(MEs) 및 전반적인 분석 성능에 영향을 미치기 때문에, 미량 수준의 정량 분석은 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다6.
가스크로마토그래피-텐덤 질량분석법(GC-MS/MS)은 복잡한 매질 내 초미량 수준의 유기인계 살충제(OPPs) 다성분 분석을 위한 표준 분석 기술로 널리 인정받고 있습니다7,8. 그럼에도 불구하고, 정확한 정량 분석은 기기 성능뿐만 아니라 시료 전처리 효율에 따라 결정됩니다. 토양 추출물에는 일반적으로 표적 분석물과 함께 크로마토그래피 시스템으로 유입되는 공추출 매질 성분들이 포함되어 있으며, 이는 신호 억제 또는 증강을 통해 분석물의 응답을 변화시킬 수 있습니다4,5,6. 이러한 효과의 정도는 토양마다 상당히 다르며, 유기물 함량, 점토 분율, 광물 조성 및 pH와 같은 요인의 영향을 받습니다. 결과적으로, 매질 효과(MEs)는 GC-MS/MS 기반 살충제 분석에서 분석 불확실성의 주요 원인 중 하나이며, 분석물의 회수율을 유지하면서 공추출물 부하를 줄일 수 있는 정제 전략의 필요성을 강조합니다5,9,10. 또한, 신뢰할 수 있는 잔류물 데이터를 생성하려면 분석법의 정확성, 연구 간 비교 가능성 및 환경 모니터링 응용 분야에 대한 적합성을 보장하기 위해 국제적으로 인정되는 분석 성능 기준을 준수해야 합니다11.
Quick-Easy-Cheap-Effective-Rugged-Safe (QuEChERS) 방법은 간단한 절차, 적은 용매 소비량, 그리고 농산물 매트릭스 전반에 걸친 폭넓은 적용성 덕분에 다성분 잔류 농약 분석을 위한 가장 널리 사용되는 시료 전처리 접근법이 되었습니다4,12,13. 모듈식의 유연한 설계 덕분에 다양한 시료 유형과 분석 응용 분야에 걸쳐 광범위한 최적화가 가능했으며, 이는 현대의 다성분 분석에서 광범위하게 채택되고 용매 소비 감소 및 전처리 간소화로 인해 지속 가능한 분석 화학과 빈번하게 연관되는 계기가 되었습니다. 이러한 적응성 덕분에 특정 매트릭스 특성에 따라 추출 및 정제 조건을 선택하여 방법을 맞춤 설정할 수 있습니다. 토양 분석에서는 분산 고상 추출(dSPE) 정제 단계의 효율성이 매우 중요한데, 이는 함께 추출된 매트릭스 성분이 충분히 제거되지 않을 경우 후속 GC-MS/MS 분석의 분석 성능에 부정적인 영향을 미칠 수 있기 때문입니다4,14. 1차-2차 아민(PSA) 및 옥타데실실란(C18) 기반의 기존 흡착제 조합은 극성 휴믹 성분의 제거 능력이 제한적인 경우가 많으며, 이러한 성분들은 농경지 토양 추출물에서 매트릭스 유도 신호 효과를 일으키는 주요 원인 중 하나입니다14. 넓은 극성 범위의 화합물에 대한 친화력을 가진 마그네슘 실리케이트 흡착제인 Florisil은 식품 및 식물 매트릭스에서 유망한 정제 성능을 보여주었습니다15,16. 그러나 농경지 토양을 위한 혼합 흡착제 dSPE 정제 전략에서 Florisil의 기여도는, 특히 다양한 물리화학적 특성을 나타내는 토양 환경에서 여전히 충분히 규명되지 않은 상태입니다17,18,19,20,21.
본 연구에서는 pH, 유기물 함량 및 토성이 다양한 6종의 농경지 토양을 대상으로 7가지 dSPE 흡착제 조합을 평가한 수정된 QuEChERS 프로토콜을 제시합니다. 본 연구는 혼합 흡착제 dSPE 정제 과정에 규산마그네슘 흡착제를 포함하면 농경지 토양 추출물에서 함께 추출된 매트릭스 성분의 제거 효율이 향상될 것이라는 가설을 바탕으로 수행되었습니다. 흡착제 선정은 공추출물 제거에 대한 중량 분석 평가를 기반으로 하였으며, 평균 정제 효율이 가장 높은 조합을 선정하여 이후 전체 분석 밸리데이션을 실시하였습니다. 최적화된 절차는 내부 표준법, 매트릭스 일치 검량선법 및 GC-MS/MS를 사용하여 12종의 OPPs를 동시에 정량 분석함으로써 검증되었습니다. 또한, 잔류 매트릭스로 인한 신호 영향을 최소화하기 위한 보완 전략으로 분석물 보호제(ethylglycerol, L-gulonic acid γ-lactone, D-sorbitol 및 shikimic acid)를 최종 프로토콜에 포함하였습니다. 물리화학적 특성이 서로 다른 토양들에 대해 체계적인 정제 최적화와 종합적인 분석 밸리데이션을 통합함으로써, 본 프로토콜은 불균질한 농경지 토양 내 농약 잔류물 분석을 용이하게 하는 강건하고 재현성 있는 워크플로우를 제공합니다.
프로토콜
dSPE 정제 절차의 실험적 최적화, 매트릭스 효과 데이터 세트, 그리고 6가지 농경토의 물리화학적 특성 분석의 근거가 되는 소스 데이터는 Zenodo에 저장되었으며 DOI: 10.5281/zenodo.21644870에서 공개적으로 이용 가능합니다. 사용된 시약 및 장비에 대한 상세 내용은 재료 표(Table of Materials)에 기재되어 있습니다.
1. 토양 샘플링 및 준비
참고: 개인의 안전을 위해 본 프로토콜 전 과정 동안 실험복, 보호 안경 및 니트릴 장갑을 착용할 것을 권장합니다.
- 선정된 각 농업 지점의 상층(0–10cm)에서 8개의 개별 부표본을 수집하여 혼합함으로써 벌크 복합 토양 시료를 채취하십시오. ~을 통해 정사각형 격자 체계적 표집 설계22.
참고: 8지점 격자 설계는 약 1000m² 규모의 부지에 대한 뉴사우스웨일스 환경보호국(NSW EPA)의 권고 사항을 준수합니다.2 (0.1 ha)22. - 현장에서 이 하위 시료들을 결합하여 충분히 혼합함으로써 지점당 하나의 대표 벌크 시료(≥500 g)를 생성하고, 분석법 성능 평가를 위한 균질화된 매트릭스 기선(baseline)을 설정하십시오.
참고: 여기서 혼합 시료 채취(Composite sampling)는 방법 최적화 및 검증을 위해 매질 배경 효과를 표준화하려는 목적으로만 활용됩니다. 미지의 오염 지역 또는 실제 오염 토양 평가를 위한 규제 프레임워크 하에서는 화학적 희석 위험으로 인해 NSW EPA에서 혼합 시료 채취를 엄격히 제한하고 있습니다.22실제 부지 특성 분석이나 핫스팟 검출을 위해서는, 위음성을 방지하고 공간적 분산 데이터를 보존하기 위해 그리드 노드의 시료들을 개별적으로 유지하고 각각 분석해야 합니다. - 토양 시료를 밀폐된 갈색 유리 용기에 담아 차광 상태로 실험실까지 운반하십시오.
참고: 소수성 또는 반휘발성 유기인계 살충제(OPPs)가 플라스틱 표면에 흡착되어 손실되는 것을 최소화하고, 오염 물질의 용출이나 폴리머-분석물 간의 상호작용 위험을 줄이기 위해 폴리에틸렌 백보다 유리 용기 사용이 권장됩니다. 암소 조건은 운송 중 빛에 민감한 화합물의 광분해를 최소화합니다. - 직사광선이 없는 상온에서 시료의 무게가 일정해질 때까지 공기 건조하십시오.
참고: 풍건(Air-drying)은 토양 수분 함량을 표준화하고 결과를 건조 중량 기준으로 보고하여, 서로 다른 천연 수분 함량을 가진 시료 간의 비교 가능성을 높이기 위해 적용됩니다. 열에 불안정하거나 반휘발성인 유기인계 살충제(OPP)의 손실 및 토양 유기물 구조와 흡착 특성의 변화를 방지하기 위해 강제 오븐 건조는 피합니다. - 토양 덩어리를 수동으로 부순 후 2 mm 스테인리스강 망으로 체질하십시오. 균질화된 토양은 밀폐된 갈색 유리 용기에 담아 암소 및 냉장 조건인 다음 온도에서 보관하십시오. 4 °C 추출 전까지.
참고: 본 연구에 사용된 6가지 토양의 물리화학적 특성은 이전의 정기 토양 분석 데이터를 통해 확보하였다. 이 데이터는 넓은 범위의 pH(토양:H2O, 1:2)23, 유기물 함량 (Walkley-Black법)24, 그리고 토성(Bouyoucos법)25 방법 평가를 위해.
2. 시약, 표준 물질 및 내부 표준 용액의 조제
참고: 별도로 명시되지 않는 한, 개별 농약 스톡 용액, 혼합 작업 표준 용액, 절차 내표준물질(P-IS) 및 주입 내표준물질(I-IS) 용액, 회수 용액, 검정 표준 용액은 10 mL 용량 플라스크에서 조제하여 갈색 유리 바이알에 옮긴 후 사용 시까지 −20 °C에서 보관합니다. 매트릭스 일치 검정, 분석물 보호제, P-IS 및 I-IS는 각각 분석 가변성의 서로 다른 원인을 해결하여 복잡한 토양 매트릭스에서의 정량 분석 견고성을 향상시키기 위해 도입되었습니다.
- 12종의 상용 OPP 표준품(재료 표 참조) 각각을 톨루엔에서 1000 mg/L 농도의 개별 스톡 용액으로 준비합니다.
- 개별 스톡 용액을 적절한 부피로 혼합하여 아세토니트릴(ACN) 내 400 mg/L 농도의 혼합 작업 표준 용액을 준비합니다.
참고: 이 혼합 작업 표준 용액은 이후 회수율 및 검정 용액 준비에 사용됩니다. - chlorpyrifos-methyl-d10을 ACN 내 750 mg/L 농도의 P-IS로 준비합니다. 분석 과정의 변동성을 모니터링하고 보정하기 위해 추출 단계(단계 3.2)에서 첨가합니다.
참고: Chlorpyrifos-methyl-d10은 동위원소 표지된 OPP로서, MS/MS로 쉽게 구별되면서도 표적 분석물과 유사한 물리화학적 거동을 보이기 때문에 P-IS로 선택되었습니다. - triphenyl phosphate를 ACN 내 1050 mg/L 농도의 I-IS로 준비합니다. 주입 변동성을 보정하기 위해 기기 분석 직전(단계 4.2.4)에 첨가합니다.
- 0.05% (v/v) 포름산을 첨가하여 산성화한 ACN 내에 스톡 회수 용액을 준비합니다. 이는 추출 전 5 g의 흑토에 300 µL를 첨가했을 때 OPP의 최종 토양 환산 농도가 50 µg/kg, 200 µg/kg, 400 µg/kg이 되도록 합니다. 200 µg/kg 시료 환산량에 해당하는 별도의 P-IS 용액을 준비합니다.
참고: 포름산을 이용한 산성화는 저장 중 OPP의 안정성을 향상시킵니다. - 0.05% (v/v) 포름산이 포함된 ACN 내에 12종의 OPP와 chlorpyrifos-methyl-d10을 포함하는 검정 용액을 준비합니다. 농도는 분석물의 경우 최종 토양 환산 농도 5, 10, 25, 75, 200, 400, 600 µg/kg에 해당하며, P-IS의 경우 200 µg/kg에 해당하도록 합니다.
참고: 이 용액들은 이후 각 토양 매질에 대한 매질 일치 검정 곡선을 작성하는 데 사용되며, 곡선은 가중치 없는 선형 회귀 분석으로 피팅되었습니다. 검출 한계(LOD)와 정량 한계(LOQ)는 SANTE/2020/12830 (Rev.2) 가이드라인 문서에 따라 정의되었습니다. LOD는 매질 내 최저 검정 수준으로 간주하였으며, LOQ는 허용 가능한 회수율과 정밀도를 입증한 최저 검증 농도 수준으로 정의하였습니다. - 0.1% 포름산으로 산성화한 ACN:water (1:1, v/v) 내에 ethylglycerol (100 g/L), L-gulonic acid γ-lactone (10 g/L), D-sorbitol (10 g/L), shikimic acid (5 g/L)로 구성된 분석물 보호제 혼합물을 준비합니다. −20 °C에서 보관합니다. ME 완화를 위해 기기 분석 직전(단계 4.2.4)에 첨가합니다.
3. QuEChERS 추출
- 공기 건조 및 체질한 토양 5.00 g ± 0.01 g을 50 mL 폴리프로필렌 원심 분리 튜브에 칭량합니다.
- 회수율 실험의 경우, P-IS 용액(단계 2.3에서 준비)과 적절한 회수 용액(단계 2.5에서 준비)을 첨가하여 chlorpyrifos-methyl-d10의 최종 농도는 200 µg/kg, 표적 OPPs의 최종 농도는 50, 200 또는 400 µg/kg이 되도록 합니다 (각 토양당 회수 수준별로 n = 5).
참고: 회수율 실험에서는 단계 3.2에 설명된 대로 추출 전에 P-IS와 살충제 회수 용액을 모두 첨가합니다. 토양 시료의 일상적인 분석에서는 시료 준비 및 분석 중의 절차적 가변성을 보정하기 위해 추출 전에 P-IS만 첨가합니다. 매질 일치 검정 추출물을 준비할 때는 추출 중에 P-IS나 살충제 표준품을 첨가하지 않습니다. 공시료 토양 추출물을 준비한 후, 정제 단계(단계 4.2.4 참조) 이후에 분석물과 P-IS가 모두 포함된 검정 표준품(단계 2.6에서 준비)을 첨가합니다. - 30초 동안 볼텍싱하고, 강화된 시료를 상온에서 10분 동안 평형 상태가 되도록 둡니다.
참고: 평형 기간은 추출 전 강화된 분석물과 토양 매질 간의 상호작용을 촉진하여 회수율 실험의 대표성을 향상시킵니다. - 탈이온수 10 mL를 첨가하고 30초 동안 수동으로 흔들어 토양 매질이 완전히 젖도록 합니다.
참고: 재수화는 토양 입자로부터의 분석물 탈착을 개선하고 추출 중 효율적인 분배를 용이하게 합니다. - 1% (v/v) 아세트산이 포함된 ACN 10 mL를 첨가합니다. 즉시 튜브 캡을 닫고 2분 동안 격렬하게 흔듭니다.
- 무수 황산마그네슘 (MgSO4) 6.0 g과 아세트산나트륨 1.5 g을 첨가하고, 즉시 튜브를 1분 동안 격렬하게 흔듭니다.
참고: 염 첨가 후 즉시 교반하는 것은 효율적인 상 분배를 보장하고 염 응집체의 형성을 방지하는 데 필수적입니다. - 1800 × g 에서 5분 동안 원심 분리합니다.
- 상층의 ACN 상을 깨끗한 튜브로 옮겨 후속 dSPE 정제를 수행합니다.
4. 분산 고상 추출 정제
참고: 이 섹션은 두 가지 접근 방식으로 구성됩니다. 먼저, 6가지 농경지의 토양 전반에 걸쳐 가장 높은 평균 공동 추출물 제거 효율을 제공하는 정제 조성을 확인하기 위해 7가지 dSPE 흡착제 조합을 평가했습니다. 이어서, 선정된 흡착제 조합을 유럽 위원회 보건 및 식품 안전 총국(DG SANTE) 가이드라인 문서 SANTE/2020/12830 (Rev.2)11에 따른 방법 검증을 위한 최적화된 정제 절차로 적용했습니다.
- dSPE 흡착제 조합의 최적화
참고: 중량 분석법을 이용한 공-추출물 제거가 최적화 기준으로 선택되었는데, 이는 분석 대상 물질에 관계없이 정제 효율을 측정할 수 있기 때문입니다. 평가된 흡착제 양은 QuEChERS 기반 dSPE 절차에서 널리 사용되는 일반적인 비율에 해당하며, 이를 통해 제안된 프로토콜이 일반 분석 실험실에서 쉽게 도입될 수 있도록 하였습니다.- 다음의 흡착제 조합을 포함하는 2 mL 마이크로원심분리관을 준비합니다: (i) 150 mg 무수 MgSO4 + 50 mg PSA; (ii) 150 mg 무수 MgSO4 + 50 mg C18; (iii) 150 mg 무수 MgSO4 + 50 mg 규산마그네슘 흡착제; (iv) 150 mg 무수 MgSO4 + 50 mg PSA + 50 mg C18; (v) 150 mg 무수 MgSO4 + 50 mg PSA + 50 mg 규산마그네슘 흡착제; (vi) 150 mg 무수 MgSO4 + 50 mg C18 + 50 mg 규산마그네슘 흡착제; (vii) 150 mg 무수 MgSO4 + 50 mg PSA + 50 mg C18 + 50 mg 규산마그네슘 흡착제.
- 단계 3.8에서 얻은 추출액 1.0 mL를 각 dSPE 튜브에 옮깁니다.
참고: 각 토양에 대해 모든 흡착제 평가를 3회 반복 수행합니다. 비교에 사용되는 분취액은 동일한 추출액에서 얻어야 하며, 이를 통해 공-추출물 제거의 차이가 전적으로 정제 조성에 의한 것임을 보장해야 합니다. - 1분 동안 볼텍싱하고 1800 × g에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 정제된 각 추출액 1.0 mL를 미리 건조하고 무게를 잰 유리 시험관에 옮깁니다. 40 °C에서 약한 질소 기류 하에 용매를 완전히 증발시킵니다.
- 시험관을 데시케이터에서 실온으로 식힌 후, 남은 잔류물의 질량을 측정합니다. 용매 증발 후의 최종 무게에서 빈 시험관의 초기 무게를 빼서 공-추출물의 질량을 계산합니다.
- dSPE 정제를 거치지 않은 추출액의 동일한 분취액을 동일한 조건에서 증발시켜, dSPE 정제 전 추출액에 존재하는 공-추출물의 양을 결정합니다.
- 식 126에 따라 공-추출물 제거율을 계산합니다:
- 각 흡착제 조합과 토양에 대해 3회 반복 측정값으로부터 평균 공-추출물 제거율을 계산합니다. 그런 다음, 각 흡착제 조합에 대해 6가지 농경지 토양 전체의 평균 제거율을 계산합니다.
- 흡착제 조합을 처리 요인으로, 토양 매질을 블록 요인으로 하는 랜덤화 완전 블록 설계(RCBD) 하에서 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 흡착제 조합 간의 차이를 평가합니다. ANOVA 수행 전, 각각 Shapiro-Wilk 검정과 Levene 검정을 사용하여 잔차의 정규성과 분산의 균일성을 평가합니다. 유의 수준 α = 0.05에서 Tukey's HSD 검정을 사용하여 사후 쌍별 비교를 수행합니다.
- 통계 분석 결과와 전체 평균 공-추출물 제거율의 종합적인 평가를 바탕으로 정제 조성을 선택합니다.
참고: 공-추출물 부하를 줄이면 크로마토그래피 시스템으로 유입되는 매질 성분이 최소화되어 크로마토그래피 성능이 향상되고, GC-MS/MS 시스템의 오염이 줄어들며, 기기 유지보수 요구 사항이 낮아집니다.
참고: PSA, C18 및 규산마그네슘 흡착제(각 50 mg, 무수 MgSO4 150 mg 포함) 조합이 가장 높은 평균 공-추출물 제거율을 나타내어, 이후의 모든 분석을 위한 최적화된 정제 절차로 선택되었습니다.
- 최적화된 dSPE 정제 절차의 적용
- 단계 3.8에서 얻은 추출액 1.0 mL를 무수 MgSO4 150 mg, PSA 50 mg, C18 50 mg 및 규산마그네슘 흡착제 50 mg이 포함된 2 mL 마이크로원심분리관에 옮깁니다.
- 추출액과 흡착제가 완전히 상호작용하도록 1분 동안 볼텍싱합니다.
- 1800 × g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 정제된 상층액 200 µL를 오토샘플러 바이알에 옮기고, 단계 2.7에서 준비한 분석 물질 보호제 혼합물 20 µL와 단계 2.4에서 준비한 트리페닐 포스페이트 용액 50 µL를 추가합니다. 기기 분석 전 충분히 혼합합니다.
참고: 매질 일치 검정(matrix-matched calibration)을 위해, 살충제나 P-IS를 첨가하지 않고 단계 3 및 4.2에 기술된 추출 및 정제 절차에 따라 각 토양에서 공-추출액(blank extract)을 준비합니다. 정제 후, 정제된 공-추출액 200 µL를 7개의 개별 오토샘플러 바이알에 옮기고, 단계 2.6에서 준비한 검정 용액을 추가하여 분석 물질의 최종 농도가 5, 10, 25, 75, 200, 400, 600 µg/kg이 되고 P-IS의 농도가 200 µg/kg이 되도록 합니다. 단계 4.2.4에 설명된 대로 각 바이알에 분석 물질 보호제 혼합물 20 µL와 트리페닐 포스페이트 50 µL를 추가하면 최종 바이알 부피는 270 µL가 됩니다. 각 토양 매질에 대해 독립적인 매질 일치 검정 곡선을 작성합니다. 토양 환산 농도는 원래의 5 g 토양 시료에서 얻은 추출액을 나타내는 정제된 추출액 200 µL 분취액을 기준으로 합니다. 이후 분석 물질 보호제와 I-IS를 추가하면 최종 바이알 부피는 증가하지만, 추출액 분취액이 나타내는 토양의 양은 변하지 않습니다. 용매 기반 검정의 경우, 정제된 토양 추출액 200 µL 대신 ACN 200 µL를 사용하며, 매질 일치 검정에 사용된 것과 동일한 분석 물질 농도, P-IS 농도, I-IS 농도 및 분석 물질 보호제 혼합물을 사용하여 검정 바이알을 준비합니다. 이 용매 기반 검정 곡선은 이후 ME 평가에 사용됩니다. - GC-MS/MS 시스템을 사용하여 기기 분석을 수행합니다.
5. GC-MS/MS 분석 및 데이터 획득
참고: GC-MS/MS 구성 및 데이터 수집 절차에 대한 자세한 설명은 Varela-Martínez 등의 문헌27에서 확인할 수 있습니다. 주요 크로마토그래피 및 질량 분석 파라미터는 아래에 요약되어 있습니다.
- 트리플 쿼드러폴 질량 분석계, -70 eV에서 작동하는 전자 이온화(EI)원 및 자동 시료 주입기가 장착된 GC-MS/MS 시스템을 사용하십시오.
- 저극성 융합 실리카 모세관 컬럼(30 m × 0.25 mm 내경 × 0.25 µm 박막 두께) 및 헬륨을 운반 가스로 사용하여 1.2 mL/min의 일정 유량으로 공급한다.
- 분석 전, 운반 가스 공급, 진공 시스템 성능, 시린지 상태 및 오토샘플러 세척 용매 잔량을 포함하여 기기의 준비 상태를 확인하십시오. 제조사의 권장 사항에 따라 기기 튜닝을 수행하십시오.
주의: 분석 시퀀스를 시작하기 전에 작동 진공도가 기기 제조사에서 권장하는 사양을 충족하는지 확인하십시오. - GC 오븐 온도 프로그램을 다음과 같이 설정하십시오: 초기 온도는 50 °C 1분 동안; ~까지 증가시키십시오. 180 °C ~에서 25 °C/분; 이후 다음으로 230 °C ~에, ~에서 5 °C/분; 그리고 마지막으로 290 °C ~에서 25 °C/분. 최종 온도를 6분 동안 유지합니다. 총 실행 시간은 24.6분입니다.
- 주입구 온도를 다음과 같이 설정하십시오. 250 °C 및 수행하십시오 1 µL splitless 모드로 주입합니다. 주입 1분 후에 split vent를 엽니다.
참고: 잔류 효과(carryover)를 최소화하기 위해, 각 주입 사이에 오토샘플러 시린지를 메탄올, 에틸아세테이트, ACN 순으로 세척하십시오. - MS 전송관 온도를 다음과 같이 설정하십시오. 250 °C 그리고 이온원 온도를 300 °C.
- 다음에 나열된 전구체-생성 이온 전이(precursor-product ion transitions)를 이용하여 다중 반응 모니터링(MRM) 모드로 데이터를 획득하십시오. 표 1.
- 각 토양 매질에 대해 조제된 매질 일치 검량선을 사용하여 분석물을 정량하십시오. 분석물의 피크 면적과 chlorpyrifos-methyl-d10의 피크 면적 간의 비율로부터 분석물 농도를 계산하십시오.
- 분석 시퀀스 전반에 걸쳐 주입 일관성을 검증하기 위해 트리페닐 포스페이트(triphenyl phosphate)를 내부 표준 물질(I-IS)로 사용하십시오.
- ~에 따라 측정 오차(MEs)를 계산하십시오. 식 228:
![기질 효과 공식, ME(%)=[Slope_matrix/Slope_solvent-1]x100, 분석 화학 공식.](/files/ftp_upload/72745/72745eq2.jpg "figure-protocol-2")
음수 값은 신호 억제를 나타내고 양수 값은 신호 증강을 나타냅니다.
참고: 전체 분석 워크플로의 개략적인 개요는 다음에서 제시됩니다. 그림 1.
결과
방법 평가를 위해 선정된 6가지 농경지는 pH(토양:H2O, 1:2) 값 4.67~7.31, 유기물 함량 0.18%~6.46%, 점토 함량 22.9%~48.5%를 포함하여 광범위한 토양 특성을 나타냈습니다(표 2 참조). 5가지 토양은 콜롬비아의 농업 지역에서, 1가지 토양은 스페인에서 채취되었습니다. pH, 유기물 함량 및 토성 등의 토양 특성이 농약 잔류 분석 중 공동 추출, 매트릭스 효과(MEs) 및 분석물 회수율에 영향을 미치는 것으로 알려져 있기 때문에, 서로 다른 토양 매질에서 제안된 정제 절차의 견고성을 평가하기 위해 이러한 다양성을 의도적으로 포함하였습니다.
공추출물 제거의 중량 분석법을 이용하여 7가지 dSPE 흡착제 조합을 평가하였다(그림 2 참조). 단일 흡착제 중에서는 Florisil이 가장 높은 평균 공추출물 제거율(71%)을 달성했으며, PSA(58%)와 C18(41%)이 그 뒤를 이었다. 마그네슘 실리케이트 흡착제는 S2에서 완전한 공추출물 제거(100%)를 달성했으며, S3(91%) 및 S4(91%)에서도 90% 이상의 값을 나타냈다. 반면, PSA는 토양 간의 변동성이 더 컸으며, 제거 효율은 S4의 21%부터 S6의 완전 제거까지 다양하게 나타났다. C18은 가장 낮고 변동성이 큰 성능을 보였으며, S1 및 S2의 0%에서 S4의 93%까지의 범위를 나타냈다. 혼합 흡착제 조합 중에서 PSA+Adsorbent는 80%의 평균 공추출물 제거율을 달성했다. PSA+Adsorbent 및 C18+Adsorbent 조합은 각각 73%와 74%로 더 낮은 평균 제거율을 보였다. PSA+C18 혼합물에 마그네슘 실리케이트 흡착제를 추가했을 때 평균 제거율은 88%로 더욱 증가했으며, 이는 평가된 모든 정제 구성 중 가장 높은 수치였다. PSA+C18+Adsorbent 조합은 6가지 토양 중 5가지에서 80% 이상의 제거율을 달성했으며, S2와 S6에서는 완전한 공추출물 제거를 이루었다. RCBD 하의 ANOVA를 이용한 통계 분석 결과, 흡착제 조합이 공추출물 제거에 유의미한 영향을 미치는 것으로 나타났다(p = 0.0432). Tukey's HSD 테스트를 통해 얻은 통계적 그룹화는 그림 2에 제시되어 있다.
표적 분석물의 예상 머무름 시간에서 간섭 크로마토그래피 피크가 나타나지 않음으로써 방법의 선택성이 입증되었습니다. 각 분석물과 토양 매질에 대해 5–600 µg/kg의 농도 범위에서 매질 일치 검정 곡선을 작성하였으며, LOD는 5 µg/kg였습니다 (Table 3 참조). 표적 분석물에 해당하는 머무름 시간에서 간섭 피크는 관찰되지 않았습니다. 대다수의 분석물-토양 조합에서 우수한 직선성이 얻어졌습니다. 결정 계수(R2)가 0.9933 미만인 검정 곡선은 단 3개뿐이었으며, 모두 fenamiphos에 해당하였는데, 각각 S1 (R2 = 0.9888), S3 (R2 = 0.9606) 및 용매 기반 검정 (R2 = 0.9871)에서 나타났습니다. ME와 관련하여, 6가지 토양의 평균값을 기준으로 (Figure 3 참조), 12가지 표적 OPP 중 10가지에서 신호 억제(ME < 0)가 관찰된 반면, 신호 증강(ME > 0)은 malathion (+3%)과 fenamiphos (+25%)에서만 관찰되었습니다. 대부분의 분석물은 낮은 ME를 보였으며, 평균 ME 값은 methidathion의 −25%와 parathion-methyl의 −23%에서 ethion의 −5%까지 나타났습니다. Fenamiphos는 가장 높은 평균 증강(+25%)을 보인 반면, malathion은 약간의 증강(+3%)만을 보였습니다. 개별 토양 수준에서는 S5의 pirimiphos-ethyl (−60%)과 S1의 parathion-methyl (−44%)에서 가장 강한 신호 억제가 관찰되었습니다. 대조적으로, fenamiphos는 6가지 토양 중 5가지에서 신호 증강을 나타내어 S2에서 최대 ME 값 +58%에 도달하였으며, malathion은 4가지 토양에서 증강을 보였고 S4에서 최대값 +16%를 기록하였습니다.
3가지 농축 수준에서 얻은 회수율 및 정밀도 결과가 표 4에 요약되어 있습니다. 가장 낮은 농축 수준은 목표 분석법의 LOQ인 50 µg/kg에 해당했습니다. 대부분의 분석물-토양 조합은 평균 회수율 70%에서 120% 사이, 상대 표준 편차(RSD) ≤ 20%로 SANTE/2020/12830 (Rev.2) 성능 기준11을 충족했습니다. Fenamiphos는 S1, S2 및 S4에서 70% 미만의 회수율을 보였습니다. Pirimiphos-ethyl은 S1 및 S6에서 70% 미만의 회수율을 보였으며, ethion은 S1에서 70% 미만의 회수율을 보였습니다. 나머지 분석물의 경우, 모든 토양 및 농축 수준에서 회수율이 일반적으로 허용 범위 내에 있었습니다. RSD 값은 대부분의 경우 20% 허용 기준 미만으로 유지되어, 평가된 농도 범위에서 만족스러운 분석법 정밀도를 입증했습니다.
그림 1: QuEChERS 추출, 최적화된 dSPE 정제 및 GC-MS/MS 분석을 이용한 농경지 토양 내 OPPs 정량 분석의 모식적 워크플로우.혼합 토양 시료는 산성 ACN 및 염석 분배법을 이용한 QuEChERS 추출 전에 전처리(균질화, 풍건 및 체질) 과정을 거쳤습니다. 정제 단계의 최적화를 위해 7가지 dSPE 흡착제 조합을 중량법으로 평가하였으며, 선택된 혼합물(150 mg MgSO4 + 50 mg PSA + 50 mg C18 + 50 mg 규산마그네슘 흡착제)을 방법 검증에 사용하였습니다. 최종 추출물은 분석물 보호제와 I-IS를 사용하여 GC-MS/MS로 분석하였습니다. 12종의 OPPs에 대한 방법 성능은 P-IS를 사용하여 매트릭스 일치 검정 곡선, ME, 회수율 및 정밀도로 평가하였습니다. 약어: QuEChERS = Quick-Easy-Cheap-Effective-Rugged-Safe; ACN = 아세토니트릴; PSA = 1차-2차 아민; C18 = 옥타데실실란; dSPE = 분산 고체상 추출; I-IS = 주입 내부 표준물질; GC-MS/MS = 가스 크로마토그래피-텐덤 질량 분석법; MRM = 다중 반응 모니터링; OPPs = 유기인계 농약; P-IS = 절차 내부 표준물질. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
그림 2: 6가지 농경지 토양(S1–S6)에서 7가지 dSPE 흡착제 조합으로 달성한 공추출 제거 효율. 공추출 제거 효율은 QuEChERS 추출 및 dSPE 정제 후 중량법으로 측정하였다. PSA, C18, 마그네슘 실리케이트 흡착제, PSA+C18, PSA+흡착제, C18+흡착제, PSA+C18+흡착제의 7가지 흡착제 조합을 평가하였다(각 50 mg, 무수 MgSO4 150 mg 포함). 제거 백분율은 식 1에 따라 처리하지 않은 추출물 대비로 계산하였다. 값은 각 토양 매질에 대한 3회 반복 측정값의 평균을 나타내며, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. S1: Villavicencio (Meta, 콜롬비아); S2: Sabana Bogotá (Cundinamarca, 콜롬비아); S3: Floresta (Boyacá, 콜롬비아); S4: Guasca (Cundinamarca, 콜롬비아); S5: Santa Rosa de Viterbo (Boyacá, 콜롬비아); S6: La Laguna (Canarias, 스페인). 각 흡착제 조합 위의 서로 다른 소문자는 RCBD 하의 ANOVA 및 이후 Tukey´s HSD 검정(p < 0.05)에 따라 처리 평균 간에 통계적으로 유의미한 차이가 있음을 나타낸다. 통계적 비교는 6가지 토양 매질 전체의 처리 평균을 사용하여 수행하였다. 약어: PSA = primary-secondary amine; C18 = octadecylsilane. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 36가지 토양 매질(S1~S6)에 대한 12종의 OPPs의 매트릭스 효과(ME%) 히트맵. ME는 식 2에 따라 매트릭스와 용매 검정 곡선 기울기 간의 상대적 차이로 계산되었습니다. 양수 값은 신호 증강(빨간색)을 나타내며, 음수 값은 신호 억제(파란색)를 나타냅니다. 약어: OPPs = 유기인계 살충제; IS = 내부 표준물질; OM = 유기물. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
| 분석물 | tR (min) | 정량 이온 (m/z) | CE (V) | 정성 이온 1 (m/z) | CE (V) | 정성 이온 2 (m/z) | CE (V) | ||
| Chlorpyrifos-methyl | 11.720 | 288 286 | 5 | 28693 | 25 | 286125 | 25 | ||
| Parathion-methyl | 11.868 | 263109 | 15 | 10979 | 10 | 263125 | 10 | ||
| Tolclofos-methyl | 11.915 | 265250 | 15 | 267265 | 5 | 265125 | 5 | ||
| Pirimiphos-methyl | 12.431 | 290233 | 10 | 305290 | 10 | 290276 | 10 | ||
| Fenitrothion | 12.526 | 277260 | 5 | 277109 | 20 | 125109 | 15 | ||
| Malathion | 12.727 | 12799 | 5 | 173127 | 5 | 12593 | 5 | ||
| Chlorpyrifos | 12.976 | 314258 | 15 | 199171 | 15 | 19797 | 15 | ||
| Fenthion | 13.083 | 278109 | 20 | 278169 | 20 | 278245 | 10 | ||
| Pirimiphos-ethyl | 13.571 | 333168 | 25 | 333318 | 10 | 318180 | 10 | ||
| Methidathion | 14.856 | 14585 | 10 | 14558 | 15 | 14593 | 10 | ||
| Fenamiphos | 15.519 | 303288 | 10 | 303154 | 20 | 303217 | 10 | ||
| Ethion | 16.148 | 153125 | 10 | 153125 | 5 | 231153 | 5 | ||
| Chlorpyrifos-methyl-d10 (P-IS) | 12.862 | 324260 | 25 | 324195 | 25 | 324292 | 10 | ||
| Triphenyl phosphate (I-IS) | 18.187 | 326325 | 5 | 326169 | 25 | 326215 | 25 | ||
표 1: 12종의 표적 OPP, chlorpyrifos-methyl-d10 (P-IS) 및 triphenyl phosphate (I-IS)에 대한 GC-MS/MS 분석 시 머무름 시간, 정량 전이, 정성 전이 및 충돌 에너지. 약어: GC-MS/MS = 가스 크로마토그래피-텐덤 질량 분석법; OPPs = 유기인계 살충제; P-IS = 실험 절차 내부 표준물질; I-IS = 주입 내부 표준물질; tR = 머무름 시간; CE (V) = 충돌 에너지 (볼트); m/z = 질량 대 전하비. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
| 토양 | 기원 | 토양 pH:H2O (1:2) | 유기물 함량 (%) | 점토 (%) | 토성 분류 |
| S1 | 빌라비센시오(콜롬비아, 메타) | 5.51 | 0.18 | 48.5 | 점토 |
| S2 | 사바나 보고타 (콜롬비아, 쿤디나마르카) | 4.67 | 1.04 | 37.4 | 식양토 |
| S3 | 플로레스타 (콜롬비아, 보야카) | 5.53 | 1.71 | 28.2 | 식양토 |
| S4 | 과스카 (콜롬비아, 쿤디나마르카) | 4.89 | 6.46 | 22.9 | 사질양토 |
| S5 | 산타 로사 데 비테르보 (콜롬비아, 보야카) | 4.76 | 2.74 | 27.5 | 사질점토양 |
| S6 | 라 라구나(스페인 카나리아 제도) | 7.31 | 1.27 | 39.6 | 식양토 |
표 2: 방법 평가에 사용된 6가지 농경지 토양(S1–S6)의 기원 및 물리화학적 특성. 데이터에는 pH(토양:H2O, 1:2), 유기물 함량(Walkley–Black법), 점토 분율(Bouyoucos법) 및 토성 분류가 포함됩니다. 방법 평가를 위해 광범위한 물리화학적 조건을 보장할 수 있도록 다양한 토양을 선정하였습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
| 분석물 | 시료 | 범위 (µg/kg) | b ± sb·t(0.05;7) | a ± sa·t(0.05;7) | sy/x | R² | ME (%) | ||
| 클로르피리포스-메틸 | 토양 1 | 5–600 | 1.50·10⁻² ± 1.75·10⁻⁴ | 2.39·10⁻² ± 5.02·10⁻² | 3.61·10⁻² | 0.9999 | -22 | ||
| 토양 2 | 5–600 | 1.68·10⁻² ± 3.21·10⁻⁴ | 8.31·10⁻³ ± 9.20·10⁻² | 6.62·10⁻² | 0.9997 | -13 | |||
| 토양 3 | 5–600 | 1.83·10⁻² ± 5.62·10⁻⁴ | −6.60·10⁻² ± 1.61·10⁻¹ | 1.26·10⁻¹ | 0.9991 | -5 | |||
| 토양 4 | 5–600 | 1.72·10⁻² ± 1.59·10⁻⁴ | −2.40·10⁻² ± 4.56·10⁻² | 3.54·10⁻² | 0.9999 | -11 | |||
| 토양 5 | 5–600 | 1.66·10⁻² ± 9.51·10⁻⁴ | −6.65·10⁻² ± 2.71·10⁻¹ | 2.09·10⁻¹ | 0.9975 | -14 | |||
| 토양 6 | 5–600 | 1.62·10⁻² ± 2.28·10⁻⁴ | 1.15·10⁻² ± 6.52·10⁻² | 4.99·10⁻² | 0.9998 | -16 | |||
| 용매 | 5–600 | 1.93·10⁻² ± 1.19·10⁻³ | −1.23·10⁻¹ ± 3.41·10⁻¹ | 2.46·10⁻¹ | 0.9971 | — | |||
| 파라티온-메틸 | 토양 1 | 5–600 | 3.80·10⁻³ ± 1.42·10⁻⁴ | −3.10·10⁻² ± 4.05·10⁻² | 2.92·10⁻² | 0.9989 | -44 | ||
| 토양 2 | 5–600 | 5.16·10⁻³ ± 1.70·10⁻⁴ | −3.24·10⁻² ± 4.86·10⁻² | 3.50·10⁻² | 0.9992 | -24 | |||
| 토양 3 | 5–600 | 5.27·10⁻³ ± 1.76·10⁻⁴ | −1.93·10⁻² ± 5.02·10⁻² | 3.93·10⁻² | 0.9990 | -22 | |||
| 토양 4 | 5–600 | 5.77·10⁻³ ± 1.00·10⁻⁴ | −3.06·10⁻² ± 2.87·10⁻² | 2.23·10⁻² | 0.9997 | -15 | |||
| 토양 5 | 5–600 | 5.80·10⁻³ ± 3.16·10⁻⁴ | −5.68·10⁻² ± 9.00·10⁻² | 6.96·10⁻² | 0.9978 | -15 | |||
| 토양 6 | 5–600 | 5.45·10⁻³ ± 1.46·10⁻⁴ | −2.40·10⁻² ± 4.18·10⁻² | 3.20·10⁻² | 0.9994 | -20 | |||
| 용매 | 5–600 | 6.80·10⁻³ ± 4.74·10⁻⁴ | −7.73·10⁻² ± 1.36·10⁻¹ | 9.76·10⁻² | 0.9963 | — | |||
| 톨클로포스-메틸 | 토양 1 | 5–600 | 1.78·10⁻² ± 2.78·10⁻⁴ | −4.35·10⁻⁴ ± 7.94·10⁻² | 5.72·10⁻² | 0.9998 | -17 | ||
| 토양 2 | 5–600 | 1.90·10⁻² ± 2.25·10⁻⁴ | 1.40·10⁻² ± 6.44·10⁻² | 4.64·10⁻² | 0.9999 | -12 | |||
| 토양 3 | 5–600 | 2.10·10⁻² ± 2.15·10⁻⁴ | −4.10·10⁻³ ± 6.15·10⁻² | 4.81·10⁻² | 0.9999 | -3 | |||
| 토양 4 | 5–600 | 1.97·10⁻² ± 3.08·10⁻⁴ | 3.68·10⁻² ± 8.82·10⁻² | 6.85·10⁻² | 0.9998 | -9 | |||
| 토양 5 | 5–600 | 1.97·10⁻² ± 1.01·10⁻³ | −1.08·10⁻¹ ± 2.88·10⁻¹ | 2.23·10⁻¹ | 0.9980 | -9 | |||
| 토양 6 | 5–600 | 1.95·10⁻² ± 1.68·10⁻⁴ | 7.35·10⁻³ ± 4.80·10⁻² | 3.67·10⁻² | 0.9999 | -10 | |||
| 용매 | 5–600 | 2.16·10⁻² ± 9.90·10⁻⁴ | −9.16·10⁻² ± 2.83·10⁻¹ | 2.04·10⁻¹ | 0.9984 | — | |||
| 피리미포스-메틸 | 토양 1 | 5–600 | 6.48·10⁻³ ± 1.09·10⁻⁴ | −3.28·10⁻² ± 3.11·10⁻² | 2.24·10⁻² | 0.9998 | -19 | ||
| 토양 2 | 5–600 | 7.41·10⁻³ ± 6.28·10⁻⁵ | −2.13·10⁻² ± 1.80·10⁻² | 1.30·10⁻² | 0.9999 | -7 | |||
| 토양 3 | 5–600 | 8.00·10⁻³ ± 1.29·10⁻⁴ | −1.76·10⁻² ± 3.68·10⁻² | 2.88·10⁻² | 0.9998 | 1 | |||
| 토양 4 | 5–600 | 7.80·10⁻³ ± 1.52·10⁻⁴ | −5.27·10⁻³ ± 4.36·10⁻² | 3.38·10⁻² | 0.9997 | -2 | |||
| 토양 5 | 5–600 | 7.33·10⁻³ ± 3.71·10⁻⁴ | −6.17·10⁻² ± 1.06·10⁻¹ | 8.16·10⁻² | 0.9981 | -8 | |||
| 토양 6 | 5–600 | 7.42·10⁻³ ± 8.58·10⁻⁵ | −2.18·10⁻² ± 2.46·10⁻² | 1.88·10⁻² | 0.9999 | -7 | |||
| 용매 | 5–600 | 7.96·10⁻³ ± 4.79·10⁻⁴ | −6.77·10⁻² ± 1.37·10⁻¹ | 9.88·10⁻² | 0.9972 | — | |||
| 페니트로티온 | 토양 1 | 5–600 | 4.65·10⁻³ ± 2.84·10⁻⁴ | −4.91·10⁻² ± 8.12·10⁻² | 5.85·10⁻² | 0.9971 | -40 | ||
| 토양 2 | 5–600 | 6.34·10⁻³ ± 2.12·10⁻⁴ | −5.64·10⁻² ± 6.06·10⁻² | 4.36·10⁻² | 0.9991 | -18 | |||
| 토양 3 | 5–600 | 6.43·10⁻³ ± 2.20·10⁻⁴ | −2.81·10⁻² ± 6.31·10⁻² | 4.94·10⁻² | 0.9989 | -17 | |||
| 토양 4 | 5–600 | 7.41·10⁻³ ± 1.83·10⁻⁴ | −5.38·10⁻² ± 5.23·10⁻² | 4.07·10⁻² | 0.9995 | -4 | |||
| 토양 5 | 5–600 | 6.84·10⁻³ ± 4.22·10⁻⁴ | −8.07·10⁻² ± 1.20·10⁻¹ | 9.28·10⁻² | 0.9971 | -11 | |||
| 토양 6 | 5–600 | 6.50·10⁻³ ± 1.48·10⁻⁴ | −5.02·10⁻² ± 4.24·10⁻² | 3.25·10⁻² | 0.9995 | -16 | |||
| 용매 | 5–600 | 7.71·10⁻³ ± 7.02·10⁻⁴ | −1.06·10⁻¹ ± 2.01·10⁻¹ | 1.45·10⁻¹ | 0.9937 | — | |||
| 말라티온 | 토양 1 | 5–600 | 1.20·10⁻² ± 4.06·10⁻⁴ | −4.45·10⁻² ± 1.16·10⁻¹ | 8.37·10⁻² | 0.9991 | -24 | ||
| 토양 2 | 5–600 | 1.78·10⁻² ± 2.03·10⁻⁴ | −4.55·10⁻² ± 5.81·10⁻² | 4.19·10⁻² | 0.9999 | 12 | |||
| 토양 3 | 5–600 | 1.67·10⁻² ± 1.44·10⁻³ | 1.00·10⁻¹ ± 4.11·10⁻¹ | 3.21·10⁻¹ | 0.9933 | 5 | |||
| 토양 4 | 5–600 | 1.83·10⁻² ± 1.44·10⁻⁴ | −2.48·10⁻² ± 4.12·10⁻² | 3.20·10⁻² | 0.9999 | 16 | |||
| 토양 5 | 5–600 | 1.58·10⁻² ± 8.21·10⁻⁴ | −9.07·10⁻² ± 2.33·10⁻¹ | 1.81·10⁻¹ | 0.9980 | 0 | |||
| 토양 6 | 5–600 | 1.69·10⁻² ± 2.54·10⁻⁴ | −2.97·10⁻² ± 7.28·10⁻² | 5.57·10⁻² | 0.9998 | 7 | |||
| 용매 | 5–600 | 1.58·10⁻² ± 7.45·10⁻⁴ | −8.76·10⁻² ± 2.13·10⁻¹ | 1.53·10⁻¹ | 0.9983 | — | |||
| 클로르피리포스 | 토양 1 | 5–600 | 1.03·10⁻² ± 1.59·10⁻⁴ | −1.62·10⁻² ± 4.54·10⁻² | 3.27·10⁻² | 0.9998 | -21 | ||
| 토양 2 | 5–600 | 1.15·10⁻² ± 1.96·10⁻⁴ | 4.71·10⁻¹ ± 5.62·10⁻² | 4.04·10⁻² | 0.9998 | -12 | |||
| 토양 3 | 5–600 | 1.26·10⁻² ± 9.94·10⁻⁵ | −1.12·10⁻² ± 2.84·10⁻² | 2.23·10⁻² | 0.9999 | -3 | |||
| 토양 4 | 5–600 | 1.24·10⁻² ± 1.76·10⁻⁴ | −1.44·10⁻⁴ ± 5.04·10⁻² | 3.92·10⁻² | 0.9998 | -5 | |||
| 토양 5 | 5–600 | 1.16·10⁻² ± 6.33·10⁻⁴ | −8.42·10⁻² ± 1.80·10⁻¹ | 1.39·10⁻¹ | 0.9977 | -11 | |||
| 토양 6 | 5–600 | 1.14·10⁻² ± 2.29·10⁻⁴ | 7.10·10⁻⁴ ± 6.57·10⁻² | 5.02·10⁻² | 0.9996 | -12 | |||
| 용매 | 5–600 | 1.30·10⁻² ± 5.48·10⁻⁴ | −7.41·10⁻² ± 1.57·10⁻¹ | 1.13·10⁻¹ | 0.9986 | — | |||
| 펜티온 | 토양 1 | 5–600 | 1.71·10⁻² ± 3.38·10⁻⁴ | −3.26·10⁻² ± 9.68·10⁻² | 6.97·10⁻² | 0.9997 | -16 | ||
| 토양 2 | 5–600 | 1.88·10⁻² ± 1.89·10⁻⁴ | −2.84·10⁻² ± 5.40·10⁻² | 3.89·10⁻² | 0.9999 | -8 | |||
| 토양 3 | 5–600 | 2.01·10⁻² ± 4.45·10⁻⁴ | −1.38·10⁻² ± 1.27·10⁻¹ | 9.95·10⁻² | 0.9996 | -2 | |||
| 토양 4 | 5–600 | 1.96·10⁻² ± 2.89·10⁻⁴ | −8.63·10⁻⁴ ± 8.27·10⁻² | 6.42·10⁻² | 0.9998 | -4 | |||
| 토양 5 | 5–600 | 1.89·10⁻² ± 9.10·10⁻⁴ | −1.33·10⁻¹ ± 2.59·10⁻¹ | 2.00·10⁻¹ | 0.9983 | -7 | |||
| 토양 6 | 5–600 | 1.84·10⁻² ± 1.16·10⁻⁴ | −4.97·10⁻² ± 3.31·10⁻² | 2.54·10⁻² | 0.9999 | -10 | |||
| 용매 | 5–600 | 2.05·10⁻² ± 9.70·10⁻⁴ | −1.27·10⁻¹ ± 2.78·10⁻¹ | 2.00·10⁻¹ | 0.9983 | — | |||
| 피리미포스-에틸 | 토양 1 | 5–600 | 3.30·10⁻³ ± 6.51·10⁻⁵ | −2.54·10⁻² ± 1.86·10⁻² | 1.34·10⁻² | 0.9997 | -3 | ||
| 토양 2 | 5–600 | 3.30·10⁻³ ± 3.66·10⁻⁵ | −5.05·10⁻³ ± 1.05·10⁻² | 7.55·10⁻³ | 0.9999 | -3 | |||
| 토양 3 | 5–600 | 2.80·10⁻³ ± 1.78·10⁻⁴ | 1.98·10⁻³ ± 5.10·10⁻² | 3.99·10⁻² | 0.9963 | -17 | |||
| 토양 4 | 5–600 | 2.64·10⁻³ ± 5.18·10⁻⁵ | 2.01·10⁻³ ± 1.48·10⁻² | 1.15·10⁻² | 0.9997 | -22 | |||
| 토양 5 | 5–600 | 1.36·10⁻³ ± 6.77·10⁻⁵ | 4.60·10⁻⁴ ± 1.93·10⁻² | 1.49·10⁻² | 0.9981 | -60 | |||
| 토양 6 | 5–600 | 2.92·10⁻³ ± 1.23·10⁻⁴ | −9.09·10⁻³ ± 3.51·10⁻² | 2.69·10⁻² | 0.9985 | -14 | |||
| 용매 | 5–600 | 3.39·10⁻³ ± 1.46·10⁻⁴ | −2.62·10⁻² ± 4.18·10⁻² | 3.01·10⁻² | 0.9986 | — | |||
| 메티다티온 | 토양 1 | 5–600 | 2.12·10⁻² ± 7.46·10⁻⁴ | −9.50·10⁻² ± 2.13·10⁻¹ | 1.54·10⁻¹ | 0.9990 | -34 | ||
| 토양 2 | 5–600 | 2.59·10⁻² ± 5.46·10⁻⁴ | −1.20·10⁻¹ ± 1.56·10⁻¹ | 1.12·10⁻¹ | 0.9997 | -19 | |||
| 토양 3 | 5–600 | 2.33·10⁻² ± 1.54·10⁻³ | 6.34·10⁻² ± 4.41·10⁻¹ | 3.45·10⁻¹ | 0.9961 | -27 | |||
| 토양 4 | 5–600 | 2.51·10⁻² ± 3.38·10⁻⁴ | −5.47·10⁻² ± 9.66·10⁻² | 7.51·10⁻² | 0.9998 | -22 | |||
| 토양 5 | 5–600 | 2.59·10⁻² ± 1.32·10⁻³ | −2.06·10⁻¹ ± 3.75·10⁻¹ | 2.90·10⁻¹ | 0.9980 | -19 | |||
| 토양 6 | 5–600 | 2.27·10⁻² ± 3.71·10⁻⁴ | −6.62·10⁻² ± 1.06·10⁻¹ | 8.13·10⁻² | 0.9998 | -29 | |||
| 용매 | 5–600 | 3.21·10⁻² ± 1.75·10⁻³ | −2.83·10⁻¹ ± 5.00·10⁻¹ | 3.60·10⁻¹ | 0.9977 | — | |||
| 페나미포스 | 토양 1 | 5–600 | 2.36·10⁻³ ± 2.87·10⁻⁴ | −4.42·10⁻² ± 8.20·10⁻² | 5.91·10⁻² | 0.9888 | 8 | ||
| 토양 2 | 5–600 | 3.47·10⁻³ ± 1.21·10⁻⁴ | −2.82·10⁻² ± 3.46·10⁻² | 2.49·10⁻² | 0.9991 | 58 | |||
| 토양 3 | 5–600 | 1.89·10⁻³ ± 4.02·10⁻⁴ | 9.58·10⁻³ ± 1.15·10⁻¹ | 8.99·10⁻² | 0.9606 | -14 | |||
| 토양 4 | 5–600 | 2.63·10⁻³ ± 7.66·10⁻⁵ | −2.51·10⁻² ± 2.19·10⁻² | 1.70·10⁻² | 0.9992 | 20 | |||
| 토양 5 | 5–600 | 2.95·10⁻³ ± 1.91·10⁻⁴ | −3.58·10⁻² ± 5.43·10⁻² | 4.20·10⁻² | 0.9969 | 35 | |||
| 토양 6 | 5–600 | 3.09·10⁻³ ± 5.98·10⁻⁵ | −2.12·10⁻² ± 1.71·10⁻² | 1.31·10⁻² | 0.9997 | 41 | |||
| 용매 | 5–600 | 2.19·10⁻³ ± 2.87·10⁻⁴ | −4.33·10⁻² ± 8.20·10⁻² | 5.91·10⁻² | 0.9871 | — | |||
| 에티온 | 토양 1 | 5–600 | 5.02·10⁻³ ± 1.00·10⁻⁴ | −1.16·10⁻² ± 2.87·10⁻² | 2.07·10⁻² | 0.9997 | -3 | ||
| 토양 2 | 5–600 | 5.07·10⁻³ ± 2.15·10⁻⁴ | −1.06·10⁻² ± 6.16·10⁻² | 4.43·10⁻² | 0.9986 | -2 | |||
| 토양 3 | 5–600 | 4.58·10⁻³ ± 2.21·10⁻⁴ | 9.11·10⁻⁴ ± 6.32·10⁻² | 4.95·10⁻² | 0.9979 | -12 | |||
| 토양 4 | 5–600 | 5.07·10⁻³ ± 7.18·10⁻⁵ | −1.21·10⁻² ± 2.05·10⁻² | 1.60·10⁻² | 0.9998 | -2 | |||
| 토양 5 | 5–600 | 5.00·10⁻³ ± 2.32·10⁻⁴ | −2.72·10⁻² ± 6.61·10⁻² | 5.11·10⁻² | 0.9984 | -3 | |||
| 토양 6 | 5–600 | 4.73·10⁻³ ± 8.29·10⁻⁵ | −6.89·10⁻³ ± 2.37·10⁻² | 1.81·10⁻² | 0.9997 | -9 | |||
| 용매 | 5–600 | 5.18·10⁻³ ± 2.24·10⁻⁴ | −2.80·10⁻² ± 6.40·10⁻² | 4.61·10⁻² | 0.9986 | — | |||
표 3: 6가지 농경토 내 12가지 표적 OPPs에 대한 매트릭스 일치 검정 곡선 파라미터 및 ME.약어: OPPs = 유기인계 살충제; b = 기울기; sb = 기울기의 표준 편차; a = 절편; sa = 절편의 표준 편차; R2 = 결정 계수; sy/x = 추정치의 표준 편차; ME = 매트릭스 효과. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
| 분석물 | S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | |||||||||||||
| 50 µg/kg | 200 µg/kg | 400 µg/kg | 50 µg/kg | 200 µg/kg | 400 µg/kg | 50 µg/kg | 200 µg/kg | 400 µg/kg | 50 µg/kg | 200 µg/kg | 400 µg/kg | 50 µg/kg | 200 µg/kg | 400 µg/kg | 50 µg/kg | 200 µg/kg | 400 µg/kg | ||
| 클로르피리포스-메틸 | 106 (4) | 102 (2) | 103 (1) | 110 (17) | 99 (2) | 101 (2) | 105 (5) | 104 (2) | 110 (10) | 105 (4) | 98 (3) | 100 (4) | 107 (4) | 107 (3) | 100 (4) | 114 (4) | 102 (3) | 114 (4) | |
| 파라티온-메틸 | 96 (3) | 96 (0) | 99 (1) | 97 (17) | 92 (3) | 97 (2) | 116 (4) | 104 (6) | 121 (5) | 103 (6) | 87 (4) | 95 (6) | 117 (6) | 110 (4) | 107 (6) | 107 (6) | 100 (4) | 108 (6) | |
| 톨클로포스-메틸 | 113 (3) | 107 (2) | 104 (1) | 110 (15) | 100 (2) | 105 (3) | 101 (6) | 97 (2) | 104 (10) | 100 (7) | 98 (3) | 102 (2) | 106 (7) | 104 (3) | 101 (2) | 110 (7) | 103 (3) | 108 (2) | |
| 피리미포스-메틸 | 78 (12) | 79 (3) | 89 (2) | 106 (22) | 95 (1) | 99 (3) | 102 (7) | 97 (3) | 104 (9) | 101 (5) | 97 (2) | 100 (3) | 104 (5) | 101 (2) | 98 (3) | 113 (5) | 102 (2) | 104 (3) | |
| 페니트로티온 | 91 (4) | 90 (2) | 98 (2) | 104 (25) | 90 (3) | 95 (2) | 116 (5) | 105 (4) | 118 (5) | 101 (6) | 90 (3) | 96 (7) | 111 (6) | 107 (3) | 103 (7) | 118 (6) | 101 (3) | 103 (7) | |
| 말라티온 | 89 (3) | 81 (1) | 87 (4) | 108 (18) | 90 (2) | 92 (2) | 118 (7) | 110 (4) | 119 (5) | 106 (5) | 96 (4) | 97 (5) | 122 (5) | 110 (4) | 102 (5) | 122 (5) | 102 (4) | 103 (5) | |
| 클로르피리포스 | 97 (4) | 96 (2) | 97 (1) | 160 (13) | 117 (5) | 112 (4) | 97 (6) | 95 (3) | 103 (10) | 102 (6) | 95 (2) | 98 (4) | 105 (6) | 98 (2) | 96 (4) | 108 (6) | 97 (2) | 103 (4) | |
| 펜티온 | 101 (2) | 99 (1) | 98 (2) | 99 (3) | 98 (2) | 103 (2) | 100 (7) | 101 (3) | 106 (8) | 102 (6) | 94 (2) | 97 (4) | 104 (6) | 100 (2) | 100 (4) | 110 (6) | 100 (2) | 104 (4) | |
| 피리미포스-에틸 | 63 (14) | 66 (5) | 85 (2) | 100 (21) | 93 (3) | 101 (3) | 70 (12) | 78 (3) | 93 (8) | 105 (9) | 104 (8) | 108 (7) | 113 (9) | 103 (8) | 103 (7) | 55 (9) | 33 (8) | 34 (7) | |
| 메티다티온 | 92 (3) | 80 (16) | 91 (3) | 103 (16) | 87 (2) | 90 (2) | 125 (8) | 113 (5) | 125 (5) | 90 (12) | 85 (5) | 92 (8) | 97 (12) | 97 (5) | 97 (8) | 113 (12) | 100 (5) | 104 (8) | |
| 페나미포스 | 5 (38) | 1 (38) | 3 (52) | 58 (18) | 58 (8) | 56 (6) | 140 (16) | 117 (3) | 126 (2) | 65 (15) | 50 (19) | 40 (20) | 82 (15) | 62 (19) | 69 (20) | 88 (15) | 70 (19) | 70 (20) | |
| 에티온 | 59 (15) | 42 (11) | 59 (15) | 83 (12) | 82 (3) | 87 (3) | 93 (11) | 97 (4) | 103 (7) | 80 (10) | 78 (6) | 81 (4) | 83 (10) | 77 (6) | 87 (4) | 96 (10) | 87 (6) | 89 (4) | |
표 4: 3가지 농도 수준에서 6가지 농경지 토양(S1–S6) 내 12종의 표적 OPPs에 대한 평균 회수율(%) 및 RSD(%, 괄호 안). 회수 실험은 chlorpyrifos-methyl-d10을 P-IS로 사용하여 50, 200, 400 µg/kg(수준당 n = 5)에서 수행되었다. 살충제 강화 용액과 P-IS 용액 모두 추출 전에 첨가되었다. SANTE/2020/12830 (Rev.2) 성능 기준에 따르면, 허용 회수율 범위는 70~120%이며 RSD는 ≤20%이다. S1: Villavicencio (Meta, Colombia); S2: Sabana Bogotá (Cundinamarca, Colombia); S3: Floresta (Boyacá, Colombia); S4: Guasca (Cundinamarca, Colombia); S5: Santa Rosa de Viterbo (Boyacá, Colombia); S6: La Laguna (Canarias, España). 약어: RSD = 상대 표준 편차; OPPs = 유기인계 살충제; P-IS = 절차적 내부 표준물질. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
토론
토양의 물리화학적 성질의 높은 가변성과 그로 인해 발생하는 공동 추출 성분 조성의 차이로 인해, 토양 내 농약 잔류물 결정은 분석적으로 여전히 까다로운 과제로 남아 있습니다4,5,6,14,17,18,19,20,21. QuEChERS 기반 방법이 식품 및 식물 매질에 널리 적용되어 왔으나, 다양한 토양 특성을 보이는 농경지 토양에 대해 dSPE 정제 과정을 체계적으로 최적화한 연구는 적었습니다4. 본 연구에서는 서로 다른 토양 조건을 대표하도록 선정된 6가지 농경지 토양을 사용하여 7가지 dSPE 흡착제 조합을 평가하였습니다. 연구 결과, 정제 단계의 조성이 공동 추출된 매질 성분의 제거에 상당한 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 가장 효율적인 dSPE 구성을 선택하기 위해 분석 대상 물질과는 독립적인 기준인 공동 추출물 제거율을 사용하였으며, 이후 ME 평가 및 방법 검증을 통해 최적화된 정제 절차의 분석 성능을 평가하였습니다. 최적화된 dSPE 구성을 규명하고 이를 분석 대상 물질 보호제, 중수소 표지 P-IS, 매질 일치 표준 용액법(matrix-matched calibration), 그리고 SANTE/2020/12830 (Rev.2) 지침에 따른 검증과 통합함으로써, 본 프로토콜은 서로 다른 토양 특성을 가진 농경지 토양 전반에서 OPPs를 동시에 결정하기 위한 완전하고 실용적인 분석 워크플로우를 제공합니다. 이 프로토콜은 단일 토양 매질에 대한 최적화를 나타내기보다, 일상적인 환경 분석 실험실에서 사용하기 적합하도록 견고하고 즉시 전용 가능한 방법론을 제공하기 위해 설계되었습니다.
PSA+C18+흡착제 조합의 우수한 성능은 세 가지 흡착제가 제공하는 상호 보완적인 유지 메커니즘 덕분인 것으로 볼 수 있습니다. PSA는 주로 약한 음이온 교환 상호작용을 통해 산성 극성 공추출물을 제거하는 데 기여하는 반면, C18은 소수성 분배를 통해 비극성 화합물을 유지합니다12,13. 마그네슘 실리케이트 흡착제인 Florisil은 수소 결합, 쌍극자-쌍극자 및 루이스 산-염기 상호작용을 통해 극성 및 중등도 극성 매질 성분을 추가적으로 유지합니다15,16. 결과는 이러한 상호 보완적 거동을 뒷받침합니다. 흡착제 단독 사용 시 PSA 또는 C18 단독 사용 시보다 더 높은 평균 공추출물 제거율을 보였습니다. 또한, PSA 또는 C18 단독 사용 시 흡착제를 추가해도 평균 정제 효율에는 미미한 변화만 있었으나, PSA+C18 조합에 흡착제를 포함시켰을 때 평가된 7가지 dSPE 구성 중 가장 높은 전체 공추출물 제거율을 나타냈습니다. 이러한 패턴은 흡착제가 단순히 흡착제 질량을 증가시키는 것이 아니라, PSA 또는 C18로 효율적으로 제거되지 않는 매질 성분을 상호 보완적으로 유지하는 데 기여한다는 점과 더 일치합니다. 이러한 상호 보완성은 유기물 함량, 광물 조성 및 질감의 차이로 인해 공추출물 프로파일이 매우 불균일한 농경지 토양에서 특히 중요합니다.
본 연구의 목적은 서로 다른 물리화학적 특성을 가진 농경지에 적용 가능한 단일 정제 프로토콜을 수립하는 것이었으므로, 최종 흡착제 선정 시 평가된 정제 구성 간의 통계적 비교와 세 가지 흡착제의 상호 보완적인 유지 메커니즘이 제공하는 분석적 근거를 모두 고려하였습니다. MgSO4+PSA+C18+Adsorbent 조합은 평가된 dSPE 구성 중 매질 공추출물에 대해 가장 광범위한 물리화학적 커버리지를 제공하는 동시에, 전반적으로 가장 높은 평균 공추출물 제거율을 달성하였습니다. 이에 따라, 본 조합이 후속 방법 검증을 위해 선정되었습니다.
매트릭스 효과(MEs)는 특히 토양과 같은 불균일한 매트릭스에서 농약 잔류물을 GC-MS/MS로 측정할 때 불확실성을 유발하는 주요 요인 중 하나로 남아 있습니다4,5. 본 연구에서는 신호 억제(signal suppression) 현상이 지배적으로 관찰되었으나, 대부분의 분석물은 일반적으로 낮음에서 중간 정도로 간주되는 범위(-20% ~ +20% 및 -20% ~ -50%) 내의 평균 ME 값을 나타냈습니다14,28. 이러한 결과는 크로마토그래피 시스템으로 유입되는 공동 추출 성분(co-extractive burden)의 부담이 효과적으로 감소했음을 의미합니다. 그럼에도 불구하고 분석물에 따른 가변성이 여전히 관찰되었습니다. 예를 들어, methidathion, parathion-methyl, pirimiphos-ethyl은 가장 강한 평균 신호 억제를 보인 반면, fenamiphos는 신호 증강(signal enhancement)을 나타냈습니다. GC-MS/MS에서 MEs는 본질적으로 화합물에 따라 달라지며, 분석물, 잔류 매트릭스 성분, 그리고 주입 시스템 및 크로마토그래피 경로 내의 활성 부위(active sites) 간의 상호작용으로 인해 발생합니다. 결과적으로 잔류 매트릭스 성분은 각 분석물의 물리화학적 특성과 표면 상호작용에 대한 민감도에 따라 검출기 응답을 감소시키거나 증가시킬 수 있습니다. 따라서 평가된 유기인계 농약(OPPs)들 사이에서 관찰된 상반된 응답은 주로 토양 매트릭스 조성의 차이에 분석물 의존적 거동이 중첩되어 나타난 결과입니다. dSPE 정제 외에도, 분석 워크플로우에는 GC 시스템 내 활성 부위와 분석물 간의 상호작용을 줄여 농약 잔류물 분석의 크로마토그래피 성능을 개선한다고 이전에 보고된 분석물 보호제 혼합물(analyte protectant mixture)이 포함되었습니다28,29. 이러한 조치에도 불구하고 분석물 특이적 MEs가 지속된다는 점은 토양 매트릭스의 복잡성을 강조하며, 매트릭스 조성이 다른 토양 내 OPPs의 신뢰성 있는 정량을 위해 매트릭스 일치 표준물질법(matrix-matched calibration)을 사용해야 함을 뒷받침합니다.
회수 실험 결과, 최적화된 방법이 다양한 농경지 토양 조건에서 대부분의 표적 OPP에 대해 정확하고 정밀한 정량을 제공함이 입증되었습니다. 분석물-토양 조합의 대부분이 70%에서 120% 사이의 회수율과 20% 미만의 RSD를 보여 SANTE/2020/12830 (Rev.2) 수용 기준11을 충족하였습니다. 그럼에도 불구하고, 일부 분석물-토양 조합에서는 권장 회수 범위에서 벗어나는 사례가 일부 관찰되었습니다. 가장 유의미한 편차는 fenamiphos, pirimiphos-ethyl 및 ethion과 관련이 있었으며, 이들은 특정 토양 매트릭스에서 낮은 회수율을 보였습니다. chlorpyrifos, parathion-methyl, malathion 및 methidathion의 경우, 주로 개별 강화 수준에서 상한 수용 한계를 약간 상회하는 회수율을 보이는 추가적인 개별 편차가 관찰되었습니다. 이러한 편차가 토양 매트릭스 전반에서 일관되게 관찰되지 않았기 때문에, 관찰된 거동은 매트릭스 효과(MEs)와 결합된 화합물 의존적 특성과 관련이 있을 가능성이 높습니다. 평가된 매트릭스 중 점토 함량이 가장 높은(48.5%) S1에서 더 많은 편차가 관찰되었으며, 이는 토양의 물리화학적 특성이 일부 분석물의 추출 효율 감소에 기여했을 수 있음을 시사합니다. 점토 광물은 표면 상호작용을 통해 살충제 분자를 유지할 수 있는 수많은 흡착 부위를 제공하여 추출 시 탈착을 감소시킵니다. 이러한 상호작용의 정도는 광물 표면에 대한 친화력을 포함한 분석물의 물리화학적 성질에 따라 달라질 것으로 예상됩니다. 그러나 모든 점토 풍부 토양에서 동일한 패턴이 나타나지 않았다는 점은 단일 토양 매개변수만으로는 관찰된 편차를 완전히 설명할 수 없음을 나타냅니다. 또한, 동일한 흡착제 기반 정제 절차가 대부분의 분석물-토양 조합에서 만족스러운 성능을 제공했으므로, 정제 단계와 관련된 체계적인 손실의 증거는 관찰되지 않았습니다. 흡착제 최적화 과정에서 분석물 유지에 대한 흡착제의 개별 기여도를 독립적으로 평가하지는 않았으나, 최적화된 절차로 얻은 만족스러운 회수 성능은 이 흡착제의 포함이 분석물 정량을 저해하지 않았음을 시사합니다. 종합적으로, 이러한 결과는 제안된 방법의 적합성을 입증하는 동시에, 특정 화합물의 성능에 분석물-매트릭스 상호작용이 미치는 영향을 강조합니다.
본 방법은 평가된 6가지 농경지 토양 전반에서 만족스러운 성능을 보였으나, 염성 토양, 이탄 토양, 유기물 함량이 매우 높은 토양, 강알칼리성 토양 또는 탄소질 물질이 풍부한 매질과 같이 극단적인 특성을 가진 토양에 대한 적용 가능성은 아직 확립되어야 합니다. 또한, 이번 검증은 강화된 농경지 토양을 사용하여 수행되었으므로, 자연적으로 오염된 현장 시료에 대한 본 방법의 적용 가능성은 확인이 필요합니다. 더욱이, 본 방법은 유기인계 농약(OPPs)만을 대상으로 개발 및 검증되었기 때문에, 다른 농약 계열에 대한 적합성은 보장할 수 없습니다. 이러한 제한 사항에도 불구하고, 본 프로토콜은 농경지 토양 내 OPP 잔류물 정량을 위한 표준화된 접근 방식을 제공하며, 환경 모니터링 프로그램, 농약의 운명 및 이동 연구, 위해성 평가 조사 및 규제 감시 활동에 적용될 수 있습니다. 향후 연구에서는 최적화된 정제 전략을 추가적인 토양 유형 및 농약 계열로 확장하여 적용 가능성을 평가하고, 점토 함량이 높은 매질에서 추출 효율이 낮은 화합물의 회수율을 향상시키기 위한 개선 방안을 탐색해야 합니다.
종합적으로, 제안된 워크플로우는 최적화된 dSPE 정제, 매트릭스 일치 보정, 내부 표준법 및 분석대상물질 보호제를 하나의 검증된 프로토콜로 결합하여 농경지 토양 내 OPPs를 동시에 정량 분석할 수 있게 합니다. 서로 다른 물리화학적 특성을 가진 토양들에 대해 흡착제 조합을 체계적으로 평가함으로써, 만족스러운 분석 성능을 유지하면서 매트릭스 효과(MEs)를 최소화할 수 있는 정제 조건을 선택하기 위한 실질적인 가이드를 제공합니다. 따라서 본 프로토콜은 다양한 토양 특성을 가진 농경지 토양의 환경 모니터링, 농약 운명 연구 및 일상적인 잔류물 정량 분석을 지원할 수 있는 재현 가능한 접근 방식을 제시합니다.
공개 사항
본 연구를 준비하는 동안, 저자들은 그림 3의 그래픽 레이아웃 설계를 위해 Claude(Anthropic)의 무료 버전을 사용하였으며, 문법 및 맞춤법 교정을 위해 ChatGPT(GPT-5.5, OpenAI)의 무료 버전을 사용하였습니다. 이러한 도구들을 사용한 후, 저자들은 모든 내용을 주의 깊게 검토하고 필요에 따라 수정하였습니다. 모든 과학적 내용, 데이터, 분석 및 결론은 저자들에 의해 생성, 검증 및 승인되었으며, 저자들은 출판된 논문의 정확성과 무결성에 대해 모든 책임을 집니다.
감사의 글
저자들은 본 연구를 지원해 준 EAN 대학교와 해당 대학의 연구 및 이전 관리 사무소(Research and Transfer Management Office)에 깊은 감사를 표합니다. 또한, 연구 전반에 걸쳐 사용된 GC-MS/MS 기기 접근 권한을 포함하여, 본 연구 수행에 필요한 분석 시설과 기술적 자원을 제공해 준 EAN 대학교 실험실에 감사드립니다. 본 연구는 콜롬비아 보고타 D.C.에 위치한 Universidad EAN의 연구 및 이전 관리 부서의 지원을 받아 수행되었습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 3-에톡시-1,2-프로판디올 (에틸글리세롤) | Sigma Aldrich | 260428-1G | |
| 아세트산 | Sigma Aldrich | 695092 | |
| 아세토나이트릴 | Merck | 1006652500 | |
| AOAC 20i/s 자동 시료 주입기 | Shimadzu | 221-723115-58 | |
| 균형 | OHAUS | PA224 | |
| C18 | Sigma Aldrich | 52600-U | |
| 원심분리 튜브, 2 mL | Eppendorf | 4610-1815 | |
| 원심분리 튜브, 50 mL | 둥지 | 602002 | |
| 원심분리기 Z206A | MERMLE | 6019500118 | |
| Column SH-Rxi-5sil MS, 30 m x 0.25 mm, 0.25 µm | Shimadzu | 221-75954-30 | |
| 용기, 캡 포함, 갈색 유리, 1000 mL | Sigma Aldrich | Z674176 | |
| 데시케이터 | Simax | 415262302 | |
| 분주기(Dispensette) 5-50 mL | 브랜드 | 4600361 | |
| D-소르비톨 | Sigma Aldrich | 240850-5G | |
| 에틸 아세테이트 | Merk | 1313181212 | |
| 플로리실(Florisil) &200 메쉬 미만, 미세 분말 | Sigma Aldrich | 288705-50G | |
| 개미산 | Merck | 1002641000 | |
| GCMS-TQ8040 | Shimadzu | 211552 | |
| 주입용 주사기 | Shimadzu | LC2213461800 | |
| L-굴론산 γ-락톤 | Sigma Aldrich | 310301-5G | |
| 라이너 스플릿리스(Linner splitless) | Shimadzu | 221-4887-02 | |
| 황산마그네슘(무수물) | Sigma Aldrich | M7506-2KG | |
| 메탄올 | Panreac | 131091.12.12 | |
| Milli-Q 초순수 (type 1) | Millipore | F4H4783518 | |
| 피펫 팁 10$\mu$l 100 µL | Biologix | 200010 | |
| 피펫 팁 100 - 1000 µL | 브랜드 | 541287 | |
| 피펫 팁 20 $\mu\text{L}$ 200 µL | 브랜드 | 732028 | |
| 파스퇴르 피펫 | NORMAX | 5426023 | |
| 가변형 Pippette Transferpette S 10 - 100 µL | 브랜드 | 704774 | |
| 가변 피펫 Transferpette S 100 - 1000 µL | 브랜드 | 704780 | |
| Transferpette S 가변 피펫 20 - 200 µL | SCILOGEX | 712111099999 | |
| 1차-2차 아민 (PSA) | Sigma Aldrich | 52738-U | |
| 냉장고/냉동고 | Haceb | NEV ALC 404 | |
| 시킴산 | Sigma Aldrich | S5375-1G | |
| 아세트산나트륨 | Sigma Aldrich | 241245-1KG | |
| GCMSsolution 소프트웨어 | Shimadzu | 223-18472-92 | |
| 스테인리스강 2mm 메쉬 | 핀주아르 | PS33N10 | |
| 시험관, 유리, 10 mL | Sigma Aldrich | BR114508 | |
| 톨루엔 | Merck | 1083252500 | |
| 트리페닐 포스페이트 (I-IS) | Sigma Aldrich | 241288-50G | |
| 인서트 일체형 바이알, 0.3 mL | Sigma Aldrich | 29398-U | |
| 바이알, 스크류 캡, 갈색 유리, 15 mL | Sigma Aldrich | 27088-U | |
| 부피 플라스크, 10 mL | Sigma Aldrich | DWK28017-10 | |
| 볼텍싱 | Scilogex | 82120004 | |
| 살충제 | |||
| 클로르피리포스 | Sigma Aldrich | 45395-100MG | 2921-88-2 |
| 클로르피리포스-메틸 | Sigma Aldrich | 45396-250MG | 5598-13-0 |
| Chlorpyrifos-methyl-d10 (P-IS) | Sigma Aldrich | 90047-5MG | 285138-81-0 |
| 에티온 | Sigma Aldrich | 45477-250MG | 563-12-2 |
| 페나미포스 | Sigma Aldrich | 45483-250MG | 22224-92-6 |
| 페니트로티온 | Sigma Aldrich | 45487-250MG | 122-14-5 |
| 펜티온 | Sigma Aldrich | 36552-250MG | 55-38-9 |
| 말라티온 | Sigma Aldrich | 36143-100MG | 121-75-5 |
| 메티다티온 | Sigma Aldrich | 36158-100MG | 950-37-8 |
| 파라티온-메틸 | Sigma Aldrich | 36187-100MG | 298-00-0 |
| 피리미포스-에틸 | Sigma Aldrich | 45628-250MG | 23505-41-1 |
| 피리미포스-메틸 | Sigma Aldrich | 32058-250MG | 29232-93-7 |
| 톨클로포스-메틸 | Sigma Aldrich | 31209-250MG | 5701804-9 |
참고문헌
- Saad H, Elfeky SA, El-Gamel NE, Dena ASA. Organophosphate pesticides: a review on classification, synthesis, toxicity, remediation and analysis. RSC Adv. 2025;15(48):40802-40822.
- Mali H, et al. Organophosphate pesticides an emerging environmental contaminant: Pollution, toxicity, bioremediation progress, and remaining challenges. J Environ Sci. 2023;127:234-250.
- Dhuldhaj UP, Singh R, Singh VK. Pesticide contamination in agro-ecosystems: toxicity, impacts, and bio-based management strategies. Environ Sci Pollut Res. 2023;30:9243-9270.
- González-Curbelo MÁ, Varela-Martínez DA, Riaño-Herrera DA. Pesticide-residue analysis in soils by the QuEChERS method: A review. Molecules. 2022;27(13):4323.
- Wang J, et al. Multiresidue analysis method for the determination of 477 pesticides in soil based on thorough method validation. J Agric Food Chem. 2025;73(27):17269-17286.
- Mohamed AH, et al. Sampling and sample preparation techniques for the analysis of organophosphorus pesticides in soil matrices. Crit Rev Anal Chem. 2023;53(4):906-927.
- Bhattu M, Kathuria D, Billing BK, Verma M. Chromatographic techniques for the analysis of organophosphate pesticides with their extraction approach: a review (2015–2020). Anal Methods. 2022;14(4):322-358.
- Wondimu KT, Geletu AK, Kedir WM. Recent developments in monitoring of organophosphorus pesticides in food samples. J Agric Food Res. 2025;19:101709.
- Bulaić Nevistić M, Kovač Tomas M. Matrix effect evaluation in GC/MS-MS analysis of multiple pesticide residues in selected food matrices. Foods. 2023;12(21):3991.
- Damale RD, et al. Multiresidue analysis of pesticides in four different pomegranate cultivars: Investigating matrix effect variability by GC-MS/MS and LC-MS/MS. Food Chem. 2023;407:135179.
- European Commission. Guidance document on pesticide analytical methods for risk assessment and post-approval control and monitoring purposes (SANTE/2020/12830, Rev. 2). 2023. Available from: https://food.ec.europa.eu/system/files/2021-03/pesticides_ppp_app-proc_guide_res_mrl-guidelines-2020-12830.pdf
- González-Curbelo MÁ, et al. Evolution and applications of the QuEChERS method. Trends Anal Chem. 2015;71:169-185.
- Varela-Martinez DA, Gonzalez-Salamo J, Gonzalez-Curbelo MÁ, Hernandez-Borges J. Quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe (QuEChERS) extraction. In: Liquid-phase Extraction. Elsevier; 2020. p. 399-437.
- González-Curbelo MÁ. Analysis of organochlorine pesticides in a soil sample by a modified QuEChERS approach using ammonium formate. J Vis Exp. 2023;191:e64901.
- Jin Q, et al. Simultaneous determination of six acidic herbicides and metabolites in plant origin matrices by QuEChERS-UPLC-MS/MS. Molecules. 2025;30(4):852.
- Zhu L, et al. Establishment and validation of anticoagulant rodenticides in animal samples by HPLC-MS/MS, focusing on evaluating the effect of modified QuEChERS protocol on matrix effect reduction. ACS Omega. 2022;7(21):18146-18158.
- do Amaral B, Peralta-Zamora P, Nagata N. Simultaneous multi-residue pesticide analysis in southern Brazilian soil based on chemometric tools and QuEChERS-LC-DAD/FLD method. Environ Sci Pollut Res. 2022;29:39102-39115.
- Łozowicka B, et al. The fate of spirotetramat and dissipation metabolites in Apiaceae and Brassicaceae leaf-root and soil system under greenhouse conditions estimated by modified QuEChERS/LC-MS/MS. Sci Total Environ. 2017;603:178-184.
- Dong B, Shao X, Lin H, Hu J. Dissipation, residues and risk assessment of metaldehyde and niclosamide ethanolamine in pakchoi after field application. Food Chem. 2017;229:604-609.
- Guan J, Li D, Guo Y, Shi S, Yan F. Simultaneous determination of seven pesticide residues in soil samples using ultrasound-assisted dispersive solid-phase extraction combined with UHPLC-MS/MS. Sep Sci Plus. 2018;1(4):296-305.
- Kaczyński P, Łozowicka B, Jankowska M, Hrynko I. Rapid determination of acid herbicides in soil by liquid chromatography with tandem mass spectrometric detection based on dispersive solid phase extraction. Talanta. 2016;152:127-136.
- NSW Environment Protection Authority. Sampling design part 1 - application: Contaminated land guidelines (EPA 2022P3915). 2022. Available from: https://hdp-au-prod-app-nswepa-yoursay-files.s3.ap-southeast-2.amazonaws.com/9116/6027/3560/22p3915-sampling-design-guidelines-part1.pdf
- Eckert D, Sims JT. Recommended soil pH and lime requirement tests. In: Recommended Soil Test Procedures for the Northeastern United States. Cooperative Bulletin No. 493; 2009. p. 19-26.
- Schulte EE, Hoskins B. Recommended soil organic matter tests. In: Recommended Soil Test Procedures for the Northeastern United States. 2011. p. 52-60.
- Ashworth J, Keyes D, Kirk R, Lessard R. Standard procedure in the hydrometer method for particle size analysis. Commun Soil Sci Plant Anal. 2001;32(5-6):633-642.
- González-Curbelo MÁ, Hernández-Borges J, Borges-Miquel TM, Rodríguez-Delgado MÁ. Determination of pesticides and their metabolites in processed cereal samples. Food Addit Contam A. 2012;29(1):104-116.
- Varela-Martínez DA, González-Curbelo MÁ, González-Sálamo J, Hernández-Borges J. Determination of 45 pesticides in avocado varieties by the QuEChERS method and gas chromatography-tandem mass spectrometry. J Vis Exp. 2023;202:e66082.
- Varela-Martínez DA, González-Curbelo MÁ, González-Sálamo J, Hernández-Borges J. High-throughput analysis of pesticides in minor tropical fruits from Colombia. Food Chem. 2019;280:221-230.
- Varela-Martínez DA, González-Curbelo MÁ, González-Sálamo J, Hernández-Borges J. Analysis of pesticides in cherimoya and gulupa minor tropical fruits using AOAC 2007.1 and ammonium formate QuEChERS versions: A comparative study. Microchem J. 2020;157:104950.