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방법 논문

3D 세포외 기질 내 종양-면역 세포 상호작용에서 기계적 압축의 역할을 연구하기 위한 미세유체 플랫폼

121 조회수

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DOI:

10.3791/72929

⸱

2026년 8월 28일

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1Department of Biomedical Engineering, Cornell University, 2Department of Biological and Environmental Engineering, Cornell University, 3Translational Science and Therapeutics Division, Fred Hutchinson Cancer Center, 4Department of Pathology, Albert Einstein College of Medicine

이 논문에서

요약

우리는 3차원(3D) 환경 내에서 종양-면역 상호작용을 모델링하기 위한 미세유체 플랫폼 사용 프로토콜을 제시합니다. 연구 결과, 자연살해(NK) 세포는 기계적 압착 상태에서도 항종양 활성을 유지하는 것으로 나타났습니다.

초록

세포 기반 면역요법의 맥락에서 기계적 힘은 면역 세포가 종양 세포를 사멸시키는 능력에 상당한 영향을 미칩니다. 종양 세포를 사멸시키기 위해 면역 세포는 표적 세포에 힘을 가하고 면역 시냅스를 형성해야 하며, 이를 통해 granzyme B를 포함한 세포독성 분자들이 전달됩니다. 이러한 중요성에도 불구하고, 기계적 신호를 어떻게 활용하여 면역 매개 사멸을 강화할 수 있는지는 여전히 명확히 밝혀지지 않았습니다. 이러한 지식의 공백은 부분적으로 생리학적으로 실제와 유사한 환경에서 세포 배양액에 정밀하게 제어된 기계적 스트레스를 제공할 수 있는 도구가 부족하기 때문입니다. 본 논문에서는 세포외 기질(ECM)에 매립된 종양 스페로이드에 정적 또는 동적 압축을 가하는 동시에, 광학 현미경을 통해 종양-면역 상호작용을 실시간으로 이미징할 수 있는 미세유체 압축 장치를 설명합니다.

이 미세유체 플랫폼은 12개의 구획(대조군 6개 및 기능군 6개)으로 구성되어 있습니다. 각 구획에는 압력 제어 장치 바로 아래에 배치된 세포 챔버가 포함되어 있습니다. ECM에 매립된 스페로이드는 이 세포 챔버 내에 배치됩니다. 본 플랫폼을 사용하여, 정의된 기계적 압축 조건 하에서 유방암 스페로이드(MCF-7)에 대한 자연살해(NK) 세포의 살상 효율을 조사하였습니다. 결과에 따르면, 1.5 mg/mL 콜라겐 내에서 기계적 압축 여부와 관계없이 NK 세포가 종양 스페로이드 사멸의 주요 동인으로 유지됨을 확인하였습니다. 따라서 이는 NK 세포가 압축 응력 하에서도 항종양 활성을 유지할 수 있음을 시사합니다. 이러한 발견은 종양-면역 상호작용에서 기계적 힘의 역할을 조사하는 데 있어 본 플랫폼의 유용성을 입증합니다. 현재 면역 세포가 압축 응력에 적응할 수 있게 하는 분자적 기전을 규명하는 연구가 진행 중입니다. 이러한 연구를 통해 얻은 통찰은 유망한 치료 방안을 제시할 수 있을 것입니다.

서론

세포 기반 암 면역요법은 면역 세포를 이용해 암 세포를 표적으로 삼는 치료법입니다1. 이 전략은 혈액암 치료에서 괄목할 만한 성과를 거두었습니다2,3,4. 하지만 혈액암에서 관찰된 수준의 성공이 고형암 치료에는 아직 충분히 적용되지 못하고 있습니다5,6,7. 이러한 한계의 주요 원인 중 하나는 고형암 특유의 면역 억제성 종양 미세환경(TME)입니다.

TME는 세포 행동을 조절할 수 있는 뚜렷한 기계적 신호에 의해 특징지어집니다. 면역 세포가 종양 세포를 효과적으로 사멸시키기 위해서는 표적 세포에 힘을 가하고, 세포 독성 분자가 전달되는 통로인 면역 시냅스를 형성해야 합니다8. 따라서 기계적 힘이 면역 세포 기능에 어떤 영향을 미치는지 이해하는 것은 고형암에 대한 세포 기반 면역 요법의 효능을 향상시키기 위한 새로운 치료 전략을 발견하는 계기가 될 수 있습니다.

고형암 TME의 결정적인 기계적 특징은 종양 미세환경이 성장하는 종양에 가하는 압축 응력입니다9,10. 지금까지 대부분의 압축 연구는 종양 세포 행동에 미치는 영향에 집중되어 왔습니다10,11. 최근에 들어서야 압축이 TME 내의 면역 세포에 어떻게 영향을 미치는지 이해하려는 방향으로 관심이 옮겨갔습니다12. 그 결과, 압축 응력이 Natural Killer (NK) 세포의 이동, 면역 시냅스 형성 및 세포 독성 활성에 영향을 미치는 기전은 여전히 제대로 이해되지 않았으며 충분히 정량화되지 않은 상태입니다. 이러한 공백은 TME 내의 기계적 신호를 활용하여 고형암에 대한 면역 표적화 능력을 어떻게 향상시킬 수 있는지 이해하는 데 있어 중대한 한계가 됩니다.

이 질문을 해결하는 데 있어 주요 장벽은 생리학적으로 유의미한 3D 미세환경 내에서 제어 가능하고 정량화된 압축을 가하는 동시에 종양-면역 상호작용의 실시간 이미징을 가능하게 하는 실험 플랫폼이 부족하다는 점입니다. 압축 응력을 연구하기 위한 초기 실험적 접근 방식은 스페로이드를 아가로스 겔에 임베딩하는 방식이었습니다13. 이 방법은 물리적 구속을 효과적으로 구현했지만, 천연 세포외 기질(ECM)-세포 상호작용을 제거했습니다. Dolega 등은 삼투압을 적용하여 압축 응력을 유도했으나, 스페로이드가 배양액에 부유되어 있었기 때문에 ECM 상호작용이 결여된 상태로 유지되었습니다9. Pandey 등은 트랜스웰 인서트와 추를 사용하여 콜라겐에 임베딩된 스페로이드를 압축했으며, 이는 ECM-세포 상호작용은 보존했지만 면역 세포의 운동성과 세포 독성 활성을 정량화하는 데 필요한 고해상도 이미징을 제한했습니다14. 종합적으로, 이러한 한계점들은 TME 내에서 압축에 대한 세포의 형태학적 반응을 실시간으로 이미징할 수 있는 실험 플랫폼의 필요성을 강조합니다.

본 논문에서는 생리학적으로 유의미한 ECM-세포 상호작용을 유지하면서 압축 응력을 제어하여 가할 수 있고, 면역-종양 역동성의 고해상도 살아있는 세포 이미징을 지원하는 미세유체 압축 장치15에 대한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 장치 구성 요소의 준비(섹션 1), 장치의 조립(섹션 2), 그리고 종양-면역 상호작용의 이미징(섹션 3)으로 구성됩니다. 저희는 녹색 형광 단백질(GFP)로 표지된 종양 스페로이드에 대한 NK 세포 살상 분석을 통해 해당 워크플로우를 입증합니다. 이러한 응용 분야 외에도, 이 플랫폼은 3D 미세환경 내의 광범위한 세포 유형 및 세포 상호작용에 미치는 기계적 힘의 영향을 조사하는 데 쉽게 적용될 수 있습니다.

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프로토콜

1. 장치 구성 요소의 준비

  1. 시료 로딩 챔버의 표면 활성화
    1. 웰(well) 부분만 노출되도록 샘플 로딩 챔버(Layer 1, L1) 위에 마스크를 배치하십시오.
    2. 마스킹 처리된 층 1(Layer 1)을 고출력 설정(45 W)으로 15초 동안 산소 플라즈마에 노출시키십시오.
    3. 층 1을 페트리 접시에 넣은 후, 생물안전작업대 내에서 다음 단계를 진행하십시오.
    4. 각 웰을 다음으로 처리하십시오. 10 µL 1% 폴리에틸렌이민(polyethylenimine, PEI)으로 10분 동안 처리합니다.
    5. 유리 표면에 긁힘이 발생하지 않도록 각 웰의 네 모서리에서 진공 흡입하여 웰 내의 PEI를 제거하십시오.
    6. 웰을 다음으로 세척하십시오. 10 µL 인산완충생리식염수(PBS)로 세척한 후, 측면에서 진공 흡입법으로 세척액을 제거합니다.
    7. 웰(well)을 다음으로 처리하십시오. 10 µL 0.1% 글루타르알데하이드를 사용하여 30분 동안 처리한 후, 모서리 부분에서 진공 흡입으로 글루타르알데하이드를 제거합니다.
    8. 웰을 PBS로 3회 세척하고, 매 세척 후 모서리에 남은 세척액을 제거하십시오.
    9. 층 1이 포함된 페트리 접시를 알루미늄 호일로 감싼 후 생물안전작업대(biosafety cabinet) 내에 하룻밤 동안 둡니다.
  2. 멸균 금속 프레임의
    1. 38 mm 크기의 [대상물]을 완전히 담그십시오. × 88 mm 금속 프레임과 12개의 M2.5 팬헤드 나사를 70% 에탄올에 담가 하룻밤 동안 소독합니다.
  3. 프라이밍 압력 제어 장치의
    1. 고출력 설정(45 W)으로 압력 제어 장치를 30초 동안 산소 플라즈마에 노출시키십시오.
    2. 압력 제어 장치의 기능부(features)가 아래를 향하도록 하여 탈이온(DI)수에 하룻밤 동안 담가 압력 제어 장치의 채널과 챔버를 채웁니다.
    3. 다음 날, 증류수(DI water)에 담가두었던 압력 제어 장치를 꺼냅니다.
    4. 미세유체 리저버에 초순수(DI water) 50 mL를 채웁니다.
      참고: 미세유체 저장조는 공압 튜빙 라인과 유체 공급 튜빙 라인이라는 두 개의 튜빙 연결부가 포함된 맞춤형 뚜껑이 장착된 50 mL 원추형 튜브로 구성됩니다.
    5. 공기가 채워진 주사기를 공압 튜브 라인에 연결하십시오.
    6. 시린지 플런저를 천천히 눌러 리저버에 압력을 가함으로써, 튜브가 가득 차고 튜브 끝에서 물이 떨어지기 시작할 때까지 유체 전달 튜브를 통해 초순수(DI water)를 밀어냅니다.
    7. 미리 채워져 액체가 떨어지는 유체 전달 튜브를 폴리카보네이트 매니폴드에 연결한 다음, 압력 제어 장치 후면에 위치한 1.5mm 유입구에 연결하십시오.
    8. 압력 제어 장치와 매니폴드 어셈블리를 2시간 동안 자연 건조하십시오. 완전히 건조되면 압력 제어 장치와 매니폴드 어셈블리를 다음 단계에 사용할 수 있습니다.

2. 장치 조립

  1. 세포 함유 콜라겐의 준비
    1. 금속 프레임과 나사를 70% 에탄올에서 꺼내어 건조하십시오.
    2. 생물안전작업대(biosafety cabinet) 내에 3개의 600 µL 얼음 위에 놓인 마이크로튜브를 준비합니다. 튜브에 다음과 같이 라벨을 부착하십시오. "N" (중화), "종(sp)" (MCF-7 스페로이드), 그리고 "sp+NK" (NK 세포가 포함된 MCF-7 스페로이드).
    3. 10를 추가하여 중화 혼합물을 준비하십시오.× 필요한 양의 Medium 199 (M199)와 수산화나트륨 (NaOH)을 다음의... "N" 튜브
    4. 적절한 부피의 M199:NaOH 혼합물을 다음으로 옮기십시오. "종(species)" 및 "sp+NK" 최종 농도 1이 되도록 튜브에 분주합니다.× 농도
    5. 종양 스페로이드를 수확하고 141에서 원심 분리하십시오. × g 스페로이드가 튜브 바닥에 가라앉을 수 있도록 3분 동안 방치합니다.
      참고: 종양 스페로이드 약 200 µm 이전 보고된 아가로스 마이크로웰 플랫폼을 사용하여 직경 00mm의 웰을 제작하였다.16간략히 설명하면, 3 × 106 MCF-7 세포를 36웰 플레이트에 분주하였습니다. × 웰로 구성된 36개 아가로스 마이크로웰 어레이 200 µm 직경 및 200 µm 깊게 삽입한 후 7일 동안 배양하여 실험에 사용할 종양 구형체를 생성하였습니다.
    6. 상층액을 조심스럽게 제거하고 구형체(spheroid)를 다시 현탁하십시오. 200 µL 50:50 MCF-7/NK 완전 배지(표 1 및 표 2).
    7. NK 세포를 50 mL 원추형 튜브에 수집하고, 141에서 원심분리하십시오. × g 4분 동안 유지한 후, 세포 수를 측정합니다.
      참고: NK 세포 생존율은 다음과 같아야 합니다. >실험 당일 85%.
    8. 결과물로 얻은 펠릿을 다음의 용액에 재현탁하십시오. 200 µL 완전 NK 배지의.
    9. 각 마이크로원심분리관에 적절한 부피의 콜라겐 스톡 용액을 첨가하십시오.
    10. 최종 부피가 다음이 되도록 각 튜브에 적절한 부피의 세포 현탁액을 추가하십시오. 200 µL 1.5 mg/mL의 콜라겐을 함유한.
      참고: 해당 "종(species)" 현탁액에는 종양 스페로이드만 포함되어 있는 반면, "sp+NK" 현탁액에는 종양 스페로이드와 1.5가 포함되어 있습니다. × 106 NK 세포
    11. 기포 형성을 최소화하면서 세포와 콜라겐이 고르게 분포될 수 있도록 피펫팅을 통해 부드럽게 섞어줍니다.
  2. 장치 조립 및 세포 로딩
    1. 건조된 금속 프레임 내부에 층 1(Layer 1)을 배치하십시오.
    2. 부하 9 µL 각 웰에 콜라겐 혼합물을 분주합니다.
    3. 현미경을 사용하여 압력 제어 장치 및 매니폴드 어셈블리를 레이어 1의 셀 챔버와 정렬하십시오.
    4. 건조된 나사를 매니폴드에 통과시켜 금속 프레임에 삽입함으로써, 매니폴드와 금속 프레임 사이에 압력 조절 장치와 레이어 1(Layer 1)을 고정합니다.
    5. 조립된 장치를 다음의 위치에 놓으십시오. 37 °C, 5% CO2₂ 콜라겐 중합이 일어날 수 있도록 인큐베이터에서 45분 동안 배양합니다.
    6. 4개의 배지 포트를 통해 50:50 MCF-7/NK 완전 세포 배양 배지를 첨가하십시오.

3. 종양-면역 상호작용의 이미징

  1. 조립된 장치를 도립 형광 현미경에 장착된 스테이지 인큐베이터 내부에 배치하여 살아있는 세포 이미징을 수행합니다.
    참고: 스테이지 인큐베이터는 다음의 온도를 유지했습니다. 37 °C 그리고 이미징이 진행되는 동안 약 50%의 습도를 유지합니다.
  2. 조립된 장치 위에 보조 하우징 박스를 덮어 내부 환경을 다음 상태로 유지하십시오. 37 °C, 습도 100%, 5% CO2₂ 전체 영상 촬영 기간 동안.
  3. 공압 튜브를 사용하여 장치를 압력 컨트롤러에 연결하십시오.
  4. 압착 후 스페로이드의 변형 정도를 평가할 수 있도록, 압착을 가하기 전 종양 스페로이드의 명시야 및 GFP 이미지를 획득하십시오.
  5. 이미징 기간 전반에 걸쳐 120 mbar의 일정 압력을 가하십시오.
    참고: 압력 제어 소프트웨어를 통해 사용자는 실험 중에 적용할 압력 프로필과 크기를 정의할 수 있습니다. 부록 그림 1 압력 제어 시스템의 도식도를 포함합니다.
  6. 18시간 동안 10분 간격으로 명시야(brightfield) 및 GFP 이미지를 획득하여 타임랩스 이미징을 시작하십시오.
    참고: 이미지는 20배율을 사용하여 각 종양 스페로이드의 중심 Z-평면에서 획득되었습니다.× 倒立형 에피 형광 현미경의 대물렌즈를 사용하였다. 명시야 및 GFP 형광 이미지는 각각 200.1 ms 및 298.9 ms의 노출 시간으로 촬영하였다.

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결과

다음 실험에서는 생리학적으로 유의미한 3D 미세환경 내에서 종양-면역 상호작용을 모델링하고, 동시에 종양 스페로이드에 정적 및 동적 압축을 가할 수 있는 미세유체 압축 장치15를 사용하였습니다(그림 1). 장치의 구성 요소(그림 1A1)와 조립 순서(그림 1A2)는 그림 1A에 나타나 있습니다. 금속 프레임은 장치의 베이스 역할을 하며, 세포 챔버 층(L1)이 프레임 내에 위치합니다. L2와 L3가 플라스마 본딩으로 결합된 압력 제어 유닛이 L1 위에 배치되고, 그 위에 매니폴드가 놓입니다(그림 1A2). L1과 압력 제어 유닛은 함...

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토론

본 방법은 압축 응력이 종양-면역 상호작용에 미치는 영향을 조사하기 위해 미세유체 압축 장치를 사용하는 방법을 설명합니다. 이 시스템은 3D 콜라겐 매트릭스 내에 내장된 종양 스페로이드에 제어된 기계적 압축을 가할 수 있습니다. 세포 챔버(L1)의 바닥을 형성하는 유리 기판은 고해상도 살아있는 세포 이미징을 가능하게 하여, 면역 세포의 운동성, 침투 및 세포독성 활성을 정량화하려는 연구에 매우 적합합니다. 중요한 점은, 이 시스템이 기계적 환경을 정밀하게 제어하면서도 세포-세포 및 세포-매트릭스 상호작용을 보존한다는 것입니다. 이와 대조적으로, 압축 응력을 연구하기 위한 기존의 많은 실험적 접근 방식들은 ECM 매개 세포 상호작용9,13과 고해상도 이미징14 사이의 절충이 필요했습니다.

본 연구에서는 NK 세포와 MCF-7 유방암 종...

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공개 사항

저자들은 공개할 이해관계가 없습니다.

감사의 글

본 연구는 국립암연구소(Grant R01CA221346)의 지원, FM에게 제공된 Cornell University 공과대학의 Lance R. Collins 펠로우십, 그리고 FM에게 제공된 Cornell Provost의 연구 회복력 기금(Research Resilience Fund)의 지원을 받아 수행되었습니다. 본 연구의 일부는 국립과학재단(Grant NNCI-2025233)의 지원을 받는 국가나노기술조정인프라(NNCI)의 회원 기관인 Cornell NanoScale Facility에서 수행되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1 N NaOHSigma-Aldrich797247 µL
10× M199 배지Sigma-AldrichM0650200 µL
2-머캅토에탄올ThermoFisher313500100
공기 압축기ElveflowJun-Air Model 3 컴프레서
자동 X-Y 현미경 스테이지응용 과학 기기MS-2000
CCD 카메라Hamamatsu PhotonicsORCA-R2
소태아혈청 (FBS)GeminiBioS11150
유체 전달 튜브EleveflowPTFE 튜빙 예비 롤외경 1/16인치
형광 광원Excelitas Technologies X-Cite 시리즈 120 PC 유닛
엽산시그마F7876
글루타르알데히드전자현미경 과학 160190.10%
Harrick 플라스마 세척기Harrick PlasmaPDC-001-HP고출력 설정(45W)
말 혈청 (HS)ThermoFisher16050-122
도립 에피 형광 현미경OlympusIX8120배 대물렌즈(NA = 0.25), Olympus CellSens 소프트웨어를 사용하여 작동
마스크Artus알루미늄 심 스톡 10매두께는 0.0125입니다." (0.75 mm)
MCF-7/GFP (Puromycin) 안정 세포주GenTarget IncSC050-G
금속 프레임맞춤 제작 맞춤 제작 
미세유체 저장조Eleveflow50 mL 미세유체 리저버 
현미경 OlympusCKX414배율 대물렌즈              (NA = 0.1)
미오-이노시톨시그마I7508
NK-92 MIATCCCRL-2407
페니실린/스트렙토마이신Gibco 15140122
인산완충생리식염수 (PBS) ThermoFisher 10010072
공압 튜브EleveflowPUR 폴리에테르 투명 파이프 입력단4" 외경 mm
폴리에틸렌이민 (PEI)Sigma-AldrichP31431%
압력 제어기ElveflowOB1 NK4Elveflow Smart Interface 소프트웨어를 사용하여 작동함
쥐 꼬리 유래 제I형 콜라겐 Corning35424931.3 µL 9.6 mg/mL 스톡 콜라겐의
나사필립스M2.5 팬헤드나사 12개
스테이지 인큐베이터정밀 플라스틱맞춤 제작
주사기Becton Dickinson3031343/32인치 규격의 수컷 루어 일체형 잠금 장치와 결합됨" Eleveflow의 OD 바브(Barb)
α-MEM 배지ThermoFisher12561056

참고문헌

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  15. Suh YJ, et al. A microfluidic rheometer for tumor mechanics and invasion studies. Lab Chip. 2025;25(22):6018-32.
  16. Song W, et al. Dynamic self-organization of microwell-aggregated cellular mixtures. Soft Matter. 2016;12(26):5739-46.
  17. Pandey M, et al. Viscoelastic properties of tumor spheroids revealed by a microfluidic compression device and a modified power law model. Soft Matter. 2026;22(7):1618-29.
  18. Steff A-M, Fortin M, Arguin C, Hugo P. Detection of a decrease in green fluorescent protein fluorescence for the monitoring of cell death: An assay amenable to high-throughput screening technologies. Cytometry. 2001;45(4):237-43.

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