방법 논문

고생존율 단일 세포 현탁액 제작을 위한 마우스 유선 및 종양 조직의 해리

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DOI:

10.3791/72844

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2026년 8월 21일

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University, 2Department of Oncology, Wayne State University

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 유세포 분석 및 단일 세포 RNA 시퀀싱을 포함한 후속 분석을 위해 세포 표면 에피토프를 보존하면서, 생존력이 높은 마우스 유선 및 유선 종양 조직의 단일 세포 현탁액을 생성하는 재현 가능한 방법을 수립합니다.

초록

분석을 위해 조직을 단일 세포 부유액으로 해리하는 것은 종양 미세환경의 세포 수준에서 어떤 일이 일어나고 있는지 이해하는 데 도움이 됩니다. 오랫동안 지속된 과제는 일차 세포를 획득하고 활용하는 과정은 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-Seq)이나 유세포 분석을 통한 면역표형 분석과 같은 후속 처리를 위해 세포의 특성을 보존하면서 고품질의 세포 현탁액을 생산하는 것입니다. 일반적으로 조직은 기계적 파쇄, 효소 소화 및 여과의 조합을 통해 해리되며, 각 단계의 여러 요인이 결과물에 변동성을 초래합니다. 따라서 특정 조직 유형에 가장 적합한 방법을 찾기 위해 최적화 단계가 반드시 이루어져야 합니다. 예를 들어, 유선 지방 패드 조직은 지방 세포가 풍부하여 깨끗한 세포 현탁액을 얻고 생존 세포를 성공적으로 보존하는 것이 더 어렵습니다. 결과적으로, 유선 지방 패드 조직과 상피양 종양으로부터 비교 가능한 세포 현탁액을 생성하는 것은 까다로운 작업입니다. 본 프로토콜은 추후 분석을 위해 세포 표면 에피토프를 보존하면서, 마우스 유선 및 종양 조직으로부터 생존율이 높은 단일 세포 현탁액을 생성할 수 있는 재현 가능하고 비용 효율적인 방법을 구축합니다. 이 절차는 고품질의 scRNA-Seq 라이브러리를 제작하고 다중 파라미터 유세포 분석을 이용한 면역표형 분석을 수행하는 데 사용되었습니다.

서론

조직 해리는 단일 세포 현탁액의 획득과 조직 내 세포 유형의 특성 분석을 가능하게 합니다. 이는 침윤된 면역 세포가 조직 특이적 면역 반응의 기저 기전을 규명하는 데 도움을 줄 수 있으므로, 면역 요법에 대한 반응을 분석할 때 특히 중요합니다. HER2/neu 온코진을 인코딩하는 deoxyribonucleic acid (DNA) 백신 접종은 마우스 모델에서 자연 발생적인 HER2/neu 유도 유방 종양에 대해 보호 효과를 증가시킵니다1. 또한, DNA 백신 접종은 항체 생성과 interferon-γ (IFN-γ) 분비 T 세포를 특징으로 하는 전신 반응을 유도하는 것으로 나타났습니다1,2,3. 이러한 이유로, 본 연구에서는 국소 면역력을 수치화하기 위해 유방 종양 및 지방이 풍부한 유방선 조직을 해리하는 프로토콜 개발에 집중하였습니다. 조직을 단일 세포로 해리하기 위해서는 효소적 방법, 기계적 방법 또는 두 방법을 모두 사용하는 방법이 필요합니다. 효소적 해리와 관련된 한 가지 과제는 이러한 방법들이 종종 하룻밤 내내4 장시간 효소에 노출되어야 한다는 점입니다. 과도한 노출은 개별 세포와 표면 마커의 퇴화를 초래하며, 특히 면역 세포에 가장 치명적인 영향을 미칩니다5,6. 기계적 소화는 림프구 및 대식세포와 같은 면역 세포를 유리시키는 좋은 대안이 될 수 있지만, 기질을 효과적으로 분해하지 못해 상피 세포와 기질 세포의 대표성 있는 샘플을 얻기 어렵습니다. 최근에는 조직 해리를 위한 미세유체 기술이 탐구되었으며, 처음에는 용액 내의 세포 응집체를 분쇄하는 데 사용되었습니다7. 한 연구팀은 장치 내의 전단력을 이용하여 잘게 썬 조직을 추가로 분해하는 미세유체 접근법을 구현하였습니다8. 최적화된 해리를 60 min 동안 진행한 결과, 이 방법은 유방 조직의 기존 효소 소화 프로토콜과 비교하여 상피 세포는 2배, 혈관 내피 세포는 4배 증가한 수득률을 보였습니다. 하지만 간 샘플의 간세포 수득률을 측정할 때는 간세포의 크기와 취약성으로 인해 시간이 지남에 따라 수득률이 감소하는 문제가 발생했습니다. 따라서 세포의 무결성과 표면 에피토프를 보존하면서 여러 세포 유형의 깨끗하고 대표성 있는 샘플을 얻을 수 있는 절충안을 찾는 것이 매우 중요합니다.

소화 혼합물에 사용되는 효소는 일반적으로 일반적인 콜라게나아제(collagenases)9,10, 트립신(trypsin) (고형 조직 해리 가이드)4,10,11, 히알루로니다아제(hyaluronidase)9,10,11, 또는 디스파아제(dispase)4,9,10의 일부 조합을 포함하며, 효과적인 소화를 위해 각기 다른 시간이 소요됩니다. 본 프로토콜에서는 두 가지 특정 유형의 콜라게나아제인 콜라게나아제 type II와 콜라게나아제 D를 주요 소화 효소로 사용하며, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 보조적으로 사용하여 킬레이션을 통해 세포 간 결합을 더욱 약화시킵니다. 콜라게나아제 type II는 Clostridium histolyticum에서 생성되는 주요 해리 효소로, 세포외 기질 내의 작은 콜라겐 조각의 소화를 돕습니다. 콜라게나아제 D 또한 C. histolyticum에서 생성되며, 폐, 심장, 근육, 뼈, 신경 및 내피 조직과 같은 다양한 조직을 해리하는 데 널리 사용되어 왔습니다. 이 콜라게나아제는 세포 표면 단백질의 기능성과 무결성을 유지하는 데 도움을 주며, 이는 유세포 분석을 통한 후속 면역표현형 분석에 중요한 요소입니다. 콜라게나아제와 더불어, 조직은 유리 DNA를 분해하여 결과 세포 현탁액에서 이를 제거하는 디옥시리보핵산 I(DNase I)의 존재 하에 소화됩니다.

유선 조직 해리 과정에서만 나타나는 또 다른 어려움은 시료 내에 지방세포가 존재한다는 점입니다. 마우스가 노화됨에 따라 유선 지방 패드에는 상당수의 지방세포가 축적됩니다. 이러한 세포들은 더 취약하며 후속 처리 과정 중에 파열되기 쉬운데, 이로 인해 RNA와 세포 내 파편이 세포 현탁액으로 방출되어 주변 RNA 농도를 높이고 scRNA-Seq 라이브러리 제작을 방해하며 시료의 품질을 저하시킬 수 있습니다. 세포 외 DNA는 세포 응집을 유발할 수 있으므로, 시료의 무결성을 유지하기 위해 초기 효소 해리 후 남아 있는 모든 지방세포를 반드시 제거해야 합니다. 다행히 지방세포의 부유 성질을 이용하면 원심분리 시 나머지 세포들로부터 분리하는 데 도움이 됩니다. 원심분리 프로토콜을 사용하면 지방세포는 상층액의 표면에 머물게 됩니다. 이를 통해 지방세포가 일차 세포 펠릿에 포함되는 것을 방지하면서 상층액과 함께 제거할 수 있습니다. 필수 사항은 아니지만, 점진적 감속 과정을 포함하면 튜브 내의 코리올리스 힘(Coriolis forces)을 줄여 지방세포가 상단에 뚜렷한 층으로 유지되도록 돕습니다. 이는 특히 지방세포가 매우 풍부한 유선 조직을 다루거나 지방세포 제거가 연구의 주된 목적일 때 유용합니다12,13.

이러한 조직별 고려 사항을 염두에 두고, 우리는 비용 효율적이며 특수 장비가 필요하지 않고, 모조직으로부터 일관되게 높은 품질과 재현성을 갖춘 대표성 있는 세포 샘플을 얻을 수 있는 프로토콜을 수립하고자 했습니다.

프로토콜

본 프로토콜의 모든 절차는 미국 공중보건서비스(US Public Health Service)의 실험동물 사용 정책 및 미시간 주립대학교 기관동물관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인에 따라 수행되었습니다.

1. 마우스 종양 조직 및 유선 조직으로부터의 단일 세포 현탁액 생성:

조직 소화

  1. 모든 과잉 또는 미사용 마우스 조직은 생물학적 폐기물로 처리한다. 마우스 조직이나 세포가 오염된 플라스틱은 생물학적 폐기물함에 넣어 폐기한다. 세포가 포함된 용액은 생물학적 액체 폐기물 용기에 수집하고, 폐기 전 10% 표백제로 처리한다.
  2. 조직 소화를 위해 신선한 조직 소화 칵테일을 직전에 제조해야 한다. 각 샘플당 10 mL의 소화 칵테일(10 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI), 60 U DNase I, 25 mg Collagenase D, 50 mg Collagenase type II)이 필요하다. 사용 전까지 실온(RT)에서 보관한다.
  3. 경추 탈골법으로 마우스를 안락사시키며, 부수적인 안락사 방법으로 양측성 기흉법을 사용하며, 방혈 여부는 선택적으로 결정한다.
  4. 마우스를 앙와위로 놓고 다리를 바깥쪽으로 뻗게 하여 핀으로 고정한다.
  5. 털로 인한 샘플 오염을 방지하기 위해 마우스 전체에 70% 에탄올을 분사한다. 
  6. 서혜부 지방패드부터 목까지 마우스의 정중선을 따라 한 번에 절개하되, 복막을 찌르지 않도록 주의하고, 이어 각 다리를 따라 절개하여 역 'Y'자 형태의 절개선을 만든다.
  7. 둔성 박리법을 사용하여 피부를 아래의 복막으로부터 분리하며 피부를 펴고, 부검판 위에 피부를 평평하게 핀으로 고정한다. 
  8. 중간 크기의 종양 또는 유선/지방패드를 제거하여 10% fetal bovine serum (FBS)이 포함된 5 mL R10 세포 세척 배지(R10은 RPMI임)가 들어있는 50 mL 원추형 튜브에 넣는다.
    1. 가능하다면 괴사되었거나 혈액이 가득 찬 종양(외관상 매우 어둡고 말랑말랑함)의 사용은 피한다.
    2. 생물학적 안전 작업대(BSC) 내에서 유선 지방패드와 종양만을 깨끗한 페트리 접시에 옮긴다. 두 개의 외과용 메스 날을 사용하여 조직이 페이스트와 같은 점성이 될 때까지 미세하게 다진 후, 깨끗한 50 mL 튜브에 넣는다. 이 단계는 RT에서 수행한다.
  9. 샘플당 10 mL의 소화 칵테일을 첨가한다.
  10. 37 °C 진탕 배양기에서 250 revolutions per min (rpm)으로 30분 동안 배양한다.
  11. 최종 농도가 10 mM이 되도록 0.5 M EDTA를 첨가한다(10 mL 소화 완충액당 200 µL EDTA).
  12. 37 °C, 250 rpm의 진탕 배양기로 되돌려 5분 더 배양한다.
  13. 반응을 중단시키기 위해 40 mL의 R10 세포 세척 배지를 첨가한다.
  14. 소화된 세포를 70 µm 필터로 걸러 깨끗한 50 mL 튜브에 담아 덩어리를 제거한다.
  15. 가속도 설정 9, 감속도 설정 6으로 4 °C에서 10분 동안 500 x g로 원심분리하여 세포 펠릿을 형성한다(림프구 세포에만 관심이 있는 경우 원심분리 강도를 300 x g에서 5분으로 낮출 수 있다)14. 이는 지방세포가 풍부한 유선 조직의 해리를 수반하므로, 감속도를 낮춘 프로토콜이 원심분리 중 지방세포의 부유 특성으로 인해 형성되는 층을 유지하는 데 도움이 된다13.
  16. 상층액은 생물학적 폐기물로 버리고, 펠릿을 분산시킨 후 40 mL의 세포 세척 배지를 첨가하고 위와 같이 원심분리한다(단계 1.15). 이후 단계에서는 제동을 최대 감속도로 되돌릴 수 있으며, 그렇게 하지 않더라도 샘플에 부정적인 영향을 미치지 않는다.
  17. 40 mL의 R10 세포 세척 배지로 총 3회 세척하며, 원심분리는 단계 1.15와 동일하게 수행한다.
  18. 펠릿을 분산시키고 2 mL의 차가운 1 × PBS에 세포를 재현탁한다.
  19. 2배 부피의 1× RBC lysis buffer를 첨가한다. 10 × lysis buffer 농축액을 물을 사용하여 1 ×로 희석한다(예: 2 x = 2 mL 1 × PBS + 4 mL lysis buffer). 이 단계는 RT에서 수행한다.
  20. 튜브를 가끔 부드럽게 반전시켜 섞어주며 실온에서 5분 동안 배양한다.
  21. 동량의 R10 세포 세척 배지를 첨가하여 RBC lysis buffer를 중화한다.
  22. 세포 용액을 30 µm 필터로 걸러 15 mL 튜브에 담아 세포 잔해를 제거한다.
  23. R10 세포 세척 배지를 사용하여 부피를 15 mL로 맞춘다.
  24. 4 °C에서 10분 동안 500 x g로 원심분리한다.
  25. 상층액을 완전히 제거하고, 세포 수 측정 및 생존율 평가를 위해 세포 세척 배지로 최종 부피를 최대 5 mL까지 재현탁한다. 원하는 희석 배율로 재현탁한다. 이후 유세포 분석을 위한 염색 또는 scRNA-seq 준비 단계로 진행한다. 
  26. 별도로 명시되지 않는 한, 단계 사이에는 세포를 얼음 위에 보관한다.

2. 유세포 분석을 위한 단일 세포 현탁액 염색

  1. 원하는 세포를 5 mL 폴리프로필렌 라운드 바텀 튜브에 옮기고 얼음 위에 둔다.
  2. 형광 태그가 접합된 원하는 단클론 항체(mAb)를 사용하여 총 부피 (n + 1) × 100 µL의 세포 염색 용액을 flow PBS(490 mL 1x PBS, 10 mL FBS, 0.5g Sodium azide)로 제조한다. n을 샘플 수라고 할 때, (n+1) × 100 µL의 염색 용액을 준비한다 (예: 샘플 5개인 경우 6 × 100 µL = 600 µL)
    참고: Sodium Azide는 분말 형태일 때 발암물질이다. 적절한 개인 보호 장구를 착용하고, 모든 장비를 세척하여 화학 폐기물 보관함에 버리기 전에 azide가 용액 상태인지 확인한다.
  3. 염색할 각 샘플을 4 °C에서 500 x g로 5분 동안 원심분리한다. 100 µL의 염색 용액에 재현탁한다. 염색하지 않은 대조군은 1000 µL의 flow PBS에 재현탁한다.
  4. 빛으로부터 보호하기 위해 튜브를 덮고 4 °C에서 15분 동안 배양한다.
    ​참고: 형광 태그가 붙은 항체는 빛에 오래 노출되면 분해될 수 있으므로 배양 및 이후 샘플 보관 중에 계속 덮어두어야 한다.
  5. 염색된 각 튜브에 1 mL의 flow PBS를 추가하고 500 x g, 4 °C에서 5분 동안 원심분리하여 세척한다.
  6. 상층액을 제거하고 펠렛을 분산시킨 후, 세포를 1 mL flow PBS에 재현탁한다. 이전과 같이 원심분리한다(단계 2.5).
  7. 단계 2.6을 총 3회 반복하여 세척한다. 상층액을 제거하고 펠렛을 분산시킨다.
  8. 이후 필요한 염색 과정에 따라 고정액 또는 flow PBS에 세포를 재현탁한다.
  9. 세포를 고정하거나 세포 내 염색을 수행하는 경우에만 사용하며, 그렇지 않으면 단계 2.10으로 진행한다:
    1. 핵 내 염색이 가능하도록 각 샘플에 200 µL의 투과성/고정 용액을 추가한다. 
    2. 세포를 알루미늄 호일로 덮고 4 °C에서 최소 20분 동안 배양한다. 다른 날에 샘플을 가동할 계획이라면, 이 단계에서 샘플을 덮은 채로 4 °C에서 하룻밤 동안 보관할 수 있다.
    3. 고정 후, 샘플을 500 x g에서 5분 동안 원심분리하고 1 × 투과성 버퍼(증류수로 희석)에 재현탁한다.
    4. 2차 염색 또는 세포 내 염색을 준비하는 경우, 원하는 희석 배율의 1x 투과성 버퍼에서 샘플을 염색한다. 덮개를 씌운 튜브를 4 °C 인큐베이터에 15~20분 동안 둔다.
    5. 염색된 각 튜브에 1 mL 1x 투과성 버퍼를 추가하고 500 x g에서 5분 동안 원심분리하여 세척한다.
    6. 상층액을 제거하고 펠렛을 분산시킨 후, 세포를 1 mL 1x 투과성 버퍼에 재현탁한다. 이전과 같이 원심분리한다(단계 9.5).
    7. 단계 2.9.6을 총 3회 반복하여 세척한다. 상층액을 제거하고 펠렛을 분산시킨다.
    8. 세포를 200 µL 1x 투과성 버퍼에 재현탁하고 유세포 분석기로 가동할 때까지 얼음 위에 둔다.
  10. 세포를 고정하지 않는 경우, 200 µL의 flow PBS에 재현탁하고 유세포 분석기로 가동할 때까지 얼음 위에 둔다.
  11. scRNA-Seq 분석을 위해서는 잔해 및 사멸 세포 제거, RNA 품질 평가, 라이브러리 제작 프로토콜을 따른다.

3. scRNA-Seq 라이브러리 품질 평가

  1. 세포에 확실하게 매핑된 리드(read)의 비율이 높은지 확인하십시오. 이상적으로 이 수치는 90%보다 커야 합니다.
  2. 고유 분자 식별자(UMI) 수와 바코드를 비교하십시오. 고품질 샘플의 경우, 약 10,000개의 바코드에서 UMI 수가 급격히 감소하는 양상을 보입니다(바코드 랭크 플롯의 ‘니 벤드(knee bend)’ 지점).
  3. 균일 매니폴드 근사 및 투영(UMAP)을 검토하십시오. 유선이나 자연 발생 유방종양과 같은 복잡한 조직에서 얻은 고품질 샘플은 세포 클러스터가 뚜렷하고 잘 분리되어 나타납니다.
  4. 발현되는 미토콘드리아(mt-) 유전자의 수를 확인하십시오. 미토콘드리아 유전자 수가 많은 클러스터는 해당 세포가 죽었거나 죽어가는 상태임을 의미합니다.

결과

HER2는 여성의 공격적인 유선 종양을 유발하는 종양 온코진(oncogene)이며, HER2 표적 단클론 항체 치료를 받는 여성의 최대 70%가 치료에 반응하지 않거나 HER2 표적 치료에 대한 내성을 개발합니다.15,16,17,18최종 목표는 HER2/neu에 대한 면역 반응을 활성화하여 HER2 면역력을 향상시키고 생존율을 높이는 것입니다. HER2/neu 면역력을 연구하기 위해 HER2/neu에 의해 자발적인 유방 종양이 발생하는 면역 정상 마우스 모델이 사용됩니다.2,19HER2는 인간의 유전자에 의해 인코딩됩니다. Erbb2 및 쥐 유래 neu Erbb2BALB NeuT 마우스는 형질전환 랫드 유전자를 보유하고 있습니다. 신경(neu) MMTV 프로모터에 의해 발현되는 (NeuT) 트랜스진19Neu는 BALB 배경의 사춘기 암컷 생쥐의 유선에서 발현되며, 이는 관성 암종의 발생으로 이어진다(그림 1A, 삽입도) 모든 형질전환 암컷의 어느 하나 또는 모든 유선에서. 다음의 지속적인 발현은 신경(neu) 생후 14주에서 19주 사이에 촉진 가능한 종양이 발생하며, 이는 점진적으로 성장합니다.1자가 neu와 이종 HER2를 모두 인코딩하는 플라스미드 DNA(pNeuE2TM으로 명명)를 형질전환 생쥐에 접종하면 neu에 대한 면역 관용을 깨뜨릴 수 있으며, 이는 전신적인 neu 표적 다클론 항체와 IFN-γ 분비 비장 T 세포의 증가로 이어진다.1이러한 면역 반응은 neu 발현 TUBO 종양 세포의 거부 반응으로 이어졌습니다. 전신 반응은 유용한 정보를 제공하지만, 종양 부위에서의 작용 기전을 이해하는 데에는 한계가 있습니다. 따라서 본 연구에서는 세포 표면 마커를 유지하면서 높은 생존율의 단일 세포를 얻을 수 있는 유선 및 유선 종양 조직용 해리 프로토콜을 개발하고자 하였습니다. 그림 1 워크플로의 개요를 제공합니다. 간단히 설명하면, 수집 후 조직을 메스로 잘게 다집니다(그림 1B) 및 collagenase type II와 collagenase D를 2:1 비율로 혼합하고 DNase I을 첨가한 RPMI 기반 조직 소화 완충액에 넣은 후, 진탕 인큐베이터에서 30분 동안 처리하였다(그림 1C–D), 이어서 0.5 M EDTA로 5분간 추가 처리한다(그림 1E). FBS가 함유된 세척 완충액을 첨가하여 소화를 중단시키고, 혼합물을 여과하여 조직 파편을 제거합니다 (그림 1F). 세척 단계 및 적혈구 용해 과정 이후 (그림 1G–H), 세포를 30 $\mu$m 스트레이너로 여과한 후 수를 측정한다(그림 1I–K 그리고 그림 2이 시점에서 세포를 유세포 분석(flow cytometry) 또는 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-Seq)과 같은 하위 워크플로우에 할당할 수 있습니다.

직접적인 비교를 위해 상용 키트를 사용하여 평행하게 해리 과정을 수행하였다. ‘Tough’ 종양에 대해 발표된 프로토콜을 따랐으며, 효소 중화 후 샘플을 동일한 방식(즉, RBC 용해 등)으로 처리하였다. 상용 키트를 사용했을 때는 1.3 × 106 cells/mL이 76%의 생존율로 회수된 반면, 본 프로토콜을 사용했을 때는 4.5 × 106 cells/mL이 89%의 생존율로 회수되었다(Figure 2A,B). RBC 용해 후 두 프로토콜 간의 데브리(debris) 양은 비슷했다. 사멸 세포를 제거하기 위해 각 프로토콜에서 얻은 1 × 107 cells를 사멸 세포 제거 파이프라인으로 처리하였다. 상용 키트는 96%의 생존율로 1.3 × 106 cells/mL을 회수했으며, 본 프로토콜은 98%의 생존율로 1.94 × 106 cells/mL을 회수하였다(Figure 2C,D). 따라서 본 프로토콜은 특수 장비 없이도 후속 분석을 위해 더 높은 수율의 생존 세포를 제공하였다.

본 프로토콜을 통해 얻은 세포 현탁액의 품질과 재현성을 구체적으로 평가하기 위해, 16~18주령의 건강한 암컷 BALB 및 BALB NeuT 마우스에서 유선 샘플을 수집하였습니다. BALB NeuT 조직은 유선 조직과 종양 조직을 모두 포함하고 있었습니다. 서혜부 유선 지방 패드(제4 및 제9 유선)에서 조직을 채취하였으며, BALB NeuT의 경우 종양 조직을 포함하여 이후 분석을 위해 균질한 용액으로 분리하였습니다. 유선 수집 전 감시 림프절을 제거하였음에 유의하십시오.

처리 후, 세포 표면 마커의 유지와 세포 생존율을 확인하기 위해 유세포 분석을 수행하였으며(그림 3), 라이브러리 제작을 위한 세포 준비물의 품질을 검증하기 위해 scRNA-Seq 분석을 수행하였다(그림 4). 사멸 세포 제거 전, 유선 또는 종양 유래 단일 세포의 생존율은 평균 ≥85%였다. scRNA-Seq를 위해 생존율이 매우 높은 초기 세포 준비물을 만들기 위해 시판되는 사멸 세포 및 파편 제거 키트를 사용할 수 있다. 해당 프로토콜을 따른 결과, 단일 세포 준비물의 생존율은 94%에서 98% 사이였다(그림 2C,F). 본 프로토콜로 얻은 세포를 고정하여, 시판 Thermolysin을 사용하는 상업적 고정 우선 해리 프로토콜이라 불리는 scRNA-Seq 권장 고정 방법과 비교하였다(그림 2E,F). 상업적 고정 우선 해리 프로토콜은 1.5 × 107 cells/mL를 생성하였으며, 해리 전 조직을 고정시키므로 생존율은 측정하지 않았다. 반면, 본 프로토콜은 초기 생존율 94%에서 8.6 × 106 cells/mL를 얻었다. 따라서 상업적 고정 우선 해리 프로토콜 방법은 본 문서에서 보고한 프로토콜과 비슷하거나 약간 더 많은 수의 세포를 생성하였다.

유세포 분석기를 사용하여 세포를 염색하고 세포 표면 마커를 평가했습니다. 상피 세포(그림 3A)와 섬유아세포(그림 3B)는 각각 EpCAM 및 Pdgfrb/CD140a mAb로 염색하여 식별했습니다. BALB NeuT 마우스에 HER2/neu DNA를 3회 백신 접종했을 때 종양 발생이 유의하게 지연되고 전신 면역이 형성되었으므로, 유선 및 종양 내의 면역 세포를 평가하는 것이 특히 중요했습니다. 면역 계통의 CD45+ 세포는 세포 현탁액의 약 50%를 차지했습니다(그림 3C). B 세포와 T 세포의 존재는 B220/CD45R 및 CD3를 사용하여 평가했으며(그림 3D), CD3+T 세포는 다시 CD4와 CD8로 세분화했습니다(그림 3E). 희소 세포 집단을 유지하는 능력을 평가하기 위해, 샘플을 조절 T 세포에 대해 염색했습니다. 이를 위해 세포 샘플을 고정하고 Treg 특이적 전사 인자인 Foxp3로 염색했습니다. 조절 T 세포는 일반적으로 체내 전체 면역 집단에서 작은 비율을 차지하지만, 면역 체계 조절에서의 역할은 암 연구 및 자가면역 질환 분야에서 매우 중요합니다. 따라서 조직 해리 프로토콜을 고려할 때, 조절 T 세포와 같이 수는 적지만 강력한 면역 세포 집단을 안정적으로 포착하는 것이 중요합니다. Foxp3+ 조절 T 세포는 먼저 CD3+CD4+ 세포를 CD25(고친화성 IL-2 수용체) 및 Foxp3 발현으로 서브 게이팅하여 식별했습니다. 이 게이팅 전략을 사용했을 때, CD4+ 세포의 약 5%가 두 마커 모두에 양성이었으며, 약 25%는 Foxp3에 양성이었으나 CD25는 낮거나 음성이었습니다(그림 3F). 별도의 종양 샘플에서 CD64를 평가하여 이 해리 기술을 통해 CD64+ 대식세포를 성공적으로 분리할 수 있음을 확인했습니다(그림 3G). 더 넓은 골수성 그룹을 식별하기 위해, F4/80+ 대식세포와 수지상 세포로 식별되는 F4/80- CD11c+ 세포를 분석했습니다(그림 3H). 수지상 세포는 전체 세포의 약 3%를 차지한 반면, CD11b+Ly6G+ 호중구는 약 5%를 차지했습니다(그림 3H,I). 따라서 위 프로토콜을 사용하여 유선 및 종양 조직을 모두 해리한 후 CD45+ 세포의 표면 에피토프를 안정적으로 회복하고 보존할 수 있었습니다.

scRNA-Seq 라이브러리 제작을 위해 제출하기 전, 샘플의 RNA 무결성을 평가할 수 있습니다. 상용 프로토콜 또는 본 논문에서 보고한 프로토콜을 사용하여 준비한 신선한 샘플은 각각 1.9와 2.2의 A260/230 비율을 나타냈습니다. 고정된 샘플은 200 뉴클레오타이드(nt)보다 긴 리드의 백분율을 결정하여 평가합니다. 본 논문에서 보고한 프로토콜에 따라 즉시 고정하고 –에서 보관한 결과,80 °C, 그 결과 샘플의 83%에서 리드가 검출되었습니다 > 200 nt.

시료의 품질

scRNA-Seq 라이브러리 제작 및 시퀀싱 후, 샘플 품질을 평가하였다(그림 4). scRNA-Seq 샘플 라이브러리는 먼저 세포 호출(cell calling) 및 매핑 품질 지표, 바코드 랭크 플롯, 시퀀싱 포화도 및 UMAP 투영을 사용하여 평가한다. 본 프로토콜에 기술된 해리 방법을 사용하여 BALB 유선 조직을 해리한 결과 16,182개의 세포가 얻어졌으며, 리드의 97%가 세포에 할당되어 세포 외 RNA에 할당된 리드가 거의 없는 건강한 샘플임을 나타냈다. 세포 외부에서 기록된 리드의 비율이 높으면 죽었거나 죽어가는 세포로부터 유래한 주변 mRNA 오염 수준이 증가했음을 의미한다. 매핑 품질은 프로브 세트에 매핑된 프로브의 백분율이며, 본 실험에서는 99.1%였다. 시퀀싱 포화도는 정체기에 도달하여, 고유한 유전자가 아닌 이미 식별된 유전자가 반복적으로 시퀀싱되고 있음을 나타냈다. 바코드 랭크 플롯은 바코드 대비 UMI 수를 보여주며, 고품질 샘플은 ~10K UMIs 지점에서 뚜렷한 하락 또는 '니 벤드(knee bend)'를 보인다(그림 4A). 마지막으로, UMAP 투영은 여러 개의 뚜렷한 클러스터를 보여준다(그림 4A). 이러한 모든 지표는 해당 scRNA-Seq 라이브러리가 고품질임을 나타낸다.

본 프로토콜의 품질을 Flex chemistry에 권장되는 상용 고정 후 해리 프로토콜과 비교하기 위해, 상용 고정 후 해리 프로토콜을 본 프로토콜과 병행하여 수행하고 생성된 라이브러리의 품질을 평가하였습니다. BALB 유선 샘플에 대한 상용 고정 후 해리 프로토콜에서는 720개의 세포가 회수되었으며, 세포 내 리드 비율은 68%, 매핑 품질은 89.3%였습니다. 마찬가지로 포화도는 정체기에 진입하기 시작했으나, 유전자/세포 수는 생세포 해리 방식보다 뚜렷하게 낮았습니다(생세포 해리 4,500 genes/cell vs. 상용 고정 후 해리 프로토콜 1,000 genes/cell). 바코드 랭크 플롯에서는 니 벤드(knee bend)가 나타나지 않았으며(그림 4B), 뚜렷한 클러스터들이 존재하지만 그 수가 더 적었습니다(그림 4B).

BALB NeuT 종양 함유 유선 조직 라이브러리에 대해서도 품질 평가를 수행하였다(그림 4C,D). 본 논문에서 기술한 생세포 분리법을 사용한 결과, 18,077개의 세포가 시퀀싱되었으며, 리드의 97%가 세포 내에 존재하였고 99.1%가 프로브 세트에 매핑되었다. 니 벤드(knee bend)가 뚜렷하게 나타났으며(그림 4C), 클러스터 간의 구분 또한 명확하였다(그림 4C). 상용 고정 우선 분리 프로토콜은 종양이 존재할 때 더 나은 성능을 보였으며, 7,119개의 세포가 시퀀싱되었고 리드의 91%가 세포 내에 존재하였으며 리드의 98.6%가 프로브 세트에 매핑되었다. 바코드 순위 도표(그림 4D)에서 더 양호한 니 벤드가 관찰되었으나, 시퀀싱 포화 상태임에도 불구하고 UMAP 투영 결과에서는 뚜렷한 클러스터가 거의 나타나지 않았다(그림 4D).

추가적인 품질 지표에는 세포 클러스터별로 발현되는 미토콘드리아 유전자의 수를 결정하는 것이 포함됩니다. 우수한 세포 분리는 샘플 품질을 나타내며, 'reads in cell' 비율이 높을수록 샘플의 상태가 건강함을 의미합니다. 미토콘드리아 유전자(‘mt-’로 표시)의 수가 많은 세포는 오픈 소스 및 벤더 제공 클러스터링 도구를 사용하여 식별하고 제거할 수 있습니다. 직접적인 샘플 비교는 Cell Ranger 애플리케이션으로 샘플을 통합하여 직접적인 생물정보학적 비교를 수행하거나, 오픈 소스 및 벤더 제공 클러스터링 도구의 ‘integration’ 스크립트를 사용하여 수행할 수 있습니다. 세포 클러스터는 알려진 세포 계통 마커(예: 면역 세포의 경우 CD45/Ptprc, 상피 세포의 경우 EpCAM, 섬유아세포의 경우 Fap 또는 Pdgfra)를 쿼리하여 식별합니다. 알려진 계통 마커로 세포 클러스터를 정의할 수 없는 경우, 유전자 세트 풍부도 분석 도구를 사용하여 가장 높게 발현된 상위 10~15개 유전자를 분석함으로써 가능한 세포 유형에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다. 또는, 참조 세포-아틀라스 도구를 사용하여 상위 발현 유전자를 쿼리함으로써 알려진 세포 유형에서의 발현 여부를 확인할 수 있습니다.


미토콘드리아 유전자 수가 많은 세포를 각 샘플에서 제거한 결과, BALB 유선에서는 16,114개 세포(미토콘드리아 유전자 함량이 높은 세포의 0.5%)가, BALB NeuT에서는 18,024개 세포(0.3%)가 남았습니다. 상용 고정-선해리(fixation-first dissociation) 프로토콜 샘플의 경우, BALB 유선에서는 627개(미토콘드리아 유전자 함량이 높은 세포의 13%), BALB NeuT에서는 6,181개(14%)의 세포가 유지되었습니다.

본 문서에서 설명하는 살아있는 세포 해리 프로토콜을 위해 BALB 및 BALB NeuT 유선 간의 통합이 수행되었으며, 이는 그림 4E,F에 나타나 있습니다. 샘플을 비교한 결과, 라이브러리 간에 유사한 세포군이 확인되었습니다(그림 4E, F, 및 표 1). 알려진 세포 계통 마커를 사용하여 세포 클러스터를 라벨링하고 샘플 간 비교를 수행했습니다. 면역 세포군에는 T 세포, B 세포 및 대식세포 클러스터가 포함되었으며, 비면역 세포군에는 상피 세포, 섬유아세포 및 내피 세포가 포함되었습니다. 예상대로 BALB NeuT 샘플에서는 종양 세포의 추가적인 집단이 관찰되었습니다(그림 4F). 특정 세포군을 살펴보면, 종양을 가진 BALB NeuT 샘플에서 대식세포는 더 많았으나, T 세포와 비종양 상피 세포는 더 적었습니다. scRNA-Seq 분석 결과, BALB 유선 유래 상피 세포군은 유사한 수준으로 나타났으며, NeuT 대조군에서는 상피/종양 세포군이 상당수 확인되었습니다. 차원 축소 도표는 정상 유선 상주 상피 세포군과 BALB NeuT 샘플 특이적인 상피 종양 세포군 사이의 명확한 구분을 보여줍니다(그림 4E,F).

상피 세포군을 설정한 후, BALB 및 BALB NeuT 샘플 간의 기질 세포를 평가하였습니다. 섬유아세포에서 발현되는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 알파(Pdgfrα) 유전자 분석을 통해 BALB와 BALB NeuT 샘플 모두에서 뚜렷한 섬유아세포 집단을 확인하였습니다. BALB scRNA-Seq 샘플에서 Pdgfrα를 발현하는 섬유아세포는 전체 세포의 15%를 차지했으며, 이는 유세포 분석 결과인 29%보다 다소 낮은 수치였습니다(그림 3B). 생존율과 단일 세포 상태를 게이팅한 후, PDGFRα (CD140a) 마커를 이용하여 유세포 분석으로 섬유아세포를 식별하였습니다. 후속 분석 방법과 관계없이 여러 샘플에서 관찰된 이러한 결과는 시간이 경과하고 여러 차례의 시험을 거쳐도 이 해리 프로토콜이 일관되게 유지됨을 뒷받침합니다.

CD45 단백질은 Ptprc 유전자에 의해 인코딩되며, Ptprc를 발현하는 세포의 RNA 시퀀싱 결과 샘플 내에서 매우 뚜렷하게 식별 가능한 림프구 클러스터가 확인되었습니다(Figure 4E). 림프구 집단을 더욱 상세히 평가하기 위해, Cd3e+ 또는 Cd79a+를 사용하여 B 세포 및 T 세포 집단을 분석하였습니다(Figure 4E,F). 단일 세포 시퀀싱 데이터를 평가한 결과 이러한 집단들은 서로 뚜렷이 구분되었으며, scRNA-Seq을 통해 Cd3을 발현하는 T 세포의 여러 하위 클러스터가 추가로 식별되었습니다. 시퀀싱 분석을 통한 추가적인 면역 세포 수 측정 결과, Itgam 및 Adgre1 (F4/80) 의 발현으로 나타나듯이 BALB NeuT 샘플에서 대식세포가 증가한 것이 확인되었습니다(Figure 4F). scRNA-Seq에서의 희귀 세포 집단 식별 능력을 평가하기 위해, Foxp3 발현을 통해 조절 T 세포를 식별하였습니다(Figure 4F). 조절 T 세포는 scRNA-Seq 라이브러리에 존재하지만, 별도의 클러스터로 식별될 만큼 충분히 풍부하지는 않았습니다. 대신, 이들은 T 세포 및 자연 살해(NK) 세포와 함께 클러스터를 형성하였습니다.

마지막으로, scRNA-Seq 라이브러리 내에서 호중구(PMNs)를 식별하는 능력은 그동안 해결하기 어려운 문제였으며, 상용화된 다른 유선 조직 분해 프로토콜로는 달성되지 않았습니다20. 유세포 분석을 통해 면역 세포의 약 5%가 Ly6G 및 CD11b를 발현하는 호중구로 식별되었습니다(그림 3H). scRNA-Seq 라이브러리 내에서 호중구를 식별하기 위해서는, 벤더 파이프라인을 사용하여 표준 knee bend 이하의 세포들을 호출하도록 재클러스터링하는 것이 권장됩니다. 이 작업은 BALB 및 BALB NeuT 유선 라이브러리 모두에 대해 수행되었습니다. 대식세포와 일반적으로 연관된 유전자(Ptprc, Adgre1, Mrc1)의 닷플롯을 호중구에서 발현되는 유전자(S100a8, Trem1, Clec4)와 비교하였습니다. BALB 및 BALB NeuT 라이브러리 모두에서 호중구가 유의미한 수로 포함되지 않았습니다(그림 5A,B). 그러나 이는 모델 배경에 따라 달라지는 것으로 보이며, BALB x PWK 배경의 F1 NeuT 마우스에서는 호중구 마커를 발현하는 세포 클러스터가 확인되었습니다(그림 5C).

따라서, 이 해리 프로토콜을 통해 BALB 마우스 및 자연 발생성 유선 종양을 형성하는 BALB NeuT 마우스의 유선 내 세포 유형을 규명할 수 있었습니다. 이 세포들은 생존력이 매우 높기 때문에, 본 기술은 분리된 면역 세포 집단의 항종양 면역 및 항-HER2/neu 기능을 평가하는 데 활용될 수 있습니다.

scRNA-Seq을 위한 조직 처리 흐름도: 배양, 원심분리, 세포 여과, 사멸 세포 제거.
그림 1: 조직 해리 프로토콜의 워크플로우. (A) 유선 또는 종양을 제거하고 (B,C), 잘게 다진 후(D), collagenase type II, collagenase D, DNase I 칵테일에서 37 °C로 흔들어주며 소화시켰다(E). EDTA를 첨가하고 5분 더 소화 과정을 지속했다. (F) 10% FBS가 포함된 RPMI(R10 세척 배지)를 사용하여 40 mL까지 부피를 맞춰 소화를 중단시키고, 현탁액을 70 µm 필터로 여과했다. (G) 세포 현탁액을 4 °C, 500 × g에서 10분 동안 원심분리한 후, RPMI 세척 배지로 3회 세척했다. (H) 염화암모늄 기반의 10 × RBC Lysis solution을 사용하여 적혈구(RBC)를 용해했다. (I) R10 세척 버퍼를 사용하여 용해를 중단시키고, 세포 현탁액을 30 µm 필터로 여과했다. (J,K) 적혈구 용해 후, 농도와 생존율을 평가하기 전 세포를 3회 추가로 세척한다. (L) scRNA-Seq 라이브러리 제작에 세포를 사용하는 경우, 상용 키트의 프로토콜에 따라 사멸 세포와 파편을 제거한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

세포 생존율 결과; 해리, Chop Fix 방법; 현미경 이미지; 세포 수, 생존율.
그림 2: 해리 비교. 본 연구에서 보고한 해리 프로토콜을 시판되는 Miltenyi 프로토콜 및 scRNA-Seq용으로 권장되는 상용 고정-선행 해리 프로토콜과 비교한 세포 수 및 생존율 데이터. 해리 후 세포 수는 acridine orange/propidium iodide (AO/PI) 사멸 세포 염색을 이용한 자동 세포 계수기로 측정하였다. 세포 수는 사멸 세포 제거 후 측정되었으며 생존율이 기록되었다. (A–B) 사멸 세포 제거 직전의 세포 수 및 생존율. (C–D) 사멸 세포 제거 후의 세포 수 및 생존율로, 이는 scRNA-Seq 파이프라인에 진입하는 샘플의 대표 값이다. (E–F) 본 연구의 프로토콜과 상용 고정-선행 해리 프로토콜을 비교한 세포 수 및 생존율. Liberase 함유 프로토콜을 이용한 해리 후에는 조직 샘플이 해리 전 고정되었으므로 생존율을 평가할 수 없었다. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

유세포 분석 그래프; CD45, EPCAM, PDGFRa, 림프구, 골수성 세포 염색 결과.
그림 3: 해리된 조직의 유세포 분석. 면역 세포의 존재와 생존력을 확인하기 위해 대표적인 BALB 및 BALB NeuT 샘플을 분석하였다. 세포는 먼저 생존력을 기준으로 게이팅되었으며, 하위 그룹 식별 전 싱글렛(singlets)을 식별하였다. 상피 및 기질 계통 세포가 회수되었는지 확인하기 위해 먼저 평가를 수행하였다. EpCAM을 사용하여 상피 유래 세포를 식별하였고(A), PDGFRa를 사용하여 섬유아세포를 식별하였다(B). 면역 세포군을 평가한 결과, 유선 조직 전체 세포의 51%가 CD45 양성이었다(C). 해리된 마우스 유선 조직에서 B 세포(B220+) 및 T 세포(CD3+) 집단을 얻었으며(D), 종양 조직에서 CD8+ 및 CD4+ 집단을 하위 게이팅하였다(E). 본 프로토콜이 희귀한 세포 집단을 효과적으로 분리할 수 있는지 확인하기 위해(F) 종양 조직 내 Treg을 Foxp3+ 발현을 이용하여 평가하였다. 이는 먼저 CD3+ 및 CD4+ 집단을 게이팅한 후, 해당 집단 내에서 Foxp3+ 및 CD25+인 세포(약 6%)를 식별함으로써 수행되었다. (G) 종양 조직의 CD64+ 대식세포 평가. (H) CD11b+ 세포를 대상으로 F4/80 및 CD11c 발현을 추가 분석하였으며, F4/80− CD11c+ 세포를 수지상 세포로 식별하였다. (I) 중성구는 CD45+, Ly6G+, CD11b+를 발현하지만 F4/80−인 세포로 식별하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

마우스의 유선 및 종양에 대한 세포 해리 효율 그래프와 세포 클러스터 도표.
그림 4: scRNA-Seq 라이브러리 평가. 고정된 샘플을 사용하여 scRNA-Seq 라이브러리를 생성했습니다. 여기서는 본 논문에서 보고된 고정 절차를 따르는 생세포 해리 프로토콜 또는 권장되는 상용 고정-선행 해리 프로토콜을 사용했습니다. (A) 생세포 해리를 통한 BALB 유선 scRNA-Seq 라이브러리의 품질 관리 결과입니다. 16,182개의 세포를 시퀀싱했으며, 리드의 97.1%가 세포 내에 확실하게 매핑되었고 98.8%가 필터링된 프로브 세트에 확실하게 매핑되었습니다. 상단에는 Knee bend 플롯이, 하단에는 UMAP 투영도가 표시되어 있습니다. 급격한 knee bend와 뚜렷한 세포 클러스터는 고품질 라이브러리임을 나타냅니다. (B) 상용 고정-선행 해리 프로토콜을 사용한 BALB 유선 scRNA-Seq 라이브러리의 품질 평가 결과, knee bend가 나타나지 않으며 세포 수가 적음을(n = 720) 알 수 있습니다. (C) BALB NeuT 유선 scRNA-Seq 라이브러리는 본 프로토콜에 따라 생성되었습니다. 18,077개의 세포를 시퀀싱했으며, 리드의 97%가 세포에 매핑되었고 98.9%가 필터링된 프로브 세트에 매핑되었습니다. 급격한 knee bend와 뚜렷한 클러스터는 우수한 품질을 입증하는 반면, 상용 고정-선행 해리 프로토콜을 사용한 BALB NeuT 라이브러리(D) 는 시퀀싱된 7,119개의 세포 전체에서 knee bend가 약하고 세포 클러스터가 뚜렷하지 않음을 보여줍니다. 라이브러리 생성 후, Cell Ranger를 사용하여 BALB 및 BALB NeuT 유선 라이브러리를 통합했으며, 직접 비교를 위해 Loupe Cell Browser에서 K-Means 클러스터링을 수행했습니다. T-SNE 플롯(E,F)에 표시된 바와 같이, 10개의 고유한 클러스터가 BALB/c 유선을 구성하는 세포들을 정의합니다. NeuT 형질전환(F) 유선에서는 종양 세포 집단이 추가로 나타났습니다. 림프구 클러스터 내에서 Cd4- 및 CD8a 발현 세포가 전체적으로 분포되어 있습니다. Cd4 발현은 삽입 그림에 표시되어 있습니다. Foxp3 발현으로 정의되는 조절 T 세포는 별도의 클러스터를 형성할 만큼 충분하지 않았으나, 강조된 피처 플롯에 표시된 것처럼 T 세포와 함께 클러스터링되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

유선 및 종양 샘플의 발현량과 백분율을 상세히 나타낸 유전자 발현 분석 도표.
그림 5호중구(PMN)의 식별. PMN은 RNA 전사체 수준이 낮고 품질이 낮아 scRNA-Seq 라이브러리에서 식별하기 매우 어려운 것으로 알려져 있습니다. Ly6g 발현. scRNA-Seq 라이브러리의 다형핵백혈구(PMN)는 Cell Ranger의 ‘count’ 명령어를 사용하고 명령줄에 ‘force cell = 8000’ 옵션을 포함하여 식별할 수 있다. 이 분석은 BALB(A) 및 BALB NeuT (B유선 라이브러리였으나, PMN 특이적 유전자를 발현하는 세포는 거의 없었습니다. BALB 및 BALB NeuT의 모든 골수구 세포 클러스터 또한 다음을 발현했습니다. Adgre1 (F4/80) 및 Mrc1 (CD206). 골수성 세포군 중 PMN 특이적 유전자를 발현하는 세포는 매우 적습니다. S100a8, Trem1, 그리고 Clec4e그러나 이러한 결과는 모델의 BALB 배경으로 인한 것이며, 본 논문에서 설명한 해리 기술을 사용하여 (BALBxPWK)F1 NeuT 암컷 생쥐로부터 준비한 scRNA-Seq 라이브러리의 경우 (C), force cell 명령어를 사용하지 않았을 때, PMN 특이적 유전자는 발현하지만 [내용 없음]은 발현하지 않는 세포 군집이 관찰되었습니다. Adgre1이는 본 해리 프로토콜이 다른 골수성 세포군뿐만 아니라 다형핵 백혈구(PMN)를 실제로 포착할 수 있음을 강조합니다. 빨간색 직사각형 상자는 다음을 발현하는 클러스터를 나타냅니다. Adgre1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

BALB NeuT 종양유세포 분석법단일 세포 RNA 시퀀싱
CD3 / 림프구전체 세포의 6%
(CD45+ 세포의 12%)		전체 세포의 7%
CD4 / Cd4전체 세포의 3.9%
(CD45+CD3+ 세포의 65%)		전체 세포의 4%
CD8 / Cd8a 전체 세포의 1%
(CD45+CD3+ 세포의 17%)		전체 세포의 0.9%
Foxp3 / Foxp3전체 판매량의 0.8%
(CD3+CD4+ 세포의 33%)		전체 세포의 0.7%
F4/80 / Adgre1전체 세포의 20% 전체 세포의 16%
CD64 / Fcgr1NT전체 세포의 14%
다핵구/호중구전체 세포의 2% (CD45+ 세포의 5%)전체 세포의 0.05%
PDGFRa (CD140a)
/ 기질		전체 세포의 29%전체 세포의 10%
EpCAM / 상피성전체 세포의 32%전체 세포의 54%
NT, 테스트되지 않음

표 1: 단일 세포 RNA 시퀀싱 및 유세포 분석을 포함한 하위 분석 기술을 통해 본 해리 프로토콜로 얻은 세포 백분율의 비교.

토론

이 해리 프로토콜은 모조직을 대표하는 세포 집단으로 구성된 단일 세포 현탁액을 일관되게 생성합니다. 유방 조직에서 더 큰 섬유아세포와 지방세포 줄기세포를 포함하여 대표적인 세포 유형을 분리하기 위해 500 x g의 원심력이 사용되었습니다14,21,22. 면역, 상피 및 기질 세포 집단을 포함한 여러 세포 유형 전반에서 생존율과 세포 표면 에피토프가 안정적으로 유지됩니다. 이 해리 프로토콜의 물류적 장점 중 하나는 특수 장비 없이도 초기 조직 수집부터 추가 처리가 가능한 깨끗한 세포 현탁액을 얻기까지 소요되는 시간이 상대적으로 짧다는 점입니다. 전반적으로 이 워크플로우는 시작부터 끝까지 완료하는 데 약 3시간이 소요되며, 이는 시료를 효소에 하룻밤 동안 노출시켜야 할 수도 있는 유사한 효소 해리 프로토콜에 비해 유리합니다. 이 프로토콜은 2023년부터 제공된 형식으로 개발되었으며 본 실험실 및 다른 실험실에서 사용되어 왔습니다. 최근 6개월 동안에만 본 실험실에서 이 프로토콜을 37회 수행하여 유사한 결과를 얻었으며, 모든 교육 수준의 수련생들이 성공적으로 완료하였습니다. 유세포 분석 및 scRNA-Seq 라이브러리 제작 외에도, 이 프로토콜은 ex vivo 기능 분석을 위한 종양 침윤 림프구(TIL) 및 종양 관련 대식세포(TAM)를 분리하는 데 사용되었습니다. 결과는 이 해리 프로토콜이 주요 세포 집단을 식별할 수 있음을 보여주지만, 유세포 분석과 scRNA-Seq는 근본적으로 다르다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 유세포 분석은 단일 세포 수준에서 여러 마커의 발현을 연구하도록 설계되었으며, 이를 위해 게이팅(gating) 및 서브게이팅(sub-gating)을 활용합니다. 반면, scRNA-Seq는 게이팅과 서브게이팅 없이 세포 클러스터 전반의 유전자 발현 변화를 식별하도록 설계되었습니다.

프로토콜의 문제 해결 방법은 다음과 같습니다: 1) 불완전한 소화: 조직 샘플의 소화는 물리적 해리에 매우 큰 영향을 받습니다. 조직이 페이스트 형태가 될 때까지 잘게 다지며, 조직 조각의 크기를 확인하기 위해 넓게 펴십시오. 이 단계는 예상보다 오래 걸리는 경우가 많습니다. 해리가 불완전하면 면역 세포에 비해 기질 세포 및 상피 세포의 수가 감소합니다. 2) 낮은 생존율: 세포 생존율은 소화 시간과 collagenase type II와 collagenase D의 2:1 비율 유지 여부에 영향을 받습니다. collagenase type II가 부족하면 세포 생존율이 크게 감소합니다. 또한, 샘플 생존율이 70–85% 사이인 경우, 시판되는 사세포 제거 시스템을 사용하면 생존율을 효과적으로 개선할 수 있으며, scRNA-Seq 라이브러리 제작을 위해 샘플을 제출하기 전에 이를 권장합니다. 3) 높은 세포 잔해: 세포 잔해는 종종 물리적 해리와 소화의 부작용으로 발생합니다. 잔해는 밀도 구배 배지나 밀도가 현저히 낮은 시판 잔해 제거 용액을 사용하여 가장 효과적으로 제거할 수 있습니다. 4) 낮은 펠릿 회수율: 샘플 회수율 저하는 주로 초기 조직의 양에 영향을 받습니다. 이 프로토콜은 2개의 유선 또는 10에서 20 mg 사이의 중간 크기 종양에 최적화되었습니다. 초기 샘플 크기가 유선 1개 미만이거나 종양의 크기가 ~200 mm3보다 작은 경우 세포 수득률이 낮아집니다. 조직 크기가 작은 경우, 부피를 50%로 줄일 수 있습니다. 마찬가지로, 큰 종양이나 여러 개의 유선(4개 이상의 유선 또는 ~25 mg보다 큰 종양)이 있는 경우, 부피를 1.5 ×로 늘릴 수 있습니다. ~25 mg보다 큰 샘플은 분할하여 처리해야 합니다. 5) 낮은 scRNA-Seq 품질: scRNA-Seq 라이브러리의 품질은 거의 전적으로 원래 샘플의 품질에 달려 있습니다. 종양 조직을 다룰 때는 초기 겔 비즈 인 에멀젼(GEM) 및 cDNA 생성 타이밍이 필수적입니다. 이러한 이유로, 프로브 기반 고정 RNA 단일 세포 화학 시스템과 같이 즉각적인 RNA 고정으로 자연스럽게 이어지는 프로토콜을 사용하면 샘플 품질에 영향을 주는 변수인 시간을 제거할 수 있습니다. 그렇더라도 scRNA-Seq 파이프라인에 진입하기 전 RNA 품질을 평가하면 결과 라이브러리가 유용한 정보를 담고 있는지 확인할 수 있습니다. 6) 예상보다 적은 세포 클러스터: scRNA-Seq 결과에서 소수의 고유 클러스터의 유전자 발현 수준이 낮게 나타나는 경우, 리드 수(시퀀싱 깊이)를 늘리기 위해 라이브러리를 다시 시퀀싱할 수 있습니다. 또한, 면역 세포만을 분석하는 연구라면 라이브러리 제작 전에 CD45+ 집단을 정제하여 시퀀싱 민감도를 높일 수 있습니다.

위에 언급된 상용 고정 및 해리 프로토콜은 지방 조직의 처리 과정에서 한계가 있었습니다. 우선, 고정된 지방 조직은 부력이 있어 추가적인 해리와 효과적인 필터링이 어려웠습니다. 이러한 이유로, 본 연구에서 사용된 상용 고정 및 해리 프로토콜에 지방 조직을 사용하는 것은 권장되지 않습니다. 단일 세포 현탁액으로 해리하기 전에 조직을 고정하면, 고정 후 생존능 측정 및 해리와 같은 품질 관리 단계를 거칠 수 없게 됩니다. 이로 인해 조직 해리 과정의 필수 단계인 하위 scRNA-seq 제출 전 샘플 품질 추정이 어려워졌습니다. 하위 scRNA-seq를 위한 조직 고정은 RNA를 분해할 수 있습니다. RNA 품질은 고정된 세포 샘플의 뉴클레오타이드(nt) 리드 길이를 조사하여 평가할 수 있습니다. 샘플 중 다음의 비율이 높을수록 >200 nt 리드일수록 품질이 더 우수합니다. RNA 무결성 점수가 있는 샘플은 >리드가 존재하는 샘플의 30% >200 nt이며, 이후 높은 신뢰도로 scRNA-Seq 라이브러리를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 본 연구에서 보고된 BALB 유선 및 BALB NeuT 종양 조직의 고정 시료는 각각 83%와 82%의 리드(read)를 나타냈습니다. >각각 200 nt입니다.

유선과 같이 지방 함량이 높은 조직은 지방세포가 고품질의 세포 조제물 생성을 방해할 수 있어 문제가 됩니다. 대부분의 지방세포는 원뿔형 튜브 상단에 머무르며, 진공 흡입이나 상층액 제거를 통해 제거할 수 있습니다. New Zealand Obese (NZO) 배경의 암컷과 같이 지방이 매우 많은 유선의 경우, 지방세포 제거를 용이하게 하기 위해 깨끗한 보풀 없는 실험용 와이프로 튜브 상단을 닦아낸 후, 지방을 완전히 제거하기 위해 추가 세척 단계를 거치는 추가 과정이 필요함을 확인하였습니다. 유선 조직은 또한 수율이 낮은 경향이 있습니다. 이 문제를 완화하기 위해, 세포 수율을 높이기 위해 가능한 한 샘플을 풀링(pooling)합니다. 매우 단단한 종양의 경우, 콜라겐 분해 효소가 생존율이 높은 단일 세포를 생성하는 데 필요한 시간 내에 소화해야 할 표면적을 줄여주므로 적절한 세절(mincing)이 필수적입니다.

하지만 이 프로토콜에는 한계가 있습니다. 이질적인 세포 혼합물을 얻을 때 상피 세포를 단일 현탁액으로 완전히 소화시키는 것은 쉽지 않습니다. BALB NeuT 유선 종양은 일반적으로 종양 캡슐과 강력한 기질 성분을 포함하고 있어 단단합니다. 반면, 침윤된 면역 세포를 수집할 때는 효소에 거의 노출되지 않아야 하며, 과도한 노출은 이들의 표현형 상태를 변화시킬 수 있습니다. 따라서 침윤된 호중구를 포함한 이러한 다양한 세포 유형의 품질을 유지하면서 종양 및 기질 세포를 수집하기 위해서는 적절한 절충점을 찾아야 합니다. 그러므로 이 프로토콜을 통해 얻은 상피 세포와 기질 세포의 비율은 실제 모조직에 나타난 비율보다 낮을 수 있습니다. 이 프로토콜은 생존력이 높으면서도 고품질의 이질적인 세포 샘플을 수집하기 위한 최적의 방법을 결정하기 위해 콜라게나아제 효소 비율과 해리 시간을 평가하는 수많은 실험을 통해 최적화되었습니다. 이 프로토콜을 활용하여, 향후에는 유선 종양의 발생 및 진행 과정 중 침윤된 면역 세포의 ex vivo 기능 분석을 통해 치료의 기회 창을 식별하는 연구가 가능할 것입니다. 

공개 사항

저자들은 공개해야 할 이해관계의 충돌이 없습니다.

감사의 글

본 문서에 제시된 데이터는 부분적으로 Michigan State University의 Office of Research & Innovation의 지원을 받아 Genomics Core(RRID: SCR_012406)의 기기를 사용하여 획득되었습니다. 

이 연구는 CA278818의 지원을 받아 수행되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
RPMIGibco11875-093
DNA 분해효소Invitrogen18047019
콜라게나아제 D시그마11088866001
콜라게나제 IIWorthington BiochemicalLS004177
우태아혈청VWR97068-085
10배 농축 PBSGibco70011-044
아지드화 나트륨VWR0639-250G
MACS Smart Strainer, 70 µmMiltenyi Biotec130-110-916
MACS Smart Strainer, 30 µmMiltenyi Biotec130-110-915
EDTAMillipore324506-100ML
10x 적혈구 용해 버퍼 (10x RBC Lysis Buffer)eBioscience/Invitrogen00-4300-54
Foxp3/전사 인자 고정/투과화 키트eBioscience/Invitrogen00-5523-00
Brilliant 염색 버퍼Invitrogen00-4409-42
Mojosort 사멸 세포 제거 키트Biolegend580157
Mojosort 버퍼 (5x)Biolegend480017
Quick-RNA Miniprep Plus KitZymo ResearchR1057
종양 해리 키트, 마우스용Miltenyi Biotec130-096-730
혈소판 유래 성장인자 수용체α PerCP-eFluor710Invitrogen46-1401-80
Epcam eF450Invitrogen48-5791-82
CD11c APCBiolegend117310
CD11b AF700Invitrogen56-0112-82
고정 가능 생존능 염색약 eF780Invitrogen65-0865-14
B220/CD45R AF488Biolegend103225
CD3 PE-Cy7Invitrogen25-0031-82
CD49b PerCP-eFluor710Invitrogen46-5971-82
CD8a BV480Invitrogen414-0081-80
CD4 SB600Invitrogen63-0041-82
CD45 BV711Invitrogen407-0451-80
FOXP3 항원제시세포(APC)Invitrogen17-5773-82
Ly6G APCInvitrogen17-5931-82
Ly6C PECy7Invitrogen25-5932-82
CD64 PerCP-eFluor71046-0641-80
TruStainBiolegend101320
10x Genomics GEM-X Flex 유전자 발현 시약 키트10x Genomics(https://www.10xgenomics.com/blog/answering-your-questions-about-single-cell-analysis-in607 clinical-ffpe-samples);1000781
Attune NxT 유세포 분석기Thermo Fisher Scientific적색, 청색 및 자색 레이저 채널을 이용한 유세포 분석 데이터 수집에 사용됨.
FCS ExpressDe Novo 소프트웨어유세포 분석 데이터 분석에 사용됩니다.
Miltenyi's 종양 해리 키트상용 종양 해리 키트
Miltenyi 키트 / Miltenyi 프로토콜시판 키트" 또는 "참조 키트
Liberase 효소시판되는 thermolysin/collagenase 혼합물
찹 픽스(Chop Fix)상용 고정 우선 해리 프로토콜 
플렉스 화학 / 플렉스 화학 시스템프로브 기반의 고정 RNA 단일 세포 화학 분석법
Seurat(https://satijalab.org/seurat/)오픈 소스 및 벤더 클러스터링 도구
Cell Ranger오픈 소스 및 벤더 클러스터링 도구
 Loupe Cell Browser 오픈 소스 및 벤더 클러스터링 도구
EnrichRhttps://maayanlab.cloud/Enrichr/) 유전자 세트 농축 및 참조 세포 아틀라스 도구
마우스 지도(Tabula Muris)https://tabula400 muris.sf.czbiohub.org/visualizations유전자 세트 풍부도 분석 및 참조 세포 아틀라스 도구
타불라 사피엔스(Tabula Sapiens)https://tabula-sapiens.sf.czbiohub.org/유전자 세트 풍부도 분석 및 참조 세포 지도 도구
Cellometer K2" 기기와 "아크리딘 오렌지 / 프로피듐 아이오다이드 (AOPI)" 아크리딘 오렌지/프로피디움 아이오다이드(AO/PI) 생존능 염색 기능을 갖춘 자동 세포 계수기
킴와이프보풀 없는 실험실용 와이퍼
STEMCELL Technologies밀도 구배 매질(예: Ficoll 또는 Percoll 유형 매질)
피콜/퍼콜(Ficoll/Percoll)#10 메스 날
10번 메스 2개
Cellometer K2 + AOPI 시약acridine-orange/propidium-iodide (AO/PI) 생존력 염색 기능이 포함된 자동 세포 계수기
STEMCELL Technologies줄기세포
Technologies, www.stemcell.com, 2018
피콜/퍼콜 (Ficoll/Percoll)밀도 구배 매질 
#10 메스 10개수술용 메스 날
Foxp3/전사 인자 고정/투과화 키트핵 내 염색이 가능한 시판 용액

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