마우스의 제1하악구치 추출을 위한 수정된 접근법을 설명하고, 절차적 효율성과 재현성을 평가하기 위해 기존 접근법과 비교합니다. 이 수정된 접근법은 마우스 하악 치아 소켓 치유 모델을 구축하는 과정에서 절차적 일관성을 향상시키고 기술적 어려움을 줄여줍니다.
이 논문에서
요약
초록
치아 소켓 치유 모델(TSHM)은 골 재생의 근저에 있는 분자적 메커니즘을 조사하기 위해 널리 사용되는 동물 모델입니다. 마우스 하악 TSHM은 하악 특이적 병리 과정을 연구하는 데 가치가 있지만, 하악 구치 영역의 해부학적 및 생체역학적 특성으로 인해 이 모델을 구축하는 것은 여전히 기술적으로 어렵습니다. 본 프로토콜에서는 절차적 효율성과 재현성을 높이기 위해 마우스 하악 제1구치 발치를 위한 수정된 접근법을 설명하고, 이를 기존 기술과 비교합니다. 통제된 실험 조건 하에서, 수정된 접근법은 평균 발치 시간을 29분에서 10분으로 유의하게 단축시켰습니다. 또한, 수정된 그룹은 치근 및 치조골 골절을 포함한 발치 관련 합병증이 더 적게 나타나 절차적 일관성이 향상되었음을 보여주었습니다. 마이크로 컴퓨터 단층촬영(μCT) 분석 결과, 초기 치유 과정 동안 발치 소켓 구조의 보존 상태가 개선된 것이 추가로 입증되었습니다. 이러한 결과는 수정된 발치 접근법이 마우스 하악 치아 발치와 관련된 기술적 어려움을 줄이면서 절차적 효율성과 재현성을 향상시킨다는 것을 나타냅니다. 본 프로토콜은 특히 미세수술 경험이 적은 연구자들이 마우스 하악 치아 소켓 치유 모델을 보다 일관되게 구축하는 데 도움이 될 수 있습니다.
서론
치아 소켓 치유 모델(tooth socket healing model, TSHM)은 골 재생을 연구하기 위한 고전적인 모델입니다1. 이 모델은 치조골 내에 까다롭지만 임계점 이하의 손상을 유도하여, 추가적인 처치 없이도 유리한 자연 치유가 가능하게 합니다1. 마우스는 유전적 배경, 인간과 유사한 골 대사, 상대적으로 낮은 번식 비용 및 유지 관리의 용이성으로 인해 모델 생물로 널리 사용됩니다2. 지난 수십 년 동안 유전자 편집 기술의 급격한 발전으로 마우스는 골 재생의 근저에 있는 분자적 메커니즘을 조사하는 데 필수적인 존재가 되었습니다3. 결과적으로, 형질전환 마우스의 구치 추출은 골 재생의 조절 메커니즘을 연구하기 위한 TSHM을 구축하는 데 널리 이용되어 왔습니다4,5,6.
대부분의 이전 연구들은 상악골을 사용하여 마우스 TSHM을 구축해 왔는데4,5,6, 이는 하악골이 상악골보다 기계적으로 더 단단하고 순응도가 낮아7 치아 추출의 기술적 난이도가 높기 때문입니다. 또한, 상악 구치 추출을 위한 수술 부위가 상대적으로 더 접근하기 쉽고, 상악골이 하악골보다 고정하기 쉬워 절차상의 기술적 요구도가 더 낮습니다. 이러한 어려움에도 불구하고, 마우스 하악 제1구치의 굽어 있고 확장된 치근단 형태는 주변 치조골 내에서 기계적 유지를 증가시켜8,9 추출을 더욱 복잡하게 만듭니다 (그림 1). 그럼에도 불구하고, 하악 발치 모델은 골수염, 약물 관련 턱뼈 괴사, 임플란트 골유착, 생체 재료를 이용한 골 재생 등 하악 특이적 병리 과정을 조사하는 데 필수적입니다10,1,12. 따라서 하악 특이적 치아 소켓 치유 모델이 필요한 연구를 위해 마우스 하악 구치를 추출하는 재현 가능하고 신뢰할 수 있는 방법이 중요합니다.
그림 1. 인간과 생쥐의 치아 형태에 대한 도식적 비교.
(A) 성인 인간 치아의 모식도. (B) 청소년기 마우스 하악 제1대구치의 모식도. (C) 성인 마우스 하악 제1대구치의 모식도. 위 도식들은 치조골 내에서 성인 마우스 하악 제1대구치의 기계적 유지력을 증가시키는 요인 치근 형태 및 백세질 분포의 차이점을 강조한다. 법랑질, 상아질 및 백세질은 범례에 표시된 해당 색상으로 나타냈다. 해부학적 특징은 기발표된 기술 내용을 바탕으로 하였다.8,9,15. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
본 연구팀에서 이전에 개발한 치아 추출 기술은 치과용 엘리베이터로 개조된 주사기를 사용합니다13. 이 방법은 마우스의 우측 하악 제1대구치를 성공적으로 추출할 수 있게 하지만, 매우 높은 수준의 기술적 정밀도가 필요하며 숙련되기까지 광범위한 연습이 필요한 가파른 학습 곡선을 가지고 있습니다. 미숙련자의 경우 인접한 해부학적 구조에 의도치 않게 손상을 입힐 수 있습니다. 또한, 좌측 하악 제1대구치를 추출하려면 절차적 능숙도를 확보하기 위해 추가적인 "거울상(mirror-image)" 훈련이 필요합니다. 이러한 어려움은 추출 발치와의 무결성을 손상시키고, 개체 간 치유 결과의 일관성을 떨어뜨리며, 미세 수술 경험이 부족한 연구자들의 모델 접근성을 제한할 수 있습니다.
본 프로토콜은 시술 접근성과 재현성을 향상시키기 위해 수정된 마우스 하악 제1대구치 발치 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 하악 제1대구치 TSHM을 구축하기 위해 8주령 수컷 C57BL/6 마우스에서 검증되었습니다. 수정된 접근법을 기존 기술과 체계적으로 비교하여 시술 효율성, 발치 성공률 및 시술 관련 합병증을 평가했습니다. 또한, 방법 습득 과정에서 발생하는 일반적인 기술적 실패 사례를 분석하여 마우스 하악 TSHM을 구축하는 연구자들에게 실질적인 지침을 제공하고자 하였습니다.
프로토콜
모든 절차는 쓰촨 대학교 서중국 구강학 대학 윤리 위원회(WCHSIRB-D-2025-18)의 승인을 받았으며, 기관의 동물 관리 지침에 따라 수행되었습니다.
참고: 체중 2–29 g인 8주령 수컷 C57BL/6 마우스를 사용하십시오. 표준 사육 조건(21°C–24°C, 습도 40%–60%, 12시간 명암 주기) 하에서 표준 사료와 물을 자유롭게 섭취하도록 유지하십시오. 재료 표에 나열된 재료와 기구를 사용하십시오. 비교 평가 및 실패 사례 제시를 위해 24마리의 마우스를 사용하십시오. 비교 실험 전 작업자 교육을 위해 추가 마우스를 사용하십시오.
1. 수술 전 준비
- 기구 준비
- 엘리베이터로 사용할 25 G 주사 바늘을 준비한다(선택 사항). 각 바늘의 경사진 팁을 약 20°–40°로 구부린다13.
- 치과용 포셉으로 사용할 치상 안과용 핀셋을 준비한다. 확대경을 통해 치상 팁을 검사하여 치아가 제대로 정렬되어 있고 변형이 없는지 확인한다.
- 고무줄 1개와 25 G 주사 바늘 4개를 사용하여 구강 견인기를 조립한다. 수술 플랫폼으로 사용할 폼 보드 또는 판지, 마우스 사지를 고정할 테이프, 수술 부위를 비출 헤드램프를 준비한다.
- 수술 후 회복을 위한 가열 패드를 준비하고 수술 전 약 38°C로 예열한다. 지혈을 위한 솜 뭉치와 구강 세척을 위한 적당량의 식염수를 준비한다.
- 발치 과정 동안 엄지손가락을 덮어 작업자를 보호할 핑거 슬리브를 준비한다.
- 무균 상태를 유지하기 위해 수술 표면과 가열 패드 위에 멸균 부직포를 깐다.
- 마취 준비
- 포비돈-요오드 소독액에 적신 솜 뭉치를 사용하여 마우스의 복부를 소독한다. 1% 펜토바르비탈 나트륨(50 mg/kg)을 복강 내 투여한다14. 발가락 꼬집기 테스트(toe-pinch test)를 통해 마취 깊이를 평가하고 필요에 따라 추가 마취제를 투여한다.
참고: 발가락 꼬집기 반사가 돌아오거나 절차가 예상 마취 지속 시간에 도달하면, 절차를 중단하고 승인된 기관 수의학 프로토콜에 따라 추가 마취제를 투여한다. - 각막 건조를 방지하기 위해 마취 직후 양쪽 눈에 수의용 안연고를 도포한다.
- 포비돈-요오드 소독액에 적신 솜 뭉치를 사용하여 마우스의 복부를 소독한다. 1% 펜토바르비탈 나트륨(50 mg/kg)을 복강 내 투여한다14. 발가락 꼬집기 테스트(toe-pinch test)를 통해 마취 깊이를 평가하고 필요에 따라 추가 마취제를 투여한다.
- 소독 및 멸균 준비
- 75% 에탄올로 수술 플랫폼, 가열 패드, 테이프, 핑거 슬리브 및 주변 작업 영역을 소독한다. 각 마우스마다 새로운 멸균 면봉, 부직포, 고무줄 및 바늘을 사용한다. 치상 핀셋과 식염수는 사용 전 표준 기관 증기 멸균 프로토콜을 사용하여 멸균한다.
주의: 75% 에탄올은 인화성 물질이다. 열, 스파크, 노출된 화염 및 기타 점화원으로부터 떨어진 환기가 잘 되는 곳에서 사용한다. 적절한 개인 보호 장구를 착용한다. 절차를 시작하기 전에 에탄올로 처리한 기구와 표면을 완전히 건조시킨다. - 절차를 시작하기 전 손 위생을 실시한다. 깨끗한 수술복, 멸균 수술모, 수술용 마스크 및 멸균 장갑을 착용한다.
- 75% 에탄올로 수술 플랫폼, 가열 패드, 테이프, 핑거 슬리브 및 주변 작업 영역을 소독한다. 각 마우스마다 새로운 멸균 면봉, 부직포, 고무줄 및 바늘을 사용한다. 치상 핀셋과 식염수는 사용 전 표준 기관 증기 멸균 프로토콜을 사용하여 멸균한다.
2. 수술 과정
- 마우스의 고정 및 세척
- 마우스를 고정 플레이트 위에 앙와위(supine position)로 놓고 테이프로 사지를 고정합니다. 안와-귀 평면 높이의 폼 보드에 25 G 바늘 2개를 삽입하고, 하악골 아래에 추가로 25 G 바늘 2개를 삽입합니다.
- 바늘 위에 고무줄을 걸고 절치에 걸쳐 입을 벌린 상태로 유지합니다. 혀를 부드럽게 당겨 발치 부위의 반대편으로 위치시켜 수술 시야가 가려지지 않도록 합니다. 본 프로토콜 전반에서는 우측 하악 제1대구치를 대표 예시로 사용합니다.
- 식염수를 적신 작은 면봉을 사용하여 구강 내의 음식물 찌꺼기 및 기타 이물질을 제거합니다.
참고: 질식의 원인이 될 수 있으므로, 면봉을 충분히 짜서 과도한 식염수가 구강 내로 들어가지 않도록 합니다.
- 원심측 및 근심측 저항 제거(선택 사항)
- 왼손에 핀셋을 사용하여 입 오른쪽 구석을 당겨 우측 하악 제1대구치와 주변의 협측 및 설측 연조직을 완전히 노출시킵니다.
- 오른손으로 핀셋을 잡습니다. 그런 다음 왼손으로 25 G 바늘을 잡고 원심측 치근에 인접한 협측 치주인대 내로 바늘을 조심스럽게 삽입하여 치주인대 공간을 만듭니다.
- 바늘을 치근단 부위를 향해 천천히 전진시키면서, 치아를 향해 근심측 및 설측으로 회전시켜 치조와에서 치근을 헐겁게 만듭니다.
- 협측에서 치근 분지부(root furcation)로 25 G 바늘을 삽입하고 왼손으로 교합면 방향으로 들어 올립니다. 오른손으로 근심측 치근에 인접한 설측 치주인대에 두 번째 25 G 바늘을 삽입하여 치주인대 공간을 만든 후, 바늘을 원심측 및 협측으로 회전시킵니다.
- 치주인대 사전 이완을 완료한 후 수술 시야에서 두 바늘을 모두 제거합니다.
참고: 치주인대 사전 이완은 포셉으로 초기 흔들기(swinging)를 수행한 후에도 치아의 동요도가 최소 수준이고 저항이 현저할 때만 수행합니다.
- 흔들기 및 발치
- 왼손의 검지와 중지를 사용하여 마우스의 머리를 고정합니다. 손가락 슬리브를 낀 엄지손가락을 하악 절치에 대어 지지하고, 오른손으로는 핀셋을 잡습니다.
- 핀셋 팁을 교합 평면에 수직이 되게 하고 치아의 장축과 평행하게 유지합니다. 안정적인 견인력을 얻기 위해 톱니 모양의 팁을 치근 분지부 내에 위치시킵니다.
참고: 치근 파절이 발생할 수 있으므로 핀셋으로 치근을 직접 잡지 마십시오. - 핀셋으로 치관을 잡고 부드럽게 협설측으로 흔들어 줍니다. 협측 흔들기 각도는 30°, 설측 흔들기 각도는 50°로 제한합니다. 1~1.5초마다 한 번씩 흔들기 동작을 수행합니다.
- 하악을 안정시키기 위해 왼손 엄지 지두로 하악 절치에 꾸준한 대항 지지(counter-support)를 가하면서, 대구치의 장축을 따라 치근단에서 치관 방향으로 견인력을 유지합니다.
참고: 절치 및 인접 연조직에 과도한 압박이나 변위가 생기지 않도록 주의하며 지속적이고 안정적인 대항 지지를 유지합니다. - 치아가 점차 흔들리고 교합면이 인접 대구치보다 눈에 띄게 상승할 때까지 흔들기 동작을 계속합니다. 시술 내내 핀셋 팁을 치아의 장축과 평행하게 유지하고, 충분한 동요도가 확보되면 치아를 발치합니다.
참고: 최종 발치력을 가하기 전에 치관을 협설측 방향으로 부드럽게 흔들어 치아의 동요도를 평가합니다. 치관이 최소한의 저항으로 변위되고 협설측 이동 진폭이 치관 너비의 약 절반에 도달했을 때만 발치를 진행합니다. 완전 발치 직전에 마취 깊이를 재평가합니다. 필요한 경우 추가 마취를 실시합니다 (그림 2).
그림 2전통적 방식과 수정된 방식의 마우스 하악 제1대구치 발치법 비교.
(A) 굽힌 25 G 바늘을 치주인대에 삽입하여 지렛대로 사용하여 치아를 탈구시키는 기존 발치법의 모식도. (B) 톱니 모양의 안과용 핀셋으로 치관을 잡고 치아의 장축과 평행하게 견인력을 가하는 수정 발치법의 모식도. (C) 엘리베이터로 사용된 25 G 바늘의 굽은 팁 대표 이미지. (D) 마이크로 발치 집게로 사용된 톱니 모양 안과용 핀셋의 대표 이미지. (E) 하악 제1대구치 발치 직후의 발치窩를 보여주는 대표적인 수술 중 이미지; 점선 외곽선은 발치窩를 나타냄. (F) 성공적으로 발치된 하악 제1대구치의 협측 뷰. (G) 동일하게 발치된 하악 제1대구치의 설측 뷰. 스케일 바 = 2 mm (C,D) 및 400 µm (E–G). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
3. 추출된 치아 및 발치窩(발치窩) 검사
- 발치된 치아를 검사하여 완전히 제거되었는지와 구조적 무결성을 확인합니다. 근관 형태가 보존되어 근심근(mesial root)이 더 길고 원심근(distal root)이 더 짧으며, 치근단 확장(apical enlargement)이 나타나는지 확인합니다15. 발치된 치아에 치조골 파편이 붙어 있지 않은지 확인합니다.
- 발치窩(extraction socket)를 검사하여 깨끗하고 잔존 치근 파편이 없는지 확인합니다 (그림 2).
참고: 발치 중 잔존 또는 파절된 치근이 의심되는 경우, 과도한 시도는 발치窩 결손을 악화시킬 수 있으므로 반복적인 조작을 피하십시오. 확대경을 통해 발치 부위를 검사하여 잔존 치근 파편의 존재 여부를 확인합니다. 잔존 또는 파절된 치근이 있는 사례는 발치 실패로 기록하고 이후의 모델 평가에서 제외합니다. 해당 동물들은 승인된 동물 실험 프로토콜에 따라 처리하십시오.
4. 수술 후 관리
- 마른 솜을 사용하여 지혈합니다. 생리식염수를 적신 작은 솜 뭉치로 구강 내를 세척한 다음, 혀를 원래 위치로 되돌립니다.
참고: 솜 뭉치는 액체가 흘러나오지 않을 정도로 표면만 적실 수 있는 최소량의 멸균 생리식염수로 적십니다. - 수술 후 통증 완화를 위해 carprofen(5 mg/kg, 피하 주사)을 투여합니다.
- 동물을 가열 패드 위에 놓고 의식을 회복할 때까지 지속적으로 관찰합니다.
- 마취에서 회복된 후, 3일 동안 케이지 바닥에 부드럽게 만든 표준 사료 또는 젤 식단을 제공하고 물은 자유롭게 섭취하게 합니다. 정상적인 섭식 행동이 확인되면 표준 사료 식단으로 복귀합니다.
- 정해진 간격으로 사료 섭취량, 체중, 활동성, 그루밍 행동, 안면 부종, 구강 출혈 및 통증이나 고통의 징후를 모니터링합니다.
5. 실험자 교육
- 마우스 경조직 재생 모델에 대한 이전 경험이 없는 두 명의 술자를 무작위로 선정하여 기존 발치군 또는 수정 발치군에 배정합니다. 두 가지 발치 방식 모두에 능숙한 동일한 지도자의 감독 하에 각 술자를 개별적으로 교육합니다.
- 첫째 주에는 각 술자가 마우스 사체에서 배정된 발치 절차를 연습하여 수술 워크플로우에 익숙해지도록 지도합니다.
- 둘째 주에는 살아있는 마우스를 대상으로 교육을 감독하여 각 기술의 실질적인 적용을 평가하고 개선합니다. 각 절차를 모니터링하여 적절한 마취가 이루어졌는지 확인하고, 부적절한 기구 조작으로 인한 주변 연조직의 우발적 손상이나 치조 구조의 손상 등 의도치 않은 수술 합병증을 방지합니다. 술자가 독립적으로 3회 연속 성공적인 발치를 수행할 수 있을 때 숙련도를 인정합니다. 지도하의 교육을 완료한 후, 비교 발치 실험을 진행합니다.
6. 시료 준비
- 경추 탈구법으로 마우스를 안락사시킨다. 머리에서 하악골을 적출하고 부착된 연조직을 제거한다.
- 하악골을 4% 파라포름알데히드 용액에 48시간 동안 고정한다. µCT 스캐닝 전까지 시료를 PBS에 보관한다.
7. µCT 및 분석
- µCT 스캐너를 사용하여 하악골을 스캔합니다. 스캔 파라미터를 80 kV, 50 µA, 10 µm voxel 해상도 및 층별 스캔(layer-by-layer scanning)으로 설정합니다.
- 하이드록시아파타이트 팬텀을 사용하여 µCT 시스템을 교정합니다. 팬텀을 스캔하고 DataViewer를 사용하여 재구성된 이미지를 내보냅니다.
- CTAn을 사용하여 팬텀 이미지를 분석합니다. 팬텀 삽입물의 측정된 CT 감쇠 값과 알려진 무기질 밀도를 상관시켜 감쇠 값을 BMD로 변환하는 교정 곡선을 설정합니다.
- 모든 샘플에 동일한 스캔 및 재구성 파라미터를 적용합니다.
- µCT 시스템과 연동된 CTAn의 표준화된 재구성 워크플로우를 사용하여 모든 데이터 세트를 재구성합니다. 모든 샘플에 동일한 재구성 설정, ROI 정의 및 정량 분석 기준을 적용합니다. 대표 시각화를 위해 CTAn 정량 분석에 사용된 것과 동일한 ROI 정의를 따라 Mimics Research를 사용하여 3차원 재구성을 별도로 수행합니다.
- 발치된 하악 제1대구치의 원심 치근 부위를 선택하여 관심 영역(ROI)을 정의합니다. 인접한 제2대구치의 백아법랑경계(cementoenamel junction)로부터 치근단 방향으로 연속된 횡단면 슬라이스 100장을 수집합니다.
- 발치窩를 둘러싼 새로 형성된 치조골의 경계를 따라 각 슬라이스의 ROI를 수동으로 외곽선을 그립니다. 모든 샘플에 대해 동일한 분석 파라미터를 사용하여 CTAn으로 후속 이미지 처리 및 정량 분석을 수행합니다.
- Mimics Research를 사용하여 3차원 재구성을 수행합니다. 치근 파절 및 발치窩 벽 결손의 발생률을 전체 하악골 샘플 수 대비 각 상태를 보이는 하악골 샘플의 비율로 계산합니다.
- GraphPad Prism v10.1.2를 사용하여 모든 통계 분석을 수행하고 그래프를 생성합니다. Shapiro–Wilk 검정을 사용하여 연속 변수의 정규성을 평가합니다.
- 모든 분석에서 개별 마우스와 그에 해당하는 발치窩를 실험 단위로 정의합니다.
- 비쌍체 양측 Student’s t test를 사용하여 그룹 간 발치 시간, BMD 및 BV/TV를 비교합니다. Fisher’s exact test를 사용하여 치근 파절 및 발치窩 벽 결손의 발생률을 비교합니다.
- 통계적 유의성을 다음과 같이 표시합니다: *, p < 0.05; **, p < 0.01; 및 ***, p < 0.01. 두 그룹 간에 통계적으로 유의미한 차이가 없는 경우 “ns”를 사용합니다.
결과
하악 제1대구치 발치와 관련된 해부학적 특징은 그림 1에 나타나 있으며, 기존 및 수정된 발치 접근법은 그림 2A,B에 도식적으로 표시되어 있습니다. 준비된 바늘과 치상 안과용 핀셋, 신선한 발치窩, 그리고 발치된 하악 제1대구치의 대표 이미지는 그림 2C–G에 나와 있습니다. 전체적인 절차 워크플로우는 그림 3에 요약되어 있습니다. 두 접근법의 절차적 효율성과 일관성을 비교하기 위해, 마우스 핸들링 경험이 동일한 두 명의 작업자가 기존 방법 또는 수정된 방법 중 하나를 사용하여 하악 제1대구치 발치를 수행하도록 무작위로 배정되었습니다. 모든 마우스는 8주령 수컷 C57BL/6 마우스를 사용하였습니다. 발치 시간과 절차 관련 합병증은 발치 직후에 기록하였으며, 발치窩는 치유 2주 후 µCT로 평가하였습니다. 발치 시간은 시술 중에 기록되었으므로 맹검 평가가 불가능했으나, 발치된 치아와 µCT 데이터셋은 평가 전 코딩하여 평가자가 발치 방법을 알 수 없도록 맹검 처리하였습니다.
그림 3기존 및 수정된 마우스 하악 제1대구치 발치 절차의 워크플로.
작업 흐름은 기구 준비, 마취, 소독 및 멸균, 그리고 마우스 고정으로 시작됩니다. 이후 프로토콜은 전통적 추출 방식과 수정된 추출 방식으로 나뉩니다. 전통적 방식은 치아 추출 전 원심측 및 근심측 저항을 순차적으로 제거하는 과정을 포함하며, 수정된 방식은 선택적인 치주인대 사전 이완 후, 요철이 있는 안과용 핀셋을 사용하여 치아를 흔들어 추출하는 과정을 포함합니다. 두 방식 모두 추출된 치아와 발치와를 검사하는 것으로 마무리되며, 이후 수술 후 처치가 이어집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
발치 직후와 치유 2주 후에 얻은 대표적인 µCT 이미지가 그림 4A–D에 제시되어 있다. 수정된 접근법은 기존 접근법에 비해 평균 발치 시간을 유의하게 단축시켰다 (10 min vs. 29 min, p = 0.06; 그림 4E). 치근 파절은 수정 그룹의 마우스 2/6마리(3.3%)와 기존 그룹의 마우스 4/6마리(6.7%)에서 발생했으며, 그룹 간에 통계적으로 유의한 차이는 없었다 (p = 0.545; 그림 4F). 치조와 벽 결손은 수정 그룹의 마우스 0/6마리와 기존 그룹의 마우스 4/6마리(6.7%)에서 관찰되었으며, 이 차이는 통계적으로 유의하지 않았다 (p = 0.0606; 그림 4G). 치유 2주 후, µCT 분석 결과 수정 그룹의 BMD 및 BV/TV 값이 기존 그룹보다 유의하게 높게 나타났다 (각 p = 0.018 및 p = 0.0253; 그림 4H,I). 이러한 결과는 수정된 접근법을 통해 발치 시간이 단축됨을 입증하며, 테스트된 실험 조건 하에서 발치의 일관성이 개선되었음을 시사한다.
그림 4생쥐 하악 제1대구치 발치 및 이후 치조와 치유에 대한 기존 방식과 수정된 방식의 비교.
(A–D) 대표 마이크로 컴퓨터 단층촬영 (µCT) conventional approach(A,C) 또는 modified approach(B,D)를 사용하여 발치 직후(A,B) 및 발치 2주 후(C,D)의 발치窩 이미지를 나타낸다. 패널 1-3은 각각 시상면, 관상면 및 횡단면 뷰를 보여주며, 패널 4는 이에 상응하는 3차원 재구성 영상을 보여준다. 빨간색 점선은 원래의 치근 윤곽을 나타낸다. 흰색 점선과 빨간색 화살표는 발치窩 벽 결손을 나타낸다. A1, B1, C1 및 D1의 주황색 실선은 해당 단면 뷰의 위치를 나타낸다. C1, C2, D1 및 D2의 파란색 점선은 발치窩 내에 새롭게 형성된 골의 범위를 나타낸다. 3차원 재구성 영상(C4,D4)에서 신생골은 빨간색으로 강조 표시되었다. (E–I) 발치 시간(E), 치근 파절 발생률(F), 발치窩 벽 결손 발생률(G), 골밀도(BMD; H) 및 골 부피 분율/조직 부피(BV/TV; I)를 포함하여 발치 효율 및 초기 발치窩 치유의 정량적 비교를 나타낸다. 시술 결과(E–G)의 경우, n = 그룹당 생쥐 6마리; 다음을 위해 µCT 발치窩 치유 분석(H,I), 제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요. = 그룹당 마우스 3마리. 개별 마우스와 그에 해당하는 발치窝를 실험 단위로 간주하였다. E, H, I의 연속 결과값은 평균 ± 표준편차(SD)로 나타내었으며, 비쌍체 꼬리 양방향 Student's t-검정을 사용하여 비교하였다. t F와 G의 범주형 결과는 원시 수치와 백분율로 표시되었으며, Fisher의 정확 검정을 사용하여 비교하였다. 치근 파절은 대조군 6마리 중 4마리(6.7%), 수정군 6마리 중 2마리(3.3%)에서 발생하였다. 치조벽 결손은 대조군 6마리 중 4마리(66.7%)에서 발생하였으며, 수정군에서는 0/6마리였다. 통계적 유의성: *, p < 0.05; ***, p < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
성공적인 발치는 그림 4A–D에 예시된 바와 같이, 이후의 치유 평가를 위해 치조와 구조를 보존하면서 잔존 치근 파편 없이 하악 제1대구치를 완전히 제거한 것으로 정의하였다. 불완전한 치아 제거 또는 시술 관련 손상으로 인해 이후의 치조와 치유 평가가 저해된 경우 발치 실패로 간주하였다. 대표적인 실패 사례는 그림 5A–F에 나타나 있다. 치관 파절은 그림 5A에, 원심근 파절은 그림 5B에, 근심근 결손은 그림 5C에 각각 표시되어 있다. 잔존 치근 파편과 치근단 파절은 각각 그림 5D,E에 나타나 있다. 하치조신경관 부근의 구조적 손상은 그림 5F에 표시되어 있다. 이러한 실패 사례들은 바늘 삽입 각도나 깊이의 조절 미흡, 부적절한 발치 경로, 과도한 힘의 가함 또는 과도한 조작과 관련이 있었다. 성공적인 결과와 최적이 아닌 결과를 모두 포함함으로써 프로토콜 수행 중 발생할 수 있는 결과의 범위를 보여주고, 발치의 성공과 실패를 해석하기 위한 기준을 제공한다.
그림 5. 실패한 마우스 하악 제1대구치 발치의 대표적인 예시.
(A–F) 대표 이미지 µCT 일반적인 발치 관련 합병증을 보여주는 이미지 및 3차원 재구성 영상. (A) 치관 파절. (B) 원심근 파절. (C) 근심근 결손. (D) 잔존 치근 파편. (E) 치근단 파절. (F) 주변 해부학적 구조의 손상. 빨간색 점선은 원래의 치근 윤곽을 나타낸다. 흰색 점선은 골 결손 또는 인접 해부학적 구조를 나타낸다. 빨간색 화살표는 손상 부위 또는 잔존 치근 파편의 위치를 가리킨다. 패널 A, B, D, E에 표시된 3차원 재구성 영상에서 파절된 치근과 인접 치아는 빨간색으로 강조 표시되어 있다. 패널 C와 F에는 3차원 재구성 영상의 대표적인 단면도가 포함되어 있다. 모든 표본은 치아 발치 2주 후에 수집되었다. 스케일 바 = 200 µm. 약어: µCT마이크로 컴퓨터 단층촬영. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
토론
TSHM의 성공적인 구축을 위해서는 주변 치조 구조를 보존하면서 치아를 완전히 제거해야 하며, 이는 발치 관련 손상이 이후의 골 재생을 저해할 수 있기 때문입니다16. 따라서 발치 과정의 재현성은 모델 신뢰성의 결정적인 요인이 됩니다17. 본 연구에서는 표준화된 훈련 조건 하에서 수정된 포셉 기반 하악 제1대구치 발치법을 기존의 레버 기반 기술과 체계적으로 비교하였습니다. 수정된 방법은 현저히 단축된 발치 시간과 적은 발치 관련 합병증에서 나타나듯, 개선된 절차적 효율성과 재현성을 보였습니다. 구체적으로, 동일한 2주간의 훈련 기간 후, 평균 발치 시간은 기존 방법의 29분에서 수정된 방법의 10분으로 단축되었습니다. 또한, 기존 그룹에서는 치조와 벽 결손이 빈번하게 발생한 반면, 수정 그룹에서는 이러한 합병증이 관찰되지 않았습니다. 치근 파절 발생률은 그룹 간에 유의미한 차이가 없었으나, 수정된 방법에서 더 낮은 빈도가 관찰된 것은 현재의 실험 조건 하에서 절차적 일관성이 향상되었음을 시사합니다. 아울러, 발치와 구조의 보존 능력이 향상됨에 따라 2주 후 초기 골 치유가 증진된 것과 연관이 있었습니다. 종합적으로, 이러한 결과는 수정된 기술이 모델 구축 중 시술자에 따른 변동성을 줄일 수 있음을 나타냅니다.
추출된 치아와 발치와를 직접 검사하는 것만으로도 명백한 치근 파절 및 주요 발치와 결손을 일상적으로 식별하기에 충분합니다. 본 비교 연구에서는 잔존 치근 파편과 미세한 발치와 벽 결손을 식별하고 초기 발치와 치유 결과를 정량화하기 위해 µCT를 객관적인 검증 도구로 사용하였습니다. 수정된 접근법의 향상된 성능은 치아 추출에 사용된 기계적 전략의 차이에서 기인한 것으로 보입니다. 마우스 하악 TSHM에 대한 일반적인 추출 기술은 주로 럭세이션(luxation) 절차13,18에 의존하며, 여기서는 구치 주변에 삽입된 기구를 통해 기계적 힘을 가해 치아를 점진적으로 흔들어 이동시킵니다. 하지만 마우스 하악 제1대구치는 치근단 형태가 비대하고 외과적 접근성이 제한적이기 때문에9, 이러한 절차는 삽입 부위와 주변 치조 구조에 국소적인 기계적 스트레스를 유발할 수 있습니다. 반면, 수정된 접근법은 일차적인 힘의 적용 지점을 치근 영역에서 더 안정적인 치관으로 옮깁니다. 하악을 동시에 고정하면서 치아의 장축과 평행하게 조절된 견인력을 가함으로써, 이 전략은 발치와의 점진적인 확장을 촉진하고 통제되지 않은 스트레스 집중을 줄일 수 있습니다. 중요한 점은, 이러한 수정 사항이 추출 과정 중 주요 힘 조절 단계를 단순화하여, 미세 수술 경험이 부족한 연구자들의 기술적 장벽을 잠재적으로 낮춰준다는 것입니다.
이러한 장점에도 불구하고, 결과가 술자의 숙련도에 따라 달라지므로 본 프로토콜을 성공적으로 구현하기 위해서는 몇 가지 기술적 고려 사항이 여전히 중요합니다. 첫째, 치관의 파지를 개선하고 축외 힘 적용과 관련된 불필요한 응력 집중 및 치근 파절을 최소화하기 위해 가해지는 힘의 방향을 치아의 장축과 평행하게 유지하십시오. 둘째, 치과용 핀셋을 너무 깊게 삽입하거나 과도하게 조작하지 마십시오. 이는 발치窩의 무결성을 손상시킬 수 있습니다. 셋째, 선택 사항인 치주인대 사전 이완 단계에서는 저자들의 이전 보고13와 마찬가지로, 주변 치조골의 손상을 최소화하기 위해 바늘을 치근의 장축과 평행하게 삽입하십시오. 따라서 수정된 접근 방식이 절차적 접근성을 향상시키기는 하지만, 일관된 결과를 얻기 위해서는 적절한 교육과 표준화된 취급 방식이 필수적입니다.
이러한 결과를 해석할 때 몇 가지 제한 사항을 고려해야 합니다. 첫째, µCT 평가를 위한 표본 크기가 상대적으로 제한적이었습니다. 따라서 초기 골 치유에서 관찰된 차이는 치유 촉진의 결정적 증거라기보다 모델 구축의 개선을 뒷받침하는 근거로 해석되어야 합니다. 둘째, 본 연구에는 두 명의 작업자만 참여하였습니다. 결과적으로 작업자 간 변동성에 대한 평가가 제한적이었으며, 이로 인해 작업자 관련 편향이 발생했을 수 있습니다. 셋째, 본 프로토콜은 8주령 수컷 생쥐의 우측 하악 제1대구치에서만 검증되었습니다. 연령대별로 발치 성공률, 시술 관련 합병증 및 치조골 치유에 대한 정량적 비교는 수행되지 않았습니다. 따라서 관찰된 이점이 다른 연령이나 성별의 동물에게도 일반화될 수 있는지에 대해서는 추가적인 연구가 필요합니다.
요약하자면, 본 연구는 생쥐 하악 제1대구치 발치를 위한 최적화된 접근 방식을 제시하며, 이를 기존 기술과 직접 비교하여 그 성능을 검증하였습니다. 수정된 방법은 초보자의 초기 기술적 장벽을 낮추는 동시에 생쥐 하악 TSHM의 더 재현성 있는 구축을 가능하게 합니다. 이러한 결과는 하악 치조골 치유 모델을 구축하는 연구자들에게 실질적인 지침을 제공합니다.
공개 사항
저자들은 이해 상충 관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 중국 국가자연과학재단(Grant No. 82571084)과 쓰촨성 과학기술 프로그램(Grant No. 2024JDKXJ0001)의 지원을 받아 수행되었습니다.
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