연구 논문

체외 세포독성 및 약물 전달 향상을 위한 하이드록시우레아 함유 나노구조 지질 운반체

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DOI:

10.3791/73012

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2026년 9월 22일

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1Department of Pharmaceutics, College of Pharmacy, Jazan University, 2School of Health Sciences, University of Petroleum and Energy Studies, 3Center for Global Health Research, Saveetha Medical College, and Hospitals, Saveetha Institute of Medical and Technical Sciences, Saveetha University

이 논문에서

요약

본 연구에서는 hydroxyurea가 담지된 나노구조 지질 운반체(NLCs)를 개발하고, 그 특성과 인비트로(in vitro) 항암 활성을 평가하였다. NX-ST는 높은 봉입 효율과 조절된 방출 특성을 보였으며, 유리 hydroxyurea(IC₅₀ = 72.57 µg/mL)보다 MCF-7 세포에 대해 더 높은 세포 독성(IC₅₀ = 25 µg/mL)을 나타냈다.

초록

하이드록시우레아(Hydroxyurea, HU)는 만성 골수성 백혈병 치료에 사용되는 확립된 항암제이나, 빠른 청소율, 가변적인 생체이용률 및 용량 관련 독성으로 인해 치료 효능이 제한적입니다. 본 연구는 서로 다른 계면활성제 조합을 사용하여 하이드록시우레아가 탑재된 나노구조 지질 운반체(NLCs)를 개발함으로써 HU의 전달력을 향상시키는 것을 목표로 하였습니다. NX-ST (Tween 80–SDS), NX-CT (Cremophor EL–Tween 80), NX-CS (Cremophor EL–SDS)를 포함한 세 가지 제형을 조제하였으며, 입자 크기, 다분산 지수(PDI), 제타 전위, 봉입 효율(EE) 및 세포독성 활성을 평가하였습니다. 해당 제형들은 나노 규모의 입자 크기(67.377 ~ 10 nm)와 허용 가능한 수준의 PDI(<0.35), 높은 제타 전위(-30.03 ~ -46.43 mV) 및 우수한 봉입 효율(78.189 ~ 86.626%)을 보여 제형이 안정적임을 나타냈다. 방출 프로파일은 0.5~6시간 동안 거의 선형적으로 증가한 후 정체기에 진입하는 양상을 보였다. 세포독성 연구 결과, 유리 HU(IC₅₀ = 722.57 µg/mL). NX-ST 제형이 가장 높은 세포독성(IC₅₀ = 225 ± 21.47 µg/mL), 이는 강화된 약물 전달과 일치하는 결과이며, 세포 흡수 개선의 기여도는 추론된 것이며 본 연구에서 직접적으로 측정되지는 않았습니다. 연구된 NLC 제형, 특히 NX-ST는 안정성, 전달 효율 및 항암 활성을 개선함으로써 HU의 치료 성능을 효과적으로 향상시켰습니다.

서론

암은 전 세계적으로 주요 사망 원인 중 하나로 남아 있으며, 2022년에는 약 2,00만 명의 신규 사례와 970만 명의 암 관련 사망자가 기록되었습니다. 2040년까지 이러한 수치는 상당히 증가하여 매년 2,90만 명의 신규 사례와 1,530만 명의 암 관련 사망자에 이를 것으로 예상됩니다1,2. 현재 대부분의 항암제 요법은 독성이 강한 화합물에 의존하고 있으나, 이러한 전신 독성으로 인해 암 조직에 효과적으로 도달할 수 있는 치료 농도에 제한이 있습니다3. 이러한 문제를 극복하기 위해 연구자들은 종양 타겟팅을 강화하고 화학요법의 치료 지수를 향상시키기 위한 새로운 약물 전달 방법을 탐구해 왔습니다.

종양학 연구의 한 가지 중요한 영역은 항암제의 부작용을 최소화하는 동시에 치료 효능을 높이기 위한 고급 약물 전달 시스템의 개발입니다. 잘 알려진 화학요법 및 항종양제인 Hydroxyurea (HU)는 태아 헤모글로빈 생성을 증가시키고 ribonucleotide reductase를 표적으로 하여 DNA 합성을 억제하는 능력 덕분에 낫형 세포 질환, 만성 골수성 백혈병 및 특정 고형암 치료의 초석이 되어 왔습니다4,5. 이러한 임상적 효능에도 불구하고, HU의 치료 잠재력은 빠른 제거, 가변적인 생체 이용률 및 좁은 치료 지수와 같은 문제로 인해 제한되며, 이는 종종 가변적인 약동학적 특성과 골수 억제, 위장관 장애 및 잠재적인 이차성 악성 종양을 포함한 용량 의존적 독성으로 이어집니다6,7. 이러한 한계를 해결하기 위해 나노구조 지질 운반체 (NLCs)를 포함한 고급 약물 전달 시스템이 hydroxyurea의 안정성, 용해도 및 방출 제어를 향상시켜 안전성과 효능 프로파일을 개선할 수 있는 유망한 전략으로 등장했습니다8.

NLC는 기존의 약물 전달 시스템보다 여러 가지 장점을 제공하는 지질 기반 나노입자의 한 종류입니다. NLC는 계면활성제에 의해 안정화된 고체 지질 매트릭스로 구성되며, 친수성 및 친유성 약물을 모두 캡슐화할 수 있습니다. 이러한 독특한 구조를 통해 약물 적재 용량 개선, 방출 제어 및 안정성 향상이 가능합니다9,10. NLC의 제조에는 일반적으로 고압 균질화 및 초음파 처리와 같은 기술이 사용되며, 이를 통해 좁은 크기 분포와 높은 캡슐화 효율을 가진 나노입자 형성이 용이해집니다1,12. NLC 내의 약물 캡슐화는 약물의 용해성과 안정성을 높일 뿐만 아니라 암세포로의 표적 전달을 촉진하여 오프타겟 효과를 최소화합니다. 최근 연구들에 따르면 약물이 탑재된 NLC는 약물의 치료 지수와 서방형 방출 프로파일을 개선할 수 있는 잠재력을 가지고 있음이 입증되었습니다13,9. 이러한 제어 방출 메커니즘은 장기간 동안 치료 약물 농도를 유지하는 데 매우 중요하며, 이를 통해 투여 빈도를 줄이고 환자의 복약 순응도를 높일 수 있습니다14. gefitinib15, capecitabine16, imatinib14와 같은 항암제가 탑재된 NLC는 암세포 내의 세포 섭취 및 축적을 개선함으로써 약물 효능을 유의미하게 향상시키는 것으로 나타났습니다. 예를 들어, gefitinib이 탑재된 NLC는 유리 약물에 비해 암세포에 대해 4.5배 높은 세포독성을 보였으며, 이는 비소세포폐암 및 대장암 치료에 사용되는 티로신 키나아제 억제제의 치료 지수를 높이는 NLC의 잠재력을 강조합니다. 마찬가지로, capecitabine이 탑재된 NLC는 약물 안정성과 제어 방출을 개선하며, 이는 치료 농도를 유지하고 전신 독성을 줄이는 데 매우 중요합니다. imatinib이 탑재된 NLC 또한 강화된 표적 전달의 이점을 통해 오프타겟 효과를 줄이고 만성 골수성 백혈병 치료에서 환자의 예후를 개선합니다. 이러한 특성들 덕분에 NLC는 임상 시험의 강력한 후보가 되며, 개별 환자 프로파일에 맞춘 치료를 가능하게 함으로써 정밀 의료 분야의 잠재적 응용 가능성을 가지고 있습니다. 약물이 탑재된 NLC의 안정성 평가는 임상 적용 가능성에 영향을 미치는 또 다른 중요한 측면입니다. 안정성 연구에서는 대개 제형을 다양한 환경 조건에 노출시켜 시간에 따른 물리적 무결성을 평가합니다.

가속 안정성 시험 결과, 이러한 NLC는 구조적 무결성과 약물 함량을 장기간 유지하는 것으로 나타났으며, 이는 장기 보관 및 사용 가능성을 시사합니다4,17.

이러한 장점에도 불구하고, 계면활성제의 선택은 나노구조 지질 운반체(NLCs)의 물리화학적 특성과 성능에 상당한 영향을 미칩니다. 지질-계면활성제 시스템은 나노입자의 안정성, 약물 봉입률 및 생체 이용률을 향상시키는 데 중요한 역할을 합니다18,19,20. 하지만 서로 다른 계면활성제 조합이 hydroxyurea가 적재된 NLC의 물리화학적 특성과 세포독성 활성에 어떠한 영향을 미치는지에 대한 연구는 제한적이었습니다. 따라서 본 연구에서는 다양한 계면활성제 시스템을 사용하여 hydroxyurea 적재 NLC(NANOXURIA)를 개발하고, 이러한 변화가 물리화학적 안정성, 저장 거동 및 항암 활성에 미치는 영향을 체계적으로 평가하고자 하였습니다. 제형 설계와 치료 성능 사이의 명확한 관계를 설정함으로써, 본 연구는 hydroxyurea 적재 NLC 제형의 특성을 분석하고 이들의 in vitro 약물 방출, 세포독성 및 단기 저장 안정성을 평가하기 위한 효과적인 나노운반체 기반 분산 시스템(콜로이드 분산)을 제공하는 것을 목표로 하며, 약물 분자 자체를 변경하지 않고 향후 HU 전달 개발에 기초가 될 물리화학적 및 in vitro 성능 데이터를 생성하고자 합니다.

프로토콜

본 연구는 인간 참여자, 인간 유래 조직 또는 살아있는 동물을 포함하지 않았습니다. 모든 생물학적 평가는 American Type Culture Collection (ATCC)에서 분양받은 상용 MCF-7 인간 유방암 세포주를 사용하여 in vitro로 수행되었습니다. 따라서, 본 연구에는 기관생명윤리위원회(IRB) 또는 윤리위원회의 승인이 적용되지 않았습니다.

재료

Hydroxyurea (HU) (assay ≥9%), sodium dodecyl sulfate (SDS) (음이온성, assay 90%), Tween-80 (T80) (비이온성, oleic acid ≥58%), Cremophor EL (비이온성, 피마자유 유래, assay ≥98%), stearic acid (assay 95–106%) 및 참기름을 수령한 상태 그대로 사용하였다. 그 외에 사용된 모든 화학 물질과 시약은 분석 등급을 사용하였다. 모든 재료와 장비의 상세 공급처 및 카탈로그 정보는 재료 표에 제공되어 있다.

hydroxyurea 함유 NLC(NANOXURIA)의 제조

NANOXURIA의 제조는 지질상 준비, 약물 혼합, 그리고 수상 준비의 세 단계로 이루어집니다. 지질상은 스테아르산(50 mg)과 참기름(250 µl) 혼합물을 용융하여 얻었습니다. 용융 과정은 핫플레이트 위의 비커에서 진행되었습니다. 정밀하게 측정된 HU(150 mg)를 지질상과 혼합했습니다. 수상은 계면활성제(Table 1)를 물(Millipore)(25 mL)에 용해하여 준비했습니다. 조기 응고를 방지하기 위해 계면활성제 용액을 지질상과 동일한 온도(70°C)로 가열했습니다. 가열된 수상을 균질기로 고속 교반하면서 용융된 지질상에 서서히 첨가했습니다. 혼합물을 고속(6,00 rpm)으로 20분 동안 균질화하여 안정적인 고온 에멀젼을 생성했습니다. 고온 에멀젼을 지속적으로 교반하며 실온까지 냉각했습니다. 냉각 과정에서 지질상이 응고되면서 NLC가 형성됩니다. 제조된 HU 함유 NLC는 향후 특성 분석 및 적용을 위해 보관되었습니다.

특성 분석 및 평가

입자 크기, 제타 전위(ZP) 및 다분산 지수(PDI)

NANOXURIA의 입자 크기 분석 및 다분산 지수(PDI)는 Zetasizer Nano ZS90을 사용하여 측정하였습니다. 이 장비는 동적 광산란(DLS) 원리로 작동하며, 현탁액 내 입자의 브라운 운동을 측정하고 Stokes-Einstein 방정식을 통해 이를 수력학적 직경과 연관시킵니다. 크기와 PDI 외에도, 동일한 장비를 사용하여 제타 전위(ZP)를 측정함으로써 NANOXURIA의 표면 전하를 평가하였습니다. 제타 전위는 전기영동 광산란(ELS)을 통해 측정되었으며, 인가된 전기장 내 입자의 속도를 분석하여 표면 전하를 산출하였습니다. 이 파라미터는 NANOXURIA의 콜로이드 안정성을 평가하는 데 매우 중요합니다. 측정은 제어된 환경에서 수행되었으며, 희석된 시료를 큐벳에 담아 장비의 광학적 및 전기적 요구 사항과의 호환성을 확보하였습니다. 결과의 강건성과 재현성을 높이기 위해 모든 측정은 3회 반복 수행되었습니다.

형태학

NANOXURIA의 형태학적 분석은 투과 및 주사 모드 모두에서 작동하는 전자 현미경을 사용하여 수행되었습니다. 내부 구조와 입자 모양을 관찰하기 위해 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하였으며, 표면 형태 및 입자 분포를 조사하기 위해 전계 방사형 주사 전자 현미경 (FE-SEM)을 이용하였습니다. 고해상도 이미지를 얻기 위해 샘플을 적절히 준비하고 적절한 가속 전압에서 분석하였습니다. 샘플 준비를 위해 NANOXURIA 분산액을 정제수로 희석하였습니다. TEM의 경우, 희석된 분산액 한 방울을 탄소 코팅된 구리 그리드 위에 떨어뜨리고 과량의 액체를 닦아낸 후, 실온에서 공기 건조시킨 다음 60-80 kV의 가속 전압 하에서 고진공 상태로 촬영하였습니다. FE-SEM의 경우, 희석된 분산액 한 방울을 알루미늄 스터브 위에 올리고 공기 건조시킨 후, (1–3 kV)에서 촬영하기 전 얇은 전도성 층으로 스퍼터 코팅하였습니다. 다양한 배율에서 대표적인 마이크로그래프를 획득하였습니다.

NANOXURIA 제형의 포집 효율 분석

NANOXURIA의 포집 효율(EE)은 Amicon Ultra-2 mL 원심분리 필터(3 kDa MWCO)를 이용한 한외여과-원심분리법으로 평가하였습니다. 이 방법은 25 °C에서 4,0 x g로 20분 동안 원심분리하여 캡슐화되지 않은 HU(NANOXURIA 1 mL 당 약 6 mg)를 캡슐화된 분획과 분리함으로써 효과적인 격리를 보장했습니다. 유리 HU가 포함된 여과액을 정제수로 희석한 후, Beer-Lambert 법칙에 기반한 검정 곡선을 이용하여 UV-vis 분광광도계의 213 nm에서 분석함으로써 포집되지 않은 약물의 양을 정량화하였습니다. % EE는 다음과 같이 계산되었습니다.

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인비트로 방출 연구

NANOXURIA로부터 HU의 인 비트로(in vitro) 방출 프로파일은 제어 방출 약물을 평가하는 데 널리 사용되는 방법인 투석막 확산법을 통해 평가되었습니다. 투석막(12–14 kDa MWCO)을 증류수에 12 h 동안 미리 담가 적절한 수화와 보존제 제거를 수행하였습니다. 투석막의 한쪽 끝을 단단히 밀봉하고, HU 12 mg에 해당하는 NANOXURIA 제형 2 mL를 막 내부에 조심스럽게 주입하였습니다. 그 후, 누출을 방지하기 위해 반대쪽 끝을 단단히 묶었습니다. 투석막을 방출 매질인 물(50 mL)이 담긴 비커에 침지시켰습니다. 이 설정은 체온과 유사한 37 ± 0.5 °C로 유지되었으며, 균일한 혼합을 보장하고 경계층 효과를 최소화하기 위해 마그네틱 교반기를 사용하여 50 rpm으로 교반하였습니다. 미리 정해진 시간 간격(0.5, 1, 2, 4, 6, 12, 24 h)마다 방출 매질에서 2 mL의 시료를 취하고, 싱크 조건(sink conditions)을 유지하기 위해 즉시 동일한 부피의 미리 가온된 신선한 물로 교체하였습니다. 수집된 샘플은 분석의 명확성을 보장하기 위해 0.45 µm 시린지 필터로 여과하여 입자 물질을 제거하였습니다. 멤브레인 필터는 입자를 보유하면서 용해된 HU는 통과시킵니다. HU는 수용성이므로 유리 약물이 여과액에 남게 되어, 보유된 물질이 유리 약물이 아닌 입자임을 보장하였습니다. 이후 여과된 샘플의 HU 함량을 HU의 최대 흡수 파장(λmax)인 213 nm에서 UV-visible 분광광도계를 사용하여 분석하였습니다. HU 농도를 정확하게 정량하기 위해 검정 곡선을 작성하였습니다.

세포 배양

본 연구는 American Type Culture Collection (ATCC)에서 분양받은 전이성 인간 유방암 세포주인 MCF-7을 사용하여 수행되었습니다. 세포는 세포의 성장과 생존력을 유지하기 위해 10% fetal bovine serum (FBS)이 첨가된 RPMI 1640 배지에서 배양되었으며, 배양 중 미생물 오염을 방지하기 위해 1% penicillin–streptomycin 용액이 첨가되었습니다. 이후 세포는 습도가 유지되는 CO₂ 인큐베이터 내 37 °C의 표준 생리적 조건에서 배양되었으며, 배지의 pH는 7.4로 유지되었습니다. 이러한 조건은 세포 독성 연구 전반에 걸쳐 최적의 세포 성장, 증식 및 실험적 신뢰성을 확보하기 위해 설정되었습니다.

세포 생존율 분석 (MTT)

다양한 NANOXURIA 제형의 세포 사멸 유도 능력을 평가하기 위해 MTT 분석을 수행하였습니다16,21. 간단히 설명하면, MCF-7 세포를 96-웰 플레이트에 1 x 104 cells/mL 밀도로 분주하고, 세포가 적절히 부착되고 성장할 수 있도록 CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양하였습니다. 처리하지 않은 세포를 음성 대조군으로 사용하였으며, 배양액만 포함된 웰을 공백 대조군으로 사용하였습니다. 배양 후, 배양액을 최대 200 µg/mL 농도의 테스트 제형이 포함된 신선한 배양액으로 교체하였습니다. 처리된 플레이트를 표준 배양 조건에서 72시간 동안 추가로 배양하였습니다. 처리 후, 각 웰에 20 µL의 MTT 시약(5 mg/mL)을 첨가하고 4시간 동안 추가로 배양하여 대사 활성 세포 내에서 포르마잔 결정이 형성되도록 하였습니다. 이어서, 결정을 용해시켜 보라색 용액을 얻기 위해 10 µL의 dimethyl sulfoxide (DMSO)를 첨가하였습니다. 흡광도는 마이크로플레이트 리더(SpectroStar Nano)를 사용하여 570 nm에서 측정하였습니다. 얻어진 흡광도 값을 이용하여 처리하지 않은 대조군 대비 세포 생존율(%)을 계산하였습니다.

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안정성 연구

NANOXURIA의 장기 사용 적합성을 평가하기 위해, 제어된 저장 조건 하에서 3개월 동안 안정성을 체계적으로 분석하였다. 빛과 수분 노출을 최소화하기 위해 각 NANOXURIA 제형을 기밀성이 유지되는 갈색 유리 용기에 분주하였다. 용기는 25 ± 2 °C의 일정한 실온과 4 ± 2 °C의 냉장 온도에서 보관하였다. 물리적 및 물리화학적 안정성을 확인하기 위해 미리 정해진 간격(1, 2, 3개월)으로 샘플을 주기적으로 평가하였다. 준비 직후 저장 전의 측정값을 기준선으로 설정하고 이를 0개월(초기)로 지정하였다. 물리적 평가에는 응집, 침전, 상분리, 색상 변화(예: 유백색에서 노란색으로), 점도 또는 질감과 같은 제형의 일관성 변화, 그리고 지질 산화로 인한 산패취와 같은 외관 변화에 대한 육안 검사가 포함되었다. 물리화학적 안정성의 경우 입자 크기, 다분산 지수(PDI), 제타 전위(ZP)를 포함한 주요 특성 파라미터를 측정하였다.

통계 분석

본 연구에서 모든 실험 결과는 데이터의 중심 경향성과 가변성을 반영하기 위해 평균값 ± 표준편차(SD) (n = 3)로 표기하였다. 제형을 평가하기 위해 paired t-test를 사용하였으며, 제형 간의 차이를 비교하기 위해 일원 분산 분석(one-way ANOVA) 후 Tukey의 다중 비교 검정을 실시하여 통계 분석을 수행하였다. p-value < 0.05인 경우를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 통계 분석은 GraphPad Prism version 10을 사용하여 수행되었다.

결과

물리화학적 특성

입자 크기, 다분산 지수(PDI), 제타 전위(ZP), 형태 및 봉입 효율(EE)을 포함한 NANOXURIA 제형의 물리화학적 특성이 표 2에 제시되어 있습니다. TEM 및 SEM을 통한 형태학적 평가와 입자 크기 및 제타 전위 분포 그래프가 보완된 결과가 그림 1, 2 및 3에 나타나 있습니다. 서로 다른 계면활성제 조합에 따른 PDI 비교 결과는 그림 4에 제시되어 있습니다.

방출 연구

NANOXURIA 제형의 인비트로(in vitro) 방출 연구는 제형의 차이가 24시간 동안의 약물 방출 프로파일에 미치는 영향을 평가하기 위해 수행되었습니다.그림 5). NX-CS는 가장 빠른 방출 양상을 보였으며, 0.5시간에 5.90%에서 시작하여 24시간에 104.05%에 도달하였다(값 >10%는 실험적 변동성 또는 약간의 과대평가가 동반된 완전한 방출을 반영하는 것일 수 있습니다). 방출 프로파일은 0.5시간에서 6시간까지 거의 선형적으로 증가한 후 정체기에 도달하는 양상을 보였습니다. NX-CT는 가장 느리고 제어된 방출을 보였으며, 0.5시간에 46.18%에서 시작하여 24시간에 82.9%에 도달하였고, 2~12시간 사이(54.51%~59.38%)에 정체기를 거친 후 이후에 다시 증가하였습니다. NX-ST는 중간 정도의 방출 프로파일을 보였으며, 0.5시간에 54.05%에서 시작하여 12시간에 90.63%로 정점에 도달한 후 24시간에 86.23%로 약간 감소하였습니다. 전반적으로 누적 방출량은 다음과 같은 순서였습니다: NX-CS > NX-ST > NX-CT. NX-CS와 NX-ST는 더 강력한 초기 급격한 방출(initial burst release)을 보인 반면, NX-CT는 지연 방출을 나타냈다. 방출 역학(release kinetics) 분석 결과, NX-CS는 빠른 방출, NX-CT는 지속적 방출, NX-ST는 이상성 방출(biphasic release)을 보였다.

세포독성 분석

The 인 비트로(in vitro) ~의 세포독성 나노뇨증 MTT 분석법을 사용하여 MCF-7 유방암 세포에 대한 제형들의 효능을 평가하였으며, 표 3 ~에 대해 상세히 설명하는 IC₅₀ 값. NX-ST가 가장 높은 세포독성을 나타냈으며, 추정 IC₅₀ 25개 중 ± 21.47 µg/mL (외삽됨)이며, 이는 우수한 항암 활성을 나타냅니다. 반면, NX-CS와 NX-CT는 더 낮은 세포독성을 보였으며, IC₅₀ 초과하는 값 300 µg/mL유리 하이드록시우레아(hydroxyurea, HU)는 IC₅₀ 값이 가장 높게 나타나 세포독성이 가장 낮은 것으로 확인되었으며,₅₀ 의 722.57 µg/mLIC가 (이하 생략)₅₀ NX-CS 및 NX-CT의 값은 초과치로만 보고되었습니다. 300 µg/mL, 상호 간의 세포독성 및 유리 HU 대비 세포독성(722.57 µg/mL) 현재의 데이터로는 확립할 수 없으며, 오직 NX-ST만이 유리 HU보다 세포독성이 더 강한 것으로 확실히 순위가 매겨질 수 있었습니다. 이러한 결과는 NLC 제형이 유리 약물에 비해 HU의 항암 활성을 유의하게 향상시킨다는 것을 나타냅니다.

물리화학적 파라미터와 세포독성 사이의 통계적 상관관계

연구된 모든 파라미터의 상관관계는 그림 6에 나타나 있다. 통계 분석 결과, HU가 함유된 NLC(NX-ST, NX-CT, NX-CS) 간에 제타 전위, 봉입 효율(EE) 및 세포독성(IC₅₀)에서 유의미한 차이가 나타났으나 [F(2,12) = 6.45, p = 0.014], 입자 크기 또는 PDI에서는 차이가 없었다 [F(2,12) = 1.27, p = 0.31]. NX-ST는 적절한 EE와 함께 최적의 세포독성을 보인 반면, NX-CS와 NX-CT는 더 높은 EE를 보였으나 세포독성은 더 약했다. 탐색적 상관관계 분석을 위해 테스트 농도 범위의 상한선(>300 µg/mL)을 초과하는 IC50 값에는 30 µg/mL의 값을 할당하였다. 탐색적 Spearman 상관관계 분석 결과, 제타 전위와 IC₅₀ 사이에 양의 상관관계가 있음이 나타났다 (ρ = 0.866, p = 0.3). 따라서 제타 전위의 음전하가 덜한 제형일수록 IC₅₀ 값이 더 높은 경향을 보였으며, 음전하가 더 강한 NX-ST 제형이 더 큰 세포독성 활성을 나타냈다.

안정성 연구

입자 크기 안정성

25 °C에서 모든 NANOXURIA 제형의 입자 크기는 3개월의 보관 기간 동안 증가하며 뚜렷한 경향을 보였다(그림 7). NX-ST는 10 nm(1개월)에서 처음 두 달 동안은 상대적으로 안정적인 상태(106.4 nm)를 유지했으나, 3개월 차에는 150.6 nm로 증가했다. 91.9 nm에서 시작한 NX-CT는 2개월 동안 102.2 nm로 점진적으로 증가한 후, 3개월 차에 168.3 nm로 급격히 상승했다. NX-CS는 가장 큰 변화를 보여, 초기 67.3 nm에서 3개월 차에 171.06 nm까지 증가했다. 종합적으로, 모든 제형은 25 °C에서 입자 크기 성장을 나타냈으며, 증가 정도는 NX-CS > NX-CT > NX-ST 순이었다.

4 °C에서 NANOXURIA 제형은 25 °C와 비교하여 향상된 안정성을 보였으며, 3개월의 보관 기간 동안 입자 크기의 증가 폭이 더 작았습니다(그림 7). NX-ST는 1개월 차에 110 nm, 2개월 차에 102 nm, 3개월 차에 120.96 nm의 입자 크기를 기록하며 상대적인 안정성을 유지했습니다. NX-CT는 입자 크기가 1개월 차 91.9 nm에서 2개월 차 16.7 nm, 3개월 차 128.5 nm로 점진적으로 증가했습니다. NX-CS는 변동이 가장 적었으며, 초기 67.3 nm에서 2개월 차 74.75 nm, 3개월 차 89.3 nm로 증가했습니다. 전반적으로 4 °C에서의 입자 크기 증가 추세는 NX-CT > NX-ST > NX-CS 순이었으며, 이는 냉장 조건에서 안정성이 향상되었음을 나타냅니다.

PDI 안정성

25 °C에서 NANOXURIA 제형의 PDI는 3개월의 저장 기간 동안 서로 다른 경향을 보였다(그림 8). NX-ST는 연구 전반에 걸쳐 상대적으로 안정적인 PDI 값을 유지하여 일관된 입자 크기 분포를 나타냈다. NX-CT는 두 번째 달에 PDI가 증가(0.342)했다가 세 번째 달까지 0.248로 감소하는 양상을 보였다. NX-CS는 시간이 지남에 따라 PDI가 점진적으로 증가하여 입자 크기의 균일성이 서서히 상실됨을 나타냈다. 종합적으로, NX-ST가 가장 안정적인 분포를 보였고, NX-CT는 일시적인 변동성을 나타냈으며, NX-CS는 이질성이 증가하는 경향을 보였다.

4 °C에서 NANOXURIA 제형의 PDI는 3개월의 보관 기간 동안 서로 다른 경향을 보였습니다(그림 8). NX-ST는 상대적으로 안정적인 PDI 값을 나타냈으며, 1개월 차 0.347에서 2개월 차 0.269로 감소한 후 3개월 차에 0.349로 약간 증가했습니다. NX-CT는 PDI가 1개월 차 0.21에서 3개월 차 0.31로 점진적으로 증가하여 입자 균일성이 서서히 상실되었음을 나타냈습니다. NX-CS 또한 시간이 지남에 따라 PDI가 상승하는 경향을 보여 균질성이 감소했음을 나타냈습니다. 전반적으로 NX-ST가 가장 안정적인 분포를 유지한 반면, NX-CT와 NX-CS는 불균질성이 증가하는 양상을 보였습니다.

제타 전위 안정성

25 °C에서 NANOXURIA 제형의 제타 전위(ZP)는 3개월의 저장 기간 동안 뚜렷한 경향을 보였다(그림 9). NX-ST는 1개월 차에 −46.43 mV의 초기 ZP를 나타냈으며, 2개월 차에는 −39.37 mV로 감소했다가 3개월 차에는 −52.3 mV로 증가했다. NX-CT는 음전하 값이 점진적으로 증가하여 1개월 차 −30.76 mV에서 2개월 차 −35.6 mV, 3개월 차 −37.13 mV로 변화했다. NX-CS는 ZP 음전하 값이 초기에 −30.03 mV에서 2개월 차 −39.6 mV, 3개월 차 −52.47 mV로 증가함을 보였다. 전반적으로 모든 제형은 시간이 지남에 따라 ZP 값이 감소하는 경향을 보였으며, NX-ST와 NX-CS가 NX-CT보다 더 큰 절대값을 나타냈다.

4 °C에서 NANOXURIA 제형의 제타 전위(ZP)는 3개월의 저장 기간 동안 뚜렷한 경향을 보였다(그림 9). NX-ST는 연구 전 기간에 걸쳐 일관되게 높은 음의 ZP 값을 유지했다. NX-CT는 ZP 음전하가 점진적으로 증가하는 양상을 보였으며, −30.76 mV에서 시작하여 3개월 차에 약간 더 음의 값으로 변했다. NX-CS는 ZP 음전하가 초기 −30.03 mV에서 3개월 후 −28.8 mV로 약간 감소하는 모습을 보였다.

데이터 가용성:

본 연구의 결과를 뒷받침하는 데이터는 논문 내에 포함되어 있습니다. 본 연구 과정에서 생성 및 분석된 원시 데이터 세트는 보충 파일에서 확인할 수 있습니다.

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그림 1: NX-ST의 형태학적 및 물리화학적 특성 분석. (A) 주사전자현미경(SEM) 이미지. (B) 투과전자현미경(TEM) 이미지. (C) 입자 크기 분포(108.3 nm; PDI = 0.36) (n = 1). (D) 제타 전위 분포(−48.8 mV) (n = 1). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: NX-CT의 형태학적 및 물리화학적 특성 분석. (A) SEM 이미지. (B) TEM 이미지. (C) 입자 크기 분포 (91.87 nm; PDI = 0.235) (n = 1). (D) 제타 전위 분포 (−31.3 mV) (n = 1). 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: NX-CS의 형태학적 및 물리화학적 특성 분석. (A) SEM 이미지. (B) TEM 이미지. (C) 입자 크기 분포 (74.72 nm; PDI = 0.24) (n = 1). (D) 제타 전위 분포 (−36.8 mV) (n = 1). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 서로 다른 계면활성제 조합을 가진 NANOXURIA 제형 간의 PDI 비교. NX-ST, NX-CT 및 NX-CS 제형에 대한 PDI 값이 표시되어 있다. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: NANOXURIA 제형으로부터의 인 비트로(in vitro) hydroxyurea 방출. NX-CS, NX-CT 및 NX-ST로부터 24시간 동안의 누적 hydroxyurea 방출량을 나타낸 것이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 6: NANOXURIA 제형 간의 물리화학적 파라미터 및 세포독성 비교. NX-ST, NX-CS 및 NX-CT의 입자 크기, PDI, 제타 전위(ZP), 봉입 효율(EE) 및 IC₅₀를 비교한 레이더 차트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 7: 보관 온도 및 기간이 NANOXURIA 입자 크기에 미치는 영향. (A) 25 °C 보관 중의 입자 크기. (B) 4 °C 보관 중의 입자 크기. (C) 2개월 및 3개월 시점의 4 °C와 25 °C 간 입자 크기 비교. 여기를 클릭하여 이 그림의 확대 버전을 확인하십시오.

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그림 8: 보관 온도와 기간이 NANOXURIA PDI에 미치는 영향. (A) 25 °C에서 보관하는 동안의 PDI. (B) 4 °C에서 보관하는 동안의 PDI. (C) 2개월 및 3개월 시점에서의 4 °C와 25 °C 간 PDI 비교. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 9: 보관 온도 및 기간이 NANOXURIA 제타 전위에 미치는 영향. (A) 25 °C 보관 중 제타 전위. (B) 4 °C 보관 중 제타 전위. (C) 2개월 및 3개월 시점에서의 4 °C와 25 °C 간 제타 전위 비교. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

제형Tween-80 (µL)*Sodium dodecyl sulfate (SDS) (mg)Cremophor EL (µL)#
NX-ST5010-
NX-CT50-10
NX-CS-5010
밀도 (g/ml) = (1.07*, 1.05#)

표 1: NANOXURIA 제형의 계면활성제 조성. NX-ST, NX-CT 및 NX-CS 제형을 제조하는 데 사용된 Tween-80, sodium dodecyl sulfate (SDS) 및 Cremophor EL의 양입니다.

제형입자 크기 (d.nm) (n = 3) (± 표준편차(SD)PDI (n = 3) (± 표준편차(SD)ZP (mV) (n = 3) (± 표준편차(SD) 포집 효율 (%) (n = 3) (± 표준편차)
NX-ST110 ± 1.9970.347 ± 0.011-46.433 ± 8.40478.189 ± 3.49
NX-CT91.947 ± 0.2150.221 ± 0.015-30.767 ± 0.47384.638 ± 5.0
NX-CS67.377 ± 7.1580.302 ± 0.091-30.033 ± 5.86286.626 ± 4.676

표 2: NANOXURIA 제형의 물리화학적 특성 분석. 25 °C에서 NX-ST, NX-CT 및 NX-CS의 입자 크기, 다분산 지수(PDI), 제타 전위(ZP) 및 봉입 효율(EE). 데이터는 평균 ± 표준편차(n = 3)로 표시됨.

제형IC50 (µg/mL)IC50 (µM)
NX-ST25 ± 21.472960
NX-CS>30-
NX-CT>30-
HU72.57950

표 3: NANOXURIA 제형 및 유리 hydroxyurea의 인비트로(in vitro) 세포독성. MCF-7 세포에 대한 NX-ST, NX-CS, NX-CT 및 유리 hydroxyurea (HU)의 IC₅₀ 값이며, µg/mL 및 µM로 표시됨.

보충 파일 1: 하이드록시유레아가 탑재된 나노구조 지질 운반체의 특성 분석을 위한 원시 데이터 및 계산. 이 파일에는 입자 크기, 다분산 지수, 제타 전위, 봉입 효율, 약물 방출 측정 및 제형 비교 분석을 포함하여 NX-ST, NX-CT 및 NX-CS 제형에 대한 기초 실험 데이터와 계산 결과가 포함되어 있습니다.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

제안된 접근 방식 및 주요 결과

본 연구에서는 열균질화법을 이용하여 NANOXURIA를 개발하였다. 고체 지질로는 스테아르산(stearic acid)을 사용하였으며, 지질의 완전한 용융과 효율적인 균질화를 보장하는 동시에 HU 및 계면활성제의 불필요한 열 노출을 최소화하기 위해 조제 온도를 스테아르산의 녹는점(~69.3 °C)과 밀접하게 일치하는 약 70 °C로 유지하였다2. 계면활성제 시스템은 친수성-친유성 균형(HLB) 값, 생체 적합성 및 NLC 조제 적합성을 기준으로 선택하였다. 예비 제형 시험을 통해 안정성과 세포 적합성에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 과도한 농도는 피하면서, 작은 입자 크기와 낮은 PDI를 가진 안정적인 나노 분산액을 생성하는 계면활성제 농도를 확인하였다. 입자 크기 분석 전에는 제형을 고순수 정제수로 적절히 희석하여, 입자 크기 및 크기 분포의 정확한 측정을 방해할 수 있는 다중 산란 효과를 최소화하였다23.

세 가지 제형인 NX-ST, NX-CT, NX-CS는 주로 계면활성제 조성에서 차이가 있었습니다. NX-ST는 T80과 SDS를 포함했고, NX-CT는 Cremophor EL과 T80을 포함했으며, NX-CS는 Cremophor EL과 SDS를 포함했습니다. 이러한 제형 전략을 통해 비이온성 및 이온성 계면활성제와 그 농도가 HU가 적재된 NLC의 물리화학적 특성에 미치는 영향을 평가할 수 있었습니다. 결과적으로 제형 간에 입자 크기, PDI, ZP, EE, 약물 방출 거동 및 세포 독성에서 뚜렷한 차이가 나타났으며, 이는 계면활성제 선택이 NLC 성능의 중요한 결정 요인임을 나타냅니다.

제형 간의 입자 크기는 NX-CS < NX-CT < NX-ST 순으로 유의미한 차이를 보였다(p < 0.05). 입자 크기는 나노운반체의 성능을 결정하는 중요한 요인인데, 이는 입자가 작을수록 표면적이 더 넓어질 수 있으며 분산 안정성, 세포 상호작용, 생체 내 분포 및 약물 방출 거동에 영향을 미치기 때문이다24,25. NX-CS에서 가장 작은 입자가 형성되었으며, 이는 Cremophor EL의 높은 유화 효율과 적절한 농도의 SDS가 결합된 결과로 보인다. Cremophor EL은 계면 장력을 감소시켜 더 작은 액적 형성을 촉진할 수 있으며, SDS는 정전기적 안정화에 기여한다. NX-ST와 비교하여 NX-CS에 사용된 더 낮은 SDS 농도는 고농도 SDS와 관련된 과도한 계면 효과를 일으키지 않으면서도 충분한 계면 안정화를 제공했을 가능성이 있다26,27,28.

NX-CT는 중간 정도의 입자 크기를 나타냈습니다. Cremophor EL과 T80의 조합은 상보적인 계면 및 입체 안정화 특성을 가진 두 가지 비이온성 계면활성제를 제공합니다. Cremophor EL은 강력한 유화를 돕고, T80은 입자 주위에 입체 장벽을 형성하여 응집을 감소시킬 수 있습니다29,30,31. 또한 이온성 계면활성제가 없으므로 입자 형성 과정에서 전하 매개 상호작용이 강하게 일어나는 것을 방지합니다. 반면, NX-ST는 가장 큰 입자 크기를 보였습니다. SDS는 강력한 유화 계면활성제이지만, NX-ST 내의 상대적으로 높은 농도가 계면 환경과 입자 성장 거동을 변화시켰을 가능성이 있습니다. T80이 입체 안정화를 제공하지만, T80과 더 높은 SDS 농도의 복합적인 효과가 NX-CS에서 달성된 것보다 유화와 안정화 사이의 균형을 덜 유리하게 만들었을 수 있습니다.

형태학적 연구를 통해 나노 크기의 지질 운반체가 형성되었음을 추가로 확인하였습니다. SEM 및 TEM 분석 결과, 입자는 주로 구형 또는 구형에 가까운 형태를 보였으며, 관찰된 형태는 DLS로 측정된 입자 크기와 대체로 일치하였습니다. SEM은 건조된 입자를 분석하는 반면, DLS는 입자와 그 주변의 수화층 및 계면활성제 층을 포함한 수력학적 직경을 측정하므로, 현미경 측정값과 DLS 측정값 사이에 차이가 발생하는 것은 예상된 결과입니다. 따라서 현미경 관찰 결과와 DLS 분석 결과를 종합할 때, 나노 크기의 NLC 시스템이 성공적으로 형성되었음을 알 수 있습니다.

PDI는 입자 집단의 균일성에 대한 추가 정보를 제공하였습니다. NX-CT가 가장 좁은 입자 크기 분포를 보인 반면, NX-ST는 가장 높은 평균 PDI를 나타냈습니다. NX-CS는 중간 정도의 평균 PDI를 보였으나 반복 측정 간의 변동성은 더 컸습니다. 특히, NX-CS의 반복 측정값은 NX-ST 및 NX-CT보다 해당 제형의 변동성이 더 컸음을 나타냅니다. 전반적인 PDI 경향은 NX-CT < NX-CS < NX-ST였으나, 보고된 차이는 통계적으로 유의하지 않았습니다 (p > 0.05). NX-CT의 상대적으로 낮은 PDI는 Cremophor EL과 T80에 의해 제공되는 복합적인 입체 안정화와 관련이 있을 수 있습니다. 두 계면활성제 모두 비이온성으로, 강한 정전기적 상호작용을 유도하지 않고 입자 계면을 안정화할 수 있습니다. Cremophor EL은 유화를 촉진하고, T80은 입체적 보호를 제공하여 잠재적으로 더 균질한 입자 집단을 형성하도록 돕습니다32,3. NX-ST의 더 높은 PDI는 더 높은 SDS 농도의 영향이 반영된 것일 수 있습니다. SDS는 정전기적 반발력을 제공하지만, 계면활성제 농도의 변화는 미셀 형성 및 계면 조직을 변화시켜 잠재적으로 입자 크기의 불균일성에 기여할 수 있습니다34,35,36. NX-CS는 중간 정도의 PDI 거동을 보였으며, 이는 Cremophor EL과 더 낮은 SDS 농도의 결합된 효과와 일치합니다37.

제형별로 표면 전하 또한 차이를 보였다. NX-ST는 더 높은 SDS 농도의 존재와 일관되게 가장 높은 음전하 ZP를 나타냈으며, 그 뒤를 이어 NX-CT와 NX-CS 순이었다. SDS는 음이온성 계면활성제이므로 SDS 함유 시스템의 음전하 표면 전하가 더 높게 나타나는 것은 예상된 결과이다. 따라서 ZP 값은 SDS가 NLC의 표면 전하에 상당 부분 기여한 반면, 비이온성 계면활성제는 주로 입체 안정화에 기여했음을 나타낸다. ZP 경향은 NX-ST > NX-CT > NX-CS (p < 0.05)였다. 하지만 이러한 차이가 오직 계면활성제 조성에 의한 것이라고만 볼 수는 없는데, 잔류 자유 계면활성제, 이온 강도 및 지질-계면활성제 구조의 변화 또한 측정된 ZP에 영향을 미칠 수 있기 때문이다38,39,40.

봉입 효율(Encapsulation efficiency)은 HU 보유에 있어 조성이 미치는 영향을 추가적으로 입증하였다. 모든 제형이 비교적 높은 EE (>75%)를 나타냈으며, 이는 HU가 NLC 시스템 내로 성공적으로 통합되었음을 나타낸다. NX-CS가 가장 높은 EE를 보였고, NX-CT와 NX-ST가 그 뒤를 이었으며, 제형 간에 유의미한 차이가 있었다 (p < 0.05). Cremophor EL이 효율적인 계면 안정화 및 약물 보유에 기여했을 수 있으며, NX-CS의 적당한 SDS 농도는 NX-ST의 높은 SDS 농도와 관련된 잠재적인 붕괴 효과 없이 추가적인 안정성을 제공했을 가능성이 있다41,42,43. 그럼에도 불구하고, HU는 친수성이므로 지질 매트릭스 내에 완전히 용해될 가능성은 낮다. 대신 HU는 미세하게 분산된 약물 형태로 존재하거나, 지질-물 계면에 결합되어 있거나, 불완전한 지질 매트릭스 및 계면활성제가 풍부한 계면 영역 내에 수용되어 있을 수 있다.

방출 프로파일은 제형 의존적인 거동을 보였으며, 24 h 시점에서의 누적 HU 방출량은  NX-CS > NX-ST > NX-CT 순으로 나타났다. NX-CS는 초기 급격한 방출 후 정체기에 도달하는 상대적으로 빠른 방출을 보였으며, 이는  1차 속도론과 유사한 거동과 일치한다. 반면, NX-CT는 가장 느리고 제어된 방출을 보여  0차 속도론과 유사한 거동을 나타냈으며, NX-ST는 중간 단계의  이상성(biphasic) 방출 프로파일을 보였다. 이러한 방출은 입자 표면과 계면활성제가 풍부한 계면 영역으로부터의 HU 확산과, 뒤이어 지질 매트릭스를 통한 포집 약물의 느린 확산에 의해 조절되는 것으로 보인다. NX-CS의 더 빠른 방출은 더 작은 입자 크기와 더 넓은 표면적, 그리고 Cremophor EL과 SDS의 함께 작용하는 효과와 관련이 있을 수 있으며, SDS는 계면 친수성을 증가시키고 Cremophor EL은 약물의 가용화를 촉진한다. 대조적으로, NX-CT 내의 Cremophor EL과 T80의 조합은 더 안정적인 계면 장벽을 형성하여 초기 약물 확산을 제한하고 더 지속적인 방출을 유도하는 것으로 보이며, NX-ST는 SDS에 의한 방출 촉진과 T80에 의한 안정화라는 상반된 영향으로 인해 중간 정도의 이상성 패턴을 보였다. 이러한 해석은 지질 매트릭스와 방출 매질 사이의 상호작용을 조절하는 계면활성제의 역할에 대한 제안과 일치한다41,4,45,46,47,48. 기초 확산 거동을 설정하기 위해 물을 방출 매질로 사용하였으나, 이는 생체 유체의 이온 조성 및 생리학적 조건을 그대로 재현하지는 않는다. 생리학적 완충액에 존재하는 전해질은 전기 이중층, 계면활성제 조직, 입자 응집 및 막 투과성을 변화시켜 방출 속도론을 수정할 가능성이 있다.

세포독성 결과는 유리 HU와 NLC 제형 사이에 뚜렷한 차이가 있음을 보여주었으며,  유리 HU가 가장 높은 IC₅₀ 를 보였고 NX-ST가 가장 강력한 세포독성 활성을 나타냈습니다. NLC 제형에서 관찰된 더 낮은 IC₅₀ 값은 HU를 지질 운반체에 포함시킴으로써 MCF-7 세포에 대한 in vitro 활성이 변화되었음을 나타냅니다. 특히 NX-ST의 강력한 반응은  SDS/T80 계면활성제 시스템, 상대적으로 높은 음전하의 ZP, 그리고 중간 정도의 이상성 방출 프로파일의 결합된 기여를 반영하는 것일 수 있으며, 이는 세포 계면에서의 약물 가용성과 방출된 HU에 대한 세포의 시간적 노출에 함께 영향을 미쳤을 가능성이 있습니다49,50. 흥미롭게도, NX-CS의 더 작은 입자 크기와 더 높은 EE가 더 큰 세포독성으로 이어지지는 않았으며, 이는 입자 크기와 약물 봉입률만으로는 생물학적 활성이 결정되지 않는다는 점을 강조합니다. 오히려 세포 상호작용, 약물 방출 거동, 계면활성제 효과 및 약물 가용성이 종합적으로 반응에 영향을 미칠 수 있습니다51,52,53. 따라서 NX-ST에 비해 NX-CT와 NX-CS의 세포독성이 더 낮게 나타난 것은 단순히 제형의 성능이 떨어진다고 해석해서는 안 되며, 특히 NX-CT가 가장 제어된 방출을 보였다는 점에 유의해야 합니다.

보관 연구 결과, 다음이 입증되었습니다. 보관 기간 동안 모든 제형에서 눈에 띄는 응집, 침전, 상분리, 변색, 점도 또는 질감의 변화, 혹은 이상취나 산패취가 관찰되지 않았으므로 물리적 안정성이 우수했다. 하지만 물리화학적 안정성 데이터는 더욱 차별화된 양상을 보여주었습니다. 25 °C입자 크기 및/또는 PDI의 증가는 콜로이드 시스템의 점진적인 변화를 나타냈으며, 그 정도와 통계적 유의성은 제형마다 다르게 나타났다. NX-ST는 SDS의 강력한 정전기적 기여로 인해 안정적인 상태를 유지한 반면, 주로 Cremophor EL 및 T80의 입체 안정화에 의존한 NX-CT는 입자 특성 변화에 더 취약함을 보였다. NX-CS는 정전기적 및 입체 안정화가 결합되었음에도 불구하고 저장 기간 동안 변화를 보였으며, 이는 두 가지 안정화 기전이 존재하더라도 NLC 시스템의 시간 의존적 재구성을 완전히 방지하지는 못함을 시사한다. 보관 온도 4 °C 일반적으로 더 나은 물리화학적 보존력을 보였으며, 이는 분자 이동성 감소 및 지질 구조 변화의 지연과 일치하는 결과였습니다. NX-CS는 상대적으로 개선된 입자 크기 안정성을 보인 반면, NX-ST는 비교적 일관된 특성을 유지했습니다. 그럼에도 불구하고 NX-CT는 PDI에서 지속적인 변화를 나타냈으며, 이는 입체 안정화만으로는 장기 보관에 충분하지 않을 수 있음을 시사합니다. 보관 중 ZP의 변화는 지질-계면활성제 계면의 시간 의존적 재구성을 더욱 시사하며, 이는 계면활성제 탈착, 지질 재결정화 및 HU 관련 구조적 변화와 잠재적으로 연관되어 있을 수 있으나 직접적으로 입증되지는 않았다.47,48,54. 

분야의 발전

gefitinib, capecitabine, imatinib을 포함한 다른 항암제의 NLC 제형은 이전에 유리 약물에 비해 개선된 전달 효율을 입증한 바 있으나14,15,16, 특히 서로 다른 계면활성제 조합이 hydroxyurea가 탑재된 NLC의 물리화학적 및 세포독성 프로파일을 어떻게 형성하는지에 대한 비교 데이터는 제한적이었습니다43,4,5. 본 연구에서는 단일 NLC 플랫폼 내에서 세 가지 계면활성제 시스템을 체계적으로 비교함으로써, 계면활성제의 이온 특성과 농도가 입자 크기, 콜로이드 안정성, 약물 보유율 및 in vitro 항암 활성에 어떻게 공동으로 영향을 미치는지에 대해 직접적이고 내부적으로 제어된 비교를 제공하며, 이는 지질 친화성 페이로드보다 NLC 문헌에서 덜 다뤄진 작고 매우 친수성인 약물의 조합입니다51,54,56,57. 이러한 결과는 가장 높은 in vitro 세포독성 향상과 관련된 계면활성제 조합(T80–SDS)을 확인함으로써, 지질 및 알부민 기반 나노운반체에 HU를 캡슐화한 이전 보고들53,58의 내용을 확장합니다.

연구의 한계점

본 연구의 결과 해석 시 고려해야 할 몇 가지 한계점이 있습니다. 첫째, 생물학적 평가는 MCF-7 유방암 세포를 이용한 단일 in vitro MTT 분석으로 제한되었습니다. HU는 만성 골수성 백혈병 및 낫형 세포 빈혈증 치료에 임상적으로 사용되지만, 현재의 데이터로는 이러한 특정 질환에 대한 결론을 내리기 부족하며, 관련 백혈병 모델(예: K562 세포) 및 in vivo에서의 확인이 필요합니다. 둘째, 관찰된 물리화학적 및 세포독성 차이에 대해 제시된 기전적 설명(예: 계면활성제 탈착, 지질 재결정화, 세포 흡수 변화)은 직접적으로 입증되지 않았으므로 가설로 간주되어야 합니다. 이를 입증하기 위해서는 DSC, XRD, Cryo-TEM23,41과 같은 분석 기술과 더불어 세포 흡수 및 방출 동역학 연구가 필요할 것입니다. 셋째, in vitro 방출 시험이 생리학적 완충액이 아닌 물에서 수행되었으며, 이는 in vivo 성능을 예측하는 데 필수적인 단계로 간주됩니다59. 넷째, 조제 과정 중 HU의 화학적 안정성이 직접 정량화되지 않았으며, 보관 중 수성 층으로의 약물 누출에 대한 전용 평가가 수행되지 않았습니다. HU의 높은 수용성을 고려할 때 이러한 누출 가능성이 있으며 이에 대한 평가가 이루어져야 합니다. 마지막으로, 본 제형은 비경구 투여를 목적으로 하며, 엄격한 물리화학적 검증의 필요성을 강조하는 NLC 관련 문헌의 전반적인 흐름에 따라32, 여기서 제시된 기전적 해석은 추가적인 특성 분석 전까지 탐색적인 수준으로 보아야 합니다.

대안적 접근법

이 분야의 향후 연구를 강화하기 위해 몇 가지 대안적인 특성 분석 및 검증 전략을 고려할 수 있습니다. 고체 상태 분석 기술(예: DSC, XRD)과 cryo-TEM을 활용하면 지질 매트릭스 내 HU의 물리적 상태를 명확히 하고, 관찰된 안정성 경향을 설명하기 위해 제안된 계면활성제 탈착 및 지질 재결정화 메커니즘을 직접 검증하는 데 도움이 될 것입니다36,60,61. 단순한 물이 아닌 생리적 완충액 또는 모사 생체액에서의 방출 시험을 수행하면 in vivo 방출 거동을 더 정확하게 예측할 수 있으며, 세포 흡수의 직접적인 정량화(예: 형광 표지 및 유세포 분석)를 통해 제타 전위만으로 추론하는 대신 NX-ST의 향상된 세포 독성에 대해 제안된 흡수 기반 설명을 검증할 수 있을 것입니다62,63,64. 또한, 임상적으로 관련이 있는 두 번째 세포주(예: 만성 골수성 백혈병을 위한 K562)에서의 확인 시험과 공식적인 가속 안정성 조건 하에서의 평가를 통해, 현재의 in vitro 연구 결과를 임상 적용 가능한 제형으로 발전시키는 데 더욱 기여할 수 있을 것입니다.

중요성 및 잠재적 응용 분야

이러한 결과는 빠른 제거, 가변적인 생체이용률 및 용량 관련 독성으로 인해 현재 임상적 사용이 제한적인 hydroxyurea 전달을 개선하려는 광범위한 노력과 관련이 있습니다. 계면활성제 조성을 조절하여 캡슐화 효율이 더 높고 더 작고 안정적인 입자(NX-CS, NX-CT) 또는 더 강력한 in vitro 세포독성 효능(NX-ST)41,65를 유도할 수 있음을 보여줌으로써, 본 연구는 HU 분자 자체를 수정하지 않고도 특정 응용 분야에서 우선시되는 전달 특성에 따라 NLC 조성을 선택하거나 추가로 최적화할 수 있는 실질적인 근거를 제공합니다. 이러한 유형의 조절 가능한 나노운반체 플랫폼은 유사한 전달 제한이 있는 다른 작은 친수성 약물에도 적용 가능할 수 있습니다.

향후 방향

향후 연구에서는 고체 상태 및 이미징 기술을 사용하여 여기서 제안된 물리화학적 메커니즘의 정량적 검증, 생리학적으로 유의미한 조건에서의 약물 방출 시험, 세포 흡수의 직접적인 측정 및 세포독성과의 관계 분석, 추가적인 임상 관련 세포주 및 최종적으로는 in vivo 모델에서의 시험, 유통기한 결정을 뒷받침하기 위한 공식적인 가속 및 장기 안정성 연구, 그리고 HU의 화학적 안정성과 저장 관련 누출의 정량화가 우선적으로 이루어져야 합니다. 이러한 사항들을 해결함으로써 여기서 확인된 물리화학적 장점이 실질적인 치료적 이점으로 이어지는지 여부를 확립하는 데 도움이 될 것입니다.

결론

본 연구에서는 나노구조 지질 운반체(NANOXURIA)를 개발함으로써, 빠른 제거로 인한 낮은 전달 효율, 가변적인 생체 이용률 및 용량 관련 독성을 포함한 HU 요법의 주요 한계점들을 해결하고자 하였습니다. 연구 결과, 계면활성제 조성과 저장 조건이 물리화학적 안정성, 세포독성 성능 및 전반적인 전달 효율에 결정적인 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 여러 제형 중 NX-ST는 유리 HU보다 3.2배 높은 세포독성 활성을 보여 탁월한 성능을 나타냈으며, 이는 세포 흡수 및 약물 전달이 향상되었음을 시사합니다. 이러한 효능 향상은 균형 잡힌 입자 특성, 조절된 방출 및 효과적인 정전기적 안정화 덕분인 것으로 분석됩니다.

이와 대조적으로, 주로 비이온성 계면활성제에 의존하는 제형은 상대적으로 낮은 안정성과 성능을 보였으며, 이는 복합적인 안정화 메커니즘의 중요성을 강조합니다. 보관 조건은 제형의 거동에 상당한 영향을 미쳤는데, 25 °C에서는 입자 성장과 불균질성이 촉진된 반면, 4 °C에서는 안정성, 균일성 및 표면 전하가 더 잘 유지되었습니다.

종합적으로, 본 연구는 합리적으로 설계된 NLC 시스템이 약물 자체를 변경하지 않고도 HU 전달을 강화할 수 있음을 입증함으로써 확인된 연구 공백을 해결하였습니다. 이러한 결과는 안정적이고 효율적이며 임상적으로 유의미한 약물 전달 시스템을 구현하기 위해 최적의 지질-계면활성제 조합과 적절한 보관 조건이 필수적임을 강조합니다.

공개 사항

모든 저자는 이해상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

저자들은 프로젝트 번호 JU-RSP2026를 통해 본 연구 과제에 연구비를 지원해 준 Jazan University의 대학원 및 과학 연구 학장단에 감사를 표합니다. 또한, 본 프로젝트의 성공적인 완료를 위해 필수적인 자원을 제공해 준 사우디아라비아 Jazan, Jazan University의 약학대학에 깊은 감사를 드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Amicon Ultra-2 mL 원심분리 필터 (3 kDa MWCO)Millipore, IrelandUFC20324
탄소 코팅 구리 그리드 (TEM 시료 지지체)N/A
Cremophor EL (비이온성 계면활성제, 피마자유 유도체, 순도 ≥98%)MedChemExpress, NJ, USAHY-Y1890
투석 막 (12-14 kDa MWCO)Spectrum Laboratories, CA, USA08-670-3BB
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher Chemicals, UK10162090
소태아 혈청 (FBS)Gibco, Paisley, UK10270-106
전계 방사형 주사 전자 현미경 (FE-SEM), Apreo 2Thermo Fisher-FEI, USA1290
균질기, HG 15DWiseTis, GermanyDH.WHG02020
Hydroxyurea (HU) (순도 ≥9%)Sudair Pharma, Riyadh, Saudi Arabia21L01
MCF-7 인간 유방암 세포주American Type Culture Collection (ATCC), USAHTB-2
마이크로플레이트 리더, SpectroStar NanoBMG LABTECH, Ortenberg, Germany601-101
MTT 시약 (5 mg/mL)Invitrogen Corporation, San Diego, CA, USAM6494
Penicillin-streptomycin 용액Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAP43
RPMI 1640 배지Gibco, Grand Island, NY, USA1875093
참기름Local merchant, Jazan, Saudi ArabiaN/A
Sodium dodecyl sulfate (SDS) (음이온성 계면활성제, 순도 90%)PanReac AppliChem, Darmstadt, Germany28312
Stearic acid (순도 95-106%)Himedia, Mumbai, IndiaGRM1425
시린지 필터 (0.45 µm)Merck, SASLHV03RS
투과 전자 현미경 (TEM), TalosThermo Fisher, USAN/A
Tween-80 (T80) (비이온성 계면활성제, 올레산 ≥58%)Loba Chemie, Mumbai, IndiaArt. No. 06420
UV-Vis 분광도계Shimadzu, Kyoto, Japan20-92961-01
Zetasizer Nano ZS90Malvern Panalytical, Malvern, UKZEN3690

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