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방법 논문

만성 사구체신염과 관련된 염증성 및 섬유화 촉진 메산지움 세포 모델에서 네트워크 기반의 $\beta$-sitosterol 평가

107 조회수

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DOI:

10.3791/73000

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2026년 8월 28일

 ,  ,  ,  , 
1Hemodialysis Room, Hospital of Traditional Chinese Medicine of Qiqihar, 2Department of Nephrology, Ezhou Central Hospital, 3Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, The First Hospital of Qiqihar, 4Department of Nephrology, Shanghai Minhang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 연구는 네트워크 약리학, 검증된 분자 도킹 및 in vitro 실험을 통합하여 Cordyceps sinensis 성분과 만성 사구체신염 관련 과정 사이의 후보 화합물-표적 관계를 평가하였습니다. β-Sitosterol이 화합물 수준의 검증 대상으로 선정되었으며, 사구체간질세포 모델에서 염증 및 섬유화 촉진 활성화를 완화하는 것으로 나타났습니다.

초록

만성 사구체신염(CGN)은 지속적인 염증성 손상과 점진적인 섬유성 리모델링을 특징으로 하지만, 천연물 기반 중재법의 근거가 되는 화합물-타겟 관계는 아직 완전히 정의되지 않았습니다. 본 연구에서는 네트워크 약리학, 검증된 분자 도킹 및 in vitro 실험을 통합하여 CGN 관련 병리 과정에서 동충하초(Cordyceps sinensis (C. sinensis))의 후보 성분들을 평가하였습니다. C. sinensis의 후보 성분들을 스크리닝하고, Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform에서 도출된 화합물 관련 타겟들을 CGN 관련 유전자들과 교차 분석하였습니다. 기능적 풍부도 분석 및 단백질-단백질 상호작용 분석을 통해 생물학적 과정과 허브 타겟들의 우선순위를 정하였습니다. 그 결과 PTGS2가 핵심 중첩 타겟으로 확인되었습니다. 분자 도킹은 celecoxib가 결합된 COX-2 구조를 사용하여 수행되었습니다. 공동 결정화된 celecoxib 리간드의 재도킹 결과, RMSD 0.876 Å으로 결정학적 포즈가 재현되어 도킹 프로토콜의 타당성이 입증되었습니다. β-Sitosterol과 linoleyl acetate는 COX-2 도킹 영역과 예측된 적합성을 보였으며, 결합 친화도는 각각 −7.2 및 −7.5 kcal/mol이었습니다. β-Sitosterol을 선정하여 HBZY-1 쥐 사구체 메산지움 세포에서 화합물 수준의 검증을 수행하였습니다. 0.5–10 µM 농도에서 β-sitosterol은 세포 생존율을 현저하게 감소시키지 않았습니다. Lipopolysaccharide (LPS)로 자극된 세포에서 β-sitosterol은 Tnf, Il6, Ptgs2의 발현을 감소시켰고, prostaglandin E2 (PGE2) 생성을 줄였으며, cyclooxygenase-2 (COX-2) 단백질 풍부도를 감소시켰습니다. transforming growth factor β1 (TGF-β1) 처리 세포에서 β-sitosterol은 Col1a1 및 Acta2의 발현을 감소시켰고 alpha-smooth muscle actin (α-SMA) 단백질 풍부도를 감소시켰습니다. 이러한 결과는 β-sitosterol이 메산지움 세포 모델에서 염증 및 섬유화 촉진 활성을 조절한다는 가설 생성 근거를 제공하지만, 직접적인 COX-2 효소 억제나 CGN에서의 치료 효능을 확립하는 것은 아닙니다.

서론

만성 사구체신염(CGN)은 만성 신장 질환 및 말기 신질환으로 진행될 수 있는 불균일한 사구체 질환 그룹으로 구성됩니다1. 이는 지속적인 사구체 손상, 염증 활성화 및 점진적인 섬유성 리모델링을 특징으로 합니다2,3. 선택된 환자들에게 코르티코스테로이드와 면역억제제가 사용되지만, 많은 경우 장기적인 질병 조절이 여전히 어려우며 치료 관련 부작용이 흔하게 발생합니다1,4,5. CGN의 진행에는 면역 활성화, 내피 세포 기능 장애, 산화 스트레스 및 세포외 기질 축적을 포함하여 서로 상호작용하는 병리적 과정들이 관여합니다3,6,7. 따라서 염증 및 전섬유성 반응을 연결하는 분자 노드를 식별하는 것은 질병 관련 중재 전략을 위한 검증 가능한 가설을 생성하는 데 도움이 될 수 있습니다.

동충하초 (C. sinensis)는 신장 관련 임상 및 실험적 맥락에서 사용되어 왔으며, 여러 질환 모델에서 항염증, 항세포사멸 및 세포 보호 효과를 나타내는 것으로 보고되었습니다.8,9,10하지만 해당 후보 성분들이 사구체신염 관련 표적과 상호작용하는 분자적 기전은 여전히 충분히 정의되지 않은 상태이다.11~의 다성분 특성을 고려할 때, C. sinensis 그리고 CGN의 기전적 이질성으로 인해, 네트워크 약리학은 후보 화합물-표적-경로 관계의 우선순위를 정하는 데 유용한 프레임워크를 제공합니다.12,13.

본 연구에서는 C. sinensis의 후보 성분과 CGN 관련 병리 과정 사이의 잠재적인 분자적 관계를 탐색하기 위해 화합물 스크리닝, 타겟 검색, 질병-유전자 교차 분석, 기능적 풍부도 분석, 단백질-단백질 상호작용 네트워크 분석, 분자 도킹 및 in vitro 검증을 통합적으로 수행하였다. 화합물-질병 네트워크에서 허브 타겟으로 우선순위가 지정된 Prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (PTGS2)를 대상으로, celecoxib가 결합된 cyclooxygenase-2 (COX-2) 구조를 이용한 분자 도킹 및 리도킹 검증을 통해 평가하였다. 네트워크 결과, 도킹 분석, 그리고 항염증 및 항섬유화 활성에 대한 기존 근거를 바탕으로 β-sitosterol을 후속 검증을 위한 대표 후보 화합물로 선정하였다14,15,16. 염증성 활성화 및 COX-2/prostaglandin E2 (PGE2) 관련 반응을 평가하기 위해 Lipopolysaccharide (LPS)로 자극된 메산지움 세포를 사용하였으며, 섬유화 촉진 마커 발현을 평가하기 위해 transforming growth factor β1 (TGF-β1) 유도 모델을 포함하였다.

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프로토콜

네트워크 약리학 및 생물정보학 분석은 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스를 기반으로 하였으며, 인간 참여자나 동물을 포함하지 않았습니다. in vitro 실험은 기성 세포주를 사용하여 수행되었으며, 기관 요구 사항에 따라 윤리 위원회의 승인을 필요로 하지 않았습니다.

후보 성분 스크리닝 및 타겟 검색

2025년 7월 13일, Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP)에서 검색어 “dongchongxiacao”를 사용하여 후보 성분과 그에 해당하는 표적들을 검색하였습니다. 예측 경구 생체이용률이 30% 이상이고 약물 유사성이 0.18 이상인 화합물을 유지하였습니다. 총 7개의 후보 성분이 두 가지 스크리닝 기준을 모두 충족하였습니다. 기술적 비교를 위해 TCMSP로부터 분자량, 경구 생체이용률, 약물 유사성 및 기타 가용한 약동학적 기술자를 기록하였습니다.

보존된 성분과 관련된 화합물-타겟 정보는 TCMSP에서 직접 다운로드하였다. 중복되지 않는 타겟 세트를 구축할 때 중복된 타겟 항목은 수동으로 제거하였으며, 이후의 네트워크 구축을 위해 원래의 화합물-타겟 관계는 그대로 유지하였다. TCMSP는 표준화된 유전자 심볼이 아닌 전체 명칭으로 타겟 이름을 제공하므로, 각 타겟을 UniProt 데이터베이스(2025년 7월 14일 접속)에서 검색하였다. 이에 해당하는 인간 항목을 선택하고 타겟 이름을 공식 유전자 심볼로 변환하였다. 표준화된 화합물-타겟 데이터셋은 질환-타겟 교집합 분석 및 화합물-타겟 네트워크 분석에 사용되었다.

사구체신염 관련 유전자 수집 및 타겟 교집합 분석

질환 관련 유전자는 2025년 7월 14일에 "glomerulonephritis"라는 검색어를 사용하여 GeneCards, DisGeNET, PharmGKB 및 Therapeutic Target Database에서 검색하였다. GeneCards의 경우, 관련성 점수가 중앙값인 10보다 높은 항목을 유지하였다. 다른 데이터베이스의 적격 항목들은 큐레이션된 질환-타겟 주석에 따라 포함되었다. 유전자 이름은 공식 인간 유전자 기호로 표준화하였으며, 중복 항목은 제거하였다. 이 절차를 통해 1,134개의 고유한 사구체신염 관련 유전자를 얻었다. 검색에 "glomerulonephritis"라는 광범위한 용어를 사용했기 때문에, 결과 데이터셋은 단일 조직병리학적 하위 유형에 특이적이기보다는 만성 사구체신염 관련 분자 프로세스와 관련이 있는 것으로 간주되었다.

TCMSP 유래 화합물 관련 타겟과 질병 관련 유전자 세트를 R을 사용하여 교집합 분석하였습니다. 이를 통해 23개의 중첩 타겟이 확인되었습니다. R 패키지인 venn을 사용하여 벤 다이어그램을 생성하였으며, 화합물-중첩 타겟 네트워크는 Cytoscape를 사용하여 구축 및 시각화하였습니다. 후보 성분과 중첩 타겟 간의 관계는 표 1에 요약되어 있습니다.

기능적 농축 및 단백질-단백질 상호작용 분석

clusterProfiler 및 org.Hs.eg.db를 사용하여 R에서 유전자 온톨로지(Gene Ontology, GO) 및 교토 유전자 및 게놈 백과사전(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG) 풍부도 분석을 수행하였다. 유전자 온톨로지 용어는 생물학적 과정, 세포 구성 성분 및 분자 기능 범주에서 분석되었다. P 값은 Benjamini-Hochberg 방법을 사용하여 다중 검정 보정을 거쳤으며, 보정된 P 값이 0.05 미만인 용어 또는 경로를 유지하였다. 풍부해진 용어와 경로는 독립적으로 생성된 막대 그래프와 도트 플롯을 사용하여 표시하였다.

중첩된 23개의 타겟을 STRING에 제출하였으며, 생물종은 Homo sapiens로 선택하고 최소 상호작용 점수는 0.4 초과로 설정하였습니다. 결과로 도출된 단백질-단백질 상호작용 네트워크를 Cytoscape로 가져왔습니다. 네트워크 토폴로지는 degree, betweenness, closeness, eigenvector centrality, local average connectivity 및 network centrality를 기반으로 CytoNCA를 사용하여 평가하였습니다. 허브 타겟은 degree, betweenness centrality, closeness centrality, eigenvector centrality, local average connectivity 및 network centrality 값이 모두 네트워크의 해당 중앙값보다 큰 노드로 정의하였습니다. 이 분석을 통해 후속 해석을 위한 9개의 허브 타겟을 우선적으로 선정하였습니다.

분자 도킹 및 리도킹 검증

분자 도킹은 celecoxib가 결합된 cyclooxygenase-2 구조인 PDB ID 3LN1을 사용하여 수행되었습니다. 수용체 준비 과정에서 Chain A와 관련 heme 그룹은 수용체로 유지하였으며, 결정학적 물 분자와 공동 결정화된 celecoxib 리간드는 제거하였습니다. redocking 검증을 위해 Chain A에서 천연 celecoxib 형태를 별도로 추출하였습니다. AutoDockTools를 사용하여 극성 수소 원자와 Gasteiger 전하를 추가하였으며, 수용체는 PDBQT 형식으로 저장하였습니다. PDB ID 3LN1은 celecoxib가 결합된 마우스 COX-2의 2.40 Å 구조입니다. β-sitosterol 및 linoleyl acetate의 구조는 PubChem에서 가져와 Open Babel을 사용하여 준비하였습니다. 수소 원자와 Gasteiger 부분 전하를 추가하고, 회전 가능한 결합을 할당한 후, 각 리간드를 PDBQT 형식으로 변환하였습니다. Celecoxib, β-sitosterol 및 linoleyl acetate를 동일한 수용체 및 탐색 파라미터를 사용하여 AutoDock Vina로 도킹하였습니다.

도킹 박스는 다음 좌표를 사용하여 천연 celecoxib 결합 부위에 중심을 맞추었습니다: center_x = 30.9886 center_y = -22.2836 center_z = -16.5072 size_x = 26 Å size_y = 26 Å size_z = 26 Å. exhaustiveness 값은 16, 출력 모드 수는 10, 에너지 범위는 3 kcal/mol로 설정하였습니다. 예측된 결합 에너지가 가장 낮은 최상위 포즈를 시각화를 위해 유지하였습니다. 프로토콜 검증을 위해 동일한 조건에서 천연 celecoxib를 재도킹하였으며, 결정 구조 포즈와 재도킹된 포즈 사이의 중원자 평균 제곱근 편차(RMSD)를 PyMOL을 사용하여 계산하였습니다. 2 Å 미만의 RMSD를 기준 포즈의 허용 가능한 재현으로 간주하였습니다. 도킹된 각 리간드로부터 4 Å 이내에 위치한 잔기들을 PyMOL에서 식별하였습니다. 도킹 점수와 포즈는 구조적 적합성에 대한 추정치로 해석하였으며, 표적 결합이나 효소 억제의 직접적인 증거로 간주하지 않았습니다.

세포 배양 및 화합물 준비

HBZY-1 쥐 사구체 메산지움 세포를 10% fetal bovine serum과 1% penicillin-streptomycin이 첨가된 high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium에서 37 °C, 5% CO₂의 가습 조건으로 배양하였다. 모든 실험에는 계대 배양 2-7대의 세포를 사용하였으며, 사용 전 마이코플라스마 음성 상태임을 확인하였다. 화학적으로 정의된 화합물로 β-Sitosterol과 celecoxib를 사용하였다. β-Sitosterol은 절대 에탄올에 용해하여 10 mM 스톡 용액(약 4.15 mg/mL)을 제조하였다. 필요한 경우, 육안으로 투명한 용액이 될 때까지 짧은 시간 동안 초음파 처리 및 50–60 °C 가온을 수행하였다. Celecoxib는 dimethyl sulfoxide에 용해하여 10 mM 스톡 용액(약 3.81 mg/mL)을 제조하였다. 제조된 스톡 용액은 소분하여 −20 °C에서 보관하였다. 처리에 앞서, 스톡 용액을 미리 가온한 배양액에 직접 희석하여 즉시 혼합하였다.

각 실험 내에서 용매 농도를 동일하게 맞추었습니다. 세포 생존율 분석에서는 테스트한 β-sitosterol의 최고 농도가 20 µM이었으므로, 모든 군의 최종 에탄올 농도를 0.2% v/v로 조정하였습니다. LPS 유도 염증 실험에서는 모든 군의 최종 에탄올 및 dimethyl sulfoxide 농도를 각각 0.1% 및 0.01% v/v로 조정하였습니다. TGF-β1 유도 섬유화 촉진 실험에서는 모든 군의 최종 에탄올 농도를 0.1% v/v로 조정하였습니다. 대조군, LPS 군 및 TGF-β1 군에는 해당 용매를 동일한 부피로 첨가하였습니다.

세포 생존율 분석

세포를 96-well 플레이트에 well당 5 × 103 cells의 밀도로 완전 배지 100 µL에 분주하고 24시간 동안 부착시켰다. β-sitosterol의 농도 범위를 평가하기 위해, 세포를 0.5, 1, 5, 10 또는 20 µM β-sitosterol과 함께 24시간 동안 배양하였다. LPS 관련 세포 생존율 분석을 위해, 세포를 1, 5 또는 10 µM β-sitosterol로 2시간 동안 전처리한 후, 1 µg/mL lipopolysaccharide에 24시간 동안 추가로 노출시켰다.

처리군은 대조군, 0.5 µM β-sitosterol, 1 µM β-sitosterol, 5 µM β-sitosterol, 10 µM β-sitosterol, 20 µM β-sitosterol, LPS, LPS 및 1 µM β-sitosterol, LPS 및 5 µM β-sitosterol, 그리고 LPS 및 10 µM β-sitosterol로 구성되었습니다. 웰당 10 µL의 Cell Counting Kit-8 시약을 첨가하고 플레이트를 2 h 동안 배양하였습니다. 이후 450 nm에서 흡광도를 측정하였습니다. 세포 생존율은 세포가 없는 공시료(blank) 값을 뺀 후 대조군에 대한 상대값으로 산출하였습니다. 각 조건은 6회의 독립적인 생물학적 실험에서 각각 6개의 기술적 반복 웰(technical wells)을 포함하였습니다. 통계 분석을 위해 각 실험의 기술적 반복 웰 값들을 평균하여 하나의 생물학적 반복 값을 생성하였습니다.

LPS로 유도된 염증성 활성화

염증 활성화 실험을 위해, HBZY-1 세포를 6-well plate에 well당 2 × 105 cells의 밀도로 분주하고, 세포 밀도가 약 70%–80%에 도달한 후 처리하였습니다. 세포는 처리 전 12시간 동안 1% fetal bovine serum이 첨가된 배지에서 배양되었습니다. β-Sitosterol 또는 celecoxib를 LPS 자극 2시간 전에 투여하였습니다. 그 후, 세포를 1 µg/mL LPS에 24시간 동안 노출시켰습니다.

실험군은 대조군, 10 µM β-sitosterol, LPS, 1 µM β-sitosterol 첨가 LPS, 5 µM β-sitosterol 첨가 LPS, 10 µM β-sitosterol 첨가 LPS, 그리고 1 µM celecoxib 첨가 LPS로 구성하였다. Celecoxib는 COX-2 의존적 프로스타글란딘 생성 억제의 기능적 양성 대조군으로 포함되었다. 처리 종료 후, PGE2 측정을 위해 배양 상층액을 수집하였다. 세포는 Tnf, Il6, Ptgs2의 정량적 실시간 PCR 분석과 COX-2의 웨스턴 블롯 분석을 위해 별도로 수집하였다.

TGF-β1 유도 섬유화 촉진 활성화

섬유화 촉진 활성을 평가하기 위해 별도의 TGF-β1 유도 모델을 사용하였습니다. HBZY-1 세포를 6-웰 플레이트에 웰당 2 × 105 cells 밀도로 분주하고, 처리 전 1% fetal bovine serum이 보충된 배지에서 12 h 동안 유지하였습니다. 세포를 β-sitosterol로 2 h 동안 전처리한 후, 10 ng/mL recombinant TGF-β1으로 48 h 동안 자극하였습니다.

처리군은 대조군, β-sitosterol (10 µM), TGF-β1, TGF-β1 + β-sitosterol (5 µM), TGF-β1 + β-sitosterol (10 µM)로 구성되었습니다. 처리 기간이 종료된 후, Col1a1 및 Acta2의 정량적 실시간 PCR 분석과 alpha-smooth muscle actin (α-SMA)의 웨스턴 블롯 분석을 위해 세포를 회수하였습니다.

정량적 실시간 PCR

제조사의 프로토콜에 따라 페놀-구아니디늄 기반의 RNA 추출 시약을 사용하여 처리된 세포로부터 총 RNA를 분리하였습니다. 분광광도계를 사용하여 RNA 농도와 순도를 측정하였습니다. A260/A280 비율이 1.8–2.0인 샘플만을 역전사 과정에 사용하였습니다. 각 샘플당 1 µg의 총 RNA를 최종 반응 부피 20 µL에서 상보적 DNA로 역전사하였습니다. 생성된 상보적 DNA는 정량 PCR 전 nuclease-free water로 5배 희석하였습니다. 정량 PCR은 10 µL의 2× SYBR Green master mix, 10 µM의 정방향 및 역방향 프라이머 각 0.4 µL, 2 µL의 희석된 상보적 DNA, 7.2 µL의 nuclease-free water를 포함하여 총 부피 20 µL로 수행하였습니다. 증폭 조건은 95 °C에서 30 s 동안 초기 변성 단계를 거친 후, 95 °C에서 5 s 동안 변성 및 60 °C에서 30 s 동안 어닐링-신장 단계를 40회 반복하였습니다. 이어서 증폭 특이성을 검증하기 위해 65 °C에서 95 °C까지 멜팅 커브 분석을 수행하였습니다.

측정된 유전자는 Tnf, Il6, Ptgs2, Col1a1, Acta2 및 Gapdh였습니다. Gapdh는 내부 참조 유전자로 사용되었습니다. 상대적 유전자 발현은 Control 그룹을 보정자로 하여 2−ΔΔCt 방법을 통해 결정되었습니다. 프라이머 서열은 부록 표 1에 제공되어 있습니다. 각 샘플은 기술적 반복으로 3회 분석되었으며, 6회의 독립적인 생물학적 실험이 수행되었습니다. 기술적 반복에서 얻은 값은 통계 분석 전 평균을 내어 사용하였습니다.

효소결합면역흡착측정법을 이용한 PGE2 측정

LPS 자극 24시간 후에 배양 상청액을 수집하고, 4 °C에서 1,000 × g로 10분간 원심분리하여 세포 잔해를 제거하였다. PGE2 농도는 제조사의 지침에 따라 시판되는 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA) 키트를 사용하여 측정하였다.

표준 물질과 시료를 분석 플레이트에 두 번씩 분주하였습니다. 항체 결합 및 발색 단계를 마친 후, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였습니다. PGE2 농도는 4-매개변수 로지스틱 표준 곡선을 통해 결정하였으며 pg/mL로 표기하였습니다. 6회의 독립적인 세포 실험에서 얻은 상층액을 분석하였습니다. 통계 분석 전, 각 생물학적 시료에 대한 중복 측정값의 평균을 산출하였습니다.

웨스턴 블로팅

처리된 세포를 프로테아제 억제제 혼합물이 첨가된 radioimmunoprecipitation assay 버퍼로 용해하였다. 용해물을 얼음 위에서 30분 동안 배양한 후 4 °C에서 12,000 × g로 15분 동안 원심분리하였다. 상층액의 단백질 농도는 bicinchoninic acid 단백질 분석법을 사용하여 측정하였다. 동일한 양의 단백질(레인당 30 µg)을 로딩 버퍼와 혼합하고 95 °C에서 5분 동안 변성시켰다. LPS 실험의 단백질은 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide 겔에서 분리하였고, TGF-β1 실험의 단백질은 12% 겔에서 분리하였다. 분리된 단백질은 이후 polyvinylidene fluoride 막으로 전이하였다.

멤브레인은 0.1% Tween 20이 포함된 Tris-buffered saline 내의 5% 무지방 우유로 상온에서 1시간 동안 블로킹한 후, COX-2 (1:1000), α-SMA (1:1000) 및 GAPDH (1:5000)에 대한 1차 항체와 함께 4 °C에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. COX-2는 LPS 실험 시료에서 분석하였고, α-SMA는 TGF-β1 실험 시료에서 분석하였다. 세척 후, 멤브레인을 horseradish peroxidase-conjugated 2차 항체 (1:5000)와 함께 상온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 단백질 밴드는 강화 화학발광 기질을 사용하여 시각화하고 화학발광 이미징 시스템으로 캡처하였다. 노출 시간은 COX-2의 경우 약 10 s, α-SMA의 경우 10 s, GAPDH의 경우 2 s였다.

ImageJ를 사용하여 밴드 강도를 정량화하였습니다. COX-2 및 α-SMA 신호는 이에 대응하는 GAPDH 신호를 기준으로 표준화하였습니다. Western blotting은 6회의 독립적인 세포 배양 및 처리 실험에서 얻은 단백질 샘플을 사용하여 수행되었습니다.

통계 분석

통계 분석은 GraphPad Prism을 사용하여 수행되었습니다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시되었습니다. 각 정량 분석을 위해 6회의 독립적인 세포 배양 및 처리 실험이 수행되었으며, 각 독립 실험은 하나의 생물학적 반복구(biological replicate)를 나타냅니다. 동일한 생물학적 실험에서 얻은 기술적 반복구(technical replicate) 측정값은 통계 분석 전에 평균을 내었으며, 이를 독립적인 관측치로 간주하지 않았습니다.

세포 생존능 분석을 위해, 각 생물학적 실험은 조건당 6개의 기술적 웰(technical well)을 포함하였습니다. 정량적 PCR 반응은 각 생물학적 시료에 대해 3회 반복(technical triplicate)으로 수행되었으며, PGE2 측정은 2회 반복으로 수행되었습니다. 웨스턴 블롯 정량화는 독립적으로 준비된 6개의 단백질 시료를 기반으로 하였습니다. 따라서 각 정량 막대 그래프는 6개의 개별 생물학적 반복 실험 값을 포함하고 있습니다.

여러 그룹 간의 차이는 일원 분산 분석(one-way analysis of variance) 후 Tukey의 다중 비교 검정(Tukey’s multiple-comparison test)을 사용하여 분석하였습니다. 양측 P 값 < 0.05를 통계적 유의성 기준으로 간주하였다. 개별 생물학적 반복 실험값은 평균 및 표준편차와 함께 표시하였다.

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결과

후보 성분 스크리닝, 타겟 검색 및 타겟 교집합 분석

후보 화합물-질병 중첩 타겟을 식별하기 위한 워크플로우는 다음과 같이 요약됩니다. 그림 1A의 7가지 후보 화합물은 *C. sinensis* 아라키돈산(arachidonic acid), 리놀레일 아세테이트(linoleyl acetate)를 포함하여, OB ≥30% 및 DL ≥0.18이라는 사전 정의된 스크리닝 기준을 충족하였다. β-시토스테롤, 페록시에르고스테롤, 세레비스테롤, 콜레스테릴 팔미테이트, 그리고 CLR (표 2이와 병행하여, GeneCards, DisGeNET, PharmGKB 및 TTD에서 1,134개의 사구체신염 관련 유전자를 추출하였으며, 4개 데이터베이스에 걸친 이들의 분포는 다음의 [그림/표]에 나타나 있다. 그림 1B

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토론

본 연구에서는 C. sinensis의 후보 성분으로부터 도출된 PTGS2 관련 가설을 검증하기 위해 네트워크 약리학, 참조 리간드 검증 분자 도킹 및 화합물 수준의 실험을 통합적으로 수행하였습니다. 사전 정의된 TCMSP 스크리닝 기준을 충족하는 7가지 성분이 확인되었으며, 이 중 23개의 타겟이 사구체신염 관련 유전자 세트와 중첩되었습니다. 단백질 상호작용 분석을 통해 9개의 핵심 타겟을 우선순위화하였고, 그중 PTGS2를 도킹 및 실험적 평가 대상으로 선정하였습니다. 세레콕시브(celecoxib)의 재도킹 결과 결정학적 포즈가 재현되었으며, β-시토스테롤(β-sitosterol)과 리놀레일 아세테이트(linoleyl acetate)는 COX-2 도킹 영역과 중간 정도의 예측 적합성을 보였습니다. HBZY-1 메산지움 세포에서 β-시토스테롤은 LPS로 유도된 염증 유전자 발현, COX-2 발현량 및 PGE2 생성을 감소시켰으며, TGF-β1로 유도된 섬유화 촉진 마커의 발현을 억...

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공개 사항

저자들은 이해관계의 충돌이 없음을 선언합니다. 언어 교정 및 도식적 그림의 예비 설계를 돕기 위해 인공지능 기반 도구(ChatGPT, OpenAI)가 사용되었습니다. 생성형 인공지능은 그림 1A와 7의 예비 그래픽 초안 작성을 돕는 데 사용되었으며, 이후 보고된 방법 및 결과와의 일관성을 보장하기 위해 저자들에 의해 검토 및 수정되었습니다. AI 지원을 통해 생성된 모든 결과물은 저자들에 의해 비판적으로 평가되고 승인되었습니다. 저자들은 최종 그림 내용을 확인하였으며 원고의 무결성과 정확성에 대해 모든 책임을 집니다.

감사의 글

본 연구는 중의-서의 통합 신병증 특성화 전문분야(ZYTSZK2-3) 및 만성질환 관리 관점에서의 만성 신장질환에 대한 중의약 개입 전략 연구(202240169)의 지원을 받아 수행되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
절대 에탄올Sigma-Aldrich/MerckE7023200 proof, 비변성 분자생물학 등급 에탄올; ~용 용매 β-시토스테롤 스톡 용액.
AutoDock Vina스크립스 연구소버전 1.1.2분자 도킹 시뮬레이션
생물안전작업대Thermo Fisher Scientific1300 시리즈 A2무균 세포 배양 작업
셀레콕시브MedChemExpressHY-14398양성 대조군으로 사용되는 선택적 COX-2 억제제; DMSO 내 10 mM 스톡 용액. 
세포 계수 키트-8Dojindo Molecular Technologies, Inc.CK04세포 생존율 측정을 위한 WST-8 비색 분석; 450 nm에서 흡광도 측정.
화학발광 이미징 시스템Bio-Rad LaboratoriesChemiDoc MP웨스턴 블롯 이미지 획득
clusterProfiler R 패키지Bioconductor버전 4.10.0GO 및 KEGG 농축 분석
일산화탄소2 세포 배양 배양기Thermo Fisher ScientificForma Series II 3111다음 조건에서 세포 배양 배양: 37 °C 및 5% CO₂2
COX-2 (D5H5) 토끼 단일클론 항체Cell Signaling Technology12282인간, 생쥐 및 쥐 COX-2에 대해 웨스턴 블롯 검증 완료; 1:1,000 비율로 사용.
CytoNCA 플러그인Cytoscape 앱 스토어버전 2.1.6허브 표적 위상 분석
Cytoscape 소프트웨어Cytoscape 컨소시엄버전 3.8.0네트워크 시각화 및 분석
디메틸설폭사이드Sigma-Aldrich/MerckD2650멸균 여과된 바이오시약, ≥99.7%; celecoxib 스톡 용액용 용매.
DisGeNET 데이터베이스통합 생의학 정보학 그룹해당 사항 없음사구체신염의 질환-유전자 검색
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco/Thermo Fisher ScientificC11995500BTHBZY-1 세포 배양을 위한 기초 배지
강화 화학발광 기질Beyotime BiotechnologyP0018S웨스턴 블롯 밴드 시각화
소태아혈청Gibco/Thermo Fisher Scientific10099-141C세포 배양 혈청 보충제
GAPDH (D16H11) 토끼 단클론 항체Cell Signaling Technology5174웨스턴 블롯 로딩 컨트롤; 인간, 생쥐 및 쥐의 GAPDH와 반응함; 자체 최적화 후 1:5,000 비율로 사용함.
GeneCards 데이터베이스와이즈만 과학 연구소해당 사항 없음사구체신염 관련 유전자 추출
GraphPad PrismGraphPad 소프트웨어버전 9.0.0.121인비트로(in vitro) 실험 데이터의 통계 분석
HRP-접합 염소 항-토끼 IgGProteintech 그룹SA00001-2토끼 1차 항체용 2차 항체
ImageJ 소프트웨어미국 국립보건원버전 1.54웨스턴 블롯 밀도 분석
도립 위상차 현미경OlympusCKX53세포 형태 관찰
org.Hs.eg.db R 패키지Bioconductor버전 3.18.0농축 분석을 위한 인간 유전자 주석 처리
페니실린-스트렙토마이신 용액Gibco/Thermo Fisher Scientific15140122세포 배양용 항생제 보충제
프로스타글란딘 E2 파라미터 분석 키트R&Bio-Techne 브랜드인 D SystemsKGE004B세포 배양 상청액을 위한 다종 경쟁적 ELISA; 분석 범위 39–2,500 pg/mL; 450 nm에서 비색 검출.
PharmGKB 데이터베이스약물유전체학 지식베이스해당 없음질환 관련 표적 검색
PubChem 데이터베이스국립생물공학정보센터해당 없음리간드 구조의 검색
PVDF 막Millipore/MerckIPVH00010웨스턴 블로팅을 위한 단백질 전이 막
PyMOL 분자 그래픽 시스템슈뢰딩거ödinger, LLC버전 2.6.2도킹 포즈 시각화
R 소프트웨어R 통계 계산 재단버전 4.3.2표적 교집합 및 풍부성 분석
쥐 사구체 메산지움 세포주 (HBZY-1)Procell Life Science & Technology 주식회사CL-0117인비트로 메산지움 세포 검증 모델
RCSB 단백질 구조 은행구조 생물정보학 연구 협력체PDB ID: 3LN1PTGS2/COX2 결정 구조의 검색
재조합 인간 TGF-β1 단백질Thermo Fisher Scientific 브랜드인 PeproTech100-21-10UGHEK293 유래 재조합 인간 TGF-β1; 10 ng/mL 농도의 섬유화 촉진 자극. 
SDS-PAGE 전기영동 시스템Bio-Rad LaboratoriesMini-PROTEAN TetraSDS-PAGE를 이용한 단백질 분리
STRING 데이터베이스ELIXIR/STRING 컨소시엄버전 12.0단백질-단백질 상호작용 네트워크 구축
TCMSP 데이터베이스전통 중의학 시스템 약리학 데이터베이스해당 없음동충하초 후보 화합물 스크리닝
치료 표적 데이터베이스혁신 신약 연구 및 생물정보학 그룹해당 없음치료 표적 검색
α-SMA 1차 항체Proteintech Group14395-1-AP~의 검출 α-SMA 단백질 발현
β-시토스테롤 (순도 >98%)MedChemExpressHY-N0171ACAS 83-46-5; 세포 처리에 사용되는 정의된 화합물; 절대 에탄올 내 10 mM 스톡 용액. 

참고문헌

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