본 연구에서는 해산물 내 병원성 Vibrio 종을 검출하기 위해 활성탄과 벤토나이트를 이용한 고리 매개 등온 증폭법(LAMP) 분석법을 최적화하였습니다. 이러한 전처리 과정은 반응 억제제를 효과적으로 제거하여, 기존 방법보다 훨씬 빠르고 민감하며 비용 효율적인 진단을 가능하게 합니다.
이 논문에서
요약
초록
그 비브리오균 이 속에는 100종 이상의 종이 있으며, 그 중 12종이 인간에게 병원성을 갖는 것으로 간주됩니다. 식품에서 가장 빈번하게 분리되는 종은 V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, 그리고 *V. alginolyticus*전통적인 미생물학적 방법으로 이를 식별하는 데 있어 주요 문제점은 높은 비용과 진단 기간이 길다는 점입니다. 루프 매개 등온 증폭법(Loop-mediated isothermal Amplification, LAMP)이 다음의 식별을 위해 사용되었습니다. V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, 그리고 *V. alginolyticus*벤토나이트 함유 활성탄(ACB)을 사용하여 저해제를 제거함으로써 검사의 민감도를 향상시켰으며, pH 6, 7, 9 및 시료와 ACB 간의 다양한 접촉 시간을 테스트하였다. 새우, 어류 및 굴 시료에서 반응 저해제를 제거하기 위해 활성탄과 벤토나이트를 사용했을 때 LAMP 민감도가 향상되었다. 테스트한 모든 시료에 대해 LAMP 민감도, 음성 예측도, 양성 예측도 및 LAMP 특이도는 90% 이상이었다. LAMP 방법은 ~를 식별하기 위한 대안이 될 수 있다. V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, 그리고 V. alginolyticus 표준 방법보다 분석 속도가 빠르고 민감도가 높으며 비용이 저렴하여 수산물 내 분석에 유리합니다.
서론
Vibrio 속의 종들은 해양 환경에 널리 분포하며, 어류, 연체동물 또는 갑각류와 병원성 또는 공생 관계로 연관될 수 있습니다. 12종의 종이 인간에게 병원성을 가질 수 있다고 보고되었으며, 특히 Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. alginolyticus가 수산물에서 더 높은 빈도로 분리되는 것으로 나타났습니다. 미국 보건 당국은 Vibrio spp.로 인해 연간 80,000건 이상의 감염이 발생한다고 추정합니다1,2,3,4,5. Vibrio spp.의 분리는 증균 배양, 선택 배지 배양 및 생화학적·혈청학적 시험을 통한 확인을 포함하는 전통적인 방법으로 이루어집니다6,7. 이러한 전통적인 방법은 병원체를 분리하는 데 긴 시간(최대 5일)이 소요된다는 점과 분해능이 부족하다는 한계가 있으며, 이로 인해 유사한 표현형 및 생화학적 프로파일을 가진 Vibrio 속 내의 밀접하게 연관된 종들을 정확하게 구분하지 못하는 경우가 많습니다6,7,8.
대신에, 루프 매개 등온 증폭법(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)은 병원체 식별을 위한 빠르고 정확하며 저렴한 분자 진단 기술로 보고되었습니다9,10. 이 방법은 열 순환기(thermocycler)와 같은 정밀 장비가 필요하지 않으므로 매우 비용 효율적이며 기존의 PCR보다 속도가 빠릅니다9. LAMP 방법은 단일 단계로 표적 유전자를 검출할 수 있는데, 이는 LAMP 기술에 사용되는 온도인 65 °C에서 안정한 반응 생성물인 피로인산 마그네슘의 침전으로 인해 반응 튜브 내에 탁도가 발생하기 때문입니다. 따라서 탁도의 증가 정도가 합성된 DNA의 양과 상관관계를 가지므로 아가로스 겔(agarose gel)과 투과 조명기(transilluminator)의 사용을 피할 수 있습니다11,12,13,14,15.
이러한 병원균의 검출 민감도는 Bst 중합효소를 억제하거나 DNA 표적에 결합하여 증폭을 방해할 수 있는 프로테아제, 칼슘 이온, 글리코겐 및 지질과 같은 반응 억제제를 제거함으로써 향상될 수 있습니다13,16,17,18,19,20. 활성탄과 벤토나이트(ACB)의 조합은 증폭 억제제 제거 효율이 높아 굴 샘플 내 Escherichia coli 검출 민감도를 높이며, ACB가 상용 키트보다 저렴하여 비용을 절감할 수 있는 것으로 보고되었습니다21.
본 연구에서는 활성탄과 벤토나이트를 사용하여 수산물에서 V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus 및 V. alginolyticus를 직접 식별할 때의 민감도를 높임으로써 LAMP 방법을 최적화할 것을 제안합니다. 이 최적화된 방법은 긴 전농축 단계 없이 병원균을 신속하게 진단하는 데 매우 유용하여, 식품 산업의 일상적인 모니터링 및 품질 관리를 위한 실질적인 지침을 제공합니다. 예상 성능과 관련하여, 이 방법은 생선 및 새우와 같은 매질에서 매우 우수한 민감도(98% 이상)와 특이도(100%)를 보여줍니다. 다만, 굴과 같이 오염도가 높은 원료 샘플의 경우 ACB 시스템이 모든 간섭 유기물을 완전히 제거할 수 없어 분석의 민감도가 약간 감소(94%–98%)할 수 있다는 점이 주요 고려 사항입니다.
프로토콜
본 연구는 인간 또는 척추동물 피험자를 대상으로 하지 않았으므로, 기관의 윤리적 승인이 필요하지 않았습니다. 사용된 시약과 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 사용된 박테리아 균주 및 DNA 추출
Vibrio cholerae no O1 CECT 55, V. parahaemolyticus ATCC 17802, V. vulnificus ATCC 29037 및 V. alginolyticus ATCC 17749 균주를 2% NaCl이 포함된 brain heart infusion (BHI) 배지에서 37 °C로 24시간 동안 배양하였다. 테스트의 음성 대조군으로 사용하기 위해 Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 및 Salmonella Typhimurium ATCC 14028 균주를 염화나트륨이 없는 BHI 배지에서 37 °C로 24시간 동안 배양하였다. DNA 추출을 위해, 하룻밤 배양한 배양액을 원심분리기에서 25 °C로 16,000 x g에서 6분 동안 원심분리하였다. 세포 펠렛이 흐트러지지 않도록 상층액을 조심스럽게 따라내고, 500 μL의 TAE 완충액(Tris-acetic acid-EDTA, pH 8)으로 피펫팅하여 펠렛을 완전히 재현탁하였다. 세포를 용해시키기 위해 현탁액을 6분 동안 끓인 후, 즉시 얼음 위에서 5분 동안 냉각하였다. 마지막으로 원심분리를 수행하여 세포 잔해를 펠렛화함으로써 추출된 DNA가 포함된 투명한 상층액을 얻었으며, 이를 이후 LAMP22,23 증폭을 위한 템플릿으로 사용하였다.
2. LAMP 절차
LAMP에 사용된 프라이머(표 1)를 통해 V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus 및 V. alginolyticus 식별의 특이성을 확인하였습니다. LAMP를 이용한 각 Vibrio 종의 식별은 각 프라이머 1.6 μM, dNTP 혼합물 1.4 mM, 6 mM MgSO4, 800 mM betaine, 8 U의 Bst DNA polymerase 및 5 μL의 템플릿 DNA를 포함하여 최종 부피 25 μL의 혼합물을 반응 튜브에 준비하여 수행하였습니다. 반응 혼합물을 부드럽게 섞은 후 65 °C의 항온수조에서 60분 동안 배양하였습니다. 배양 시간이 지난 후, 증폭 산물을 1.5% agarose gel에서 분리하였습니다. 그 후 1:100으로 희석한 형광 DNA 염색약 1 μL를 사용하여 증폭 산물을 염색하고 청색광 투과조명장치(blue light transilluminator)로 확인하였습니다. 병원균 식별 테스트의 양성 여부를 판단하는 또 다른 방법으로, 반응 튜브에 4 μL의 hydroxynaphthol blue (HNB, 125 μM)를 첨가하고 육안으로 색 변화를 관찰하였습니다. 청색으로 변하면 양성, 보라색으로 변하면 음성으로 판단하였습니다24. LAMP 방법의 음성 대조군으로는 Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 및 Salmonella Typhimurium ATCC 14028을 사용하였습니다. LAMP를 통해 얻은 증폭 산물은 agarose gel에서 분리하여 투과조명장치로 관찰하였습니다. 결과 이미지는 MS 1D Analysis Software를 사용하여 획득하고 디지털화하였습니다.
3. 시료 내에 자연적으로 존재하는 Vibrio spp. 제거를 위한 굴, 새우 및 어류 시료의 처리
각각 약 200 g 무게의 굴 샘플 10개, 새우 샘플 10개, 생선 샘플 10개를 수집하였습니다. 자연적으로 존재하는 Vibrio 세포를 제거하기 위해 이전에 발표된 방법론21을 따랐습니다. 각 샘플에서 50 g을 정밀하게 측정하여 패들 블렌더(paddle blender)에서 260 rpm으로 1분간 기계적으로 균질화하여 균일한 조직 현탁액을 만들었으며, 이를 -70 °C에서 72시간 동안 보관하였습니다. 그 후, 40 °C 항온수조를 사용하여 샘플을 완전히 해동하고, 300 mL의 인산염 식염 완충액(0.85% NaCl, pH 9)으로 세척하였습니다. 이전 단계에서 샘플 내의 Vibrio가 성공적으로 제거되었는지 확인하기 위해, 미국 식품의약국(FDA)의 세균 분석 매뉴얼(Bacteriological Analytical Manual) 9장에 명시된 사전 증균 방법론7을 수행하였습니다. 샘플이 포함된 식염수를 450 mL의 알칼리 펩톤수(APW, pH 9)로 교체하였습니다. 이후 APW 내에서 10⁻3 희석 배수까지 정밀하게 연속 희석을 수행하고 24시간 동안 배양하였습니다. 마지막으로, 각 튜브의 분취액을 thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose (TCBS) 한천 선택 배지에 도말하여 37 °C에서 24시간 동안 배양함으로써 특징적인 Vibrio 콜로니가 없음을 시각적으로 확인하였습니다. 모든 테스트는 3회 반복 수행되었습니다.
4. 벤토나이트 포함 활성탄(ACB)의 제조 및 세포 회복률 평가
수산물 시료에 존재하는 억제제는 최대한 흡수하면서 표적 세포의 흡수는 최소화하여 ACB의 효율이 가장 높은 조건을 결정하기 위해, 기존에 발표된 방법론21에 따라 ACB와 식품 시료 간의 최적 pH 및 접촉 시간을 설정하였습니다. 활성탄을 증류수로 충분히 세척하고 55 °C에서 건조하였습니다. 이어서, 32.6 g의 활성탄을 3.04 g의 벤토나이트와 혼합하고, 균일한 분산을 위해 150 rpm에서 24시간 동안 지속적으로 교반한 후, 55 °C에서 건조 및 멸균하여 미세하고 균질한 건조 ACB 분말을 제조하였습니다. 활성탄-벤토나이트(ACB) 혼합물과 Vibrio 세포를 혼합한 후의 세포 회수율을 평가하기 위해, 각 균주를 2% NaCl이 포함된 BHI broth에서 세포 밀도가 1.5 x 104 CFU/mL에 도달할 때까지 개별적으로 배양하였습니다. 그런 다음, 각 Vibrio 균주 1 mL를 100 mL의 인산염 완충액(PBS, 0.85% NaCl, pH 4, 6 및 9로 조정)에 각각 접종하였습니다. 이후 세균 현탁액을 미리 준비한 ACB 4.6 g과 혼합하고, 접촉을 촉진하기 위해 150 rpm에서 15, 30, 60분 동안 교반하였습니다. 각 지정된 접촉 시간이 지난 후, 0.1 mL의 aliquot를 조심스럽게 분리하여 TCBS agar에 도말 평판 배양하고 37 °C에서 24시간 동안 배양한 후 콜로니 수를 측정하였습니다.
5. 활성탄 및 벤토나이트로 처리한 굴, 새우 및 어류 시료 내 V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus 및 V. alginolyticus의 검출 한계 평가
각각의 비브리오(Vibrio) 본 연구에 사용된 종은 BHI 배지에서 배양되었으며, 세포 밀도는 1.5 x 10으로 정밀하게 조정되었습니다.4, 7.5 x 103, 3.8 x 103, 1.5 x 103, 7.5 x 102, 3 x 102, 1.5 x 102, 그리고 분광광도계를 사용하여 측정한 결과 76 CFU/mL (A600 nm ~0.25)였습니다. 이어서, 각각의 1 mL를 비브리오(Vibrio) 배양액을 사용하여 이전에 오염물을 제거 처리한 각 시료(굴, 생선, 새우) 50g에 접종하였습니다. 비브리오균 존재. 접종된 시료를 패들 블렌더(paddle blender)에서 360rpm으로 30초 동안 균질화하고, 450mL의 APW(pH 6)로 희석하였다. 그 후 혼합물을 260 x g ~에서 5분 동안 4 °C 큰 잔해물을 분리하기 위해 사용하였습니다. 결과물인 상청액을 23g의 ACB가 들어 있는 플라스크에 따라내고, 150rpm에서 15분 동안 교반하여 저해제를 흡착시킨 후, 여과지를 사용하여 여과함으로써 큰 입자가 없는 투명한 용출액을 얻었습니다. 이 용출액을 16,000 x g 10분 동안 다음 온도에서 4 °C그 결과 튜브 바닥에 눈에 보이는 세포 펠렛(cell pellet)이 형성되었으며, 이를 사용하여 DNA를 추출하였습니다. 각 비브리오균 종은 LAMP법으로 확인하였다. 음성 대조군은 다음의 균주를 접종한 시료로 구성되었다. Escherichia 대장균 ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) ATCC 49594 및 Salmonella Typhimurium ATCC 14028. 반응 혼합물을 항온수조에서 배양하였다. 65 °C 60분 동안 반응시켰다. 배양 시간이 지난 후, 증폭 산물을 1.5% 아가로스 겔에서 분리하고 형광 DNA 염색약으로 염색하였다. 겔은 청색광 투과조명장치(blue light transilluminator)에서 확인하였다. 마지막으로, 4 μL 하이드록시나프톨 블루(hydroxynaphthol blue)의125 μM)를 각 튜브에 첨가하여 육안으로 검출하였다24.
6. LAMP 방법의 양성 예측도, 음성 예측도, 특이도 및 민감도 결정
LAMP 방법의 민감도, 특이도 및 예측값은 30개의 시료(새우 10개, 굴 10개, 어류 10개)를 사용하여 결정되었습니다. 각 시료에는 Vibrio의 각 종에 대해 설정된 최소 검출 농도를 접종하였습니다. 민감도와 특이도의 백분율뿐만 아니라 음성 예측값(NPV) 및 양성 예측값25을 결정하기 위해, 실험 중에 얻은 진양성(TP), 진음성(TN), 위양성(FP) 및 위음성(FN)을 요약하는 분할표가 사용되었습니다. (표 2). 이 데이터를 바탕으로 다음 공식들을 적용하였습니다:
결과
사용된 세균 균주 및 DNA 추출
후속 LAMP 분석의 템플릿으로 사용하기 위해 모든 병원성 균주 및 음성 대조군 균주로부터 DNA를 성공적으로 추출하였습니다.
LAMP 절차
본 연구에 사용된 프라이머는 각 Vibrio 종의 분자 표적 증폭에 특이적으로 설계되었습니다. Vibrio 균주를 사용하여 LAMP로 얻은 증폭 산물을 통해 각 프라이머가 각 Vibrio 종의 표적 유전자 증폭에 특이적임을 확인하였습니다 (그림 1).
시료에 자연적으로 존재하는 Vibrio spp. 제거를 위한 굴, 새우 및 어류 시료의 처리
시료에 자연적으로 존재하는 Vibrio spp.를 제거하기 위한 처리는 적절했으며, Vibrio spp.를 100% 감소시킬 수 있었습니다. BAM 방법7을 따랐을 때 Vibrio spp.의 증식은 나타나지 않았습니다.
벤토나이트 함유 활성탄(ACB)의 조제 및 세포 회수율 평가
활성탄-벤토나이트를 이용한 반응 억제제의 제거를 통해 LAMP법에 의한 병원균 검출 민감도를 높일 수 있었다. 이는 증폭 과정 중 폴리머라아제에 영향을 줄 수 있는 억제 물질을 흡착하는 활성탄-벤토나이트의 능력과 박테리아 세포의 제한적인 보유력 덕분이다(그림 2). 다양한 pH와 접촉 시간을 사용하여 Vibrio 회수율을 측정한 결과, pH 6에서 접촉 시간 15분일 때 가장 높은 세포 회수율(93.4% ± 2.9%)을 보였다. pH 4를 사용했을 때는 Vibrio의 성장이 전혀 없었으며, pH 7과 9에서는 각각 33.4% ± 7.6%와 67.2% ± 5.8%의 회수율을 나타냈다. 본 연구는 해당 방법의 검출 민감도를 향상시키기 위해 pH 6를 사용할 것을 제안한다.
활성탄 및 벤토나이트로 처리한 굴, 새우, 어류 시료 내 V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus 및 V. alginolyticus의 검출 한계 평가
굴 시료의 경우, V. cholerae의 검출 한계는 150 CFU/g였으며, V. alginolyticus, V. vulnificus 및 V. parahaemolyticus의 검출 한계는 3 x 102 CFU/g였다. 새우 및 어류 시료에서는 V. cholerae가 최소 150 CFU/g의 농도에서 검출된 반면, V. alginolyticus, V. vulnificus 및 V. parahaemolyticus의 검출 한계는 76 CFU/g였다. LAMP법으로 얻은 결과에 따르면, ACB로 처리하지 않은 시료의 경우 반응 억제제를 제거함으로써 hydroxinaphthol blue를 사용했을 때와 비교하여 LAMP 민감도가 달라짐을 확인하였다(그림 3). 우리는 시료를 ACB로 처리했을 때 LAMP 민감도가 더 높다는 것을 관찰하였다.
LAMP 방법의 양성 예측도, 음성 예측도, 특이도 및 민감도 결정
활성탄-벤토나이트(ACB) 전처리를 적용한 경우와 적용하지 않은 경우의 최적화된 루프 매개 등온 증폭(LAMP) 방법의 진단 성능을 150회 시험을 통해 체계적으로 평가하여 그 견고성을 확인하였다(표 3). ACB 시스템을 사용하여 천연 식품 억제제들을 제거함으로써, 처리하지 않은 시료와 비교하여 모든 매트릭스에서 모든 진단 파라미터(민감도, 특이도, 양성 예측도(PPV), 음성 예측도(NPV))가 90% 이상의 값으로 유의미하게 향상되었다.
ACB로 처리한 어류 및 새우 샘플에서 해당 분석법은 민감도, 특이도, PPV 및 NPV 모두 100%를 달성하여 최대 진단 성능을 나타냈습니다(그림 4). 반대로, 처리하지 않은 어류 및 새우 샘플에서는 매트릭스 유래 억제제의 존재로 인해 분석 효율이 심각하게 저하되어, 검출 민감도가 각각 62.5%와 52.5%로 감소했습니다. 매우 복잡한 굴 매트릭스의 경우, ACB 처리가 주요 간섭 물질을 성공적으로 완화하여 95.0%의 높은 전체 민감도와 71.4%의 NPV를 기록했습니다(그림 5). 이와 대조적으로, 처리하지 않은 굴 샘플은 중합효소를 억제하는 글리코겐 및 지질과 같은 유기 화합물이 다량 존재하여 검출 민감도가 32.5%, NPV가 15.6%로 급격히 떨어지는 결과를 보였습니다.
LAMP법의 진단 특이도는 매질의 종류나 전처리 여부에 관계없이 150회의 모든 시험에서 100%로 유지되었으며, 위양성 결과는 전혀 기록되지 않았습니다. 이러한 절대적인 특이도는 종 특이적 유전자(V. alginolyticus의 gyrB, V. cholerae의 ompW, V. parahaemolyticus의 tlh, V. vulnificus의 vvhA)를 표적으로 하는 프라이머 세트의 매우 선택적인 설계 덕분입니다. 이러한 통계적 결과는 최적화된 ACB-LAMP법이 다양한 수산물 내 병원성 Vibrio 종을 배양 없이 신속하게 검출할 수 있는 매우 신뢰할 수 있고 강력한 도구임을 입증합니다.
마지막으로, 반응 억제제를 제거하기 위한 전처리 과정을 LAMP법과 병용하여 사용하면, LAMP법을 이용한 식품 내 병원체 검출의 민감도를 높일 수 있을 것으로 생각됩니다. 따라서 V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus 및 V. vulnificus 탐색에 적용된 이 기술은 이러한 미생물로 인한 감염을 예방하기 위한 모니터링에 유용할 것입니다.
데이터 가용성:
다양한 pH 값과 접촉 시간 조건에서의 수치적 세균 회수 집락 수(CFU/g) 및 150회 전체 검증 시험의 완전한 진단 성능 결과를 포함하여, 본 연구의 결과물을 뒷받침하는 모든 원시 데이터는 Zenodo 저장소(https://doi.org/10.5281/zenodo.21799272)에서 공개적으로 이용 가능합니다. 관련 데이터셋에는 전체 스프레드시트 파일(부록 파일 1)이 포함되어 있습니다.
그림 1: 1.5% 아가로스 겔에서 확인한 LAMP 증폭 산물의 특이성 분석. 레인 M, 100 bp 분자량 마커; 레인 1, 음성 대조군 (Escherichia coli ATCC 25922); 레인 2, 음성 대조군 (Listeria monocytogenes ATCC 49594); 레인 3, V. alginolyticus ATCC 17749; 레인 4, V. cholerae no O1 CECT 557; 레인 5, V. parahaemolyticus ATCC 7802; 레인 6, V. vulnificus ATCC 29037. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 활성탄-벤토나이트(ACB) 혼합물을 이용한 다양한 pH 조건 및 접촉 시간에 따른 Vibrio 균주의 회수율(%). pH 4.0, 6.0, 7.0 및 9.0으로 조절된 PBS에 Vibrio 균주를 1.5 × 104 CFU/mL로 접종하고, 4.6 g의 ACB로 15분, 30분, 60분 동안 처리한 후 세포 회수율(%)을 측정하였다. pH 6.0 및 접촉 시간 15분에서의 데이터 지점은 최적의 세포 회수율(93.4% ± 2.9%)을 보여주며, 이는 높은 저해제 제거 효율을 유지하면서 표적 세포를 회수하는 데 짧은 접촉 시간으로도 충분함을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 인위적으로 첨가된 해산물 샘플 내 LAMP 증폭 산물의 검출 한계. ACB로 전처리하고 Vibrio 종을 단계적으로 희석하여 첨가한 (A) 굴, (B) 새우, (C) 생선 샘플의 증폭 결과. 튜브: (1) 음성 대조군; (2) V. alginolyticus; (3) V. parahaemolyticus; (4) V. vulnificus; (5) V. cholerae no O1; (6) V. mimicus (표적 대조군으로 사용). 상단 패널: 4 μL의 Hydroxynaphthol Blue (HNB, 125 μM)를 사용하여 육안으로 확인한 비색 검출 결과로, 양성 반응은 파란색으로 나타나고 음성 반응은 보라색으로 유지됨. 하단 패널: 청색광 투과조명기 하에서 시각화한 Midori Green Advanced (MGA) 염색 기반의 형광 검출 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 억제제 제거 여부에 따른 LAMP 방법의 진단 성능 매개변수 비교. 최소 검출 한계로 스파이킹된 어류, 새우 및 굴 샘플에서의 전체 민감도, 특이도, 양성 예측도(PPV) 및 음성 예측도(NPV) 비교(종/매질 조합당 n = 10회 시험, 총 150회 시험). 막대는 최적화된 활성탄-벤토나이트(ACB) 혼합물로 전처리한 샘플을 전처리하지 않은 대조군(억제제 제거 없음)과 비교하여 나타낸 것이다. 스파이킹 수준은 모든 매질에서 V. cholerae의 경우 150 CFU/g, 굴의 경우 V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. vulnificus가 300 CFU/g, 어류 및 새우의 경우 76 CFU/g로 설정되었다. ACB 전처리를 통해 모든 매질에서 모든 진단 매개변수가 ≥90%로 성공적으로 회복되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5다양한 해산물 매질에서 최적화된 ACB-LAMP 방법의 표적 특이적 민감도 및 특이도. ~에 대한 개별 진단 성능 V. alginolyticus, V. cholerae, V. parahaemolyticus, 그리고 V. vulnificus ACB로 전처리한 어류, 새우 및 굴 시료(표적/식품 조합당 n = 10회 테스트)에서 분석하였다. 종 특이적 프라이머 설계를 통해 표적 부위를 타겟팅함으로써 모든 표적에 대해 100%의 특이성을 확보하였다. gyrB, ompW, 제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 소스 텍스트를 입력해 주세요.및 vvhA 유전자. 민감도는 어류 및 새우 매트릭스에서 100%에 도달했으며, 굴의 경우 유기 매트릭스의 높은 기저 복잡성이 반응을 방해하여 90%로 약간 감소하는 것이 관찰되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) 분석에 사용된 프라이머. V. alginolyticus (gyrB), V. parahaemolyticus (tlh), V. vulnificus (vvhA), 및 V. cholerae (ompW)의 종 특이적 타겟팅을 위해 설계된 정방향 및 역방향 내부 프라이머 (FIP, BIP), 외부 프라이머 (F3, B3), 및 루프 프라이머 (LF, LB)에 대한 설명. 이 표를 다운로드하시려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: LAMP 방법의 진단 성능 파라미터 평가를 위한 분할표. 스파이크 처리된 해산물 샘플 및 처리되지 않은 해산물 샘플에서 민감도, 특이도, 양성 예측도(PPV) 및 음성 예측도(NPV)를 계산하기 위해 진양성(TP), 진음성(TN), 위양성(FP) 및 위음성(FN)을 분류하고 요약하는 데 사용되는 표준 2x2 행렬 설정. 이 표를 다운로드하시려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 본 연구의 결과물을 뒷받침하는 원시 데이터 세트. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
토론
본 연구는 오염된 해산물 시료 내 V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus 및 V. vulnificus 검출을 위한 고리 매개 등온 증폭법(LAMP)의 민감도를 높이기 위해 최적화된 조건을 확립합니다. 전통적인 사전 증식 단계를 생략함으로써 진단 시간을 크게 단축하였으며, 이를 통해 수산물에서 병원균을 직접 식별할 수 있는 매우 효율적이고 신속한 접근 방식을 제공합니다.
본 연구의 핵심적인 방법론적 개선 사항은 억제제 제거 단계의 최적화입니다. 이전의 방법론에서는 증폭 전 pH를 4로 설정하였으나21, 이는 Vibrio 종이 산성 환경에 매우 민감하기 때문에26 Vibrio 균주가 전혀 회수되지 않는 결과를 초래했습니다. 이를 해결하기 위해 세포 회수율을 높이는 동시에 천연 반응 억제제를 제거할 수 있도록 조건을 체계적으로 수정하였습니다. 벤토나이트를 포함한 활성탄(ACB)을 pH 6의 완충 용액에 재현탁시킨 후, 시료와 함께 15분 동안 교반하는 것이 최적의 조건임이 입증되었습니다. 이러한 수정은 박테리아 세포막의 등전점에 근접하게 하여 박테리아와 ACB 사이의 정전기적 반발력을 최대화함으로써21,27,28 표적 세포의 손실을 최소화합니다. 결과적으로, 이러한 방법론적 개선을 통해 ACB 처리를 하지 않은 시료보다 2~50배 더 높은 검출 민감도를 얻을 수 있었습니다.
이러한 방법론적 개선과는 별개로, 본 프로토콜을 성공적으로 수행하기 위해서는 일반적인 문제가 발생했을 때 명확한 트러블슈팅이 필요할 수 있습니다. 수행 과정에서 빈번하게 발생하는 문제는 유기물의 불완전한 제거이며, 이는 특히 오염도가 높은 매질에서 폴리머라제(polymerase)를 방해하여 LAMP 민감도를 낮출 수 있습니다. 증폭에 실패하거나 민감도가 떨어지는 경우, 우선 ACB-시료 혼합물의 pH를 확인하는 트러블슈팅을 실시해야 합니다. pH 6에서 벗어날 경우 세포 사멸(너무 산성인 경우) 또는 억제제 흡착 부족으로 이어질 수 있습니다. 또한, 적절한 ACB 처리를 했음에도 불구하고 위음성이 발생하는 경우, 매질에 의해 표적 세포가 의도치 않게 유지될 수 있으므로 접촉 시간이 15 min을 초과하지 않도록 해야 합니다. 육안 검출 시 색 변화가 모호한 경우에는 매질의 칼슘 이온이 완전히 제거되었는지 확인하여 트러블슈팅을 진행할 수 있으며, 그렇지 않으면 LAMP 분석에서 피로인산 마그네슘(magnesium pyrophosphate) 침전을 방해할 수 있습니다.
본 연구에서는 최초로 ~의 확인을 보고합니다. 비브리오균 ACB 전처리와 LAMP 방법을 결합하여 어류 시료 내의 spp.를 검출하였습니다. 본 연구는 수산물에 대한 신속하고 신뢰할 수 있으며 비용 효율적인 동정 방법을 구축함으로써 과학 분야 발전에 기여합니다.13,19,23,29전통적인 PCR이 이 가설을 검증하기 위한 대안적인 접근법이 될 수 있으나, 본 연구에서 얻은 강력한 특이도와 예측값은 ACB-LAMP 분석법이 더 우수한 선택지임을 입증한다. 이 기술의 결정적인 방법론적 장점은 써모사이클러(thermocycler), 전기영동 장치 및 투과조명기(transilluminator)와 같이 정교하고 고가인 장비가 필요하지 않다는 점이다.9,30또한, 결과의 시각적 검출은 ~을 통해 하이드록시나프톨 블루(hydroxynaphthol blue)는 데이터 해석을 상당히 단순화합니다.
높은 민감도와 특이도를 달성했음에도 불구하고, 굴 샘플과 같이 기저 오염도가 높은 매질에서는 본 연구의 뚜렷한 한계점이 관찰되었습니다. 이러한 경우 ACB 시스템이 모든 간섭 유기물을 완전히 제거할 수 없으며, 이로 인해 어류나 새우 샘플에 비해 분석의 민감도가 약간 감소합니다. 마지막으로, 이 방법의 잠재적 응용 분야는 Vibrio 관련 감염을 예방하기 위한 식품 산업의 일상적인 고처리량 모니터링에서의 유용성을 강조합니다. 향후 연구 방향은 DNA 추출 및 ACB 억제제 제거 단계의 자동화에 우선순위를 두어야 합니다. 이러한 핵심 방법론적 특성을 자동화하는 것은 수작업 시간을 크게 줄이고, 인적 오류를 최소화하며, 문제 해결 변수를 표준화할 수 있는 결정적인 이점이 되며, 이를 통해 산업 품질 관리 실험실에서 이 기술의 대규모 적용을 용이하게 할 것입니다.
공개 사항
저자들은 상충하는 이해관계가 없음을 선언합니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 활성탄 | Sigma-Aldrich | C2764 | |
| 벤토나이트 | Sigma-Aldrich | 682659 | |
| 베타인 | Sigma-Aldrich | B0300 | |
| Bio-Image systems 트랜스일루미네이터 | Bio-Image systems | MBE-CP-01 | |
| Bst DNA polymerase | New England Biolabs | M0374 | |
| 원심분리기 (모델 J2-HS) | Beckman Coulter | https://www.americaninstrument.com/products/beckman-j2-hs-high-speed-1273g-centri | |
| Cronobacter sakazakii | ATCC | 12868 | |
| dNTP 혼합물 | Thermo Fisher Scientific | R0241 | |
| Escherichia coli | ATCC | 25922 | |
| 하이드록시나프톨 블루 | Sigma-Aldrich | 219916 | |
| Listeria monocytogenes | ATCC | 49594 | |
| Midori Green Advanced | Nippon Genetics | MG01 | |
| MS 1D 분석 소프트웨어 | Major Science | MBE-IMG-SW | |
| Salmonella Typhimurium | ATCC | 14028 | |
| 분광광도계 (모델 6300) | Jenway | 630531 | |
| 스토마커 서큘레이터 (모델 400) | Seward | 0400/000/AJ | |
| Vibrio alginolyticus | ATCC | 17749 | |
| Vibrio cholerae no O1 | CECT | 55 | |
| Vibrio parahaemolyticus | ATCC | 17802 | |
| Vibrio vulnificus | ATCC | 29037 | |
| Whatman 여과지 | Whatman | 1001-055 |
참고문헌
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