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연구 논문

수산물 내 Vibrio spp. 검출을 위한 활성탄 및 벤토나이트 이용 고감도 루프 증폭법

93 조회수

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DOI:

10.3791/72887

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2026년 9월 8일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Departamento de Microbiología, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, 2Departamento de Biotecnología, División de Ciencias Biológicas y de la Salud

이 논문에서

요약

본 연구에서는 해산물 내 병원성 Vibrio 종을 검출하기 위해 활성탄과 벤토나이트를 이용한 고리 매개 등온 증폭법(LAMP) 분석법을 최적화하였습니다. 이러한 전처리 과정은 반응 억제제를 효과적으로 제거하여, 기존 방법보다 훨씬 빠르고 민감하며 비용 효율적인 진단을 가능하게 합니다.

초록

그 비브리오균 이 속에는 100종 이상의 종이 있으며, 그 중 12종이 인간에게 병원성을 갖는 것으로 간주됩니다. 식품에서 가장 빈번하게 분리되는 종은 V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, 그리고 *V. alginolyticus*전통적인 미생물학적 방법으로 이를 식별하는 데 있어 주요 문제점은 높은 비용과 진단 기간이 길다는 점입니다. 루프 매개 등온 증폭법(Loop-mediated isothermal Amplification, LAMP)이 다음의 식별을 위해 사용되었습니다. V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, 그리고 *V. alginolyticus*벤토나이트 함유 활성탄(ACB)을 사용하여 저해제를 제거함으로써 검사의 민감도를 향상시켰으며, pH 6, 7, 9 및 시료와 ACB 간의 다양한 접촉 시간을 테스트하였다. 새우, 어류 및 굴 시료에서 반응 저해제를 제거하기 위해 활성탄과 벤토나이트를 사용했을 때 LAMP 민감도가 향상되었다. 테스트한 모든 시료에 대해 LAMP 민감도, 음성 예측도, 양성 예측도 및 LAMP 특이도는 90% 이상이었다. LAMP 방법은 ~를 식별하기 위한 대안이 될 수 있다. V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, 그리고 V. alginolyticus 표준 방법보다 분석 속도가 빠르고 민감도가 높으며 비용이 저렴하여 수산물 내 분석에 유리합니다.

서론

Vibrio 속의 종들은 해양 환경에 널리 분포하며, 어류, 연체동물 또는 갑각류와 병원성 또는 공생 관계로 연관될 수 있습니다. 12종의 종이 인간에게 병원성을 가질 수 있다고 보고되었으며, 특히 Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. alginolyticus가 수산물에서 더 높은 빈도로 분리되는 것으로 나타났습니다. 미국 보건 당국은 Vibrio spp.로 인해 연간 80,000건 이상의 감염이 발생한다고 추정합니다1,2,3,4,5. Vibrio spp.의 분리는 증균 배양, 선택 배지 배양 및 생화학적·혈청학적 시험을 통한 확인을 포함하는 전통적인 방법으로 이루어집니다6,7. 이러한 전통적인 방법은 병원체를 분리하는 데 긴 시간(최대 5일)이 소요된다는 점과 분해능이 부족하다는 한계가 있으며, 이로 인해 유사한 표현형 및 생화학적 프로파일을 가진 Vibrio 속 내의 밀접하게 연관된 종들을 정확하게 구분하지 못하는 경우가 많습니다6,7,8.

대신에, 루프 매개 등온 증폭법(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)은 병원체 식별을 위한 빠르고 정확하며 저렴한 분자 진단 기술로 보고되었습니다9,10. 이 방법은 열 순환기(thermocycler)와 같은 정밀 장비가 필요하지 않으므로 매우 비용 효율적이며 기존의 PCR보다 속도가 빠릅니다9. LAMP 방법은 단일 단계로 표적 유전자를 검출할 수 있는데, 이는 LAMP 기술에 사용되는 온도인 65 °C에서 안정한 반응 생성물인 피로인산 마그네슘의 침전으로 인해 반응 튜브 내에 탁도가 발생하기 때문입니다. 따라서 탁도의 증가 정도가 합성된 DNA의 양과 상관관계를 가지므로 아가로스 겔(agarose gel)과 투과 조명기(transilluminator)의 사용을 피할 수 있습니다11,12,13,14,15.

이러한 병원균의 검출 민감도는 Bst 중합효소를 억제하거나 DNA 표적에 결합하여 증폭을 방해할 수 있는 프로테아제, 칼슘 이온, 글리코겐 및 지질과 같은 반응 억제제를 제거함으로써 향상될 수 있습니다13,16,17,18,19,20. 활성탄과 벤토나이트(ACB)의 조합은 증폭 억제제 제거 효율이 높아 굴 샘플 내 Escherichia coli 검출 민감도를 높이며, ACB가 상용 키트보다 저렴하여 비용을 절감할 수 있는 것으로 보고되었습니다21.

본 연구에서는 활성탄과 벤토나이트를 사용하여 수산물에서 V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus 및 V. alginolyticus를 직접 식별할 때의 민감도를 높임으로써 LAMP 방법을 최적화할 것을 제안합니다. 이 최적화된 방법은 긴 전농축 단계 없이 병원균을 신속하게 진단하는 데 매우 유용하여, 식품 산업의 일상적인 모니터링 및 품질 관리를 위한 실질적인 지침을 제공합니다. 예상 성능과 관련하여, 이 방법은 생선 및 새우와 같은 매질에서 매우 우수한 민감도(98% 이상)와 특이도(100%)를 보여줍니다. 다만, 굴과 같이 오염도가 높은 원료 샘플의 경우 ACB 시스템이 모든 간섭 유기물을 완전히 제거할 수 없어 분석의 민감도가 약간 감소(94%–98%)할 수 있다는 점이 주요 고려 사항입니다.

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프로토콜

본 연구는 인간 또는 척추동물 피험자를 대상으로 하지 않았으므로, 기관의 윤리적 승인이 필요하지 않았습니다. 사용된 시약과 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 사용된 박테리아 균주 및 DNA 추출

Vibrio cholerae no O1 CECT 55, V. parahaemolyticus ATCC 17802, V. vulnificus ATCC 29037 및 V. alginolyticus ATCC 17749 균주를 2% NaCl이 포함된 brain heart infusion (BHI) 배지에서 37 °C로 24시간 동안 배양하였다. 테스트의 음성 대조군으로 사용하기 위해 Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 및 Salmonella Typhimurium ATCC 14028 균주를 염화나트륨이 없는 BHI 배지에서 37 °C로 24시간 동안 배양하였다. DNA 추출을 위해, 하룻밤 배양한 배양액을 원심분리기에서 25 °C로 16,000 x g에서 6분 동안 원심분리하였다. 세포 펠렛이 흐트러지지 않도록 상층액을 조심스럽게 따라내고, 500 μL의 TAE 완충액(Tris-acetic acid-EDTA, pH 8)으로 피펫팅하여 펠렛을 완전히 재현탁하였다. 세포를 용해시키기 위해 현탁액을 6분 동안 끓인 후, 즉시 얼음 위에서 5분 동안 냉각하였다. 마지막으로 원심분리를 수행하여 세포 잔해를 펠렛화함으로써 추출된 DNA가 포함된 투명한 상층액을 얻었으며, 이를 이후 LAMP22,23 증폭을 위한 템플릿으로 사용하였다.

2. LAMP 절차

LAMP에 사용된 프라이머(표 1)를 통해 V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus 및 V. alginolyticus 식별의 특이성을 확인하였습니다. LAMP를 이용한 각 Vibrio 종의 식별은 각 프라이머 1.6 μM, dNTP 혼합물 1.4 mM, 6 mM MgSO4, 800 mM betaine, 8 U의 Bst DNA polymerase 및 5 μL의 템플릿 DNA를 포함하여 최종 부피 25 μL의 혼합물을 반응 튜브에 준비하여 수행하였습니다. 반응 혼합물을 부드럽게 섞은 후 65 °C의 항온수조에서 60분 동안 배양하였습니다. 배양 시간이 지난 후, 증폭 산물을 1.5% agarose gel에서 분리하였습니다. 그 후 1:100으로 희석한 형광 DNA 염색약 1 μL를 사용하여 증폭 산물을 염색하고 청색광 투과조명장치(blue light transilluminator)로 확인하였습니다. 병원균 식별 테스트의 양성 여부를 판단하는 또 다른 방법으로, 반응 튜브에 4 μL의 hydroxynaphthol blue (HNB, 125 μM)를 첨가하고 육안으로 색 변화를 관찰하였습니다. 청색으로 변하면 양성, 보라색으로 변하면 음성으로 판단하였습니다24. LAMP 방법의 음성 대조군으로는 Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 및 Salmonella Typhimurium ATCC 14028을 사용하였습니다. LAMP를 통해 얻은 증폭 산물은 agarose gel에서 분리하여 투과조명장치로 관찰하였습니다. 결과 이미지는 MS 1D Analysis Software를 사용하여 획득하고 디지털화하였습니다.

3. 시료 내에 자연적으로 존재하는 Vibrio spp. 제거를 위한 굴, 새우 및 어류 시료의 처리

각각 약 200 g 무게의 굴 샘플 10개, 새우 샘플 10개, 생선 샘플 10개를 수집하였습니다. 자연적으로 존재하는 Vibrio 세포를 제거하기 위해 이전에 발표된 방법론21을 따랐습니다. 각 샘플에서 50 g을 정밀하게 측정하여 패들 블렌더(paddle blender)에서 260 rpm으로 1분간 기계적으로 균질화하여 균일한 조직 현탁액을 만들었으며, 이를 -70 °C에서 72시간 동안 보관하였습니다. 그 후, 40 °C 항온수조를 사용하여 샘플을 완전히 해동하고, 300 mL의 인산염 식염 완충액(0.85% NaCl, pH 9)으로 세척하였습니다. 이전 단계에서 샘플 내의 Vibrio가 성공적으로 제거되었는지 확인하기 위해, 미국 식품의약국(FDA)의 세균 분석 매뉴얼(Bacteriological Analytical Manual) 9장에 명시된 사전 증균 방법론7을 수행하였습니다. 샘플이 포함된 식염수를 450 mL의 알칼리 펩톤수(APW, pH 9)로 교체하였습니다. 이후 APW 내에서 10⁻3 희석 배수까지 정밀하게 연속 희석을 수행하고 24시간 동안 배양하였습니다. 마지막으로, 각 튜브의 분취액을 thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose (TCBS) 한천 선택 배지에 도말하여 37 °C에서 24시간 동안 배양함으로써 특징적인 Vibrio 콜로니가 없음을 시각적으로 확인하였습니다. 모든 테스트는 3회 반복 수행되었습니다.

4. 벤토나이트 포함 활성탄(ACB)의 제조 및 세포 회복률 평가

수산물 시료에 존재하는 억제제는 최대한 흡수하면서 표적 세포의 흡수는 최소화하여 ACB의 효율이 가장 높은 조건을 결정하기 위해, 기존에 발표된 방법론21에 따라 ACB와 식품 시료 간의 최적 pH 및 접촉 시간을 설정하였습니다. 활성탄을 증류수로 충분히 세척하고 55 °C에서 건조하였습니다. 이어서, 32.6 g의 활성탄을 3.04 g의 벤토나이트와 혼합하고, 균일한 분산을 위해 150 rpm에서 24시간 동안 지속적으로 교반한 후, 55 °C에서 건조 및 멸균하여 미세하고 균질한 건조 ACB 분말을 제조하였습니다. 활성탄-벤토나이트(ACB) 혼합물과 Vibrio 세포를 혼합한 후의 세포 회수율을 평가하기 위해, 각 균주를 2% NaCl이 포함된 BHI broth에서 세포 밀도가 1.5 x 104 CFU/mL에 도달할 때까지 개별적으로 배양하였습니다. 그런 다음, 각 Vibrio 균주 1 mL를 100 mL의 인산염 완충액(PBS, 0.85% NaCl, pH 4, 6 및 9로 조정)에 각각 접종하였습니다. 이후 세균 현탁액을 미리 준비한 ACB 4.6 g과 혼합하고, 접촉을 촉진하기 위해 150 rpm에서 15, 30, 60분 동안 교반하였습니다. 각 지정된 접촉 시간이 지난 후, 0.1 mL의 aliquot를 조심스럽게 분리하여 TCBS agar에 도말 평판 배양하고 37 °C에서 24시간 동안 배양한 후 콜로니 수를 측정하였습니다.

5. 활성탄 및 벤토나이트로 처리한 굴, 새우 및 어류 시료 내 V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus 및 V. alginolyticus의 검출 한계 평가

각각의 비브리오(Vibrio) 본 연구에 사용된 종은 BHI 배지에서 배양되었으며, 세포 밀도는 1.5 x 10으로 정밀하게 조정되었습니다.4, 7.5 x 103, 3.8 x 103, 1.5 x 103, 7.5 x 102, 3 x 102, 1.5 x 102, 그리고 분광광도계를 사용하여 측정한 결과 76 CFU/mL (A600 nm ~0.25)였습니다. 이어서, 각각의 1 mL를 비브리오(Vibrio) 배양액을 사용하여 이전에 오염물을 제거 처리한 각 시료(굴, 생선, 새우) 50g에 접종하였습니다. 비브리오균 존재. 접종된 시료를 패들 블렌더(paddle blender)에서 360rpm으로 30초 동안 균질화하고, 450mL의 APW(pH 6)로 희석하였다. 그 후 혼합물을 260 x g ~에서 5분 동안 4 °C 큰 잔해물을 분리하기 위해 사용하였습니다. 결과물인 상청액을 23g의 ACB가 들어 있는 플라스크에 따라내고, 150rpm에서 15분 동안 교반하여 저해제를 흡착시킨 후, 여과지를 사용하여 여과함으로써 큰 입자가 없는 투명한 용출액을 얻었습니다. 이 용출액을 16,000 x g 10분 동안 다음 온도에서 4 °C그 결과 튜브 바닥에 눈에 보이는 세포 펠렛(cell pellet)이 형성되었으며, 이를 사용하여 DNA를 추출하였습니다. 각 비브리오균 종은 LAMP법으로 확인하였다. 음성 대조군은 다음의 균주를 접종한 시료로 구성되었다. Escherichia 대장균 ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) ATCC 49594 및 Salmonella Typhimurium ATCC 14028. 반응 혼합물을 항온수조에서 배양하였다. 65 °C 60분 동안 반응시켰다. 배양 시간이 지난 후, 증폭 산물을 1.5% 아가로스 겔에서 분리하고 형광 DNA 염색약으로 염색하였다. 겔은 청색광 투과조명장치(blue light transilluminator)에서 확인하였다. 마지막으로, 4 μL 하이드록시나프톨 블루(hydroxynaphthol blue)의125 μM)를 각 튜브에 첨가하여 육안으로 검출하였다24.

6. LAMP 방법의 양성 예측도, 음성 예측도, 특이도 및 민감도 결정

LAMP 방법의 민감도, 특이도 및 예측값은 30개의 시료(새우 10개, 굴 10개, 어류 10개)를 사용하여 결정되었습니다. 각 시료에는 Vibrio의 각 종에 대해 설정된 최소 검출 농도를 접종하였습니다. 민감도와 특이도의 백분율뿐만 아니라 음성 예측값(NPV) 및 양성 예측값25을 결정하기 위해, 실험 중에 얻은 진양성(TP), 진음성(TN), 위양성(FP) 및 위음성(FN)을 요약하는 분할표가 사용되었습니다. (표 2). 이 데이터를 바탕으로 다음 공식들을 적용하였습니다:

민감도 및 특이도 공식; 통계 분석; 진단 검사 평가.

양성 예측도 공식; TP/(TP+FP); 통계 분석; 의료 데이터 평가

음성 예측 값 공식: TN/(TN+FN), 통계 분석 방법.

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결과

사용된 세균 균주 및 DNA 추출
후속 LAMP 분석의 템플릿으로 사용하기 위해 모든 병원성 균주 및 음성 대조군 균주로부터 DNA를 성공적으로 추출하였습니다.

LAMP 절차
본 연구에 사용된 프라이머는 각 Vibrio 종의 분자 표적 증폭에 특이적으로 설계되었습니다. Vibrio 균주를 사용하여 LAMP로 얻은 증폭 산물을 통해 각 프라이머가 각 Vibrio 종의 표적 유전자 증폭에 특이적임을 확인하였습니다 (그림 1).

시료에 자연적으로 존재하는 Vibrio spp. 제거를 위한 굴, 새우 및 어류 시료의 처리
시료에 자연적으로 존재하는 Vibrio spp.를 제거하기 위한 처리는 적...

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토론

본 연구는 오염된 해산물 시료 내 V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus 및 V. vulnificus 검출을 위한 고리 매개 등온 증폭법(LAMP)의 민감도를 높이기 위해 최적화된 조건을 확립합니다. 전통적인 사전 증식 단계를 생략함으로써 진단 시간을 크게 단축하였으며, 이를 통해 수산물에서 병원균을 직접 식별할 수 있는 매우 효율적이고 신속한 접근 방식을 제공합니다.

본 연구의 핵심적인 방법론적 개선 사항은 억제제 제거 단계의 최적화입니다. 이전의 방법론에서는 증폭 전 pH를 4로 설정하였으나21, 이는 Vibrio 종이 산성 환경에 매우 민감하기 때문에26 Vibrio 균주가 전혀 회수되지 않는 결과를 초래했습니다. 이를 해결하기 위해 세포 회수율을 높이는 동시...

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공개 사항

저자들은 상충하는 이해관계가 없음을 선언합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
활성탄Sigma-AldrichC2764
벤토나이트Sigma-Aldrich682659
베타인Sigma-AldrichB0300
Bio-Image systems 트랜스일루미네이터Bio-Image systemsMBE-CP-01
Bst DNA polymeraseNew England BiolabsM0374
원심분리기 (모델 J2-HS)Beckman Coulterhttps://www.americaninstrument.com/products/beckman-j2-hs-high-speed-1273g-centri
Cronobacter sakazakiiATCC12868
dNTP 혼합물Thermo Fisher ScientificR0241
Escherichia coliATCC25922
하이드록시나프톨 블루Sigma-Aldrich219916
Listeria monocytogenesATCC49594
Midori Green AdvancedNippon GeneticsMG01
MS 1D 분석 소프트웨어Major ScienceMBE-IMG-SW
Salmonella TyphimuriumATCC14028
분광광도계 (모델 6300)Jenway630531
스토마커 서큘레이터 (모델 400)Seward0400/000/AJ
Vibrio alginolyticusATCC17749
Vibrio cholerae no O1CECT55
Vibrio parahaemolyticusATCC17802
Vibrio vulnificusATCC29037
Whatman 여과지Whatman1001-055

참고문헌

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