우리는 3차원(3D) 환경 내에서 종양-면역 상호작용을 모델링하기 위한 미세유체 플랫폼 사용 프로토콜을 제시합니다. 연구 결과, 자연살해(NK) 세포는 기계적 압착 상태에서도 항종양 활성을 유지하는 것으로 나타났습니다.
이 논문에서
요약
초록
세포 기반 면역요법의 맥락에서 기계적 힘은 면역 세포가 종양 세포를 사멸시키는 능력에 상당한 영향을 미칩니다. 종양 세포를 사멸시키기 위해 면역 세포는 표적 세포에 힘을 가하고 면역 시냅스를 형성해야 하며, 이를 통해 granzyme B를 포함한 세포독성 분자들이 전달됩니다. 이러한 중요성에도 불구하고, 기계적 신호를 어떻게 활용하여 면역 매개 사멸을 강화할 수 있는지는 여전히 명확히 밝혀지지 않았습니다. 이러한 지식의 공백은 부분적으로 생리학적으로 실제와 유사한 환경에서 세포 배양액에 정밀하게 제어된 기계적 스트레스를 제공할 수 있는 도구가 부족하기 때문입니다. 본 논문에서는 세포외 기질(ECM)에 매립된 종양 스페로이드에 정적 또는 동적 압축을 가하는 동시에, 광학 현미경을 통해 종양-면역 상호작용을 실시간으로 이미징할 수 있는 미세유체 압축 장치를 설명합니다.
이 미세유체 플랫폼은 12개의 구획(대조군 6개 및 기능군 6개)으로 구성되어 있습니다. 각 구획에는 압력 제어 장치 바로 아래에 배치된 세포 챔버가 포함되어 있습니다. ECM에 매립된 스페로이드는 이 세포 챔버 내에 배치됩니다. 본 플랫폼을 사용하여, 정의된 기계적 압축 조건 하에서 유방암 스페로이드(MCF-7)에 대한 자연살해(NK) 세포의 살상 효율을 조사하였습니다. 결과에 따르면, 1.5 mg/mL 콜라겐 내에서 기계적 압축 여부와 관계없이 NK 세포가 종양 스페로이드 사멸의 주요 동인으로 유지됨을 확인하였습니다. 따라서 이는 NK 세포가 압축 응력 하에서도 항종양 활성을 유지할 수 있음을 시사합니다. 이러한 발견은 종양-면역 상호작용에서 기계적 힘의 역할을 조사하는 데 있어 본 플랫폼의 유용성을 입증합니다. 현재 면역 세포가 압축 응력에 적응할 수 있게 하는 분자적 기전을 규명하는 연구가 진행 중입니다. 이러한 연구를 통해 얻은 통찰은 유망한 치료 방안을 제시할 수 있을 것입니다.
서론
세포 기반 암 면역요법은 면역 세포를 이용해 암 세포를 표적으로 삼는 치료법입니다1. 이 전략은 혈액암 치료에서 괄목할 만한 성과를 거두었습니다2,3,4. 하지만 혈액암에서 관찰된 수준의 성공이 고형암 치료에는 아직 충분히 적용되지 못하고 있습니다5,6,7. 이러한 한계의 주요 원인 중 하나는 고형암 특유의 면역 억제성 종양 미세환경(TME)입니다.
TME는 세포 행동을 조절할 수 있는 뚜렷한 기계적 신호에 의해 특징지어집니다. 면역 세포가 종양 세포를 효과적으로 사멸시키기 위해서는 표적 세포에 힘을 가하고, 세포 독성 분자가 전달되는 통로인 면역 시냅스를 형성해야 합니다8. 따라서 기계적 힘이 면역 세포 기능에 어떤 영향을 미치는지 이해하는 것은 고형암에 대한 세포 기반 면역 요법의 효능을 향상시키기 위한 새로운 치료 전략을 발견하는 계기가 될 수 있습니다.
고형암 TME의 결정적인 기계적 특징은 종양 미세환경이 성장하는 종양에 가하는 압축 응력입니다9,10. 지금까지 대부분의 압축 연구는 종양 세포 행동에 미치는 영향에 집중되어 왔습니다10,11. 최근에 들어서야 압축이 TME 내의 면역 세포에 어떻게 영향을 미치는지 이해하려는 방향으로 관심이 옮겨갔습니다12. 그 결과, 압축 응력이 Natural Killer (NK) 세포의 이동, 면역 시냅스 형성 및 세포 독성 활성에 영향을 미치는 기전은 여전히 제대로 이해되지 않았으며 충분히 정량화되지 않은 상태입니다. 이러한 공백은 TME 내의 기계적 신호를 활용하여 고형암에 대한 면역 표적화 능력을 어떻게 향상시킬 수 있는지 이해하는 데 있어 중대한 한계가 됩니다.
이 질문을 해결하는 데 있어 주요 장벽은 생리학적으로 유의미한 3D 미세환경 내에서 제어 가능하고 정량화된 압축을 가하는 동시에 종양-면역 상호작용의 실시간 이미징을 가능하게 하는 실험 플랫폼이 부족하다는 점입니다. 압축 응력을 연구하기 위한 초기 실험적 접근 방식은 스페로이드를 아가로스 겔에 임베딩하는 방식이었습니다13. 이 방법은 물리적 구속을 효과적으로 구현했지만, 천연 세포외 기질(ECM)-세포 상호작용을 제거했습니다. Dolega 등은 삼투압을 적용하여 압축 응력을 유도했으나, 스페로이드가 배양액에 부유되어 있었기 때문에 ECM 상호작용이 결여된 상태로 유지되었습니다9. Pandey 등은 트랜스웰 인서트와 추를 사용하여 콜라겐에 임베딩된 스페로이드를 압축했으며, 이는 ECM-세포 상호작용은 보존했지만 면역 세포의 운동성과 세포 독성 활성을 정량화하는 데 필요한 고해상도 이미징을 제한했습니다14. 종합적으로, 이러한 한계점들은 TME 내에서 압축에 대한 세포의 형태학적 반응을 실시간으로 이미징할 수 있는 실험 플랫폼의 필요성을 강조합니다.
본 논문에서는 생리학적으로 유의미한 ECM-세포 상호작용을 유지하면서 압축 응력을 제어하여 가할 수 있고, 면역-종양 역동성의 고해상도 살아있는 세포 이미징을 지원하는 미세유체 압축 장치15에 대한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 장치 구성 요소의 준비(섹션 1), 장치의 조립(섹션 2), 그리고 종양-면역 상호작용의 이미징(섹션 3)으로 구성됩니다. 저희는 녹색 형광 단백질(GFP)로 표지된 종양 스페로이드에 대한 NK 세포 살상 분석을 통해 해당 워크플로우를 입증합니다. 이러한 응용 분야 외에도, 이 플랫폼은 3D 미세환경 내의 광범위한 세포 유형 및 세포 상호작용에 미치는 기계적 힘의 영향을 조사하는 데 쉽게 적용될 수 있습니다.
프로토콜
1. 장치 구성 요소의 준비
- 시료 로딩 챔버의 표면 활성화
- 웰(well) 부분만 노출되도록 샘플 로딩 챔버(Layer 1, L1) 위에 마스크를 배치하십시오.
- 마스킹 처리된 층 1(Layer 1)을 고출력 설정(45 W)으로 15초 동안 산소 플라즈마에 노출시키십시오.
- 층 1을 페트리 접시에 넣은 후, 생물안전작업대 내에서 다음 단계를 진행하십시오.
- 각 웰을 다음으로 처리하십시오. 10 µL 1% 폴리에틸렌이민(polyethylenimine, PEI)으로 10분 동안 처리합니다.
- 유리 표면에 긁힘이 발생하지 않도록 각 웰의 네 모서리에서 진공 흡입하여 웰 내의 PEI를 제거하십시오.
- 웰을 다음으로 세척하십시오. 10 µL 인산완충생리식염수(PBS)로 세척한 후, 측면에서 진공 흡입법으로 세척액을 제거합니다.
- 웰(well)을 다음으로 처리하십시오. 10 µL 0.1% 글루타르알데하이드를 사용하여 30분 동안 처리한 후, 모서리 부분에서 진공 흡입으로 글루타르알데하이드를 제거합니다.
- 웰을 PBS로 3회 세척하고, 매 세척 후 모서리에 남은 세척액을 제거하십시오.
- 층 1이 포함된 페트리 접시를 알루미늄 호일로 감싼 후 생물안전작업대(biosafety cabinet) 내에 하룻밤 동안 둡니다.
- 멸균 금속 프레임의
- 38 mm 크기의 [대상물]을 완전히 담그십시오. × 88 mm 금속 프레임과 12개의 M2.5 팬헤드 나사를 70% 에탄올에 담가 하룻밤 동안 소독합니다.
- 프라이밍 압력 제어 장치의
- 고출력 설정(45 W)으로 압력 제어 장치를 30초 동안 산소 플라즈마에 노출시키십시오.
- 압력 제어 장치의 기능부(features)가 아래를 향하도록 하여 탈이온(DI)수에 하룻밤 동안 담가 압력 제어 장치의 채널과 챔버를 채웁니다.
- 다음 날, 증류수(DI water)에 담가두었던 압력 제어 장치를 꺼냅니다.
- 미세유체 리저버에 초순수(DI water) 50 mL를 채웁니다.
참고: 미세유체 저장조는 공압 튜빙 라인과 유체 공급 튜빙 라인이라는 두 개의 튜빙 연결부가 포함된 맞춤형 뚜껑이 장착된 50 mL 원추형 튜브로 구성됩니다. - 공기가 채워진 주사기를 공압 튜브 라인에 연결하십시오.
- 시린지 플런저를 천천히 눌러 리저버에 압력을 가함으로써, 튜브가 가득 차고 튜브 끝에서 물이 떨어지기 시작할 때까지 유체 전달 튜브를 통해 초순수(DI water)를 밀어냅니다.
- 미리 채워져 액체가 떨어지는 유체 전달 튜브를 폴리카보네이트 매니폴드에 연결한 다음, 압력 제어 장치 후면에 위치한 1.5mm 유입구에 연결하십시오.
- 압력 제어 장치와 매니폴드 어셈블리를 2시간 동안 자연 건조하십시오. 완전히 건조되면 압력 제어 장치와 매니폴드 어셈블리를 다음 단계에 사용할 수 있습니다.
2. 장치 조립
- 세포 함유 콜라겐의 준비
- 금속 프레임과 나사를 70% 에탄올에서 꺼내어 건조하십시오.
- 생물안전작업대(biosafety cabinet) 내에 3개의 600 µL 얼음 위에 놓인 마이크로튜브를 준비합니다. 튜브에 다음과 같이 라벨을 부착하십시오. "N" (중화), "종(sp)" (MCF-7 스페로이드), 그리고 "sp+NK" (NK 세포가 포함된 MCF-7 스페로이드).
- 10를 추가하여 중화 혼합물을 준비하십시오.× 필요한 양의 Medium 199 (M199)와 수산화나트륨 (NaOH)을 다음의... "N" 튜브
- 적절한 부피의 M199:NaOH 혼합물을 다음으로 옮기십시오. "종(species)" 및 "sp+NK" 최종 농도 1이 되도록 튜브에 분주합니다.× 농도
- 종양 스페로이드를 수확하고 141에서 원심 분리하십시오. × g 스페로이드가 튜브 바닥에 가라앉을 수 있도록 3분 동안 방치합니다.
참고: 종양 스페로이드 약 200 µm 이전 보고된 아가로스 마이크로웰 플랫폼을 사용하여 직경 00mm의 웰을 제작하였다.16간략히 설명하면, 3 × 106 MCF-7 세포를 36웰 플레이트에 분주하였습니다. × 웰로 구성된 36개 아가로스 마이크로웰 어레이 200 µm 직경 및 200 µm 깊게 삽입한 후 7일 동안 배양하여 실험에 사용할 종양 구형체를 생성하였습니다. - 상층액을 조심스럽게 제거하고 구형체(spheroid)를 다시 현탁하십시오. 200 µL 50:50 MCF-7/NK 완전 배지(표 1 및 표 2).
- NK 세포를 50 mL 원추형 튜브에 수집하고, 141에서 원심분리하십시오. × g 4분 동안 유지한 후, 세포 수를 측정합니다.
참고: NK 세포 생존율은 다음과 같아야 합니다. >실험 당일 85%. - 결과물로 얻은 펠릿을 다음의 용액에 재현탁하십시오. 200 µL 완전 NK 배지의.
- 각 마이크로원심분리관에 적절한 부피의 콜라겐 스톡 용액을 첨가하십시오.
- 최종 부피가 다음이 되도록 각 튜브에 적절한 부피의 세포 현탁액을 추가하십시오. 200 µL 1.5 mg/mL의 콜라겐을 함유한.
참고: 해당 "종(species)" 현탁액에는 종양 스페로이드만 포함되어 있는 반면, "sp+NK" 현탁액에는 종양 스페로이드와 1.5가 포함되어 있습니다. × 106 NK 세포 - 기포 형성을 최소화하면서 세포와 콜라겐이 고르게 분포될 수 있도록 피펫팅을 통해 부드럽게 섞어줍니다.
- 장치 조립 및 세포 로딩
- 건조된 금속 프레임 내부에 층 1(Layer 1)을 배치하십시오.
- 부하 9 µL 각 웰에 콜라겐 혼합물을 분주합니다.
- 현미경을 사용하여 압력 제어 장치 및 매니폴드 어셈블리를 레이어 1의 셀 챔버와 정렬하십시오.
- 건조된 나사를 매니폴드에 통과시켜 금속 프레임에 삽입함으로써, 매니폴드와 금속 프레임 사이에 압력 조절 장치와 레이어 1(Layer 1)을 고정합니다.
- 조립된 장치를 다음의 위치에 놓으십시오. 37 °C, 5% CO2₂ 콜라겐 중합이 일어날 수 있도록 인큐베이터에서 45분 동안 배양합니다.
- 4개의 배지 포트를 통해 50:50 MCF-7/NK 완전 세포 배양 배지를 첨가하십시오.
3. 종양-면역 상호작용의 이미징
- 조립된 장치를 도립 형광 현미경에 장착된 스테이지 인큐베이터 내부에 배치하여 살아있는 세포 이미징을 수행합니다.
참고: 스테이지 인큐베이터는 다음의 온도를 유지했습니다. 37 °C 그리고 이미징이 진행되는 동안 약 50%의 습도를 유지합니다. - 조립된 장치 위에 보조 하우징 박스를 덮어 내부 환경을 다음 상태로 유지하십시오. 37 °C, 습도 100%, 5% CO2₂ 전체 영상 촬영 기간 동안.
- 공압 튜브를 사용하여 장치를 압력 컨트롤러에 연결하십시오.
- 압착 후 스페로이드의 변형 정도를 평가할 수 있도록, 압착을 가하기 전 종양 스페로이드의 명시야 및 GFP 이미지를 획득하십시오.
- 이미징 기간 전반에 걸쳐 120 mbar의 일정 압력을 가하십시오.
참고: 압력 제어 소프트웨어를 통해 사용자는 실험 중에 적용할 압력 프로필과 크기를 정의할 수 있습니다. 부록 그림 1 압력 제어 시스템의 도식도를 포함합니다. - 18시간 동안 10분 간격으로 명시야(brightfield) 및 GFP 이미지를 획득하여 타임랩스 이미징을 시작하십시오.
참고: 이미지는 20배율을 사용하여 각 종양 스페로이드의 중심 Z-평면에서 획득되었습니다.× 倒立형 에피 형광 현미경의 대물렌즈를 사용하였다. 명시야 및 GFP 형광 이미지는 각각 200.1 ms 및 298.9 ms의 노출 시간으로 촬영하였다.
결과
다음 실험에서는 생리학적으로 유의미한 3D 미세환경 내에서 종양-면역 상호작용을 모델링하고, 동시에 종양 스페로이드에 정적 및 동적 압축을 가할 수 있는 미세유체 압축 장치15를 사용하였습니다(그림 1). 장치의 구성 요소(그림 1A1)와 조립 순서(그림 1A2)는 그림 1A에 나타나 있습니다. 금속 프레임은 장치의 베이스 역할을 하며, 세포 챔버 층(L1)이 프레임 내에 위치합니다. L2와 L3가 플라스마 본딩으로 결합된 압력 제어 유닛이 L1 위에 배치되고, 그 위에 매니폴드가 놓입니다(그림 1A2). L1과 압력 제어 유닛은 함께 기능적 미세유체 장치를 형성하며, 나사를 통해 금속 프레임과 매니폴드 사이에 고정됩니다. 매니폴드에는 장치에 압력을 공급하기 위한 유체 튜브용 입구 포트와 장기간의 살아있는 세포 이미징 실험을 용이하게 하는 배지 저장소가 포함되어 있습니다.
그림 1: 기계적 압축 조건에서 면역 세포와 종양 스페로이드 간의 상호작용 연구를 위한 미세유체 압축 장치. (A1) 장치 조립에 필요한 구성 요소의 사진(왼쪽에서 오른쪽 순): 매니폴드, 압력 제어 유닛(L2 + L3), 세포 챔버 층(L1), 금속 프레임. (A2) 장치 구성 요소의 3D 도식(위에서 아래 순): 매니폴드, 압력 제어 유닛(L2 + L3), 세포 챔버 층(L1), 금속 프레임. PDMS 층 L2와 L3는 플라스마 결합으로 압력 제어 유닛을 형성하며, 이는 세포 챔버 위에 위치합니다. 매니폴드와 금속 프레임은 조립된 장치를 고정합니다. (B1) 압축 전후 압축 유닛의 단면 도식. ECM에 매립된 종양 스페로이드와 NK 세포가 세포 챔버에 배치됩니다. 압축 전 L1 바닥과 L2 바닥 사이의 초기 거리는 h로 표시됩니다. 압력 제어 유닛에 압력을 가하면 L2가 아래로 휘어지며, 이로 인해 PDMS 피스톤이 종양 스페로이드를 압축합니다. 압축 후 L2의 하향 변위는 Δh로 표시됩니다. (B2) 압축 전(왼쪽)과 후(오른쪽) NK 세포와 함께 있는 MCF-7 종양 스페로이드의 명시야 및 GFP 병합 이미지. MCF-7 세포는 GFP로 표지되었으며, NK 세포는 표지되지 않았습니다. 대표적인 NK 세포는 파란색 원으로 표시되었고, 종양 스페로이드의 주변부는 노란색 외곽선으로 표시되었습니다. 스케일 바 = 50 µm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
조립이 완료된 미세유체 압축 장치는 그림 1B에 나타낸 바와 같이 종양 스페로이드를 압축하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에서는 NK 세포가 포함된 콜라겐 매립 종양 스페로이드를 세포 챔버(L1)에 주입합니다. 압력 챔버(L3)에 압력을 가하면 변형 가능한 막 층(L2)이 아래로 굴곡되어 Polydimethylsiloxane (PDMS) 피스톤이 스페로이드에 압축력을 전달하게 됩니다. 압력 챔버는 외부 압력원으로 제어됩니다. 미세유체 압축 장치의 설계, 제작 및 특성 분석에 관한 상세 내용은 이전 연구15에 발표된 바 있습니다.
셀 챔버의 바닥(L1)과 변형 가능한 막의 바닥(L2) 사이의 거리를 h로 정의합니다 (그림 1B1, 왼쪽 패널). 압축 전 이 거리는 200 µm입니다. 압력 제어 장치에 유체 압력을 가하면 변형 가능한 막이 아래로 굴곡되어 거리 h가 Δh만큼 감소하며 (Δh; 그림 1B1, 오른쪽 패널), 이에 따라 콜라겐이 포함된 종양 스페로이드가 압축됩니다. 이 시스템에서 압축 변형률(compressive strain)은 Δh/h로 정의되며, 여기서 h는 압축 전 L1과 L2 사이의 초기 거리이고, Δh는 압축 후 L2의 하향 변위입니다. 막 변위는 이전에 L2 바닥에 부착된 형광 비드를 시각화하여 보정하였습니다. 보정 절차와 압축 변형률 계산에 대한 자세한 설명은 이전 연구17에서 확인할 수 있습니다. 보정 곡선의 예는 부록 그림 2에서 볼 수 있습니다.
그림 1B2 1.5 mg/mL 콜라겐에 NK 세포가 매립된 MCF-7 스페로이드의 압축 전(왼쪽 패널)과 후(오른쪽 패널)를 나타내는 대표적인 명시야 및 GFP 병합 이미지를 보여준다. 종양 스페로이드의 경계는 노란색으로 표시하였다. 압축 후, 스페로이드의 투영 면적이 증가하였으며, 이는 기계적 하중의 성공적인 인가에 따른 변형이 일어났음을 나타낸다. 본 논문에 제시된 모든 실험에서 우리는 다음의 압축 변형률을 사용하였다. Δh/h = 50%. 스페로이드의 직경은 140에서 시작됨을 확인하였습니다. µm ~로/에 200 µm이는 스페로이드에 가해지는 실제 압축 변형률이 50%보다 약간 작다는 것을 의미합니다. 보충 영상 1 및 보충 영상 2 1.5 mg/mL 콜라겐에 매립된 MCF-7 스페로이드의 GFP 형광 채널에서 획득한 50% 압축 변형 적용 전과 후의 대표적인 X-Y z-스택을 각각 보여줍니다.
미세유체 압축 장치를 사용하여 NK 세포, 압축, 그리고 이들의 조합이 종양 스페로이드 사멸에 미치는 영향을 조사하였습니다(그림 2). 이는 12개의 배양 웰을 포함하는 장치 설계 덕분에 가능했습니다. 이 웰들 중 6개는 압축을 가할 수 있으며, 나머지 6개는 압축되지 않은 대조군으로 사용됩니다. 이러한 구성으로 네 가지 실험 조건(그림 2A)을 설정할 수 있습니다: 압축 없는 스페로이드 단독(sp), 압축 없는 NK 세포 포함 스페로이드(+NK), 압축을 가한 스페로이드(+comp), 그리고 압축과 NK 세포 모두에 노출된 스페로이드(+comp+NK)입니다.
그림 2: 기계적 압축이 종양 스페로이드의 NK 세포 매개 살상을 조절한다. (A) 1.5 mg/mL 콜라겐에 내장된 MCF-7 스페로이드의 네 가지 조건 하에서의 타임랩스 형광 이미지: 스페로이드 단독 대조군(sp), NK 세포 포함 스페로이드(+NK), 압축 적용 스페로이드(+comp), 그리고 압축과 NK 세포가 모두 적용된 스페로이드(+comp+NK). GFP 형광은 생존 가능한 MCF-7 종양 세포를 표지한다. 노란색 외곽선은 관심 영역(ROI)을 나타내며, 이는 18시간 시점의 이미지를 사용하여 정의되었으며 형광 정량화를 위해 모든 시점에 적용되었다. ROI 내의 총 GFP 형광 강도를 측정하여 이후 분석에 사용하였다. 스케일 바 = 50 µm. (B) 4가지 조건에서 시간에 따른 단일 스페로이드의 총 GFP 형광 강도. 각 색상 선은 단일 스페로이드의 총 형광 강도를 나타내며, t = 0일 때의 초기 강도로 정규화되었다. 검은색 선은 대조군 조건에서 배양된 7개 스페로이드로부터 수집된 형광 강도 데이터의 2차 다항식 피팅 결과이며, (C)에서 종양 세포 손실을 계산하기 위한 참조선으로 사용되었다. (C) +comp, +NK, +comp+NK 조건의 정규화된 GFP 손실은 각 스페로이드의 t = 18 h에서의 GFP 강도를 스페로이드 단독 참조선(sp)에서 빼서 계산하였다. 따라서 각 데이터 포인트는 단일 스페로이드의 정규화된 GFP 손실을 나타낸다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
NK 세포, 압축, 그리고 이들의 조합이 종양 스페로이드에 미치는 영향은 1.5 mg/mL 콜라겐 내 MCF-7 스페로이드의 대표 이미지에서 확인할 수 있습니다(그림 2A). 종양 스페로이드 제작에 사용된 MCF-7 세포가 GFP로 표지되었기 때문에, GFP 형광의 변화를 통해 종양 생존율을 모니터링할 수 있었습니다. 도립 에피형광 현미경을 사용하여 18시간 동안 10분 간격으로 GFP 및 명시야 이미지를 획득했습니다. 특히, 압축을 가한 스페로이드는 압축되지 않은 스페로이드보다 투영 면적이 더 크게 나타났으며, 이는 변형 가능한 막에서 종양 스페로이드로 기계적 하중이 성공적으로 전달되었음을 확인시켜 줍니다. 시간이 경과함에 따라 +NK 및 +comp+NK 조건에서 GFP 형광의 점진적인 소실이 관찰되었으며(그림 2A), 이는 NK 세포에 의한 종양 세포 살상이 일어났음을 나타냅니다.
우리는 GFP 형광의 소실을 종양 세포 사멸의 척도로 사용합니다. 본 연구에 사용된 GFP 표지 MCF-7 세포는 렌티바이러스 형질전환을 통해 생성되었습니다. 간단히 설명하면, 렌티바이러스 벡터를 사용하여 elongation factor-1α (EF1α) 프로모터에 의해 구동되는 enhanced green fluorescent protein (eGFP) 발현 카세트와 Rous sarcoma virus (RSV) 프로모터에 의해 구동되는 puromycin 내성 유전자를 도입했습니다. 감염 후, 렌티바이러스 발현 카세트가 MCF-7 세포의 게놈 DNA에 통합되어 GFP가 안정적으로 발현되었습니다. 이후 puromycin 선택 과정을 통해 형질전환되지 않은 세포를 제거했습니다. MCF-7 세포의 GFP 표지를 통해 시간 경과에 따른 GFP 형광 강도의 변화를 모니터링함으로써 종양 세포의 생존능을 정량화할 수 있었습니다(그림 2B). GFP 형광 소실과 live/dead 마커인 propidium iodide (PI) 및 세포사멸 마커인 annexin-V를 포함한 기존의 세포 사멸 마커 사이의 강한 상관관계가 이전에 입증되었으며18, 이는 GFP 형광 소실이 종양 세포 사멸의 대리 측정치로서 유효함을 검증합니다.
네 가지 실험 조건이 종양 생존력에 미치는 영향을 정량화하기 위해, 각 종양 스페로이드의 총 GFP 형광 강도를 모든 시점에서 측정하고, 배경 값을 뺀 후 초기 값으로 정규화하였다(그림 2B). 스페로이드의 총 형광은 미리 정의된 관심 영역(ROI) 내에서 계산되었다. 이 ROI는 자체 제작한 MATLAB 스크립트를 사용하여 18시간 이미지에서 종양 스페로이드의 경계를 수동으로 외곽선을 그려 설정하였다(18시간 패널의 노란색 외곽선, 그림 2A). 이후 각 시점에서 이 ROI 내의 총 형광 강도를 계산하였으며, 이미지의 다른 영역에서 선택한 별도의 ROI에서 측정한 평균 배경 형광을 빼서 보정하였다. 이렇게 얻은 배경 보정 형광 값은 이후 스페로이드의 초기 형광 강도로 정규화되었다.
그림 2B에서 각각의 색상 곡선은 특정 실험 조건 하에 있는 개별 스페로이드의 정규화된 GFP 강도를 나타냅니다. 이 곡선은 실험 데이터에 2차 다항식 피팅을 적용하여 얻었습니다. 보라색 곡선은 압축만 가한 스페로이드(+comp, 그림 2B)를, 빨간색 곡선은 NK 세포가 포함된 스페로이드(+NK, 그림 2B)를, 파란색 곡선은 압축과 NK 세포 모두에 노출된 스페로이드(+comp+NK, 그림 2B)를 나타냅니다. 이와 대조적으로, 검은색 곡선은 대조군으로 사용된 스페로이드 단독 배양 조건(sp, 그림 2B)의 스페로이드 7개 데이터에 대한 2차 다항식 피팅 값입니다. 그림 2B에서는 명확성을 위해 실험 데이터 포인트가 아닌 다항식 피팅 데이터만 제시되었습니다. 특히, 스페로이드 단독(sp) 및 스페로이드 + 압축(+comp) 조건의 GFP 형광 강도는 시간이 지남에 따라 전반적인 상승 추세를 보였으며(그림 2B), 이는 지속적인 종양 성장 또는 생존력 유지와 일치합니다. 반면, +NK 및 +comp+NK 조건에서는 GFP 형광 강도가 점진적으로 감소하여(그림 2B), 종양 세포 사멸이 일어났음을 나타냅니다.
누적 종양 세포 손실은 특정 조건(+comp, +NK 또는 +comp+NK) 하에서의 각 스페로이드의 보정된 정규화 GFP 형광 강도를 18 h 시점의 대조군 조건에서 빼어 정량화하였습니다(그림 2C). 그 결과, 각 데이터 포인트는 스페로이드 단독 대조군 대비 개별 스페로이드의 정규화된 GFP 손실을 나타냅니다(그림 2C). 이에 따라, +comp 조건은 압축만으로 인한 GFP 손실을 반영하고(보라색, 그림 2C), +NK 조건은 NK 세포만으로 인한 GFP 손실을 반영하며(빨간색, 그림 2C), +comp+NK 조건은 압축과 NK 세포의 결합 효과로 인한 GFP 손실을 반영합니다(파란색, 그림 2C). +comp 조건에서 GFP 손실 정도가 가장 낮게 나타났으며(그림 2C), 이는 압축 단독으로는 스페로이드 생존력에 미치는 영향이 미미함을 시사합니다. 반대로, +NK 및 +comp+NK 조건 모두 +comp 조건보다 유의미하게 더 큰 GFP 손실을 보였으며(그림 2C), 이는 NK 세포가 종양 세포 사멸의 주된 요인임을 나타냅니다. +comp+NK 조건이 +NK 조건보다 평균 GFP 손실이 더 컸으나, 이 차이는 통계적 유의성에 도달하지 않았습니다(그림 2C). 이러한 결과는 압축이 NK 세포 매개 종양 세포 살상 능력을 저해하지 않음을 시사합니다. 종합적으로, 이러한 발견은 미세유체 압축 장치가 생리학적으로 유의미한 3D 환경 내에서 종양 스페로이드 생존력에 미치는 압축과 NK 세포의 독립적 및 결합적 효과를 정량화하는 데 성공적으로 사용될 수 있음을 입증합니다.
반대로, (1) 스페로이드가 피스톤 경계 외부에 위치하거나, (2) 스페로이드가 피스톤 경계에 너무 가깝게 위치하거나, (3) 여러 개의 스페로이드가 서로의 스페로이드 직경 이내의 거리로 위치한 경우에는 최적이지 않은 결과가 나타날 수 있습니다(그림 3). 이러한 경우, 해당 영역은 분석에서 제외해야 합니다.
그림 3: 분석에서 제외된 스페로이드 이미지 시퀀스의 대표 예시. 1.5 mg/mL 콜라겐 내 NK 세포가 포함된 MCF-7 스페로이드의 압축 전(왼쪽 열)과 압축 후(오른쪽 두 열) 타임랩스 명시야(BF), GFP 형광 및 병합 이미지가 표시되어 있다. 압축 전 이미지는 압력을 가하기 20분 전과 타임랩스 이미징 시작 10분 전에 획득하였다. 이후 이미지는 18시간 동안 10분 간격으로 수집되었으며, 0 h는 압축 직후에 획득한 첫 번째 이미지에 해당하고 18 h는 실험의 종료 시점을 나타낸다. 파란색 화살표는 PDMS 피스톤(L2)의 가장자리를 나타낸다. 이 이미징 필드는 압축 영역 내에 두 개의 스페로이드가 존재하고 피스톤 경계에 너무 가깝게 위치했기 때문에 분석에서 제외되었다. 그 결과, 압축 동안 스페로이드의 변형과 GFP 형광 강도를 신뢰성 있게 정량화할 수 없었다. 스케일 바 = 50 µm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
(1) 피스톤 경계 외부에 위치한 스페로이드는 압력이 피스톤 영역 내에만 가해지므로 압축을 경험하지 않습니다. 따라서 이러한 스페로이드는 압축 조건과 대조군 조건 모두에서 제외해야 합니다. (2) 피스톤 경계 위 또는 근처에 위치한 스페로이드(그림 3, 상단 스페로이드)는 불균일한 기계적 하중을 받으므로 제외해야 합니다. (3) 인접한 스페로이드와 스페로이드 지름 1배 이내의 거리에 위치한 스페로이드도 제외해야 합니다(그림 3). 스페로이드 간의 거리가 너무 가까우면 관심 영역(ROI)이 최종 시점을 기준으로 정의되기 때문에 GFP 형광 강도의 정량화가 복잡해집니다. 시간이 지남에 따라 스페로이드 경계가 불분명해질 수 있으며, 이로 인해 단일 스페로이드만을 정확하게 포함하는 ROI를 설정하는 것이 어려워질 수 있습니다. 이러한 문제는 장치 로딩 중에 스페로이드가 압축 영역의 중앙에 위치하도록 하여 최소화할 수 있습니다. 균일한 압축을 달성하고 신뢰할 수 있으며 재현 가능한 실험 결과를 생성하기 위해서는 스페로이드의 분포, 배치 및 장치 설정에 세심한 주의를 기울이는 것이 필수적입니다.
| 구성 요소 | 농도 |
| $\alpha$-MEM 배지 | |
| 소태아혈청 (FBS) | 10% |
| 페니실린/스트렙토마이신 | 1% |
표 1: MCF-7 완전 배지.
| 구성 요소 | 농도 |
| $\alpha$-MEM 배지 | |
| 마이오이노시톨 | 0.2 mM |
| 2-mercaptoethanol | 0.1 mM |
| 소태아혈청 (FBS) | 12.50% |
| 엽산 | 0.02 mM |
| 말 혈청(HS) | 12.50% |
| 페니실린/스트렙토마이신 | 1% |
표 2: NK 완전 배지.
보충 그림 1: 압력 제어 시스템의 도식. 공기 압축기가 압력 제어기에 압축 공기(최대 20 psi)를 공급합니다. 압력 제어기는 사용자 정의 설정에 따라 압력 저장조로 전달되는 공기압을 조절합니다. 제어기는 최대 작동 압력 200 mbar, 풀 스케일(FS) 대비 0.005%의 압력 안정성, 0.003% FS의 압력 분해능 및 9 ms의 응답 시간을 갖추어 정확하고 재현 가능한 압력 제어를 가능하게 합니다. 제어기는 범용 직렬 버스(USB)를 통해 컴퓨터에 연결되어, 사용자가 제공된 소프트웨어를 사용하여 인가 압력의 크기와 프로파일을 프로그래밍할 수 있습니다. 소프트웨어는 일정, 사인파, 삼각형 및 주기적 압축을 포함한 다양한 압축 파형을 지원합니다. 본 도식에서는 압력이 120 mbar로 설정되었으며, 이 압력의 압축 공기가 공압 튜브를 통해 가압 저장조로 전달됩니다. 가압 저장조에는 50 mL의 탈이온(DI)수가 들어 있으며, 공압을 유체압으로 변환하는 역할을 합니다. 가압된 저장조는 유체 전달 튜브를 통해 미세유체 압축 장치의 압력 제어 유닛으로 유체를 밀어내며(그림 1에서 장치 상세 내용 참조), 여기서 유체압이 종양 스페로이드에 압축을 가하는 데 사용됩니다. PDMS 장치 내의 기포 발생을 방지하기 위해 유체압이 사용되었음에 유의하십시오. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
부록 그림 2: 피스톤 변위(, µm)와 압력 제어 챔버에 가해진 압력(KPa) 사이의 관계를 보여주는 미세유체 압축 장치의 검정 곡선. 실험 측정값은 점으로 표시되었으며, 실선은 COMSOL 시뮬레이션 결과에 해당합니다. 오차 막대는 8회의 독립적인 실험 측정값에서 얻은 평균 표준 오차(SEM)를 나타내나, 그 크기가 너무 작아 보이지 않습니다. 이 그림은 Royal Society of Chemistry의 허가를 받아 Suh 등15의 연구에서 재구성되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 영상 1: 압축 전 GFP가 표지된 MCF-7 스페로이드의 X-Y z-스택. 스페로이드를 미세유체 압축 장치 내의 1.5 mg/mL 콜라겐에 매립하고, 1 µm z-스텝 크기로 GFP 형광 채널을 사용하여 이미징하였습니다. 이후 ImageJ를 사용하여 대비를 향상시켰습니다. 스케일 바 = 50 µm. 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 영상 2: 그 후 1.5 mg/mL 콜라겐에 매립된 GFP 표지 MCF-7 스페로이드에 50%(Δh/h = 50%)의 압축 변형률을 가하였다. 압축 후, 1 µm 단계 크기로 GFP 형광 채널에서 X–Y z-stack을 획득하였으며, 대비를 높이기 위해 ImageJ에서 처리하였다. 스케일 바 = 50 µm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
토론
본 방법은 압축 응력이 종양-면역 상호작용에 미치는 영향을 조사하기 위해 미세유체 압축 장치를 사용하는 방법을 설명합니다. 이 시스템은 3D 콜라겐 매트릭스 내에 내장된 종양 스페로이드에 제어된 기계적 압축을 가할 수 있습니다. 세포 챔버(L1)의 바닥을 형성하는 유리 기판은 고해상도 살아있는 세포 이미징을 가능하게 하여, 면역 세포의 운동성, 침투 및 세포독성 활성을 정량화하려는 연구에 매우 적합합니다. 중요한 점은, 이 시스템이 기계적 환경을 정밀하게 제어하면서도 세포-세포 및 세포-매트릭스 상호작용을 보존한다는 것입니다. 이와 대조적으로, 압축 응력을 연구하기 위한 기존의 많은 실험적 접근 방식들은 ECM 매개 세포 상호작용9,13과 고해상도 이미징14 사이의 절충이 필요했습니다.
본 연구에서는 NK 세포와 MCF-7 유방암 종양 스페로이드를 모델 시스템으로 사용하였습니다. 하지만, 미세유체 압축 장치는 이러한 세포 유형에만 국한되지 않습니다. 현재까지 이 플랫폼은 MDA-MB-231 유방암 종양 스페로이드와 MCF-10A 유방 스페로이드를 포함한 여러 유방 세포 모델에 성공적으로 적용되었습니다15,17. 본 플랫폼은 뇌 및 폐 종양 스페로이드를 포함한 다양한 다른 종양 모델에서 종양-면역 상호작용을 조사하는 데 쉽게 적용될 수 있습니다. 마찬가지로, 본 플랫폼은 NK 세포 이외의 광범위한 면역 세포군과 호환되므로, 기계적 압축 하에서 다양한 종양-면역 상호작용을 연구할 수 있습니다. 또한, 이 장치는 스페로이드 기반 연구에만 제한되지 않으며 단일 세포 실험으로도 응용이 가능합니다. 이러한 특징들을 종합할 때, 본 플랫폼은 다양한 생물학적 및 질병 맥락에서 기계적 힘이 세포 행동을 어떻게 조절하는지 조사할 수 있는 다목적 도구가 됩니다.
이 시스템의 또 다른 장점은 샘플에 가해지는 압축의 크기와 패턴을 정밀하게 제어할 수 있다는 것입니다. 본 연구에서는 실험 기간 동안 50%의 정적 압축 변형을 가하였습니다. 하지만 변형 수준은 실험 목적에 따라 용이하게 수정할 수 있습니다. 또한, 외부 압력 제어 시스템을 사용하여 구형체(spheroids)에 사각파 및 사인파 파형을 포함한 다양한 파형의 동적 압축을 가할 수 있습니다. 사각파 압축은 압축과 해제가 교대로 반복되는 간격을 포함하며17, 사인파 압축은 시간이 경과함에 따라 압축이 점진적으로 증가하고 감소하는 방식을 포함합니다15. 이러한 기능들을 정량적 이미징 및 예측 모델링과 결합하면, 동적 압축이 면역 살상 효율에 미치는 영향을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
본 압축 장치는 원래 종양의 기계적 특성을 분석하기 위해 개발되었음을 밝힙니다17. in situ 힘 센서와 종양 스페로이드 하단의 폴리아크릴아마이드(PAA) 겔 층을 통합함으로써, 강성 및 점탄성과 같은 스페로이드의 기계적 특성을 정량적으로 분석할 수 있습니다15,17. 이러한 수정은 플랫폼의 활용도를 압축 응력 모델링을 넘어 종양의 기계적 거동에 대한 직접적인 측정까지 확장합니다.
전반적으로, 이 미세유체 압축 장치는 스페로이드의 기계적 특성 측정부터 기계적으로 조절되는 환경 내에서의 종양-면역 상호작용 연구에 이르기까지 폭넓은 응용 분야를 가지고 있습니다. 하지만 장치의 성공적인 작동을 위해서는 몇 가지 중요한 단계가 필요합니다. 균일한 압축을 보장하기 위해 종양 스페로이드는 각 웰의 중심 근처에 위치시켜야 합니다. 압력을 정확하게 전달하기 위해서는 압력 제어 장치가 세포 챔버 층(L1)과 적절하게 정렬되어야 합니다. 압력 제어 장치를 L1 위에 배치할 때 기포가 유입될 수 있으며, 이는 이미징 품질과 실험 결과에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 이 문제를 방지하기 위해 콜라겐 혼합물을 로딩할 때 기포가 유입되지 않도록 주의해야 하며, 압력 제어 장치를 배치하기 전 챔버를 약간 넘치게 채우기 위해 각 웰에 8 µL의 콜라겐 혼합물을 추가해야 합니다. 이는 층 간의 완전한 접촉을 보장하고 공기가 갇힐 가능성을 줄이는 데 도움이 됩니다.
결론적으로, 이 장치는 종양-면역 상호작용을 지원하는 3D 생리학적 관련 콜라겐 매트릭스 내에서 압축 응력의 제어된 모델링을 가능하게 합니다. 이 플랫폼은 정적 및 동적 기계적 힘이 종양 미세환경 내에서 면역 매개 살상 및 종양 행동을 어떻게 조절하는지 조사하기 위한 도구를 제공합니다. 현재 우리는 종양 세포의 면역 살상에 대한 기계적 조절의 기초가 되는 분자 메커니즘을 규명하고 있습니다. 이러한 연구는 잠재적인 새로운 치료제 표적으로 이어질 수 있습니다.
공개 사항
저자들은 공개할 이해관계가 없습니다.
감사의 글
본 연구는 국립암연구소(Grant R01CA221346)의 지원, FM에게 제공된 Cornell University 공과대학의 Lance R. Collins 펠로우십, 그리고 FM에게 제공된 Cornell Provost의 연구 회복력 기금(Research Resilience Fund)의 지원을 받아 수행되었습니다. 본 연구의 일부는 국립과학재단(Grant NNCI-2025233)의 지원을 받는 국가나노기술조정인프라(NNCI)의 회원 기관인 Cornell NanoScale Facility에서 수행되었습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1 N NaOH | Sigma-Aldrich | 79724 | 7 µL |
| 10× M199 배지 | Sigma-Aldrich | M0650 | 200 µL |
| 2-머캅토에탄올 | ThermoFisher | 313500100 | |
| 공기 압축기 | Elveflow | Jun-Air Model 3 컴프레서 | |
| 자동 X-Y 현미경 스테이지 | 응용 과학 기기 | MS-2000 | |
| CCD 카메라 | Hamamatsu Photonics | ORCA-R2 | |
| 소태아혈청 (FBS) | GeminiBio | S11150 | |
| 유체 전달 튜브 | Eleveflow | PTFE 튜빙 예비 롤 | 외경 1/16인치 |
| 형광 광원 | Excelitas Technologies | X-Cite 시리즈 120 PC 유닛 | |
| 엽산 | 시그마 | F7876 | |
| 글루타르알데히드 | 전자현미경 과학 | 16019 | 0.10% |
| Harrick 플라스마 세척기 | Harrick Plasma | PDC-001-HP | 고출력 설정(45W) |
| 말 혈청 (HS) | ThermoFisher | 16050-122 | |
| 도립 에피 형광 현미경 | Olympus | IX81 | 20배 대물렌즈(NA = 0.25), Olympus CellSens 소프트웨어를 사용하여 작동 |
| 마스크 | Artus | 알루미늄 심 스톡 10매 | 두께는 0.0125입니다." (0.75 mm) |
| MCF-7/GFP (Puromycin) 안정 세포주 | GenTarget Inc | SC050-G | |
| 금속 프레임 | 맞춤 제작 | 맞춤 제작 | |
| 미세유체 저장조 | Eleveflow | 50 mL 미세유체 리저버 | |
| 현미경 | Olympus | CKX41 | 4배율 대물렌즈 (NA = 0.1) |
| 미오-이노시톨 | 시그마 | I7508 | |
| NK-92 MI | ATCC | CRL-2407 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | Gibco | 15140122 | |
| 인산완충생리식염수 (PBS) | ThermoFisher | 10010072 | |
| 공압 튜브 | Eleveflow | PUR 폴리에테르 투명 파이프 입력단 | 4" 외경 mm |
| 폴리에틸렌이민 (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | 1% |
| 압력 제어기 | Elveflow | OB1 NK4 | Elveflow Smart Interface 소프트웨어를 사용하여 작동함 |
| 쥐 꼬리 유래 제I형 콜라겐 | Corning | 354249 | 31.3 µL 9.6 mg/mL 스톡 콜라겐의 |
| 나사 | 필립스 | M2.5 팬헤드 | 나사 12개 |
| 스테이지 인큐베이터 | 정밀 플라스틱 | 맞춤 제작 | |
| 주사기 | Becton Dickinson | 303134 | 3/32인치 규격의 수컷 루어 일체형 잠금 장치와 결합됨" Eleveflow의 OD 바브(Barb) |
| α-MEM 배지 | ThermoFisher | 12561056 |
참고문헌
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재인쇄 및 허가
