연구 논문

LINC00707 억제가 LPS로 자극된 BV2 미세아교세포의 염증 및 산화 스트레스를 완화함 ~을 통해 척수 손상에서의 miR-145-5p/TRAF6 축

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2026년 9월 11일

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1Department of Nursing, Zhangjiakou First Hospital, 2Department of Orthopedics, Zhangjiakou First Hospital, 3Department of Pediatrics, Zhangjiakou First Hospital

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

혈장 LINC00707 발현은 척수 손상 시 증가하며, miR-145-5p/TRAF6 신호 전달 축을 통해 미세아교세포 매개 염증 및 산화 스트레스를 촉진합니다. LINC00707을 억제하면 이러한 병리적 반응이 완화되어, 치료 표적으로서의 잠재력이 확인되었습니다.

초록

척수 손상(SCI)은 평생 지속되는 장애를 유발하고 삶의 질을 심각하게 떨어뜨리며 상당한 사회경제적 부담을 줍니다. 본 연구에서는 miR-145-5p/TRAF6 신호 전달 축의 조절을 통해 LINC00707이 SCI에서 수행하는 역할을 조사하였습니다. 건강한 피험자 30명과 SCI 환자 75명의 혈장 샘플을 대상으로 RT-qPCR을 사용하여 LINC00707, miR-145-5p 및 TRAF6의 발현을 분석하였습니다. SCI 환자를 대상으로 혈장 LINC00707 수치와 전염증 인자 간의 연관성을 평가하였습니다. BV2 미세아교세포에 100 ng/mL LPS를 처리하고 염증 및 산화 스트레스 관련 인자를 측정하였습니다. 분자 간 상호작용은 이중 루시페라제 리포터 분석(dual-luciferase reporter assay)을 통해 평가하였습니다. LINC00707 발현과 관련된 요인을 식별하기 위해 로지스틱 회귀 분석을 사용하였습니다. SCI 환자에서 혈장 LINC00707 및 TRAF6 수치는 증가한 반면, miR-145-5p 수치는 감소하였습니다. 혈장 LINC00707 수치는 혈장 염증 인자 수치와 양의 상관관계를 보였습니다. LINC00707은 miR-145-5p의 분자 스펀지(molecular sponge)로 작용하였으며, TRAF6는 miR-145-5p의 표적 유전자였습니다. BV2 세포에서 LINC00707을 억제하면 염증 인자, 산화 스트레스 유발 물질 및 TRAF6 mRNA 수치가 감소하였습니다. miR-145-5p를 억제했을 때는 반대 효과가 나타났습니다. 이러한 결과는 LINC00707 발현 증가가 SCI 중증도와 관련이 있으며, LINC00707 넉다운(knockdown)이 miR-145-5p/TRAF6 신호 전달 축을 조절함으로써 미세아교세포 매개 염증과 산화 스트레스를 완화할 수 있음을 시사합니다.

서론

척수 손상(SCI)은 중추신경계의 핵심 구성 요소인 척수에 손상을 입히는 외상성 상태입니다. SCI는 척수와 뇌 사이의 신경 전도 경로를 직접적으로 차단하여 운동, 감각 및 자율신경 기능에 심각한 장애를 초래합니다1,2. 역학 연구에 따르면 연간 발생률은 100,000명당 약 5건이며, 질환 관련 사망률은 최대 16.7%에 달하는 것으로 보고되었습니다3,4. 캐나다의 한 조사에서는 SCI 환자 1인당 평생 재활 비용이 최대 US$336,000에 이르는 것으로 추정했습니다5. 높은 발생률과 사망률, 그리고 진단, 치료 및 재활과 관련된 상당한 비용으로 인해 SCI는 개선된 치료 전략이 필요한 주요 임상적 과제가 되었습니다.

척수 손상(SCI)의 병리적 진행은 1차 손상과 2차 손상의 두 단계로 구성됩니다. 1차 손상은 척수 조직의 외상성 기계적 압착 또는 파열로 인해 발생하며, 2차 손상은 염증 및 산화 스트레스를 포함한 병리적 과정에 의해 매개됩니다6,7. 생리적 조건에서 미세아교세포 매개 신경염증은 중추신경계의 항상성 유지에 기여합니다8,9,10. 그러나 SCI 이후 미세아교세포는 과도하게 활성화되어 다량의 염증성 매개체를 방출합니다11,12. 이러한 매개체들은 활성산소종(ROS)의 과잉 생산을 유도하여 신경세포의 손상과 사멸을 초래하고 2차 척수 손상을 악화시킵니다13,14. 따라서 과도한 미세아교세포 활성화를 억제하고 염증 연쇄 반응을 차단하는 것은 SCI 이후 신경학적 회복을 촉진하고 예후를 개선하기 위한 유망한 치료 전략이 됩니다.

긴 비부호화 RNA(lncRNA)는 200개 이상의 뉴클레오타이드로 구성되며 단백질 부호화 능력이 없는 비부호화 RNA의 한 종류이다.15초기에는 전사 단계의 것으로 간주되었으나 "노이즈," lncRNA는 이제 다양한 생리적 및 병리적 과정의 중요한 조절자로 인식되고 있습니다.16최근 연구들에 따르면 lncRNA가 신경 손상에서 결정적인 역할을 하는 것으로 나타났습니다. Long intergenic non-protein-coding RNA 707(LINC00707)은 신경계 질환의 중요한 조절 인자로 부상했습니다. 이전 연구들은 LINC00707이 미세아교세포 매개 염증을 강화함으로써 외상성 뇌손상을 악화시킨다고 보고한 바 있습니다.17또한, Zhu는 외 등 LINC00707의 발현을 억제함으로써 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)로 유도된 PC12 세포의 염증 및 세포사멸이 유의하게 감쇠됨을 입증하였다18이러한 결과는 척수 손상(SCI)에서 LINC00707의 관여를 탐구하기 위한 예비적인 이론적 근거를 제공합니다. 그러나 LINC00707이 척수 손상 동안 미세아교세포 매개 염증을 조절하는지 여부는 아직 규명되어야 합니다.

LncRNA는 경쟁적 내인성 RNA(ceRNA) 메커니즘을 통해 분자 스펀지 역할을 하여 microRNA(miRNA)를 격리하고 하위 표적 유전자의 발현을 조절합니다19. 이러한 조절 패턴은 다양한 질환의 병리 기전에 널리 관여하고 있습니다. 특히, miR-145-5p는 척수 손상(SCI) 조직20 및 LPS로 유도된 손상 과정21에서 발현이 유의하게 감소하며, 이를 과발현시키면 미세아교세포의 염증 및 산화 스트레스 반응이 효과적으로 완화됩니다22. Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6 (TRAF6) 또한 SCI 병리에 있어 중추적인 역할을 합니다23,24,25. 그럼에도 불구하고, LINC00707, miR-145-5p 및 TRAF6가 SCI에서 협동적인 조절 기능을 수행하는지는 아직 밝혀지지 않았습니다.

본 연구에서는 LPS로 자극된 미세아교세포에서 LINC00707의 발현이 유의하게 상향 조절되었습니다. 이에 따라 우리는 LINC00707이 미세아교세포에서 염증 촉진 조절자로 작용할 수 있으며, 이를 넉다운하면 신경 염증 반응이 완화되어 척수 손상(SCI)의 병리적 진행이 개선될 것이라고 가설을 세웠습니다. 본 연구에서는 LINC00707이 미세아교세포의 염증 반응을 조절하고 SCI 발병 기전에 기여하는지 조사하였습니다.

프로토콜

본 연구는 Zhangjiakou First Hospital 윤리 위원회의 승인을 받았습니다(승인 번호 2024-KY-18). 모든 참가자는 등록 전 연구 목적과 잠재적 위험에 대해 안내받았으며 서면 동의서를 제출하였습니다. 정맥혈 샘플은 일반 건강 검진 중의 건강 대조군과 병원 입원 직후의 SCI 환자로부터 수집되었습니다. 실험실 측정은 병원 임상 검사실에서 수행되었습니다. 본 프로토콜에 사용된 연구 도구는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 대상자
2023년 1월부터 2025년 1월 사이에 Zhangjiakou First Hospital에서 총 75명의 SCI 환자를 모집하였다. 선정 기준은 컴퓨터 단층촬영(CT) 또는 자기공명영상(MRI)으로 확인된 SCI이며, 부상 후 병원 입원까지의 시간이 12 h 이하인 경우였다. 제외 기준은 지난 6개월 이내의 척수 또는 뇌 외상이나 수술 이력이 있는 경우, 심근경색 또는 부정맥을 포함한 심각한 심혈관 질환, 임신 또는 수유, 악성 종양, 간 또는 신장 기능 장애, 심각한 뇌혈관 질환 또는 감염성 질환이었다.

미국 척수손상협회(ASIA)의 신경학적 분류 표준26에 따라, SCI 환자 75명을 정상 신경 기능(n = 21), 불완전 SCI(n = 36), 그리고 완전 SCI(n = 18) 그룹으로 분류하였다. 손상 부위의 분포는 경추 36.0%, 흉추 30.7%, 요추 33.3%였다. 연구 대상군과 매칭된 건강한 성인 30명을 무작위로 모집하여 대조군으로 설정하였다. 모든 참여자에 대해 기초 임상 정보를 수집하였다. 건강한 대조군의 선정 기준은 척수 또는 뇌 외상, 수술 또는 신경계 질환의 병력이 없어야 하며, 만성 염증성 질환, 자가면역 질환 또는 악성 종양의 병력이 없어야 하고, 심각한 심혈관, 간 또는 신장 질환이 없어야 하며, 최근 4주 이내에 급성 또는 만성 감염이 없어야 하고, 임신 또는 수유 중이 아니어야 하며, 연령과 성별이 SCI 그룹과 매칭되어야 하는 것으로 하였다.

일상 활동의 기능적 독립성을 평가하기 위해 기능적 독립 측정 도구(Functional Independence Measure, FIM)를 사용하였습니다. FIM의 최고 점수는 126점입니다. 감각 및 운동 기능을 평가하기 위해 촉각, 통각 및 운동 점수를 사용하였습니다. 촉각과 통각의 최고 점수는 각각 112점이었으며, 운동 점수의 최고 점수는 100점이었습니다. 점수가 낮을수록 신경학적 손상이 더 심각함을 나타냅니다.

2. 세포 배양, 모델 구축 및 형질전환
불멸화된 마우스 미세아교세포 BV2를 상하이 생물공학연구소 세포자원센터에서 분양받았다. 세포는 10% fetal bovine serum (FBS), penicillin (100 U/mL) 및 streptomycin (100 U/mL)이 첨가된 high-glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)에서 배양하였다. 세포는 5% CO₂가 포함된 습윤 인큐베이터 내 37 °C에서 유지하였다.

모델 구축을 위해 BV2 세포를 0, 10, 20, 50, 100, 150 또는 200 ng/mL의 lipopolysaccharide (LPS)로 24시간 동안 자극하였다. 실험 결과를 바탕으로 최적의 LPS 농도를 선정하였다.

형질전환을 위해, BV2 세포를 6-well 플레이트에 분주하고 적절한 합류도(confluence)에 도달했을 때 형질전환을 수행하였다. 제조사의 지침에 따라 웰당 1.5 µL의 형질전환 시약을 사용하였다. 6시간 후, 배양액을 신선한 배지로 교체하고 세포를 24시간 동안 추가로 배양하였다. LINC00707 knockdown 컨스트럭트, 해당 음성 대조군, miR-145-5p 올리고뉴클레오타이드 및 해당 대조군 올리고뉴클레오타이드를 각각 웰당 50 nM의 농도로 사용하였다. 모든 형질전환 실험은 독립적으로 최소 5회 반복하였으며, 각 독립 실험당 3개의 병행 반복구를 두었다. 데이터는 최소 5회의 독립적인 실험 결과를 사용하여 통계적으로 분석하였다.

3. ELISA
형질전환 및 LPS로 자극한 BV2 세포의 배양 상층액을 12,000 × g에서 10분 동안 원심분리하여 수집하였으며, 해당하는 ELISA 키트를 사용하여 interleukin-1β (IL-1β), IL-6 및 tumor necrosis factor-α (TNF-α)의 수치를 측정하였다. 간단히 설명하면, 제조사의 지침에 따라 비오틴화 항체, HRP-스트렙타비딘 결합체 및 TMB 기질을 순차적으로 반응시켜 분석을 수행하였다. 흡광도는 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서 기록하였다. 사이토카인 수치는 표준 곡선을 통해 결정하였다. 각 샘플은 3회 반복 측정하였으며, 6회의 독립적인 실험을 수행하였다.

4. ROS 측정
LPS로 자극된 BV2 세포의 세포 내 ROS 수치는 활성산소 측정 키트를 사용하여 측정하였다. 간단히 설명하면, 세포를 10 µmol/L DCFH-DA와 함께 37 °C에서 20분 동안 배양하였다. 배양 후 상층액을 제거하고, 세포를 인산염 완충 식염수(PBS)로 3회 세척하여 과잉의 세포 외 프로브를 제거하였다. 형광 강도는 마이크로플레이트 리더를 사용하여 들뜸 및 방출 파장 각각 488 nm와 525 nm에서 측정하였다. 상대적 ROS 수치는 형광 강도를 기반으로 계산하였다. 모든 시료는 3회 반복 분석하였으며, 전체 실험은 독립적으로 최소 5회 반복하였다.

5. 말론디알데히드, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 및 글루타치온 검출
처리된 BV2 세포를 수집하고 세포 균질물을 준비하였다. 상층액을 얻기 위해 샘플을 4 °C에서 12,000 × g로 10분 동안 원심분리하였다. 세포 상층액 내의 말론디알데히드(MDA), 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD) 및 글루타치온(GSH) 수치를 측정하기 위해 제조사의 지침에 따라 상용 검출 키트를 사용하였다. 모든 샘플은 3회 반복 분석하였으며, 전체 실험은 독립적으로 최소 5회 반복하였다.

6. 이중 루시퍼레이스 리포터 분석
예측된 miR-145-5p 결합 부위를 포함하는 LINC00707 및 TRAF6의 3' 비번역 부위(3' UTR) 단편과 이에 상응하는 돌연변이 서열을 pmirGLO 루시퍼레이스 리포터 벡터에 클로닝하여 야생형(WT-LINC00707 및 WT-TRAF6)과 돌연변이형(MUT-LINC00707 및 MUT-TRAF6) 리포터 구조물을 제작하였다. BV2 세포에 리포터 구조물과 miR-145-5p 올리고뉴클레오타이드를 함께 트랜스펙션하고 24시간 동안 배양하였다. 이후 세포를 수집하여 마이크로플레이트 리더를 이용해 firefly 및 Renilla 루시퍼레이스 활성을 측정하였다.

7. RT-qPCR
RNA 추출 시약을 사용하여 총 RNA를 추출하였다. RNA 품질은 OD₂₆₀/OD₂₈₀ 비율을 통해 평가하였으며, 1.8에서 2.0 사이의 값을 적정 수준으로 간주하였다. 역전사 키트를 사용하여 약 1 µg의 총 RNA를 cDNA로 역전사시켰다. 유전자 발현은 SYBR Green PCR 마스터 믹스를 이용한 RT-qPCR로 정량화하였다. 역전사는 42 °C에서 15분 동안 수행되었으며, 이후 95 °C에서 3분 동안 역전사 효소를 불활성화시켰다. 합성된 cDNA는 분석 시까지 −20 °C에 보관하였다. 정량적 실시간 PCR은 95 °C에서 1분간의 사전 변성 후, 95 °C에서 5초간의 변성과 60 °C에서 15초간의 어닐링 및 신장 과정을 40회 반복하여 수행하였다. 형광 신호는 각 어닐링 및 신장 단계의 끝에서 수집되었다. 융해 곡선 분석은 95 °C에서 15초, 이어서 60 °C에서 1분 동안 수행되었다. 상대적 발현 수준은 2⁻ΔΔCt법을 사용하여 계산하였다. 유전자 발현 정규화를 위한 내부 참조 유전자로 GAPDH 또는 5S를 사용하였다. 프라이머 서열은 다음과 같다: LINC00707, 정방향 5'-CCAACAGGGTATCAGAATTCTC-3' 및 역방향 5'-TGCTGACAATAGCCATTAGG-3'; miR-145-5p, 정방향 5'-GCCGAGGTCCAGTTTTCCCA-3' 및 역방향 5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'; TRAF6, 정방향 5'-ATTACAACTGAGGTGCTTCT-3' 및 역방향 5'-GCATCTGGTTCTGTTATAGGA-3'; GAPDH, 정방향 5'-ATCCCATCACCATCTTCCAGG-3' 및 역방향 5'-CGCCCCACTTGATTTTGG-3'; 5S, 정방향 5'-TCGTCTGATCTCGGAAGCTAA-3' 및 역방향 5'-AAGCCTACAGCACCCGGTAT-3'.

8. 통계 분석
통계 분석은 통계 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 데이터 분포의 정규성은 Shapiro-Wilk 검정을 통해 평가했으며, P > 0.05인 경우 정규 분포로 간주하였습니다. 정규 분포를 따르는 데이터는 평균 ± SD로 표시하였고, 비정규 분포 데이터는 중앙값 (P25, P75)으로 표시하였습니다. 정규 분포를 보이는 연속 변수의 경우, 2개 그룹 간의 비교는 Student's t-test를 사용하였고, 여러 그룹 간의 비교는 one-way ANOVA 후 Tukey's post hoc test를 통해 수행하였습니다. 비정규 분포 데이터의 경우, 2개 그룹 비교에는 Mann-Whitney U test를, 여러 그룹 비교에는 Kruskal-Wallis test를 사용하였습니다. 그룹 간 범주형 변수 분석에는 chi-square test를 사용하였습니다. LINC00707 발현과 관련된 임상 요인을 평가하기 위해 단변량 및 다변량 로지스틱 회귀 분석을 사용하였습니다. 연속 변수는 코호트 중앙값을 기준으로 이분화하였습니다 (고값 그룹 = 1; 저값 그룹 = 0). 단변량 로지스틱 회귀 분석에서 P < 0.05인 변수들을 다변량 로지스틱 회귀 분석에 포함시켰습니다. 결과는 95% 신뢰 구간 (CIs)을 포함한 오즈비 (ORs)로 표시하였으며, OR > 1은 양의 상관관계를, OR < 1은 음의 상관관계를 나타냈습니다. 모든 세포 표현형 실험은 최소 4회의 독립적인 생물학적 반복 실험을 포함하였으며, 각 생물학적 반복 실험당 3회의 기술적 반복 실험을 수행하였습니다. P < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였습니다.

결과

SCI 환자의 혈장 LINC00707 수치가 상승됨
30명의 건강한 피험자와 75명의 SCI 환자의 기저 임상 특성을 분석하였습니다. 건강한 피험자와 비교하여 SCI 환자는 촉각, acmesthesia, 운동 및 기능적 독립성 측정(FIM) 점수가 현저히 낮았으며, 이는 감각 및 운동 기능의 손상을 나타냅니다. 또한, SCI 환자의 혈청 내 염증성 사이토카인 수치가 건강한 대조군보다 유의하게 높았으며(표 1, P < 0.001), 이는 염증 반응이 강화되었음을 시사합니다.

항목HSSCIP-값
(n=30)(n=75)
연령 (years)45.83±10.0646.17±9.920.786
BMI (kg/m2)22.82±1.5723.94±1.290.69
성별 (남성, n)18410.619
흡연 (n)11280.949
음주 (n)14330.804
SCI의 ASIA 분류 (n)/
완전 SCI/18
불완전 SCI/36
정상 신경 기능/21
SCI 손상 수준 (n, %)/
경추/27 (36.0%)
흉추/23 (30.7%)
요추/25 (33.3%)
촉각 점수/53.42±22.12
근감각 점수/53.39±24.68
운동 점수/49.07±18.74
기능적 독립성 측정 점수/71.33±19.41
IL-1β (pg/mL)1.47±0.5252.21±11.32<0.001
IL-6 (pg/mL)2.14±0.9788.47±23.52<0.001
TNF-α (pg/mL)2.84±1.1361.09±18.24<0.001
CRP (mg/L)1.42±0.6362.67±21.85<0.001
약어: HS, 건강한 피험자; SCI, 척수 손상; BMI, 체질량 지수; ASIA, 미국 척수 손상 협회; FIM, 기능적 독립성 측정; IL, 인터루킨; TNF, 종양 괴사 인자; CRP, C-반응성 단백질.

표 1: 건강한 대조군과 척수 손상 환자 간의 기저 임상 특성 비교. 이 표는 건강한 대조군과 척수 손상 환자 간의 인구통계학적 특성, 신경학적 기능 점수, 손상 관련 변수 및 염증 마커 수치를 비교합니다. 약어: HS, 건강한 대조군; SCI, 척수 손상; ASIA, 미국 척수 손상 협회; FIM, 기능적 독립성 측정; IL, 인터루킨; TNF, 종양 괴사 인자; CRP, C-반응성 단백질.

RT-qPCR을 사용하여 혈장 LINC00707 발현량을 정량화하였다. 건강한 피험자와 비교했을 때, SCI 환자의 혈장 LINC00707 발현이 유의하게 증가하였다(그림 1A, P < 0.001). 수신자 조작 특성(ROC) 곡선 분석 결과, LINC00707 발현이 건강한 피험자와 SCI 환자를 구별하는 데 어느 정도의 판별 가치를 가질 수 있다는 예비 근거가 확인되었다(그림 1B). 또한, SCI의 임상적 중증도가 증가함에 따라 혈장 LINC00707 발현이 증가하였다(그림 1C, P < 0.001). 상관관계 분석 결과, 혈장 LINC00707 발현은 IL-1β (r = 0.635, P < 0.001), IL-6 (r = 0.612, P < 0.001), TNF-α (r = 0.675, P < 0.001) 및 C-반응성 단백질(CRP; r = 0.611, P < 0.001) 수치와 양의 상관관계를 보였다(그림 1D–G). 이러한 결과는 LINC00707 발현의 증가가 SCI 환자의 염증 반응과 관련이 있음을 시사한다.

발현 분석 막대 그래프 A, C; ROC 곡선 B; 상관관계 산점도 D-G; 과학적 데이터 비교.
그림 1: 혈장 LINC00707 발현 및 혈장 염증 인자와의 상관관계. (A) 척수 손상(SCI) 환자의 혈장 LINC00707 발현이 건강한 대조군보다 높았다. 통계 분석은 독립 표본 t-검정을 사용하여 수행되었다. (B) 수신자 조작 특성(ROC) 곡선 분석 결과, LINC00707 발현이 SCI 환자와 건강한 대조군을 구분하는 데 유용할 수 있다는 초기 지표가 제공되었다. (C) 미국 척수 손상 협회(ASIA) 분류에 따른 SCI 중증도가 증가함에 따라 혈장 LINC00707 발현이 증가하였다. 통계 분석은 일원 분산 분석(one-way ANOVA) 후 Tukey의 HSD 사후 검정을 사용하여 수행되었다. (D–G) 혈장 LINC00707 발현은 염증 인자 수치와 양의 상관관계를 보였다. 통계 분석은 Pearson 상관 분석을 사용하여 수행되었다. *P < 0.01 및 **P < 0.001. 건강한 대조군, n = 30; SCI 환자, n = 75. 데이터는 평균 ± SD로 표시되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

단변량 및 다변량 로지스틱 회귀 분석을 이용한 LINC00707 발현 관련 요인 분석
LINC00707 발현과 관련된 요인을 확인하기 위해 단변량 및 다변량 로지스틱 회귀 분석을 수행하였다. 단변량 분석 결과, SCI의 ASIA 분류(OR = 3.912, 95% CI: 1.792–8.537, P < 0.001), FIM 점수(OR = 0.281, 95% CI: 0.108–0.729, P = 0.009), 그리고 CRP 수치(OR = 4.600, 95% CI: 1.724–12.271, P = 0.002)가 LINC00707 발현과 연관이 있는 것으로 나타났다. 잠재적 교란 변수를 보정한 후 다변량 로지스틱 회귀 분석을 실시한 결과, SCI의 ASIA 분류(OR = 2.598, 95% CI: 1.088–6.203, P = 0.032), FIM 점수(OR = 0.303, 95% CI: 0.102–0.902, P = 0.032), 그리고 CRP 수치(OR = 3.202, 95% CI: 1.024–10.015, P = 0.045)가 LINC00707 발현과 관련된 독립적 요인임이 확인되었다(Table 2). 더 심각한 ASIA 분류 및 상승된 CRP 수치는 LINC00707의 높은 발현과 연관이 있었으며, 반면 더 높은 FIM 점수는 LINC00707의 낮은 발현과 연관이 있었다. 이러한 연관성은 LINC00707이 SCI의 병리적 과정에 관여할 가능성을 더욱 뒷받침한다.

품목단변량 회귀 분석다변량 회귀 분석
또는95% 신뢰구간P-값또는95% 신뢰구간P-값
연령 1.1760.475-2.9140.725
성별1.3030.524-3.2400.57
척수손상(SCI)의 ASIA 분류법 3.9121.792-8.537<0.0012.5981.088-6.2030.032
SCI의 ASIA 분류법0.5880.497-1.4800.582
촉각 인지 점수0.850.343-2.1050.725
아크메스테시아 점수(Acmesthesia score)0.8540.345-2.1190.734
운동 점수0.3920.153-1.0060.051
FIM 점수0.2810.108-0.7290.0090.3030.102-0.9020.032
IL-1β1.1810.475-2.9350.72
인터루킨-6 1.4530.585-3.6080.42
TNF-α1.3040.526-3.2330.567
C-반응성 단백질 4.61.724-12.2710.0023.2021.024-10.0150.045
약어: OR, 오즈비; CI, 신뢰구간; ASIA, 미국척수손상협회; FIM, 기능적 독립성 측정; IL, 인터루킨; TNF, 종양괴사인자; CRP, C-반응성 단백질.

표 2: LINC00707 발현과 관련된 요인의 로지스틱 회귀 분석. 이 표는 척수 손상 환자에서 LINC00707 발현과 관련된 임상적 요인을 식별하기 위해 사용된 단변량 및 다변량 로지스틱 회귀 분석 결과를 보여줍니다. 결과는 95% 신뢰 구간을 포함한 오즈비와 그에 해당하는 P 값으로 제시되었습니다. 약어: OR, 오즈비; CI, 신뢰 구간; ASIA, 미국척수손상협회; FIM, 기능적 독립성 측정; IL, 인터루킨; TNF, 종양괴사인자; CRP, C-반응성 단백질.

LINC00707 넉다운은 LPS로 자극된 BV2 세포의 염증 및 산화 스트레스를 완화했다
BV2 세포를 농도별 LPS(0, 10, 20, 50, 100, 150 또는 200 ng/mL)로 처리했다. RT-qPCR 분석 결과, 100, 150 및 200 ng/mL LPS 처리 후 LINC00707 발현이 유의하게 증가했다(그림 2A, P < 0.001, n = 6). 이러한 결과와 이전 보고들27˒28을 바탕으로, in vitro SCI 모델을 구축하기 위해 100 ng/mL LPS를 선택했다. 대조군과 비교하여 LPS로 자극된 BV2 세포에서 LINC00707 발현이 유의하게 높아졌다. si-LINC00707 전이(transfection)는 LINC00707 발현을 효과적으로 억제했다(그림 2B, P < 0.001, n = 6).

이어서 LINC00707 넉다운이 염증 및 산화적 스트레스에 미치는 영향을 평가하였다. LPS 자극은 IL-1β (그림 2C, P < 0.001, n = 5), IL-6 (그림 2D, P < 0.001, n = 5), TNF-α (그림 2E, P < 0.001, n = 5)의 분비를 유의하게 증가시켰으며, 세포 내 ROS 수치 (그림 2F, P < 0.001, n = 6)와 MDA 함량 (그림 2G, P < 0.001, n = 5) 또한 유의하게 증가시켰다. 반면, LPS 자극은 항산화 마커인 SOD (그림 2H, P < 0.001, n = 6) 및 GSH (그림 2I, P < 0.001, n = 5)의 수치를 유의하게 감소시켰다. LINC00707을 억제하면 LPS로 자극된 BV2 세포에서 전염증성 사이토카인의 분비와 산화적 스트레스 마커 수치가 유의하게 감소했으며, 항산화 수치는 회복되었다. 이러한 결과는 LINC00707 넉다운이 BV2 세포에서 LPS로 유도된 염증 반응과 산화적 스트레스를 완화시킨다는 것을 나타낸다.

LPS 유도 실험에서 사이토카인 발현 및 생화학적 파라미터를 분석한 막대 그래프 시리즈.
그림 2: LPS로 자극된 BV2 세포의 염증 및 산화적 스트레스에 미치는 LINC00707 넉다운의 효과. BV2 세포를 100 ng/mL lipopolysaccharide (LPS)로 자극하였다. (A) 서로 다른 농도의 LPS를 처리한 BV2 세포에서 RT-qPCR로 LINC00707 발현을 측정하였다. (B) LINC00707 발현은 LPS 군에서 증가하였으며 si-LINC00707 트랜스펙션 후 감소하였다. (C–E) ELISA 결과, 전염증 인자의 분비는 LPS 군에서 증가하였고 LINC00707 넉다운 후 감소하였다. (F–G) 활성 산소종 (ROS) 수치와 malondialdehyde (MDA) 함량은 LPS 군에서 증가하였고 LINC00707 넉다운 후 감소하였다. (H–I) Superoxide dismutase (SOD) 활성과 reduced glutathione (GSH) 수치는 LPS 군에서 감소하였고 LINC00707 넉다운 후 증가하였다. **P < 0.001; ns, 유의미하지 않음. n ≥ 5. 통계 분석은 one-way ANOVA 후 Tukey’s HSD 사후 검정을 사용하여 수행되었다. 데이터는 평균 ± SD로 표시되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

LINC00707은 miR-145-5p의 분자 스펀지(molecular sponge)로 작용함
LINC00707의 생물학적 기능의 기저에 있는 분자 메커니즘을 조사하기 위해, ENCORI 데이터베이스를 사용하여 잠재적 표적 miRNA를 예측하였다. 생물정보학 분석을 통해 LINC00707과 miR-145-5p 사이의 상보적 결합 서열을 확인하였다 (그림 3A). 이중 루시페라아제 리포터 분석 결과, WT-LINC00707 구조체에서의 루시페라아제 활성은 miR-145-5p mimic에 의해 유의하게 감소하고 miR-145-5p inhibitor에 의해 증가하였다. 반면, MUT-LINC00707 구조체에서는 두 처리 모두 루시페라아제 활성에 영향을 주지 않았으며 (그림 3B, P < 0.001, n = 4), 이는 LINC00707과 miR-145-5p 간의 직접적인 상호작용을 입증한다.

RT-qPCR 분석 결과, 척수손상(SCI) 환자의 혈장 miR-145-5p 발현은 건강한 대조군에 비해 유의하게 감소한 것으로 나타났습니다(그림 3C, P < 0.001). 또한, LINC00707 발현은 miR-145-5p 발현과 음의 상관관계를 보였으며(그림 3D, P < 0.001), 혈장 miR-145-5p 수준은 SCI 중증도가 증가함에 따라 점진적으로 감소하였습니다(그림 3E, P < 0.001). In vitro 실험에서 LPS로 자극된 BV2 세포의 miR-145-5p 발현은 대조군 세포에 비해 유의하게 감소했으나, LINC00707 넉다운 시 miR-145-5p 발현이 회복되었습니다(그림 3F, P < 0.001, n = 6). 이러한 결과는 LINC00707이 miR-145-5p를 격리함으로써 경쟁적 내인성 RNA(ceRNA)로 작용하며, 이를 통해 SCI의 병리적 진행 과정에서 miR-145-5p의 발현을 조절함을 시사합니다.

유전자 발현 분석; miR-145-5p, 루시퍼레이즈 분석, 상관관계 그래프; 막대 그래프, 서열 정렬.
그림 3. LINC00707은 miR-145-5p의 분자 스펀지로 작용한다. (A) ENCORI 데이터베이스를 통해 LINC00707과 miR-145-5p 사이의 상보적 결합 서열을 예측하였다. (B) 이중 루시퍼레이즈 리포터 분석을 통해 LINC00707과 miR-145-5p 사이의 상호작용을 확인하였다. 통계 분석은 two-way ANOVA 후 Tukey’s HSD 사후 검정을 사용하여 수행하였다. (C) RT-qPCR 결과, SCI 환자의 혈장 miR-145-5p 발현이 감소한 것으로 나타났다. 통계 분석은 독립 표본 t-검정을 사용하여 수행하였다. (D) SCI 환자에서 LINC00707 발현은 miR-145-5p 발현과 음의 상관관계를 보였다. 통계 분석은 Pearson 상관 분석을 사용하여 수행하였다. (E) ASIA 분류에 따른 SCI 중증도가 증가함에 따라 혈장 miR-145-5p 발현이 감소하였다. 통계 분석은 one-way ANOVA 후 Tukey’s HSD 사후 검정을 사용하여 수행하였다. (F) miR-145-5p 발현은 LPS 군에서 감소하였으며, si-LINC00707 전이 후에는 증가하였고, miR-145-5p 억제제 전이 후에는 감소하였다. 통계 분석은 one-way ANOVA 후 Tukey’s HSD 사후 검정을 사용하여 수행하였다. P < 0.05, *P < 0.01, **P < 0.001; ns, 유의하지 않음. 건강한 피험자, n = 30; SCI 환자, n = 75; 세포 실험, n ≥ 4. 데이터는 평균 ± SD로 표시되었다. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

miR-145-5p 억제는 LPS 자극 BV2 세포에서 염증 및 산화적 스트레스를 강화했다
miR-145-5p의 역할을 조사하기 위해 BV2 세포에 miR-145-5p 억제제 또는 그에 해당하는 음성 대조군을 형질전환하였다. 이어서 염증성 사이토카인 및 산화적 스트레스 마커의 수치를 평가하였다. 억제제 음성 대조군 그룹과 비교하여, miR-145-5p 억제는 IL-1β (그림 4A, P < 0.001, n = 5), IL-6 (그림 4B, P < 0.001, n = 5) 및 TNF-α (그림 4C, P < 0.001, n = 5)의 분비를 유의하게 증가시켰다. 또한, 세포 내 ROS 수치 (그림 4D, P < 0.001, n = 6)와 MDA 함량 (그림 4E, P < 0.001, n = 5)은 유의하게 증가한 반면, SOD (그림 4F, P < 0.001, n = 6) 및 GSH (그림 4G, P < 0.001, n = 5) 수치는 유의하게 감소했다. 이러한 결과는 miR-145-5p의 억제가 BV2 세포에서 LPS로 유도된 염증 및 산화적 스트레스에 대한 LINC00707 넉다운의 보호 효과를 역전시킨다는 것을 나타낸다.

유전자 억제 연구에서 LPS 처리 시 단백질 발현 수준을 비교한 막대 그래프.
그림 4: BV2 세포의 염증 및 산화 스트레스에 미치는 miR-145-5p 억제의 효과. (A–C) ELISA 결과, miR-145-5p 억제제 형질전환 후 염증성 인자의 분비가 유의하게 증가했다. (D–E) miR-145-5p 억제제 형질전환 후 활성산소(ROS) 수준과 말론디알데히드(MDA) 함량이 유의하게 증가했다. (F–G) miR-145-5p 억제제 형질전환 후 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD) 활성과 글루타치온(GSH) 수준이 유의하게 감소했다. **P < 0.001. n ≥ 5. 통계 분석은 one-way ANOVA 후 Tukey’s HSD 사후 검정을 사용하여 수행되었다. 데이터는 평균 ± SD로 표시되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

TRAF6가 miR-145-5p의 표적 유전자로 확인됨
miRDB 데이터베이스를 통해 TRAF6가 miR-145-5p의 잠재적 표적일 것으로 예측되었다. TRAF6의 3′ UTR과 miR-145-5p 사이의 상보적 결합 서열이 확인되었다 (그림 5A). 이중 루시퍼레이스 리포터 분석 결과, WT-TRAF6 구조체에서의 루시퍼레이스 활성은 miR-145-5p mimic에 의해 유의하게 감소하고 miR-145-5p inhibitor에 의해 증가했다. 반면, MUT-TRAF6 구조체에서는 두 처리 모두 루시퍼레이스 활성에 영향을 주지 않았으며 (그림 5B, P < 0.001, n = 4), 이를 통해 TRAF6가 miR-145-5p의 직접적인 표적임을 확인하였다.

RT-qPCR 분석 결과, SCI 환자의 혈장 TRAF6 mRNA 발현이 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다(그림 5C, P < 0.001). TRAF6 발현은 miR-145-5p 발현과 음의 상관관계를 보였으며(그림 5D, P < 0.001), 혈장 TRAF6 mRNA 수준은 SCI 중증도가 심해질수록 증가했습니다(그림 5E, P < 0.001). In vitro 실험에서 TRAF6 발현은 대조군에 비해 LPS로 자극된 BV2 세포에서 유의하게 증가했으나, LINC00707 넉다운 후에는 유의하게 감소했습니다(그림 5F, P < 0.001, n = 6). 반대로, miR-145-5p를 억제하면 TRAF6 발현이 회복되었습니다(그림 5G, P < 0.001, n = 6). 이러한 결과는 LINC00707이 miR-145-5p 신호 전달 경로를 통해 TRAF6 발현을 조절함을 시사합니다.

miR-145-5p 상호작용을 포함한 유전자 발현 조절 도식; 방정식, 차트, 데이터 포함.
그림 5: TRAF6는 miR-145-5p의 표적 유전자이다. (A) miRDB 데이터베이스를 통해 TRAF6와 miR-145-5p 사이의 상보적 결합 서열을 예측하였다. (B) dual-luciferase 리포터 분석을 통해 TRAF6와 miR-145-5p 사이의 표적 관계를 확인하였다. 통계 분석은 two-way ANOVA 후 Tukey’s HSD 사후 검정을 사용하여 수행하였다. (C) RT-qPCR 결과, SCI 환자의 혈장 TRAF6 발현이 증가되어 있었다. 통계 분석은 independent-samples t-test를 사용하여 수행하였다. (D) SCI 환자에서 TRAF6 발현은 혈장 miR-145-5p 발현과 음의 상관관계를 보였다. 통계 분석은 Pearson 상관 분석을 사용하여 수행하였다. (E) ASIA 분류에 따른 SCI 중증도가 증가함에 따라 혈장 TRAF6 발현이 증가하였다. 통계 분석은 one-way ANOVA 후 Tukey’s HSD 사후 검정을 사용하여 수행하였다. (F) LPS로 자극한 BV2 세포에서 TRAF6 발현이 증가하였으며, LINC00707 넉다운 후에는 감소하였다. 통계 분석은 one-way ANOVA 후 Tukey’s HSD 사후 검정을 사용하여 수행하였다. (G) miR-145-5p 억제 후 TRAF6 발현이 증가하였다. 통계 분석은 one-way ANOVA 후 Tukey’s HSD 사후 검정을 사용하여 수행하였다. P < 0.05, *P < 0.01, **P < 0.001; ns, 유의하지 않음. 건강한 대조군, n = 30; SCI 환자, n = 75; 세포 실험, n ≥ 4. 데이터는 평균 ± SD로 표시되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

데이터 가용성:
본 연구에서 생성 및/또는 분석된 데이터 세트는 Zenodo 리포지토리(https://doi.org/10.5281/zenodo.21470454)에서 이용 가능합니다.

토론

척수 손상(SCI)은 중추신경계의 심각한 외상성 질환으로, 척수를 통한 신경 전도의 손상 또는 완전한 소실을 초래하여 평생 지속되는 운동, 감각 및 자율신경 기능 장애뿐만 아니라 심각한 생리적, 심리적 결과를 야기합니다29˒30. 이러한 손상의 심각성은 일반적으로 SCI의 범위가 넓어질수록 증가합니다. 본 연구에서 혈장 LINC00707 발현은 SCI 환자에게서 증가했으며, 순환 전염증성 사이토카인 수치와 양의 상관관계를 보여, SCI 관련 염증 및 산화 스트레스에서 LINC00707의 잠재적 역할이 있음을 시사했습니다. 이러한 임상적 발견을 바탕으로, 본 연구진은 SCI 병인 기전의 맥락에서 LPS로 처리한 BV2 세포 내 염증 및 산화 스트레스에 대한 LINC00707의 조절 역할을 추가로 조사하였습니다.

LINC00707은 여러 신호 전달 경로의 조절을 통해 다양한 생물학적 과정에 관여하는 것으로 알려져 있습니다31. LINC00707은 세포 증식, 세포 사멸, 이동 및 침윤을 조절할 뿐만 아니라, 염증 반응과 산화 스트레스에도 참여하는 것으로 나타났습니다18˒32˒33. 이전 연구들에 따르면 폐암34, 유방암35, 자궁경부암36 및 간암37에서 LINC00707의 발현이 증가하며, 이는 하위 분자 표적을 조절함으로써 질병의 진행을 촉진합니다. 또한, LINC00707의 발현을 억제하면 miR-103a-3p 조절을 통해 골수 중간엽 줄기세포의 골분화가 촉진됩니다38. Zou et al.은 LINC00707이 MRC-5 세포에서 LPS로 유도된 염증 반응을 촉진한다는 것을 추가로 입증하여, 이의 염증 촉진 역할을 뒷받침하였습니다33. 이러한 결과와 일치하게, 본 연구에서는 LPS로 자극된 BV2 세포에서 LINC00707의 발현이 유의미하게 증가했으며, LINC00707의 넉다운(knockdown)은 전염증성 사이토카인 생성과 산화 스트레스 마커를 감소시켰음을 보여주었습니다. 이러한 발견은 LINC00707이 염증 및 산화 스트레스 반응에 관여한다는 점을 더욱 뒷받침합니다.

LINC00707은 류마티스성 심장질환39, 방광암40 및 골분화41를 포함한 여러 병리적 상태에서 miR-145-5p를 조절함으로써 경쟁적 내인성 RNA (ceRNA)로 기능하는 것으로 보고된 바 있다. 이전 연구들에 따르면 miR-145-5p는 염증과 산화 스트레스를 억제42˒43하고 혈관 형성 및 신경 회복을 촉진함으로써44˒45 SCI에서 보호 효과를 나타낸다. 이러한 관찰 결과와 일치하게, 본 연구에서는 SCI 환자와 LPS로 자극된 BV2 세포에서 혈장 miR-145-5p 발현이 감소했음을 보여주었다. 또한 LINC00707이 miR-145-5p와 직접적으로 상호작용함이 확인되었으며, LINC00707을 사일런싱하자 miR-145-5p 발현이 회복되었다. 더욱이 miR-145-5p를 억제하면 염증 반응 및 산화 스트레스에 대한 LINC00707 넉다운의 보호 효과가 역전되었다. 이러한 발견은 LINC00707이 miR-145-5p 매개 염증 및 산화 스트레스 반응을 조절함으로써 SCI 진행에 기여할 수 있음을 시사한다.

이전 연구들은 TRAF6가 중추신경계 질환에서 중요한 역할을 한다는 것을 입증했습니다46. 또한 TRAF6를 억제하면 SCI가 유의하게 개선될 수 있다는 증거가 제시되었습니다47˒48. 본 연구에서는 TRAF6가 miR-145-5p의 직접적인 표적임을 추가로 확인했습니다. TRAF6 발현은 SCI 환자와 LPS로 자극된 BV2 세포에서 유의하게 증가했습니다. 또한, LINC00707 넉다운은 TRAF6 발현을 감소시킨 반면, miR-145-5p 억제는 TRAF6 발현을 회복시켰습니다. 이러한 결과는 SCI 과정 동안 LINC00707이 miR-145-5p를 통해 TRAF6 발현을 조절할 수 있음을 시사합니다.

본 연구는 LINC00707이 miR-145-5p/TRAF6 신호 전달 축을 조절함으로써 척수 손상(SCI) 동안 미세아교세포 매개 염증 반응 및 산화 스트레스 손상에 영향을 미칠 수 있음을 시사합니다. 이러한 발견은 LINC00707 넉다운이 PC-12 세포에서 LPS로 유도된 염증과 세포 사멸을 완화했음을 입증한 Zhu et al.의 이전 보고와 일치합니다. 다만, 해당 연구의 기저 메커니즘에는 miR-30a-5p/Neurod1 축이 관여했습니다18. 종합적으로, 이러한 결과는 LINC00707이 단일 miRNA 표적을 통해 작용하는 것이 아니라 세포 유형에 따라 서로 다른 miRNA 네트워크를 통해 작용함으로써 SCI의 병리학적 과정에 기여할 수 있음을 시사합니다.

본 연구에는 몇 가지 제한점이 있습니다. 첫째, TRAF6 mRNA 발현만을 평가하였으며 단백질 발현은 조사하지 않았습니다. 향후 연구에서는 LINC00707, miR-145-5p 및 TRAF6 간의 조절 관계를 더욱 명확히 규명하기 위해 Western blot 분석과 같은 단백질 수준의 검증이 포함되어야 합니다. 둘째, 본 연구는 in vivo 검증 없이 LPS로 자극된 BV2 미세아교세포 모델을 사용하여 세포 수준에서만 수행되었습니다. 척수손상(SCI) 미세환경의 복잡성을 고려할 때, 현재의 결과가 in vivo에서의 병태생리학적 조건을 완전히 재현하지 못했을 수 있습니다. LINC00707이 SCI 동물 모델에서도 유사한 염증 촉진 효과를 나타내는지는 확인이 필요합니다. 향후 연구에서는 SCI 동물 모델을 구축하여 LINC00707의 조절 역할과 그 기저의 분자적 메커니즘을 검증할 예정입니다. 셋째, 본 연구 결과는 LINC00707이 miR-145-5p/TRAF6 신호 전달 경로를 통해 염증에 영향을 미친다는 것을 나타내지만, LINC00707이 단순히 특정 miRNA의 스펀지로만 작용하는지 아니면 특정 단백질과 직접 결합하는지도 아직 알려지지 않았습니다. 이러한 기전적 세부 사항을 밝히기 위한 추가 연구가 필요합니다. 넷째, ROC 곡선 분석은 단일 의료 센터의 데이터와 상대적으로 적은 수의 환자를 대상으로 수행되었습니다. 이로 인해 편향이 발생했을 수 있으며, 결과가 예비적일 수 있습니다. 확인된 바이오마커의 진단적 잠재력을 확인하기 위해서는 더 많은 환자를 포함하는 대규모 다기관 연구가 필요합니다.

본 연구의 결과는 LINC00707이 SCI의 잠재적인 탐색적 혈장 바이오마커 및 치료 표적이 될 수 있음을 시사합니다. 그러나 이러한 발견을 임상 응용으로 옮기기 위해서는 몇 가지 추가 단계가 필요합니다. 첫째, 혈장 LINC00707의 잠재적 판별 가치를 더 큰 규모의 다기관 코호트, 독립적인 검증 코호트 및 관련 외상 또는 염증 대조군에서 평가해야 합니다. 임상적 평가와 방사선 검사는 SCI 진단을 위한 일차적인 접근 방식으로 유지됩니다. 둘째, LINC00707 표적화의 치료적 잠재력을 동물 모델에서 평가하여 그 효능과 안전성을 검증해야 합니다. 궁극적으로 LINC00707/miR-145-5p/TRAF6 신호 전달 경로를 조절하는 것은 SCI 환자의 신경 염증과 산화 스트레스를 완화하는 새로운 접근 방식이 될 수 있으나, 기초 연구와 임상 적용 사이의 간극을 메우기 위해 상당한 연구가 더 필요합니다.

전반적으로 SCI 환자와 LPS로 자극된 BV2 세포에서 혈장 LINC00707 및 TRAF6 발현은 증가한 반면, miR-145-5p 발현은 감소하였습니다. LINC00707 넉다운은 miR-145-5p/TRAF6 신호 전달 축을 통해 염증 반응과 산화 스트레스를 완화시켰으며, 이는 해당 조절 경로가 SCI의 잠재적인 치료 표적이 될 수 있음을 시사합니다.

공개 사항

저자들은 이해관계의 충돌이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 Hebei 의과학 연구 프로젝트(지원 번호 20251479)의 지원을 받아 수행되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.5 mL 마이크로원심분리 튜브KIRGENKG2211폴리프로필렌 스냅 캡 튜브, DNase/RNase-free, 비발열성, 최대 원심분리력 20,000 × g, RNA/단백질 시료 보관 및 원심분리용.
6-웰 세포 배양 플레이트Corning3516평평한 바닥의 TC 처리된 폴리스티렌 플레이트, 멸균 및 개별 포장; 웰 부피는 16.8 mL이며 배양 면적은 9.5 cm²임
채혈 바늘Becton, Dickinson and Company367283BD Vacutainer 일회용 채혈 바늘. 정맥 천자용 끝단과 홀더 및 진공 튜브에 연결하여 다중 튜브 채혈이 가능한 끝단으로 구성된 양단 바늘 설계입니다. 삽입 시 환자의 불편함을 최소화하기 위해 실리콘 코팅 처리되었습니다.
채혈관Becton, Dickinson and Company367605BD Vacutainer 진공 혈액 채취관. 서로 다른 색상으로 구분된 캡은 다양한 첨가제를 나타내며, 이는 특정 실험실 검사와 대응합니다.
BV2 불멸화 마우스 미세아교세포주상하이 생명공학 연구소 세포 자원 센터RRID: CVCL_0182미세아교세포 특이적 마커(Iba1, CD11b, F4/80)를 안정적으로 발현하는 불멸화된 생쥐 미세아교세포주입니다. LPS 자극 시, BV2 세포는 전염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6, TNF-$\alpha$α) 및 세포 내 ROS와 MDA를 축적시켜 척수 손상 후의 생체 내 미세아교세포 염증 활성화를 모방합니다. 세포는 10% FBS와 1%가 첨가된 고농도 포도당 DMEM에서 배양합니다.× 페니실린-스트렙토마이신, ~에서 유지된 37 °C 5% CO 포함2 가습 배양기; 70% 밀도에 도달 시 계대 배양–과활성화를 방지하기 위해 80% 합류도(confluence)를 유지하십시오.
세포 말론디알데히드(MDA) 분석 키트남경 건성 바이오엔지니어링 연구소A003-4-2지질 과산화의 표지자인 세포 내 말론디알데하이드를 정량적으로 검출하기 위한 마이크로플레이트 기반의 비색 키트입니다. MDA는 가열 조건에서 티오바비투르산(TBA)과 반응하여 붉은색 부가물을 형성하며, 마이크로플레이트 분광광도계를 사용하여 532 nm에서 흡광도를 측정합니다. 세포 용해물 샘플에 최적화되었으며, 96-웰 기반의 고처리량 분석이 가능하고, 미세아교세포의 낮거나 중간 정도의 지질 산화 수준을 아우르는 선형 정량 범위를 제공합니다.
일산화탄소2 배양기Thermo Scientific3111가습된 워터 재킷형 CO22 184L 내부 용량 및 IR CO2 센서가 장착된 배양기2 센서, 미생물 오염을 최소화하기 위한 HEPA 공기 여과 시스템. 다음의 상태에서 안정적인 배양 환경을 유지합니다. 37 °C, 5% CO22 및 장기 부착 세포 배양을 위한 포화 습도.
Dual Luciferase 리포터 유전자 분석 키트Beyotime BiotechnologyRG028이 듀얼 루시페라아제 키트는 세포 용해물 내의 반딧불이 루시페라아제와 레닐라 루시페라아제를 순차적으로 정량 검출할 수 있게 합니다. 먼저 루시페린 기질을 사용하여 반딧불이 루시페라아제 신호를 측정하며, 이어지는 레닐라 검출 시약에는 기존 신호를 제거하는 강력한 소광제가 포함되어 있습니다. >99.9%의 잔류 반딧불이(firefly) 발광을 통해 coelenterazine 기질을 이용한 순수한 Renilla 신호 판독을 보장합니다. 본 키트에는 부착 세포 용해를 위한 전용 세포 용해 버퍼가 포함되어 있으며, 96-웰 마이크로플레이트 루미노미터와 호환됩니다. 반딧불이 시약은 직접 사용할 수 있도록 혼합된 액상 형태로 제공됩니다. ceRNA 표적 검증을 위한 정규화된 상대적 루시퍼라아제 활성(Firefly/Renilla 비율)을 계산하기 위해 반딧불이와 Renilla의 발광 값을 순차적으로 기록합니다.
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco11995065DMEM은 다양한 포유류 세포의 성장을 지원하기 위해 널리 사용되는 기초 배지입니다. 이 조성에는 고농도 포도당, L-글루타민, 페놀 레드 및 피루브산 나트륨이 포함되어 있습니다. 이 배지는 일반적으로 10% 소태아혈청(FBS)과 5%–10% CO2 생리학적 pH를 유지하기 위한 환경.
우태아혈청에브리 그린13011-8611프리미엄 등급 FBS, 저엔도톡신, 마이코플라스마 제거 & 박테리오파지 음성으로, 세포 성장을 돕기 위해 DMEM에 10% v/v로 첨가되었다.
GraphPad Prism 버전 9GraphPad Software, 미국 캘리포니아주 샌디에이고해당 사항 없음in vitro 세포 실험 데이터에 특화된 과학적 그래프 작성 및 통계 분석 소프트웨어. 모든 qPCR, ELISA, 산화 스트레스, dual-luciferase 발광 흡광도 원시 데이터를 Prism 9으로 가져와 정규성 검증, 모수/비모수 그룹 비교를 수행하고, 모든 정량적 수치를 도표화하며 평균을 산출함 ± 표준편차(SD), 정확한 P 값 및 95% 신뢰구간(CI)을 산출하였으며, 학술지 게재 표준을 충족하는 고해상도(300 dpi) 그림을 내보내기 하였습니다. 모든 그래프의 원본 .prism 프로젝트 소스 파일은 요구 사항에 따라 공공 데이터 저장소에 기탁되었습니다.
IBM SPSS Statistics 버전 26.0IBM Corporation, Armonk, NY, USA제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.임상 시료의 기선 데이터 정렬, 정규성 검정(Shapiro-Wilk 검정), 독립/비쌍체 t-검정, Tukey 사후 검정을 포함한 일원 분산 분석(one-way ANOVA)에 사용된 종합 통계 소프트웨어 패키지’다중 비교 보정, Mann-Whitney U 비모수 검정, 그리고 모든 인간 및 세포 정량 데이터셋에 대한 정확한 P-값 및 95% 신뢰 구간 계산을 수행하였습니다. 모든 임상 환자 인구통계 및 실험실 데이터는 해당 플랫폼 내에서 처리 및 분석되었습니다.
인터루킨-1 (IL-1)β SimpleStep ELISA 키트Abcamab255730이 1회 세척 샌드위치 비색 ELISA 키트는 독자적인 SimpleStep 기술을 적용하여, 전체 검출 과정을 90분 이내에 완료합니다. 본 키트는 쥐 인터루킨-1을 정량적으로 측정합니다.β 세포 배양 상층액, 혈청, EDTA/구연산/헤파린 혈장 시료에서 분석이 가능합니다. 검출 감도는 26.58 pg/mL에 달하며, 선형 정량 범위는 54.69–3500 pg/mL. 코팅된 분리 가능 8-웰 스트립 마이크로플레이트가 포함되어 있습니다. 마이크로플레이트 리더를 통해 450 nm에서 흡광도 신호를 검출하여 IL-1을 계산합니다.β 농도
IL-6 SimpleStep ELISA 키트Abcamab234570세포 배양 상층액, 혈청, 시트르산/EDTA/헤파린 혈장 시료 내 쥐 인터루킨-6(IL-6)의 정량적 검출에 최적화된 샌드위치比色법 SimpleStep ELISA 키트입니다. 1단계 배양 및 1회 세척 워크플로를 채택하여 총 분석 시간을 90분으로 단축하였으며, 검출 민감도는 43 pg/mL, 선형 정량 범위는 125 pg/mL에서 8000 pg/mL까지입니다. 사전 코팅된 분리형 8-웰 스트립 마이크로플레이트가 포함되어 있으며, 최종 IL-6 농도 계산을 위해 마이크로플레이트 분광광도계를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정합니다.
LightCycler 96-웰 멀티웰 플레이트, 화이트Roche LifeScience, 스위스4729692001LightCycler 96 실시간 PCR 기기에 특별히 최적화된 하프 스커트형 흰색 폴리프로필렌 96-웰 반응 플레이트입니다. 흰색의 웰 벽은 배경 형광 간섭을 줄이고 신호 반사를 강화하여 저발현 전사체의 검출 민감도를 향상시킵니다. 균일한 박막 설계로 모든 웰에 걸쳐 일관된 열전도율을 보장하며, 10에서 [내용 끊김] 사이의 반응 부피와 호환됩니다. 50 μLRNA 유래 cDNA 증폭 분석을 위해 DNase/RNase-free 및 파이로젠-free 상태여야 합니다.
LipofectamineTM 3000 형질전환 시약Thermo Fisher ScientificL3000015P3000 Enhancer와 함께 사용하는 지질 나노입자 형질전환 시약은 낮은 세포독성으로 BV2 미세아교세포에서 고효율의 siRNA/플라스미드 형질전환을 가능하게 합니다.
lnRcute lncRNA 제1가닥 cDNA 합성 키트TIANGENKR202-02본 키트는 낮은 발현량, 가변적인 GC 함량 및 복잡한 이차 구조를 가진 긴 비부호화 RNA(lncRNA)의 역전사를 위해 특별히 최적화되었습니다. 역전사 전 게놈 DNA 오염을 제거하기 위한 독립적인 gDNA 제거 버퍼와 전장 lncRNA 템플릿을 농축하기 위한 특수 lnR-RT 프라이머 믹스가 포함되어 있습니다. 변형된 역전사 효소는 10ng에서 2ng 범위의 총 RNA 입력물로부터 긴 가닥의 cDNA를 효율적으로 합성할 수 있게 합니다.
lnRcute lncRNA qPCR 검출 키트 (SYBR Green)TIANGENFP402lncRNA 정량을 위한 SYBR Green 기반의 전용 정량 PCR 프리믹스입니다. 항체 매개 핫스타트 DNA 중합효소를 통해 높은 증폭 특이성을 보장하며, H-competitor 성분이 고-GC 함량 lncRNA 템플릿의 이차 구조 간섭을 완화합니다. lnRcute lncRNA 역전사 키트로 생성된 cDNA와 호환되며, 저발현 lncRNA의 상대적 발현 정량에 적합합니다.
miR-145-5p 올리고뉴클레오타이드Generalbiol (중국 우한)해당 없음BV2 세포에서 miR-145-5p 활성을 조절하기 위해 사용된 합성 miR-145-5p mimic, inhibitor 및 해당 음성 대조군 올리고뉴클레오타이드. 발현, 염증, 산화 스트레스 및 dual-luciferase 리포터 분석에 사용됨.
miRcute Plus miRNA 제1가닥 cDNA 키트TIANGENKR211-02실험 워크플로우를 간소화하기 위해 poly(A) 꼬리 붙이기와 역전사를 결합한 단일 튜브 반응 방식을 채택하였습니다. 효소 믹스는 E. coli poly(A) polymerase, RNase H 결핍 역전사 효소 및 RNase 억제제를 포함하며, 이는 성숙한 단일 가닥 miRNA만을 특이적으로 표적하여 헤어핀 구조를 가진 pre-miRNA로 인한 증폭 간섭을 방지합니다. 세포 용해물, 혈장, 조직 샘플에서 추출한 miRNA에 적합합니다.
miRcute Plus miRNA qPCR 검출 키트 (SYBR Green)TIANGENFP411성숙한 miRNA 정량 분석에 최적화되어 miRcute 역전사 제품과 완벽하게 호환되는 SYBR Green 프리믹스입니다. 완충액 시스템이 짧은 miRNA 증폭산물의 프라이머 어닐링 효율을 개선하며, 안정적인 형광 신호와 낮은 발현량의 miRNA 검출을 위한 높은 민감도를 제공합니다. 정규화를 위한 내부 표준 물질로는 일반적으로 U6 snRNA가 사용됩니다.
페니실린-스트렙토마이신 용액 (100×)Beyotime BiotechnologyC022210,000 U/mL 페니실린과 10 mg/mL 스트렙토마이신이 포함된 멸균 여과 혼합물; 세균 오염 방지를 위해 배양액에서 1:100로 희석하여 사용함.
희석액 포함 활성 산소종 분석 키트Beyotime BiotechnologyS0034M본 키트는 DCFH-DA 형광 프로브를 사용하여 세포 내 활성산소종(ROS)을 정량화합니다. DCFH-DA는 세포막을 투과한 후 세포 내 에스테라제(esterase)에 의해 DCFH로 가수분해되며, 이는 ROS에 의해 산화되어 형광성 DCF를 생성합니다. 96-웰 마이크로플레이트 및 형광 마이크로플레이트 리더와 호환되어 고처리량 검출(Ex = 488 nm, Em = 525 nm)이 가능합니다. 전용 프로브 희석액과 Rosup 양성 대조군 시약이 포함되어 염색 신호를 안정화하며, 세포 용해 과정 없이 부착성 BV2 미세아교세포의 산화 스트레스 검출에 적합합니다.
환원형 글루타치온(GSH) 분석 키트남경 건성 생물공학 연구소A006-1-2핵심 세포 내 항산화제인 환원형 글루타치온(GSH)을 검출하기 위한 비색 마이크로플레이트 키트입니다. GSH는 dithiodinitrobenzoic acid(DTNB)와 반응하여 노란색 발색 생성물을 생성하며, 마이크로플레이트 리더를 통해 405nm에서 흡광도를 측정합니다. 본 키트는 표준 튜브 프로토콜을 고처리량 96-웰 마이크로플레이트 검출 방식으로 최적화하여 세포 용해물 항산화 분석에 적용하였습니다.
si-LINC00707GenePharma (중국 상하이)해당 사항 없음BV2 세포에서 LINC00707 발현을 감소시키기 위해 설계된 소간섭 RNA. LINC00707 넉다운이 염증 반응, 산화 스트레스, miR-145-5p 발현 및 TRAF6 발현에 미치는 영향을 평가하기 위한 기능 상실 실험에 사용됨.
si-LINC00707 NCGenePharma (중국 상하이)입력된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 제공해 주세요.si-LINC00707 형질전환의 음성 대조군으로 사용되는 비표적 소간섭 RNA(non-targeting small interfering RNA). 형질전환 과정 및 siRNA 노출로 인한 비특이적 영향을 제어하는 데 사용됨.
SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)TIANGEN4992777mRNA 상대 정량을 위한 범용 SYBR Green 정량적 PCR 프리믹스로, 핫스타트(hot-start) Taq 중합효소, dNTP, SYBR Green I 및 형광 정규화를 위한 ROX 참조 염료를 함유하고 있습니다. 비특이적 증폭이 적고 증폭 효율이 안정적이며, mRNA 표적 유전자(TRAF6, GAPDH 등) 정량에 널리 적용됩니다.
Thermo ScientificTM SorvallTM ST 8 소형 벤치탑 원심분리기Thermo Scientific75200709임상 실험실을 위한 전통적인 선택으로, 최대 24개까지 처리 가능합니다. × 한 번에 5/7 mL 혈액 수집 튜브를 처리할 수 있습니다. R 시리즈는 냉장 버전으로, 저온 원심분리가 필요한 시료를 더 효과적으로 보호할 수 있습니다.
TIANScript II 제1가닥 cDNA 합성 키트TIANGENGKR107-02최대 12kb의 장쇄 cDNA를 생성하기 위한 일반적인 mRNA 역전사 용도로 설계되었습니다. 유연한 프라이밍 전략을 위해 Oligo (dT) 15와 random hexamer 프라이머가 모두 제공됩니다. 변형된 M-MLV 역전사 효소는 GC 함량이 높거나 복잡한 2차 구조를 가진 mRNA를 효율적으로 읽어내며, 후속 mRNA qPCR 증폭과 폭넓은 호환성을 갖추고 있습니다.
TNF-α SimpleStep ELISA 키트Abcamab236712쥐 종양괴사인자(tumor necrosis factor)의 정량적 검출에 최적화된 신속 단일 세척 SimpleStep 샌드위치 ELISA 키트α (TNF-α) 세포 배양 상청액, 혈청 및 다양한 혈장 검체에서 측정하였습니다. 총 분석 시간은 90분이며, 1.04 pg/mL의 초고감도와 15.63 pg/mL에서 1000 pg/mL까지의 선형 검출 범위를 갖습니다. 탈착 가능한 8구의×12웰 사전 코팅 플레이트; 최종 TNF-α에 대한 450 nm에서의 OD 값을 기록합니다.α 정량적 계산
총 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 (T-SOD) 분석 키트남경건성생물공학연구소A001-3-2총 SOD 효소 활성을 검출하기 위한 WST-1 발색 마이크로플레이트 키트입니다. SOD는 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼을 제거하여 WST-1 환원 반응을 억제합니다. 활성 계산을 위해 마이크로플레이트 리더를 통해 450 nm에서 흡광도를 측정합니다. 세포 균질액, 혈청 및 조직 샘플에 적합하며, 색 발현이 안정적이고 재현성이 높아 항산화 능력 평가에 유용합니다.
TRIzol 시약Thermo Fisher Scientific15596018배양된 미세아교세포로부터 총 RNA를 단일 단계로 분리하기 위한 단상 페놀-구아니딘 이소티오시아네이트 시약; 동일한 시료로부터 DNA와 단백질을 동시에 추출함.

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